Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Создание острых и хронических экспериментальных моделей моторной тиковой экспрессии у крыс

Published: May 27, 2021 doi: 10.3791/61743
Automatic Translation
*1, *1, 1
1The Leslie & Susan Goldschmied (Gonda) Multidisciplinary Brain Research Center, Bar-Ilan University
* These authors contributed equally

Summary

Представлены протоколы генерации острых и хронических экспериментальных моделей тиковой экспрессии у свободно ведущие себя крысы. Модели основаны на имплантации стриатальной канюли и последующем применении антагонистаГАМК А. Острая модель использует переходные инъекции, тогда как хроническая модель использует длительные инфузии через подкожно-имплантированный мини-осмотический насос.

Abstract

Двигательные тики — это внезапные, быстрые, повторяющиеся движения, которые являются ключевыми симптомами синдрома Туретта и других тиковых расстройств. Патофизиология генерации тиков связана с аномальным торможением базальных ганглиев, в частности их первичной входной структуры, полосатого тела. В животных моделях как грызунов, так и нечеловеческих приматов местное применение антагонистов ГАМКА, таких как бикукультин и пикротоксин, в двигательные части полосатого тела вызывает местную растормаживание, приводящую к экспрессии двигательных тиков.

Здесь мы представляем острые и хронические модели двигательных тиков у крыс. В острой модели бикукуллинные микроинъекции через канюлю, имплантированную в дорсальное полосатое тело, вызывают экспрессию тиков, длящихся в течение коротких периодов времени до часа. Хроническая модель является альтернативой, позволяющей продлить экспрессию тиков до периодов в несколько дней или даже недель, используя непрерывную инфузию бикукульлина через подкужную мини-осмотическую помпу.

Модели позволяют изучать поведенческие и нейронные механизмы генерации тиков на протяжении кортико-базального пути ганглия. Модели поддерживают имплантацию дополнительных записывающих и стимулирующих устройств в дополнение к инъекционным канюлям, что позволяет использовать широкий спектр применений, таких как электрическая и оптическая стимуляция и электрофизиологические записи. Каждый метод имеет различные преимущества и недостатки: острая модель позволяет сравнивать кинематические свойства движения и соответствующие электрофизиологические изменения до, во время и после тиковой экспрессии и влияние кратковременные модуляторы на тиковую экспрессию. Эту острую модель легко установить; однако он ограничен коротким периодом времени. Хроническая модель, хотя и более сложная, делает возможным изучение динамики тиков и поведенческих эффектов на экспрессию тиков в течение длительных периодов времени. Таким образом, тип эмпирического запроса управляет выбором между этими двумя взаимодополняющими моделями тикового выражения.

Introduction

Тики являются определяющим симптомом синдрома Туретта (TS) и других тиковых расстройств. Тики описываются как внезапные, быстрые, повторяющиеся движения (двигательные тики) или вокализации (вокальные тики)1. Тиковая экспрессия обычно колеблется в своих временных (частота)2 и пространственных (интенсивность, расположение тела)3 свойствах в течение нескольких временных масштабов (часы, дни, месяцы и годы). На эти изменения влияют различные факторы, такие как особенности окружающей среды4,5,поведенческие состояния6,7и добровольное и временное подавление8.

Хотя нейронный механизм, управляющий двигательными тиками, до сих пор не полностью понят, все большее число теоретических и экспериментальных исследований предоставили новые доказательства его природы9. В настоящее время патофизиология генерации тиков считается связанной с кортико-базальными ганглиями (CBG) петлей, и конкретно связана с аномальным ингибированием полосатого тела, первичного базального ганглия входного ядра10,11,12. Предыдущие исследования на грызунах и приматах показали, что полосатое тело может быть расторможено при местном применении различных антагонистов ГАМКА, таких как бикукультин и пикротоксин13,14,15,16,17,18. Это фармакологическое вмешательство приводит к транзиторной моторной тиковой экспрессии в контралатеральной стороне к инъекции, тем самым устанавливая надежную острую модель тиковых расстройств с лицевой и конструктной валидностью. Острая модель проста в индуцировании и позволяет изучать эффекты кратковременной модуляции, такие как электрическая и оптическая стимуляция, одновременно с электрофизиологическими и кинематическими записями до, во время и после тиковой экспрессии. Однако острая модель ограничена коротким периодом времени после инъекции. Основываясь на острой модели, мы недавно предложили хроническую модель генерации тик у крыс, которая использует длительную, фиксированную инфузию бикукуллина в полосатое тело через подкожно-имплантированный мини-осмотический насос19. Эта модель продлевает период выражения тик до нескольких дней/недель. Постоянное высвобождение бикукулина в течение длительного периода времени позволяет иследовать влияние различных факторов, таких как фармакологическое лечение и поведенческие состояния, на выражение тиков.

Здесь мы представляем протоколы генерации острой и хронической моделей экспрессии тиков у крыс. В зависимости от конкретного исследовательского вопроса протоколы позволяют точно настроить параметры, включая одностороннюю и двустороннюю имплантацию, место тиков (в соответствии с соматотопической организацией полосатого тела)18 и угол имплантата-канюли (в зависимости от расположения дополнительных имплантированных устройств). Метод, используемый в хронической модели, частично основан на коммерческих продуктах, но с критическими корректировками в соответствии с моделью ТИК. В этой статье подробно описываются корректировки, необходимые для индивидуальной адаптации этих моделей TIC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры были одобрены и контролировались Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию и соответствовали Руководству Национальных институтов здравоохранения по уходу за лабораторными животными и Руководству Университета Бар-Илан по использованию и уходу за лабораторными животными в исследованиях. Этот протокол был одобрен Национальным комитетом по экспериментам на лабораторных животных при Министерстве здравоохранения.

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются самки крыс Лонг-Эванса (острая и хроническая модели) и самки крыс Sprague Dawley (острая модель) в возрасте 3-10 месяцев, 280-350 г. Реализация этих моделей в других штаммах, весах или возрастах должна быть тщательно проверена на различные реакции.

1. Острая модель

  1. Предоперационная подготовка
    1. Имплантация-канюля
      ПРИМЕЧАНИЕ: Имплантат-канюля позволяет проводить местные инъекции бикукуллина в полосатое тело.
      1. Вырежьте гипотрубку из нержавеющей стали, 25 г (OD 0,02'', ID 0,015'') для получения имплантата-канюли(рисунок 1,устройство #1). Используйте поворотный инструмент для достижения прямых краев. Длина канюли зависит от глубины цели имплантации, угла имплантации канюли и высоты конечного цементированного колпачка. Глубина имплантационной мишени должна быть на 2 мм (0,079 '') выше, чем конечная мишень для инъекции, чтобы предотвратить повреждение тканей.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Самый высокий имплантируемый объект определяет высоту колпачка.
      2. Шлифуйте и разглаживьте края имплантата-канюли, предотвращая дополнительное механическое трение о мозг. Вставьте иглу 30 G (0,01'') через нее, чтобы удалить любые внутренние препятствия.
    2. Подготовка муляжей
      ПРИМЕЧАНИЕ: Манекен представляет собой съемную внутреннюю проволоку, помещенную внутрь имплантированной канюли. Манекен герметизирует имплантированную канюлю, тем самым предотвращая ее обструкцию.
      1. Сделайте манекен, разрезав проволоку 0,013 '' с помощью вращающегося инструмента. Манекен должен быть на 3 мм (0,118'') длиннее длины имплантата-канюли(рисунок 1,устройство #2).
      2. Вставьте манекен в имплантат-канюлю до тех пор, пока он не достигнет конца. Согните лишнюю проволоку, прижав ее к канюле. Изогнутая часть должна быть вровень с имплантатом-канюлой, чтобы манекен не выпал из имплантированной канюли, и чтобы крыса не удалила его.
    3. Подготовка инжектора
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инжектор, состоящий из гибкой трубки и инъекционной канюли(рисунок 1,устройство #3), позволяет осуществлять прямую бикукуллиновую инъекцию в полосатое тело.
      1. Вырежьте гибкую полимерную микроборную трубку диаметром 70 см (27,559 '') (OD 0,06'', ID 0,02 '')(Рисунок 1,устройство #3.1).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Длина гибкой трубки определяется расстоянием между экспериментальной клеткой и расположением инфузионного насоса. Он должен быть достаточно длинным, чтобы обеспечить свободное движение крысы в период инъекции, но не слишком длинным, чтобы крыса не запуталась в нем (см. Рисунок 3А).
      2. Вырежьте из нержавеющей стали 30 г (OD 0.012'', ID 0.007'') гипотрубку для получения инъекционной канюли(Рисунок 1,устройство #3.2). Используйте поворотный инструмент для достижения прямых краев. Он должен быть на 5 мм (0,197 '') длиннее, чем имплантат-канюля: на 2 мм (0,079 '') длиннее, чем имплантированная канюля в мозге, чтобы достичь конечной цели инъекции, и 3 мм (0,118 '') для вставки его в гибкую трубку.
      3. Шлифуют и разглаживают кончик инъекционной канюли, предотвращая дополнительное механическое трение о мозг. Вставьте проволоку диаметром 0,005'', чтобы убедиться, что она беспрепятственна.
      4. Вставьте 3 мм (0,118'') инъекционной канюли в гибкую трубку и склейте стык между ними, чтобы получить инжектор. Используйте цианоакрилатный (CA) клей и ускоритель CA.
      5. Прикрепите шприц с иглой 25 г (0,018''), заполненной стерильной водой, к инжектору и промойте его. Это гарантирует, что ориентация потока, выходят из инъекционной канюли, является прямой и легкой. Важно отметить, что если поток не прямой, используйте наконечник иглы 30 G (OD 0,01 ''), чтобы удалить любые препятствия и увеличить отверстие для инъекций, а также повторно проверить поток.
    4. Подготовка канюль-держателя
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель канюли соединен со стереотаксической рукой и удерживает канюлю имплантата во время имплантации. Канюля-держатель состоит из основания держателя канюли и свинца держателя канюли, которые склеены между собой(рисунок 1,устройство #4). Во время имплантации основание держателя канюли прикрепляется к стереотаксической руке, а свинец-держатель канюли прикрепляется к имплантату-канюле.
      1. Основание держателя канюли: Вырезанная 10 см (3,947 '') из нержавеющей стали, 22 г (OD 0,028 '', ID 0,017 '') гипотрубка(рисунок 1,устройство #4.1).
      2. Свинец-держатель канюли: Отрежьте проволоку длиной 0,013'' на 3 мм (0,118'') длиннее, чем желаемый имплантат-канюля(рисунок 1,устройство #4.2).
      3. Вставьте свинец-держатель канюли в основание держателя канюли и склейте стык между ними, используя клей CA и ускоритель CA. Свинец должен быть на 1 мм (0,039'') короче, чем имплантат-канюля, чтобы избежать повреждения тканей во время имплантации.
    5. Бикукуллинный препарат: растворить бикукуллинный метиодид в физиологическом растворе или искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) до конечной концентрации 1 мкг/мкл. Разделите растворенный бикукуллин на шприцы по 1 мл, накройте алюминиевой фольгой и заморозьте при -20 °C до необходимости. При необходимости разморозить шприц перед использованием.
  2. хирургия
    1. Индуцировать начальную анестезию, помещая крысу в спроектированную камеру и доставляя 4-5% изофлурана, смешанного с кислородом со скоростью 0,5-1 л/мин. Затем вводят крысе внутримышечно (в/м или ип) смесь кетамина и ксилазина (100 и 10 мг/кг соответственно).
    2. Побрить голову крысы с помощью электрического клипера.
    3. Поместите лидокаиновый гель в уши крысы. Налейте вазелин на глаза крысы, чтобы предотвратить высыхание и травму роговицы.
    4. Закрепите крысу в стереотаксической рамке с помощью ушных перекладин и зубного бруса.
    5. Смавите кожу головы крысы повидон-йодом, а затем спиртом протрите, чтобы стерилизовать область. Инфильтрируют вдоль нужной линии разреза 0,5 - 1 % раствором лидокаина подкожно (СК). Используя лезвие скальпеля, сделайте разрез вдоль волосистой части головы.
    6. Потяните фасцию к краям, чтобы открыть хирургическую область.
    7. Очистите череп стерильным физиологическим раствором, используя ватные тампоны. В случае кровотечения используйте прижижитель для прижигиния кровеносного капилляра. Этот шаг имеет решающее значение для стабильности крышки с течением времени.
    8. Зажмите фасцию четырьмя изогнутыми гемостатами (два передних, два задних) для увеличения места операции.
    9. Измерьте брегмовые и лямбда-координаты. Выровнять дорсовентральные (DV) координаты двух точек, чтобы они были в диапазоне 100 мкм.
    10. С помощью стереотаксического аппарата измерьте и отметьте координаты интересующих областей и анкерных винтов, которые будут имплантированы. Координаты прямоимплантационной канюли для индукции тиков в области передних конечности: AP: от +1 до +1,5, мл: ±2,5, DV: 3; площадь задних налимов: AP: от -0,4 до -0,5, мл: ±3,5, DV: 318,20.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае имплантации нескольких устройств, препятствующих имплантации канюли прямой, измените угол имплантации канюли и ее координаты соответственно (координаты передней конечности: AP: +2.7, mL: ±2.5, DV: 3, угол 15° от передней к задней).
    11. Просверлите отверстия в черепе под микроскопом. Используйте бормашину с круглыми бурами из карбида размером 1/4-1/2 бита. Чтобы свести к минимуму риск черепно-мозговой травмы, отрегулируйте скорость бурения в соответствии с навыками бурения и избегайте любого механического давления. Просверлите до тех пор, пока мозг не будет виден, примерно на 1 мм. Впитайте любую кровь ватным тампоном и смойте стерильным физиологическим раствором.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анкерные винты служат для стабилизации колпачка. Убедитесь, что винты расположены в обоих полушариях и вдоль передне-задней оси.
    12. Имплантация канюли
      1. Вкрутите анкерные винты в отверстия. Используйте винты из нержавеющей стали #0 x 1/8.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Количество анкерных винтов зависит от общего количества имплантируемых устройств. Заземляющими винтами (например, для электрических записей или электрических стимуляций) должны достигать поверхности мозга.
      2. Прикрепите канюлю-держатель к стереотаксической руке.
      3. Сдвиньте имплантат-канюлю на канюлю-держатель. Медленно расположите имплантат-канюлю над отверстием, пока он не достигнет мозга.
      4. Измерьте координаты DV, начиная с поверхности мозга. Опунььте имплантат-канюлю до мишени имплантации. Впитайте любую кровь, вытекавшую из отверстия, ватным тампоном, промойте стерильным физиологическим раствором, а затем тщательно высушите.
      5. Приклейте имплантированную канюлю к черепу с помощью гелевого клея. Подождите, пока высохнет.
      6. Нанесите зубной цемент вдоль имплантированной канюли, чтобы прикрепить ее к черепу. Оставьте 2 мм (0,079 '') от верхнего конца, чтобы включить фиктивный манекен. Подождите, пока высохнет.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не кладите цемент на держатель канюли.
      7. Поднимите канюлю-держатель, оставив имплантированную канюлю на месте.
      8. Вставьте манекен в имплантированную канюлю.
      9. Имплантировать все другие устройства, такие как записывающие решетки, оптические волокна, стимулирующие электроды и т. Д. Нанесите зубной цемент на остальную часть черепа, покрывая все имплантаты.
      10. Вводят 3 мл раствора Рингера комнатной температуры и карпрофена 5 мг/кг SC21.
      11. Следите за крысой до тех пор, пока она не придет в сознание (животное находится в вертикальном положении, контролирует свои дыхательные пути и не рискует аспираться). Верните крысу в ее домашнюю клетку для полного выздоровления.
  3. Микроинъекции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инъекции крайне важно убедиться, что поток бикукулина неповрежден. Это можно сделать, позволив небольшому воздушному пузырьку образоваться в инжекторе и контролируя его движение. Оставшийся объем инжектора может быть заполнен физиологическим раствором, так что ни один бикукультин не будет потрачен впустую.
    1. Прикрепите инжектор к бикукуллинному шприцу с помощью иглы 25 г (OD 0,018''). Заполните ~1/3-1/2 инжектора и извлеките шприц, позволив сформировать небольшой воздушный пузырь.
    2. Прикрепите инжектор к стерильному шприцу, заполненному физиологическим раствором, с помощью иглы 25 г (OD 0,018''). Заполняйте инжектор до тех пор, пока бикукуллин не достигнет конца и из него не выйдет небольшая капля.
    3. Снимите поршень с прецизионного стеклянного микроприца емкостью 10 мкл.
    4. Вырежьте и прикрепите короткую гибкую полимерную трубку (~3 см, 1,181 '') к прецизионному стеклянному микроприцу.
    5. Подключите другой конец короткой гибкой трубки к шприцу 1 мл, игле 25 г (OD 0,018''), заполненной стерильной водой.
    6. Впрыскивайте воду через короткую гибкую трубку в прецизионный стеклянный микросприц, пока из него не выйдет вода. Отсоедините короткогибкую трубку.
    7. Снова вставьте плунжер до тех пор, пока он не достигнет отметки ~7 мкл на прецизионном стеклянном микрошприце.
    8. Вставьте прецизионный стеклянный микрошприц в предназначенную щель в инфузионном насосе.
    9. Прикрепите инжектор к прецизионному стеклянному микропрюску и настройте параметры со скоростью 0,35 мкл/мин и общим объемом 0,35 мкл.
    10. Под кончик инжектора положите бумажную салфетку. Отметьте расположение пузырьков воздуха на инжекторе, запустите инфузионный насос и убедитесь, что появляется бикукуллинное падение. После инъекции снова отметьте расположение пузырька воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разница между двумя метками соответствует желаемой разнице во время экспериментальной инъекции.
    11. Поместите крысу в экспериментальную клетку и извлеките манекен.
    12. Вставьте инжектор в имплантированную канюлю через конец (см. Рисунок 3А).
    13. Запустите инфузионную насосную машину. Убедитесь, что пузырь воздуха движется. Запустите секундомер, чтобы отслеживать время инициации и окончания tic.
    14. Через минуту после инъекции извлеките инжектор и медленно вставьте манекен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Введение манекекена после инъекции выталкивает бикукульт в мишень для инъекции.
  4. После инъекции
    1. Отсоедините инжектор от прецизионного стеклянного микроприце.
    2. Вымойте оставшийся раствор из инжектора, используя наполненный воздухом шприц. Очистите инжектор стерильной водой, а затем слейте его, впрыскивая воздух через инжектор.
    3. Отсоедините прецизионный стеклянный микрошприц от инфузионного насоса и очистите его стерильной водой.

2. Хроническая модель

  1. Предоперационная подготовка
    1. Подготовка канюли-гида
      ПРИМЕЧАНИЕ: Канюля-направляющая является частью инфузионной трубки и используется для прикрепления инфузии-канюли к канюле-держателю во время имплантации.
      1. Вырежьте 12 мм (0,472'') из нержавеющей стали, 25 г (OD 0,02'', ID 0,015'') гипотрубки для получения канюли-направляющей(рисунок 2,устройство #1). Используйте поворотный инструмент для достижения прямых краев.
      2. Подготовьте держатель канюли, как описано на этапе 1.1.4. Вставьте держатель канюли в направляющую канюли, чтобы убедиться, что она правильно прикреплена, и извлеките ее.
    2. Настой-канюльный препарат
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инфузионно-канюля также является частью инфузионной трубки. Он имплантируется в конечную мишень полосатого тела и позволяет проводить очаговую инфузию бикукульлина.
      1. Режут нержавеющая сталь, 30 г (OD 0.012'', ID 0.007'') гипо-трубки для получения инфузии-канюли. Используйте поворотный инструмент для достижения прямых краев. Общая длина инфузии-канюли представляет собой сумму желаемой глубины имплантации плюс коэффициент безопасности (~1-2 мм, 0,039''-0,079''), изогнутой части инфузии-канюли (2 мм, 0,079''), перекрытия с канюль-направляющей (3 мм, 0,118'') и горизонтальной части (4 мм, 0,157'')(рисунок 2,устройство #2).
        ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от острой модели, глубина имплантации равна конечной цели инфузии.
      2. Вставьте проволоку диаметром 0,005 '' в инфузионную канюлю и согните ее в L-образную форму в предполагаемом месте. Вертикальная часть соответствует желаемой глубине имплантации плюс 4-5 мм (0,157''-0,197''), а горизонтальная часть составляет 4 мм (0,157'') в длину.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Вставка внутренней проволоки предотвращает обструкцию канюли во время изгиба.
    3. Гибкая катетер-трубка
      ПРИМЕЧАНИЕ: Он также является компонентом инфузионной трубки. Он соединяет инфузионную канюлю с мини-осмотическим насосом через трубку-адаптер.
      1. Отрезанный 8 см (3,149'') трубы из полиэтилена (ПЭ)-10 (ID 0.011'', OD 0.025'')(Рисунок 2,устройство #3).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Длина катетера определяется расстоянием между мишенью имплантации и расположением насоса, что позволяет свободно поменять голову и шею крысы (см. Рисунок 3B).
    4. Сборка инфузионной трубки
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инфузионный пробирок проводит бикукультную линию от мини-осмотического насоса к мозгу. Он состоит из канюли-направляющей, инфузионной канюли, гибкого катетера-трубки, трубки-адаптера и протока-замедлителя(рисунок 2).
      1. Снимите внутреннюю проволоку с настоя-канюли. Осмотрите канюлю под микроскопом, чтобы убедиться, что ее края открыты и чисты с обеих сторон; если нет, используйте иглу 30 G (OD 0,01''), чтобы открыть ее.
      2. Приклейте канюлю-направляющую к вертикальному сечению инфузии-канюли, рядом с изогнутой частью, на перекрытие 3 мм (0,118''), используя клей CA и ускоритель CA.
      3. Вставьте горизонтальную часть инфузии-канюли в гибкую катетерную трубку. Перекрытие должно быть не менее 2 мм (0,079'').
      4. Вытолквите полупрозрачную крышку насоса-замедлителя потока. Это позволит выявить короткую трубку из нержавеющей стали(рисунок 2,устройство #5.1).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Замедлитель потока является частью комплекта мини-осмотического насоса. Он состоит из полупрозрачной шляпки, короткой части канюли, белого фланца и длинной канюли-части. Длинная канюля-часть вставляется в мини-осмотический насос, а короткая канюля-часть подключается к катетеру-трубке через трубку-трубку.
      5. Погружают трубку-переходник(фиг.2,устройство #4) в 70% спирт. Подождите несколько минут, чтобы материал набух.
      6. Прикрепите трубку-переходник к короткой канюле-части протока-замедлителя, пока она не коснется белого фланца(фиг.2,устройство #5.2). Трубка-адаптер будет сжиматься в воздухе, образуя плотное герметичное соединение.
      7. Вставьте гибкий катетер-трубку в открытый конец трубки-адаптера, пока он не коснется короткой канюли-части протока-замедлителя.
      8. Задержите длинную канюлю-деталь(рисунок 2,устройство #5.3) с помощью зажимной подставки и склейте все соединения. Соединения находятся между трубкой-адаптером и белым фланцем, трубкой-адаптером и гибкой катетер-трубкой и, наконец, гибкой катетер-трубкой и горизонтальной частью инфузионной канюли. Подождите несколько часов, пока клей полностью высохнет (в зависимости от типа клея).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте PE-совместимый клей, чтобы предотвратить ослабление соединений.
      9. Вводят стерильную воду через длинную канюлю-часть инфузионной трубки, используя шприц с тупой иглой 27 г (0,014''). Убедитесь, что вода плавно течет через настой-канюлю. Впрыскивайте воздух через инфузионную трубку, чтобы слить воду.
    5. Грунтовка мини-осмотического насоса
      ПРИМЕЧАНИЕ: Грунтовка - это процедура запуска, которая позволяет насосу начать инфузию сразу после имплантации.
      1. Наполните нагревательную ванну водой при температуре тела (~37 °C). Наполните небольшой ковш стерильным физиологическим раствором и поместите его в нагревательную ванну.
      2. Оберните мини-осмотический насос бумажной салфеткой и зафиксируйте его вертикально отверстием, обращенным вверх, используя подставку для держателя зажима.
      3. Заполните насос ACSF с помощью шприца тупой иглой 27 Г (0,014''). При извлечении шприца продолжайте вводить ACSF, чтобы предотвратить попадание воздуха. Пузырь ACSF появится в отверстии насоса.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальная инфузия ACSF позволяет крысе полностью восстановиться после операции до того, как будут вызваны тики. Опционально, насос, заполненный бикукуллином, может быть имплантирован во время первичной операции, чтобы избежать следующей замены насоса, но он не является оптимальным19.
      4. Прикрепите шприц тупой иглы 27 г (0,014'') к длинной канюль-части инфузионной трубки и ввести через нее ACSF. При извлечении шприца продолжайте вводить ACSF, чтобы предотвратить попадание воздуха. Пузырь ACSF появится в длинной части канюли.
      5. Вставьте длинную часть канюли в насос, от пузырька к пузырьку. Пузырь ОКСФ должен появиться на кончике инфузии-канюли.
      6. Поместите насос в замок. Прайм-насос, прикрепленный к инфузионной трубке, в течение не менее 4-6 часов (при ~37 °C) до имплантации насоса. Убедитесь, что только насос контактирует с физиологическим раствором.
    6. Операция по имплантации насоса
      1. Обезболить крысу в соответствии с протоколом анестезии. См. шаг 1.2.1.
      2. Побрить голову и спину крысы, используя электрический клипер, слегка задний к лопаткам.
      3. Выполните основные этапы операции, как описано в шагах 1.2.3-1.2.11. Разрез должен быть вдоль волосистой части головы вплоть до затылочной кости.
      4. Стерилизуйте большой гемостат (~14 см длиной, 5,512'') в автоклаве. Вставьте гемостат через разрез и создайте подкожный карман в спине крысы, поочередно открывая и закрывая его под кожей через среднюю лопаточную линию.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Карман должен быть достаточно большим, чтобы вместить насос и позволить ему немного двигаться.
    7. Имплантация мини-осмотического насоса и инфузионной трубки
      1. Прикрепите канюлю-держатель к стереотаксической руке и поместите ее в нужное положение для имплантации.
      2. Снимите насос из нагревательной ванны и поместите его на спину крысы, покрытую бумажной салфеткой.
      3. Сдвиньте канюлю-направляющую инфузионной трубки на канюлю-держатель.
      4. Подержите насос гемостатом и аккуратно вставьте его в подкожный карман.
      5. Имплантация анкерных винтов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Имплантируйте анкерные винты после вставки насоса, чтобы избежать закупорки карманного отверстия, и перед имплантацией канюли, чтобы избежать смещения канюли.
      6. Имплантировать настой-канюлю в мишень и приклеить его к черепу с помощью гелевого клея. Подождите, пока высохнет. Координаты индукции передних конечнок: AP: от +1 до +1.5, mL: ±2.5, DV: 5.
      7. Нанесите зубной цемент вдоль настоя-канюли, чтобы закрепить его на черепе. Подождите, пока высохнет.
      8. Поднимите канюлю-держатель, оставив имплантированную канюлю на месте.
      9. Имплантация всех остальных устройств. Нанесите зубной цемент на остальную часть черепа, покрывая все имплантаты. Оставьте достаточно гибких катетер-трубк в подкожном кармане непокрепленными, чтобы обеспечить свободное передвижение крысы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что между черепом и карманным отверстием нет открытых областей, и что катетер не согнут.
      10. Завершите операцию, как описано в шагах 1.2.12.10-1.2.12.11.
  2. Операция по замене насоса
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый мини-осмотический тип насоса имеет свой собственный заранее заданный период инфузии. Следовательно, операция по замене насоса должна быть выполнена до истечения срока годности.
    1. Предоперационная подготовка
      1. Повторите шаги 2.1.5.1-2.1.5.2.
      2. Наполните насос бикукуллином с помощью шприца тупой иглой 27 г (0,014''). При извлечении шприца продолжайте вводить бикукультин, чтобы предотвратить попадание воздуха.
      3. Вставьте замедлитель потока (прикрепленный к его полупрозрачному колпачку) внутрь насоса.
      4. Поместите насос в замок. Загрунтуй насос не менее чем на 4-6 часов (при ~37 °C) перед заменой насоса.
    2. хирургия
      1. Обезболить крысу (см. шаг 1.2.1.1) и побрить ее спину с помощью электрического клипса.
      2. Смавите спину крысы повидон-йодом, а затем спиртовой салфеткой, чтобы стерилизовать область. Инфильтрируют вдоль нужной линии разреза 0,5-1% раствором лидокаина (СК).
      3. Сделайте разрез на коже над имплантированной помпой. Вымойте карман с acSF комнатной температуры и высушите марлевыми прокладками. Используйте автоклавные одноразовые шторы, чтобы покрыть область возле разреза.
      4. Отсоедьте насос, заполненный ACSF, от замедлителя потока с помощью гемостата и выбросьте.
      5. Снимите насос, заполненный бикукуллином, из нагревательной ванны. Отсоедьте и отбросьте замедлитель потока от насоса, заполненного бикукультами.
      6. Аккуратно прикрепите насос, заполненный бикукуллинами, к имплантированному замедлительному потоку. Избегайте прикосновения к окружающей коже.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 2.2.2.4-2.2.2.6 должны выполняться быстро, с тем чтобы предотвратить появление пузырьков воздуха. Тем не менее, насос должен быть вставлен медленно, чтобы предотвратить быстрое проникновение бикукуллина в мозг.
      7. Прижмите два края разреза близко друг к другу, используя щипцы. Склеиваем линию разреза тканевым клеем. В качестве альтернативы закройте разрез с помощью швов.
      8. Смавите область повидон-йодом и завершите операцию, как описано в шагах 1.2.12.10-1.2.12.11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Протоколы генерации острой и хронической моделей индукции тиков у крыс были представлены выше. Протоколы охватывают полную подготовку к операции и экспериментам(Рисунок 1 для острой модели, Рисунок 2 для хронической модели). Применение бикукулина в двигательных областях полосатого тела приводит к выражению продолжающихся двигательных тиков. Тики появляются на контралатеральной стороне к применению и характеризуются короткими и повторяющимися мышечными сокращениями. После бикукуллинного применения в передние отделы полосатого тела тики обычно экспрессируются в передней конечности, голове и/или челюсти крысы, тогда как после задних инъекций тики экспрессируются в задней конечности18. В острой модели(рисунок 3А)тики начинают появляться через несколько минут после бикукюльной микроинъекции, длятся десятки минут и в конечном итоге распадаются и прекращаютсячерез 18. В хронической модели(рисунок 3B)тики обычно начинают появляться в первый день после имплантации бикукуллинно-заполненного насоса19. Тики колеблются в течение дня и наиболее отчетливо наблюдаются во время состояния спокойного бодрствования19. Тиковая экспрессия продолжается в течение нескольких дней и до нескольких недель, в зависимости от типа мини-осмотического насоса.

Tic экспрессия может контролироваться и количественно определяться одновременными записями видео, кинематических датчиков и нейронной активности15,19,22. Двигательные тики имеют стереотипную кинематическую сигнатуру, которая может быть обнаружена в сигналах акселерометра и гироскопа(рисунок 4),что позволяет измерять их частоту и интенсивность. Tic timing также может быть оценен с использованием сигнала локального потенциала поля (LFP) по всему пути CBG из-за появления переходных пиков LFP большой амплитуды15 (рисунок 4). Представленные здесь результаты и дополнительные реализации острой и хронической моделей подробно описаны в наших предыдущих работах15,18,19,22,23. Модель стриатальной растормаживания как у грызунов, так и у нечеловеческих приматов воспроизведала ключевые свойства тиковой экспрессии при синдроме Туретта и других тиковых расстройствах, касающихся какмоторных 15,18, так и голосовых24 тиков и их экспрессии после различных поведенческих, экологических и фармакологических вмешательств22,25,26. Однако имеющиеся находки формируют лишь верхушку айсберга комплексного проявления тиковых расстройств.  Мы считаем, что модель позволит изучить широкий спектр таких факторов, начиная от эффектов окружающей среды, таких как сенсорный ввод, поведенческих эффектов, таких как одновременная эффективность действий, и клинических эффектов, таких как реакция на различные методы лечения.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое представление заказных устройств, используемых в острой модели. (1) Имплантат-канюля, который хронически имплантируется в полосатое тело. (2) Манекен, съемный внутренний провод, используется для герметизации имплантированной канюли. (3) Инжектор, состоящий из (3.1) гибкой трубки и (3.2) инъекционной канюли, используется для острой доставки бикукульлина в полосатое тело. (4) Канюля-держатель, состоящий из (4.1) основания и (4.2) свинца, используется для удержания имплантата-канюли во время имплантации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Схематическое изображение изготовленных на заказ устройств и мини-осмотического насоса, используемого в хронической модели. (1) Канюля-направляющая используется для удержания инфузии-канюли во время имплантации. (2) Инфузия-канюля хронически имплантируется в полосатое тело. (3) Гибкая катетерная трубка соединяет инфузионную канюлю с мини-осмотическим насосом. (4) Трубка-адаптер соединяет гибкую катетерную трубку с замедлителем потока. (5) Поток-замедлитель состоит из (5.1) короткой части канюли, (5.2) белого фланца и (5.3) длинной части канюли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Схематическое представление экспериментальных установок. В острой модели тики индуцируются после бикукульной инъекции с использованием насосно-инфузионного аппарата(А). В хронической модели продолжающиеся тики достигаются путем длительной инфузии бикукульлина с помощью имплантации мини-осмотического насоса(В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Пример синхронизированных сигналов из кинематических и нейрофизиологических записей. Акселерометр, гироскоп и соответствующий LFP из первичной моторной коры во время тиковой экспрессии. Пунктирная серая линия: время начала тика, определяемого сигналом LFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой рукописи мы подробно описали протоколы острой и хронической моделей для индукции тиков у свободно ведящей себя крысы. Эти протоколы описывают подготовку всех компонентов, операцию и экспериментальный процесс, которые могут быть адаптированы для настройки в соответствии с конкретными потребностями исследований. Основным принципом, лежащим в основе этих моделей, является прямое локальное применение бикукуллина к двигательным областям полосатого тела, которое, как известно, играет ключевую роль в патофизиологии тиковых расстройств10,11,12. В обеих моделях бикукультайн доставляется к цели через изготовленные на заказ имплантированные канюли. Конкретная мишень имплантации канюли зависит от желаемого местоположения тела тиковой экспрессии. Полосатое тело соматотопически организовано27,28,29,30. Применение бикукуллина к его передним частям приводит к выражению тиков в передней конечности, челюсти и голове, тогда как его применение к задним частям приводит к тикам задних конечности18. Более того, применение к вентральному стриатуму (прилежащее ядро – NAc) приводит к гиперактивности31. Модели позволяют имплантировать канюли в оба полушария и в обе стриатальные мишени для одновременной инъекции для получения двусторонних симптомов. Этот метод применим не только к моделям экспрессии тиков, но и действителен в других моделях нейробиологии, которые требуют инъекции нейроактивных соединений.

В острой модели мы предлагаем имплантировать канюлю на 2 мм (0,079 '') выше мишени инъекции, чтобы предотвратить повреждение тканей в целевой области. Чтобы свести к минимуму последующее повреждение инъекционной канюли, мы используем тонкую трубку 30 G для достижения конечной цели. Отметим, что множественные инъекции в одну и ту же мишень в конечном итоге приведут к некрозу тканей от механического воздействия, что приведет к снижению экспрессии тиков. Одним из возможных решений является введение инжектора в более глубокие мишени во время последующих инъекций, если они остаются локализованными в двигательных областях полосатого тела. Этот некроз тканей не происходит в хронической модели, так как бикукуллинная инфузия продолжается через статическую непосредственно имплантированную инфузию-канюлю в стриатальную мишень. Чтобы свести к минимуму потенциальное повреждение тканей от хронической имплантации канюли, мы также использовали трубку 30 Г. Однако, чтобы подключить инфузионную канюлю к замедлительному потоку через гибкую катетерную трубку, нам нужно было использовать трубку-адаптер, создавая потенциальную точку отказа в процессе. Более толстая гибкая катетерная трубка может быть использована для установки замедлителя потока, что приводит к разумной стоимости большего повреждения тканей от более крупной инфузии-канюли.

Текущие исследования за последние 10 лет позволили нам определить конкретные концентрации и скорость доставки бикукуллинов15,18,22,23,чтопривелок воспроизводимому поведенческому феномену наблюдаемой тиковой экспрессии. Отклонение от этих значений в сторону более высоких объемов, концентраций или скорости инъекций может вызвать эпизодические припадки15,18,32 и односторонние вращения крыс. Более низкие концентрации приводят к более тонким, менее обнаруживаемым тикам, выраженным в течение более коротких периодов времени. В хронической модели не наблюдалось приступов на протяжении всего периода; однако обширная тик-экспрессия и склонность к односторонним вращениям наблюдались в первый день после имплантации бикукуллинно заполненного насоса, которая стабилизировалась в течение второго дня. Это, в сочетании с восстановлением после операции на головном мозге, влияет на уровень комфорта и благополучие животного. Чтобы диссоциировать восстановительный период от тиковой экспрессии, мы предлагаем имплантировать насос, заполненный ACSF, сначала19. Этот период инфузии ACSF также может быть использован для проведения контрольных экспериментов перед тиковой индукции. Контрольные экспериментальные сеансы могут также проводиться в острой модели, с использованием инъекций ОКСФ18,33.

Как острая, так и хроническая модели могут быть использованы для изучения кинематических характеристик и нейронных коррелятов тик-экспрессии. Тики могут быть идентифицированы с помощью покадрового автономного анализа видео, который, однако, занимает много времени и менее точен. Более чувствительные методы оценки включают электромиографию (ЭМГ) и кинематические датчики (акселерометр и гироскопы)(рисунок 4). Для этого кинематические устройства необходимо располагать вблизи места тик-экспрессии на теле для точной оценки движения. Нейронные корреляты тиковой экспрессии могут быть захвачены нейрофизиологическими записями по всему пути CBG(рисунок 4). При рассмотрении имплантации дополнительных записывающих устройств их расположение как внутри, так и снаружи мозга должно быть тщательно спланировано, чтобы предотвратить вмешательство в инъекцию.

Характер экспериментального запроса должен диктовать выбор модели тикового выражения. Острая модель проста и легко реализуется. Множественные переходные инъекции могут проводиться в течение относительно длительного периода времени, могут выполняться одновременно в нескольких областях мозга и позволяют сочетать контрольные и экспериментальные сеансы. Хроническая модель более сложна и требует ежедневного мониторинга самочувствия крысы. Тем не менее, постоянное и длительное бикукуллинное применение дает возможность обратиться к динамике тик-экспрессии и ее модуляции с течением времени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было частично поддержано грантом Израильского научного фонда (ISF) (297/18). Авторы благодарят М. Бронфельда за создание модели острых грызунов и М. Исраэлашвили за ее комментарии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anchor screws Micro Fasteners SMPPS0002 #0 x 1/8 - Pan Head Sheet Metal Screws
Bicuculline methiodide Sigma Aldrich 14343
Cyanoacrylate (CA) accelerator Zap PT29
Cyanoacrylate (CA) glue BSI IC-2000 This glue was found to be stronger than others
Dental cement Coltene H00322 Hygenic Perm Repair Material Reline Resin Self Cure
Glue gel Loctite Ultra Gel Control
Hemostat WPI 501242 Any hemostat sized approximately 14 cm would be sufficient
Hypo-tube, extra-thin wall 25G Component supply company HTX-25X
Hypo-tube, regular wall 22G Component supply company HTX-22R
Hypo-tube, regular wall 30G Component supply company HTX-30R
Infusion pump machine New Era Pump Systems NE-1000
Mini-osmotic pump ALZET 2001 1.0µl per hour, 7 days
PE compatible adhesive CEYS Special difficult plastics (suitable for PE)
PE-10 Catheter Tubing ALZET PE-10 ID = 0.28mm, OD = 0.61mm
Precision glass microsyringe, 10µl Hamilton 80065 1701 RNR 10µl syr (22s/51/3)
Tissue adhesive 3M 1469Sb Vetbond
Tubing-adapter CMA 3409500
Tygon micro bore tubing, 0.02 inch ID * 0.06 OD Component supply company TND80-020
Wire 0.005-inch Component supply company GWX-0050
Wire 0.013-inch Component supply company GWX-0130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Psychiatric Association. DSM-5. American Psychiatric Association. , (2013).
  2. Peterson, B. S., Leckman, J. F. The temporal dynamics of tics in Gilles de la Tourette syndrome. Biol.Psychiatry. 44, 1337-1348 (1998).
  3. Ganos, C., et al. The somatotopy of tic inhibition: where and how much. Movement Disorders. , (2015).
  4. Barnea, M., et al. Subjective versus objective measures of tic severity in Tourette syndrome - The influence of environment. Psychiatry Research. 242, 204-209 (2016).
  5. Silva, R. R., Munoz, D. M., Barickman, J., Friedhoff, A. J. Environmental Factors and Related Fluctuation of Symptoms in Children and Adolescents with Tourette's Disorder. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 36 (2), 305-312 (1995).
  6. Rothenberger, A., et al. Sleep and Tourette syndrome. Advances in Neurology. 85, 245-259 (2001).
  7. Conelea, C. a, Woods, D. W., Brandt, B. C. The impact of a stress induction task on tic frequencies in youth with Tourette Syndrome. Behaviour Research and Therapy. 49 (8), 492-497 (2011).
  8. Ganos, C., Rothwell, J., Haggard, P. Voluntary inhibitory motor control over involuntary tic movements. Movement Disorders. 33 (6), 937-946 (2018).
  9. Yael, D., Vinner, E., Bar-Gad, I. Pathophysiology of tic disorders. Movement Disorders. 30 (9), 1171-1178 (2015).
  10. Kurvits, L., Martino, D., Ganos, C., Eddy, C. M. Clinical Features That Evoke the Concept of Disinhibition in Tourette Syndrome. Frontiers in Psychiatry. 11, 1-10 (2020).
  11. Mink, J. W. Basal ganglia dysfunction in Tourette's syndrome: a new hypothesis. Pediatric Neurology. 25, 190-198 (2001).
  12. Bronfeld, M., Bar-Gad, I. Tic disorders: what happens in the basal ganglia. The Neuroscientist. 19 (1), 101-108 (2013).
  13. Tarsy, D., Pycock, C. J., Meldrum, B. S., Marsden, C. D. Focal contralateral myoclonus produced by inhibition of GABA action in the caudate nucleus of rats. Brain. 101 (1), 143-162 (1978).
  14. Crossman, A. R., Mitchell, I. J., Sambrook, M. A., Jackson, A. Chorea and Myoclonus in the Monkey Induced By Gamma-Aminobutyric Acid Antagonism in the Lentiform Complex. Brain. 111 (5), 1211-1233 (1988).
  15. McCairn, K. W., Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. The neurophysiological correlates of motor tics following focal striatal disinhibition. Brain. 132 (8), 2125-2138 (2009).
  16. Worbe, Y., et al. Behavioral and movement disorders induced by local inhibitory dysfunction in primate striatum. Cerebral Cortex. 19 (8), 1844-1856 (2009).
  17. Pogorelov, V., Xu, M., Smith, H. R., Buchanan, G. F., Pittenger, C. Corticostriatal interactions in the generation of tic-like behaviors after local striatal disinhibition. Experimental Neurology. 265, 122-128 (2015).
  18. Bronfeld, M., Yael, D., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Motor tics evoked by striatal disinhibition in the rat. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 50 (2013).
  19. Vinner, E., Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Prolonged striatal disinhibition as a chronic animal model of tic disorders. Journal of Neuroscience Methods. 292, 20-29 (2017).
  20. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6, (2007).
  21. Flecknell, P. Analgesia and Post-Operative Care. Laboratory Animal Anaesthesia. , (2016).
  22. Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Corticostriatal divergent function in determining the temporal and spatial properties of motor tics. Journal of Neuroscience. 35 (50), 16340-16351 (2015).
  23. Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Spatial and temporal properties of tic-related neuronal activity in the cortico-basal ganglia loop. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8713-8721 (2011).
  24. McCairn, K. W., et al. A Primary Role for Nucleus Accumbens and Related Limbic Network in Vocal Tics. Neuron. 89 (2), 300-307 (2016).
  25. Rizzo, F., et al. Aripiprazole Selectively Reduces Motor Tics in a Young Animal Model for Tourette's Syndrome and Comorbid Attention Deficit and Hyperactivity Disorder. Frontiers in Neurology. 9, 1-11 (2018).
  26. Vinner, E., Matzner, A., Belelovsky, K., Bar-gad, I. Dissociation of tic expression from its neuronal encoding in the striatum during sleep. bioRxiv. , (2020).
  27. Webster, K. E. Cortico-striate interrelations in the albino rat. Journal of Anatomy. 95, Pt 4 532-544 (1961).
  28. Ebrahimi, A., Pochet, R., Roger, M. Topographical organization of the projections from physiologically identified areas of the motor cortex to the striatum in the rat. Neuroscience Research. 14, 39-60 (1992).
  29. Brown, L. L., Sharp, F. R. Metabolic mapping of rat striatum: somatotopic organization of sensorimotor activity. Brain Research. 686, 207-222 (1995).
  30. Brown, L. L., Smith, D. M., Goldbloom, L. M. Organizing principles of cortical integration in the rat neostriatum: Corticostriate map of the body surface is an ordered lattice of curved laminae and radial points. Journal of Comparative Neurology. 392 (4), 468-488 (1998).
  31. Yael, D., Tahary, O., Gurovich, B., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Disinhibition of the nucleus accumbens leads to macro-scale hyperactivity consisting of micro-scale behavioral segments encoded by striatal activity. The Journal of Neuroscience. , 3120 (2019).
  32. Obeso, J. A., Rothwell, J. C., Marsden, C. D. The spectrum of cortical myoclonus. From focal reflex jerks to spontaneous motor epilepsy. Brain. 108, 124-193 (1985).
  33. Bronfeld, M., et al. Bicuculline-induced chorea manifests in focal rather than globalized abnormalities in the activation of the external and internal globus pallidus. Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3261-3275 (2010).

Tags

Поведение Выпуск 171 Тиковая индукция двигательные тики животные модели осмотический насос базальные ганглии полосатое тело бикукультин антагонисты ГАМК хроническая модель острая модель синдром Туретта
Создание острых и хронических экспериментальных моделей моторной тиковой экспрессии у крыс
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vinner, E., Belelovsky, K., Bar-Gad, … More

Vinner, E., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Generating Acute and Chronic Experimental Models of Motor Tic Expression in Rats. J. Vis. Exp. (171), e61743, doi:10.3791/61743 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter