Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Generering af akutte og kroniske eksperimentelle modeller af motorisk tic expression hos rotter

Published: May 27, 2021 doi: 10.3791/61743
Automatic Translation
*1, *1, 1
1The Leslie & Susan Goldschmied (Gonda) Multidisciplinary Brain Research Center, Bar-Ilan University
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer protokoller til generering af akutte og kroniske eksperimentelle modeller af tic udtryk i frit at opføre rotter. Modellerne er baseret på striatal kanyle implantation og efterfølgende GABAA antagonist ansøgning. Den akutte model bruger forbigående injektioner, mens den kroniske model udnytter langvarige infusioner via en subkutan implanteret mini-osmotisk pumpe.

Abstract

Motoriske tics er pludselige, hurtige, tilbagevendende bevægelser, der er de vigtigste symptomer på Tourettes syndrom og andre tic lidelser. Patofysiologien af tic generation er forbundet med unormal hæmning af basal ganglier, især dens primære inputstruktur, striatum. I dyremodeller af både gnavere og ikke-menneskelige primater fremkalder lokal anvendelse af GABA A-antagonister, såsom bikukullin og picrotoxin, i striatummotordelene lokal disinhibition, hvilket resulterer i ekspression af motorik.

Her præsenterer vi akutte og kroniske modeller af motorik hos rotter. I den akutte model fremkalder bikukuliske mikroinjections gennem en kanyle implanteret i dorsal striatum udtrykket af tics, der varer i korte perioder på op til en time. Den kroniske model er et alternativ, der gør det muligt at udvide tic udtryk til perioder på flere dage eller endda uger, udnytte kontinuerlig infusion af bicuculline via en sub-kutan mini-osmotisk pumpe.

Modellerne gør det muligt at studere de adfærdsmæssige og neurale mekanismer i tic generation i hele cortico-basal ganglier vej. Modellerne understøtter implantation af yderligere registrerings- og stimuleringsanordninger ud over injektionskanylerne, hvilket giver mulighed for en bred vifte af anvendelser såsom elektrisk og optisk stimulation og elektrofysiologiske optagelser. Hver metode har forskellige fordele og mangler: den akutte model gør det muligt at sammenligne bevægelsens kinemiske egenskaber og de tilsvarende elektrofysiologiske ændringer før, under og efter tic udtryk og virkningerne af kortsigtede modulatorer på tic udtryk. Denne akutte model er enkel at etablere; Den er dog begrænset til en kort periode. Den kroniske model, mens mere kompleks, gør det muligt at studere tic dynamik og adfærdsmæssige virkninger på tic udtryk over længere perioder. Således driver typen af empirisk forespørgsel valget mellem disse to komplementære modeller af tic-udtryk.

Introduction

Tics er det definerende symptom på Tourettes syndrom (TS) og andre tic lidelser. Tics beskrives som pludselige, hurtige, tilbagevendende bevægelser (motoriske tics), eller vokaliseringer (vokal tics)1. Tic udtryk typisk svinger i sin tidsmæssige (frekvens)2 og rumlige (intensitet, kropsplacering)3 egenskaber over flere tidsskalaer (timer, dage, måneder og år). Disse ændringer påvirkes af forskellige faktorer, såsom miljømæssige funktioner4,5, adfærdsmæssigetilstande 6,7og frivillig og midlertidig undertrykkelse8.

Selv om den neuronale mekanisme, der styrer motorik, stadig ikke er fuldt forstået, har et stigende antal teoretiske og eksperimentelle undersøgelser givet nye beviser for dens art9. I øjeblikket er patofysiologi af tic generation menes at inddrage cortico-basal ganglier (CBG) loop, og specifikt er forbundet med unormal hæmning af striatum, den primære basal ganglier input kerne10,11,12. Tidligere undersøgelser af gnavere og primater har vist , at striatum kan disinhibited ved lokal anvendelse af forskellige GABAA antagonister, såsom bicuculline og picrotoxin13,14,15,16,17,18. Denne farmakologiske intervention fører til forbigående motorisk udtryk i kontralateral side til injektionen, hvilket etablerer en robust akut model af tic lidelser med ansigt og konstruere gyldighed. Den akutte model er enkel at fremkalde og gør det muligt at studere virkningerne af kortsigtet graduering såsom elektrisk og optisk stimulation samtidig med elektrofysiologiske og kinemiske optagelser før, under og efter tic udtryk. Den akutte model er dog begrænset til den korte periode efter injektionen. Baseret på den akutte model foreslog vi for nylig en kronisk model af tic generation hos rotter, der bruger en langvarig, fast infusion af bicuculline til striatum via en subkutan-implanteret mini-osmotisk pumpe19. Denne model udvider perioden for tic-udtrykket til flere dage/uger. Den konstante frigivelse af bicuculline over en længere periode giver mulighed for undersøgelse af virkningerne af en række faktorer såsom farmakologiske behandlinger og adfærdsmæssige tilstande på tic udtryk.

Her præsenterer vi protokoller til generering af de akutte og kroniske modeller af tic udtryk hos rotter. Som en funktion af det specifikke forskningsspørgsmål muliggør protokollerne finjustering af parametrene, herunder ensidig versus bilateral implantation, tics sted (i henhold til striatums somatotopiske organisation)18 og implantatkanylens vinkel (afhængigt af placeringen af yderligere implanterede enheder). Den metode, der anvendes i den kroniske model er delvist baseret på kommercielle produkter, men med kritiske justeringer, der passer til tic model. Denne artikel beskriver de justeringer, der er nødvendige for at skræddersy disse tic-modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt og overvåget af Udvalget for Institutionel Dyrepleje og -brug og overholdt National Institutes of Health Guide for care and use of Laboratory Animals og Bar-Ilan University Guidelines for the Use and Care of Laboratory Animals in Research. Denne protokol blev godkendt af Sundhedsministeriets nationale komité for forsøg med dyr.

BEMÆRK: Denne protokol udnytter kvindelige Long-Evans rotter (akutte og kroniske modeller) og kvindelige Sprague Dawley rotter (akut model) i alderen 3-10 måneder, 280-350 g. Gennemførelsen af disse modeller i andre stammer, vægte eller aldre bør testes omhyggeligt for forskellige reaktioner.

1. Akut model

  1. Forberedelse før operationen
    1. Forberedelse af implantat kanyle
      BEMÆRK: Implantat-kanylen muliggør lokale bikukulliniske injektioner i striatum.
      1. Skær en rustfri stål, 25 G (OD 0,02'', ID 0,015'') hypo-rør for at opnå en implantat-kanyle (Figur 1, enhed #1). Brug et roterende værktøj til at opnå lige kanter. Længden af kanylen afhænger af implantationsmåldybden, vinklen på kanyleimplantationen og den endelige cementerede hættehøjde. Implantationsmåldybden skal være 2 mm højere end det endelige injektionsmål for at forhindre vævsskader.
        BEMÆRK: Det højeste objekt, der implanteres, bestemmer hættehøjden.
      2. Sand og glat implantat-kanyle kanter, forhindrer yderligere mekaniker friktion til hjernen. Sæt en 30 G (0,01'') nål igennem den for at fjerne eventuelle interne forhindringer.
    2. Dummy forberedelse
      BEMÆRK: Dukken er en aftagelig indvendig ledning placeret inde i den implanterede kanyle. Dukken forsegler den implanterede kanyle og forhindrer dermed dens obstruktion.
      1. Lav en dukke ved at skære en 0,013'' ledning med et roterende værktøj. Prøvedukken skal være 3 mm længere end implantatets kanylelængde (figur 1, anordning #2).
      2. Sæt dukken ind i implantat-kanylen, indtil den når slutningen. Bøj den overskydende ledning ved at klemme den mod kanylen. Den bøjede del skal flugte med implantat-kanylen for at forhindre dukken i at falde ud af den implanterede kanyle og for at forhindre rotten i at fjerne den.
    3. Præparat af injektor
      BEMÆRK: Injektoren, der består af et fleksibelt rør og en injektionsbeholder (Figur 1, anordning #3), muliggør direkte bikuculline injektion i striatum.
      1. Et fleksibelt polymermikroborerør (OD 0,06'', ID 0,02'')(figur 1,enhed #3,1) skæres over på et fleksibelt polymermikroborerør (OD 0,06'', ID 0,02'').
        BEMÆRK: Længden af det fleksible rør defineres af afstanden mellem forsøgsburet og infusionspumpens maskinplacering. Den skal være lang nok til at muliggøre fri bevægelighed for rotter i injektionsperioden, men ikke for lang, for at undgå, at rotten bliver viklet ind i den (se figur 3A).
      2. Skær et hyporør i rustfrit stål, 30 G (OD 0,012'', ID 0,007'') for at opnå injektionsbeholder (figur 1, enhed #3.2). Brug et roterende værktøj til at opnå lige kanter. Den skal være 5 mm længere end implantatets kanyle: 2 mm længere end den implanterede kanyle i hjernen for at nå det endelige injektionsmål, og 3 mm (0,118'') for at indsætte den i det fleksible rør.
      3. Sand og glat spidsen af injektionskanylen, hvilket forhindrer yderligere mekanisk friktion til hjernen. Sæt en ledning på 0,005'' diameter for at kontrollere, at den er uhindret.
      4. Indsprøjtningsbeholderen indsættes 3 mm (0,118') i det fleksible rør, og leddet limes mellem dem for at få en injektor. Brug cyanoacrylat (CA) lim og CA accelerator.
      5. Sæt en sprøjte med 25 G nål (0,018'') fyldt med sterilt vand på injektoren og vask den igennem. Dette sikrer, at den strømningsorientering, der kommer ud af injektionsbeholderen, er lige og ubesværet. Det er afgørende, at hvis strømmen ikke er lige, skal du bruge spidsen af 30 G (OD 0,01'') nål til at fjerne eventuelle forhindringer og forstørre injektionskanylehullet og kontrollere flowet igen.
    4. Forberedelse af kanyleholder
      BEMÆRK: Kanyleholderen er tilsluttet den stereotaxiske arm og holder implantatbeholderen under implantationen. Kanyleholderen består af kanyleholderens bund og kanyleholdersledning, som limes sammen(Figur 1, anordning #4). Under implantationen er kanyleholderens base fastgjort til den stereotaxiske arm, og kanyleholderens bly er fastgjort til implantatbeholderen.
      1. Base med kanyleholder: Skær 10 cm (3,947'') af rustfrit stål, 22 G (OD 0,028'', ID 0,017'') hypo-rør (Figur 1, enhed #4.1).
      2. Bly med kanyleholder: Ledning til 0,013'' til en længde på 3 mm (0,118'') længere end den ønskede implantatbeholder (Figur 1, anordning #4.2).
      3. Sæt kanyleholderens bly i kanyleholderens bund og lim leddet mellem dem ved hjælp af CA-lim og CA-accelerator. Blyet skal være 1 mm (0,039'') kortere end implantat-kanylen for at undgå vævsskader under implantationen.
    5. Bikukullint præparat: Bicucullin methiodide opløses i fysiologisk saltvand eller kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) til en endelig koncentration på 1 μg/μL. Den opløste bicuculline opdeles i 1 mL sprøjter, dækkes med aluminiumsfolie og fryses ved -20 °C, indtil det er nødvendigt. Tø sprøjten op før brug, når det er nødvendigt.
  2. kirurgi
    1. Fremkald indledende anæstesi ved at placere rotten i et designet kammer og levere 4-5% isofluran blandet med en ilt med en hastighed på 0,5-1 L/min. Derefter injiceres rotten intramuskulær (IM eller IP) med Ketamin og Xylazine (henholdsvis 100 og 10 mg/kg).
    2. Barber rottens hoved ved hjælp af en elektrisk klipper.
    3. Sæt lidocaingel i rottens ører. Sæt vaseline på rottens øjne for at forhindre hornhindetørring og traumer.
    4. Fastgør rotten i den stereotaktiske ramme ved hjælp af ørestænger og tandstang.
    5. Svaber rottens hovedbund med povidone jod og derefter med alkohol tørre at sterilisere området. Infiltrere langs den ønskede indsnit linje med 0,5 - 1% lidocain løsning subkutan (SC). Brug en skalpelblad, lav et snit langs hovedbunden.
    6. Træk fascia mod kanterne for at åbne det kirurgiske område.
    7. Rengør kraniet med steril saltvand ved hjælp af vatpinde. I tilfælde af blødning skal du bruge en cauterizer til at ætse blodkapillæren. Dette skridt er afgørende for cap stabilitet over tid.
    8. Klem fascia med fire buede hæmostater (to forreste, to posterior) for at forstørre det kirurgiske sted.
    9. Mål koordinaterne bregma og lambda. Niveau dorsoventral (DV) koordinater af de to punkter, så de er inden for et interval på 100 μm.
    10. Ved hjælp af det stereotaxiske apparat måler og markerer koordinaterne for de interesseområder og ankerskruerne, der skal implanteres. De lige-implantation kanyle koordinater for tic induktion i forbenet området er: AP: +1 til +1,5, mL: ±2,5, DV: 3; bagben: AP: -0,4 til -0,5, mL: ±3,5, DV:318,20.
      BEMÆRK: I tilfælde af implantation af flere enheder, der forhindrer implantering af kanylen lige, skal du ændre vinklen på kanyleimplantation og dens koordinater i overensstemmelse hermed (forbenkoordinater: AP: +2,7, mL: ±2,5, DV: 3, vinkel 15° fra forreste til bageste).
    11. Bor huller i kraniet under mikroskopet. Brug en dental boremaskine med 1/4-1/2 bit størrelse hårdmetal runde bor. For at minimere risikoen for hjerneskade skal du justere borehastigheden i henhold til borefærdigheder og undgå ethvert mekanisk tryk. Bor, indtil hjernen er synlig, i ca. 1 mm. Absorbere blod med en vatpind og vask med steril saltvand.
      BEMÆRK: Ankerskruerne tjener til at stabilisere hætten. Sørg for, at skruerne er placeret på begge halvkugler og langs den forreste bageste akse.
    12. Implantation af kanyle
      1. Skru ankerskruerne ind i hullerne. Brug skruer i rustfrit stål #0 x 1/8.
        BEMÆRK: Antallet af ankerskruer afhænger af det samlede antal implanterede enheder. Jordskruer (f.eks. til elektriske optagelser eller elektriske stimuleringer) skal nå hjerneoverfladen.
      2. Fastgør kanyleholderen til den stereotaxiske arm.
      3. Skub implantat-kanylen på kanyleholderen. Placer langsomt implantatet-kanylen over hullet, indtil den når hjernen.
      4. Mål DV-koordinaterne fra hjerneoverfladen. Sænk implantat-kanylen op til implantationsmålet. Absorbere blod, der kommer ud af hullet med en vatpind, vask med steril saltvand og tør derefter grundigt.
      5. Lim den implanterede kanyle fast til kraniet ved hjælp af gellim. Vent til tør.
      6. Påfør dental cement langs den implanterede kanyle til at fastgøre den til kraniet. Lad 2 mm (0,079'') strække sig fra den øvre ende for at muliggøre dummy indsættelse. Vent til tør.
        BEMÆRK: Sæt ikke cement på kanyleholderen.
      7. Løft kanyleholderen og lad den implanterede kanyle være på plads.
      8. Sæt dukken ind i den implanterede kanyle.
      9. Implanter alle andre enheder såsom optagelse arrays, optiske fibre, stimulation elektroder osv. Påfør dental cement over resten af kraniet, der dækker alle implantater.
      10. Der injiceres 3 ml stuetemperatur Ringers opløsning, og der tilføres en bilprofen på 5 mg/kg SC21.
      11. Overvåg rotten, indtil den genvinder bevidstheden (dyret er oprejst, har kontrol over sine luftveje og er ikke i fare for aspiration). Returner rotten til sit hjemmebur for fuld genopretning.
  3. Mikroinjections
    BEMÆRK: Under injektionen er det vigtigt at kontrollere, at strømmen af bikucullinen er intakt. Dette kan gøres ved at lade en lille luftboble dannes i injektoren og overvåge dens bevægelse. Injektorens resterende volumen kan fyldes med saltvand, så der ikke spildes bikukulering.
    1. Injektoren fastgøres til en bikukullinskøjte med en 25 G nål (OD 0,018''). Fyld indsprøjtningsbåndets ~1/3-1/2, og fjern sprøjten, så der kan dannes en lille luftboble.
    2. Injektoren fastgøres til en steril saltvandsfyldt sprøjte med en 25 G-nål (OD 0,018''). Fyld injektoren, indtil bikuculline når slutningen og en lille dråbe kommer ud af det.
    3. Stemplet af en mikrosyringe af 10 μL præcisionsglas fjernes.
    4. Skær og fastgør et kortfleks fleksibelt polymerrør (~3 cm, 1,181'') til præcisionsglasmikrosyringen.
    5. Tilslut den anden ende af det kortfleksible rør til en 1 mL sprøjte, 25 G nål (OD 0,018'') fyldt med sterilt vand.
    6. Injicere vand gennem den kortfleksible rør i præcision glas microsyringe indtil vandet kommer ud af det. Frakoble det kortfleksible rør.
    7. Sæt stemplet i igen, indtil det når ~7 μL-mærket på præcisionsglasmikrosyringen.
    8. Sæt præcisionsglasmikrosyringen i den bestemt åbning i infusionspumpemaskinen.
    9. Injektoren fastgøres til mikrosyringen af præcisionsglas og konfigureres med en hastighed på 0,35 μL/min. og et samlet volumen på 0,35 μL.
    10. Sæt en papirservietter under injektorspidsen. Marker luftboblens placering på injektoren, start infusionspumpemaskinen, og kontroller, at der vises et bikukullinisk fald. Efter injektionen skal luftboblen markeres igen.
      BEMÆRK: Forskellen mellem de to mærker svarer til den ønskede forskel under forsøgsindsprøjtningen.
    11. Sæt rotten i forsøgsburet og fjern dukken.
    12. Injektoren sættes i den implanterede kanyle gennem enden (se figur 3A).
    13. Start infusionspumpemaskinen. Kontroller, at luftboblen bevæger sig. Start stopuret for at holde styr på tic-initierings- og afslutningstider.
    14. Et minut efter injektionen skal du fjerne injektoren og langsomt genindsætte dukken.
      BEMÆRK: Hvis du sætter dukken i, efter at injektionen har skubbet bikucullinen ind i injektionsmålet.
  4. Efter injektion
    1. Afbryd injektoren fra præcisionsglasmikrosyringen.
    2. Den resterende opløsning vaskes ud fra injektoren ved hjælp af en luftfyldt sprøjte. Rengør injektoren med sterilt vand, og dræn den derefter ved at injicere luft gennem injektoren.
    3. Afbryd præcisionsglasmikrosyringen fra infusionspumpemaskinen, og rengør den med sterilt vand.

2. Kronisk model

  1. Forberedelse før operationen
    1. Forberedelse af kanyle-guide
      BEMÆRK: Kanyleguiden er en del af infusionsrøret og bruges til at fastgøre infusionsbeholderen til kanyleholderen under implantationen.
      1. Der skæres 12 mm (0,472'') af rustfrit stål, 25 G (OD 0,02'', ID 0,015'') hypo-rør for at få en kanyle-guide (Figur 2, enhed #1). Brug et roterende værktøj til at opnå lige kanter.
      2. Forbered en kanyleholder som beskrevet i trin 1.1.4. Sæt kanyleholderen i kanylevejledningen for at kontrollere, at den er korrekt fastgjort, og fjern den.
    2. Præparat af infusionsbeholdere
      BEMÆRK: Infusionsbeholderen er også en del af infusionsrøret. Det er implanteret i det endelige mål for striatum og tillader fokal infusion af bicuculline.
      1. Skær rustfrit stål, 30 G (OD 0,012'', ID 0,007'') hypo-rør for at opnå en infusions-kanyle. Brug et roterende værktøj til at opnå lige kanter. Den samlede infusions-kanylelængde er summen af den ønskede implantationsdybde plus en sikkerhedsfaktor (~1-2 mm, 0,039''-0,079''), infusionsbeholderens bøjede del (2 mm, 0,079'),overlapningen med kanylelederen (3 mm, 0,118'' og den vandrette del (4 mm, 0,157'') (Figur 2, anordning #2).
        BEMÆRK: I modsætning til den akutte model er implantationsdybden lig med det endelige infusionsmål.
      2. Sæt en 0,005'' diameter ledning i infusion-kanylen og bøj dem i en L-form på det tilsigtede sted. Den lodrette del svarer til den ønskede implantationsdybde plus 4-5 mm (0,157''-0,197''), og den vandrette del er 4 mm lang.
        BEMÆRK: Indføringen af den indre ledning forhindrer, at kanylen bliver obstrueret under bøjningen.
    3. Fleksibelt kateter-slangepræparat
      BEMÆRK: Det er også en del af infusionsrøret. Den forbinder infusionskanylen med den mini-osmotiske pumpe via en slangeadapter.
      1. 8 cm polyethylen (PE)-10 slange (ID 0,011'', OD 0,025'')(figur 2, anordning #3).
        BEMÆRK: Kateterets længde bestemmes af afstanden mellem implantationsmålet og pumpeplaceringen, hvilket muliggør fri bevægelighed for rotternes hoved og hals (se figur 3B).
    4. Samling af infusionsrøret
      BEMÆRK: Infusionsrøret leder bikucullinen fra den mini-osmotiske pumpe til hjernen. Den består af kanyle-føringen, infusionskantaen, den fleksible kateterrør, slangeadapteren og flowmoderatoren (Figur 2).
      1. Fjern den indvendige ledning fra infusionsbeholderen. Undersøg kanylen under mikroskopet for at sikre, at dens kanter er åbne og rene på begge sider; Hvis ikke, skal du bruge en 30 G (OD 0,01'') nål til at åbne den.
      2. Lim kanyleguiden til den lodrette del af infusionsbeholderen, nær den bøjede del, på overlapningen på 3 mm (0,118'') ved hjælp af CA-lim og CA-accelerator.
      3. Sæt den vandrette del af infusionsbeholderen i den fleksible kateterslange. Overlapningen skal være mindst 2 mm (0,079'').
      4. Skub pumpens flowmoderators gennemskinnelige hætte ud. Dette vil afsløre den korte rustfrit stål kanyle rør (Figur 2, enhed #5,1).
        BEMÆRK: Flowmoderatoren er en del af det mini-osmotiske pumpesæt. Den består af en gennemskinnelig hætte, en kort kanyledel, en hvid flange og en lang kanyledel. Den lange kanyledel indsættes i den mini-osmotiske pumpe, og den korte kanyledel er forbundet til kateteretslange via slangeadapteren.
      5. Fordyb slangeadapteren (Figur 2, enhed #4) i 70% alkohol. Vent flere minutter, så materialet kan svulme op.
      6. Fastgør slangeadapteren til den korte kanyledel af flowmoderatoren, indtil den rører ved den hvide flange (Figur 2, enhed #5.2). Slangeadapteren krymper i luften for at danne en tæt forseglet forbindelse.
      7. Sæt den fleksible kateterslange i den åbne ende af slangeadapteren, indtil den berører den korte kanyledel af flowmoderatoren.
      8. Hold den lange kanyledel (Figur 2, enhed #5.3) nede ved hjælp af en klipholder, og fastklæb alle forbindelserne. Forbindelserne er mellem slangeadapteren og den hvide flange, slangeadapteren og den fleksible kateterrør og til sidst den fleksible kateterrør og den vandrette del af infusionsbeholderen. Vent flere timer, indtil limen er helt tør (afhængigt af limtypen).
        BEMÆRK: Brug PE-kompatibelt klæbemiddel for at forhindre, at tilslutningerne løsner sig.
      9. Der injiceres sterilt vand gennem den lange kanyledel af infusionsrøret ved hjælp af en sprøjte med en stump nål på 27 G (0,014''). Kontroller, at vandet strømmer glat gennem infusionskanylen. Injicere luft gennem infusionsrøret for at dræne vandet.
    5. Grunding af den mini-osmotiske pumpe
      BEMÆRK: Grunding er en opstartsprocedure, der gør det muligt for pumpen at starte infusionen umiddelbart efter implantationen.
      1. Fyld et varmebad med vand ved kropstemperatur (~37 °C). Fyld et lille bægerglas med steril saltvand og læg det i varmebadet.
      2. Wrap den mini osmotiske pumpe med et papir tørre, og fastgør det lodret med åbningen opad, ved hjælp af en klipholder stå.
      3. Fyld pumpen med ACSF med en sprøjte med en stump nål på 27 G (0,014''). Mens du fjerner sprøjten, skal du fortsætte med at injicere ACSF for at forhindre luft i at komme ind. En ACSF boble vises i blænden af pumpen.
        BEMÆRK: Den første ACSF-infusion gør det muligt for rotten at komme sig helt efter operationen, før der induceres tics. Eventuelt kan den bicuculline-fyldte pumpe implanteres under den primære operation for at undgå følgende pumpeudskiftning, men den er ikke optimal19.
      4. Sæt en sprøjte på 27 G (0,014'') stump nål på den lange kanyledel af infusionsrøret, og indsprøjt ACSF gennem den. Mens du fjerner sprøjten, skal du fortsætte med at injicere ACSF for at forhindre luft i at komme ind. En ACSF boble vises i den lange kanyle-del.
      5. Sæt den lange kanyle-del i pumpen, boble til boble. En ACSF-boble skal vises på spidsen af infusionsbeholderen.
      6. Placer pumpen i bægeret. Pumpen, der er fastgjort til infusionsrøret, skal være i mindst 4-6 timer (ved ~37 °C) før pumpeimplantationen. Sørg for, at kun pumpen kommer i kontakt med saltvandet.
    6. Pumpeimplantation kirurgi
      1. Bedøve rotten i henhold til anæstesiprotokollen. Se trin 1.2.1.
      2. Barber rottens hoved og ryg, ved hjælp af en elektrisk clipper, lidt bageste til skulderbladet.
      3. Udfør de grundlæggende trin i operationen som beskrevet i trin 1.2.3-1.2.11. Snittet skal være langs hovedbunden op til nakkebenet.
      4. Steriliser en stor hæmostat (~14 cm lang, 5.512'') i autoklave. Sæt hæmostaten gennem snittet og skab en subkutan lomme i rottens ryg ved skiftevis at åbne og lukke den under huden gennem den midscapular linje.
        BEMÆRK: Lommen skal være stor nok til at indeholde pumpen og lade den bevæge sig lidt.
    7. Mini-osmotisk pump og infusionsrør implantation
      1. Fastgør kanyleholderen til den stereotaxiske arm, og placer den i den ønskede position til implantation.
      2. Fjern pumpen fra varmebadet og læg den på rottens ryg dækket med en papirservietter.
      3. Skub infusionsrørets kanyleguide på kanyleholderen.
      4. Hold pumpen med en hæmostat, og sæt den forsigtigt i den subkutane lomme.
      5. Implanter ankerskruerne.
        BEMÆRK: Implanter ankerskruerne efter indføring af pumpen for at undgå blokering af lommeåbningen og før kanyleimplantation for at undgå forskydning af kanylen.
      6. Implanter infusionsbeholderen i målet og lim den til kraniet ved hjælp af gellim. Vent til tør. Koordinaterne for forelimb tic induktion er: AP: +1 til +1,5, mL: ±2,5, DV: 5.
      7. Påfør dental cement langs infusion-kanylen for at ordne det til kraniet. Vent til tør.
      8. Løft kanyleholderen og lad den indopererede kanyle være på plads.
      9. Implanter alle andre enheder. Påfør dental cement på resten af kraniet, der dækker alle implantater. Der må være tilstrækkeligt med fleksible kateterrør i den subkutane lomme, der ikke er fastgjort, til at gøre det muligt at bevæge rotterne frit.
        BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er synlige områder mellem kraniet og lommeåbningen, og at kateteret ikke er bøjet.
      10. Operationen afsluttes som beskrevet i trin 1.2.12.10-1.2.12.11.
  2. Pumpe udskiftning kirurgi
    BEMÆRK: Hver mini-osmotisk pumpetype har sin egen forudbestemte leveringsinfusionsperiode. Derfor bør pumpen udskiftning kirurgi udføres inden udløbsdatoen.
    1. Forberedelse før operationen
      1. Gentag trin 2.1.5.1-2.1.5.2.
      2. Fyld pumpen med bicuculline ved hjælp af en sprøjte med en 27 G (0,014'') stump nål. Mens du fjerner sprøjten, skal du fortsætte med at injicere bicuculline for at forhindre luft i at komme ind.
      3. Sæt flowmoderatoren (fastgjort til dens gennemskinnelige hætte) ind i pumpen.
      4. Placer pumpen i bægeret. Pumpen skal være klar i mindst 4-6 timer (ved ~37 °C) før pumpudskiftning.
    2. kirurgi
      1. Bedøve rotten (se trin 1.2.1.1) og barbere ryggen ved hjælp af en elektrisk clipper.
      2. Svaber rottens ryg med povidone jod og derefter med en alkohol tørre at sterilisere området. Infiltrere langs den ønskede indsnit linje med en 0,5-1% lidocain løsning (SC).
      3. Lav et snit på huden over den implanterede pumpe. Vask lommen med stuetemperatur ACSF og tør med gaze puder. Brug autoklaverede engangsgardapéer til at dække området nær snittet.
      4. Tag den ACSF-fyldte pumpe af flowmoderatoren ved hjælp af en hæmostat, og kassér.
      5. Fjern den bikuculline-fyldte pumpe fra varmebadet. Tag flowmoderatoren ud af den bikucullinefyldte pumpe.
      6. Fastgør forsigtigt den bicuculline-fyldte pumpe til den implanterede flowmoderator. Undgå at røre ved den omgivende hud.
        BEMÆRK: Trin 2.2.2.4-2.2.2.6 skal udføres hurtigt for at forhindre luftbobler. Pumpen skal dog indsættes langsomt for at forhindre hurtig indtrængen af bicuculline i hjernen.
      7. Tryk de to margener af snittet tæt sammen ved hjælp af pincet. Lim snitlinjen med et vævsklæbemiddel. Som et alternativ skal du lukke snittet ved hjælp af suturer.
      8. Podning af området med povidone jod og færdiggøre operationen som beskrevet i trin 1.2.12.10-1.2.12.11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollerne for generering af de akutte og kroniske modeller for induktion hos rotter blev præsenteret ovenfor. Protokollerne dækker hele forberedelsen til kirurgi og eksperimenter(figur 1 for den akutte model, figur 2 for den kroniske model). Anvendelsen af bikuculline i striatummotorområderne resulterer i ekspression af igangværende motorik. Tics vises på den kontralaterale side til applikationen og er kendetegnet ved korte og gentagne muskelsammentrækninger. Efter bikucullin på de forreste dele af striatum udtrykkes tics typisk i rottens forben, hoved og/eller kæbe, mens tics efter bageste injektioner udtrykkes i baglimb18. I den akutte model (Figur 3A) begynder tics at dukke op flere minutter efter den bikukuliske mikroinjection, vare i snesevis af minutter og til sidst henfald og ophøre18. I den kroniske model (Figur 3B) begynder tics typisk at dukke op den første dag efter den bikuculline-fyldte pumpeimplantation19. Tics svinger i løbet af dagen og er tydeligst observerbare i den stille vågne tilstand19. Tic udtryk forbliver i gang over en periode på flere dage og op til et par uger, afhængigt af typen af mini-osmotisk pumpe.

Tic udtryk kan overvåges og kvantificeres ved samtidige optagelser af video, kinematiske sensorer og neural aktivitet15,19,22. Motoriske tics har en stereotyp kinematisk signatur, der kan detekteres i accelerometer- og gyroskopsignalerne (Figur 4), hvilket gør det muligt at måle deres frekvens og intensitet. Tic timing kan også vurderes ved hjælp af det lokale felt potentiale (LFP) signal i hele CBG vej, på grund af fremkomsten af store amplitude LFP forbigående pigge15 (Figur 4). Resultaterne præsenteres her , og yderligere implementeringer af de akutte og kroniske modeller er beskrevet detaljeret i vores tidligere værker15,18,19,22,23. Den striatal disinhibition model i både gnavere og ikke-menneskelige primater kopieret centrale egenskaber tic udtryk i Tourettes syndrom og andre tic lidelser vedrørende bådemotoriske 15,18 og vokal24 tics og deres udtryk efter en anden adfærdsmæssige, miljømæssige og farmakologiske interventioner22,25,26. Men eksisterende fund danner kun toppen af isbjerget af den komplekse manifestation af tic lidelser.  Vi mener, at modellen vil gøre det muligt at studere en bred vifte af sådanne faktorer, lige fra miljømæssige effekter såsom sensorisk input, adfærdsmæssige virkninger såsom samtidig handling ydeevne og kliniske virkninger såsom reaktion på forskellige behandlinger.

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af de specialfremstillede enheder, der anvendes i den akutte model. (1) Implantat-kanyle, som er kronisk implanteret i striatum. (2) Dummy, en aftagelig indre ledning, bruges til at forsegle den implanterede kanyle. (3) Injektor, der består af (3.1) fleksibelt rør og (3.2) injektionsbeholder, anvendes til akut levering af bikukullinen til striatum. (4) Kanyleholderen, der består af (4.1) base og (4.2) bly, anvendes til at holde implantatbeholderen under implantationen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk repræsentation af de specialfremstillede enheder og den mini-osmotiske pumpe, der anvendes i den kroniske model. (1) Kanyle-guide bruges til at holde infusion-kanylen under implantationen. (2) Infusionsbeholderen implanteres kronisk i striatum. (3) Fleksibel kateter-slange forbinder infusion-kanylen til mini-osmotisk pumpe. (4) Slangeadapteren forbinder den fleksible kateterslange med flowmoderatoren. (5) Flow-moderator består af (5,1) korte kanyle-del, (5,2) hvid flange og (5,3) lang kanyle-del. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Skematisk repræsentation af de eksperimentelle opsætninger. I den akutte model induceres tics efter en bikukullin injektion ved hjælp af en pumpeinfusionsmaskine (A). I den kroniske model opnås løbende tics ved langvarig infusion af bicuculline via mini-osmotisk pumpeimplantation (B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Et eksempel på synkroniserede signaler fra de kinematiske og neurofysiologiske optagelser. Accelerometer, gyroskop og den tilsvarende LFP fra den primære motoriske cortex under tic udtryk. Stiplet grå linje: tic debut tid som registreret af LFP signal. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette manuskript detaljerede vi protokollerne for de akutte og kroniske modeller til tic induktion i en frit barberet rotte. Disse protokoller beskriver forberedelsen af alle komponenter, operationen og den eksperimentelle proces, der kan tilpasses tilpasningen for at imødekomme specifikke forskningsbehov. Det primære princip, der ligger til grund for disse modeller, er den direkte lokale anvendelse af bikuculline til striatumens motorområder, som er kendt for at spille en central rolle i patofysiologien af tic lidelser10,11,12. I begge modeller leveres bicuculline til målet gennem specialfremstillede implanterede kanyler. Det specifikke kanyleimplantationsmål afhænger af den ønskede kropsplacering af tic-udtryk. Striatum er somatotopically organiseret27,28,29,30. Anvendelse af bikuculline på dets forreste dele fører til tic udtryk i forben, kæbe og hoved, mens dens anvendelse på de bageste dele resulterer i hindlimb tics18. Desuden fører anvendelse på ventral striatum (kerne accumbens – NAc) til hyperaktivitet31. Modellerne gør det muligt at implantere kanyler på begge halvkugler og i begge striatale mål for samtidig injektion for at producere bilaterale symptomer. Denne metode gælder ikke kun for tic-udtryksmodeller, men gælder også i andre neurovidenskabsmodeller, der kræver injektion af neuroaktive forbindelser.

I den akutte model foreslår vi, at kanylen implanteres 2 mm over injektionsmålet for at forhindre vævsskader på målområdet. For at minimere efterfølgende skader ved injektionsbeholderen bruger vi et tyndt 30 G rør for at nå det endelige mål. Bemærk, at flere injektioner til samme mål i sidste ende vil føre til vævsnekrose fra mekanisk stress, hvilket vil medføre nedsat tic udtryk. En mulig løsning er at indsætte injektoren til dybere mål under de efterfølgende injektioner, så længe de forbliver lokaliseret i striatumens motorområder. Denne vævsnekrose forekommer ikke i den kroniske model, da bikukullin infusionen er i gang gennem en statisk direkte implanteret infusions-kanyle i striatalmålet. For at minimere potentielle vævsskader fra kronisk infusions-kanyleimplantation brugte vi også et 30 G rør. Men for at forbinde infusionsbeholderen til flowmoderatoren via fleksible kateterrør, var vi nødt til at bruge en slangeadapter, hvilket skabte et potentielt svigtende punkt i processen. Tykkere fleksible kateterrør kan bruges til at passe til flow-moderator, hvilket fører til en rimelig pris for en større vævsskade fra den større infusionskantula.

Igangværende forskning i løbet af de sidste 10 år har gjort det muligt for os at definere specifikke koncentrationer og leveringshastigheder af bicuculline15,18,22,23, hvilket resulterer i et reproducerbart adfærdsfænomen af observerbart tic-udtryk. Afvigelse fra disse værdier i retning af højere mængder, koncentrationer eller injektionsrater kan forårsage episodisk anfald15,18,32 og ensidige rotationer af rotterne. Lavere koncentrationer resulterer i mere subtile, mindre påviselige tics, udtrykt over kortere perioder. I den kroniske model blev der ikke observeret anfald i hele perioden; der blev dog observeret omfattende tic udtryk og tendens til ensidige rotationer den første dag efter den bikuculline-fyldte pumpeimplantation, som stabiliserede sig i løbet af den anden dag. Dette, kombineret med post hjernekirurgi opsving, forstyrrer dyrets komfort niveau og velvære. For at adskille restitutionsperioden fra tic-ekspression foreslår vi, at du implanterer en ACSF-fyldt pumpe først19. Denne periode med ACSF-infusion kan også bruges til at udføre kontrolforsøg før tic induktion. Kontrol eksperimentelle sessioner kan også udføres i den akutte model, ved hjælp af ACSF injektioner18,33.

Både de akutte og de kroniske modeller kan bruges til at studere de kinematiske egenskaber og neurale korrelater af tic udtryk. Tics kan identificeres ved frame-by-frame offline video analyse, som dog er tidskrævende og mindre præcis. Mere følsomme evalueringsmetoder omfatter elektromyografi (EMG) og kinematiske sensorer (accelerometer og gyroskoper) (figur 4). Til dette formål skal de kinematiske enheder være placeret i nærheden af det tic-udtrykkende sted på kroppen for nøjagtig bevægelsesvurdering. De neurale korrelater af tic udtryk kan fanges af neurofysiologiske optagelser i hele CBG vej (Figur 4). Når man overvejer implantation af yderligere optageenheder, skal deres placeringer både i og uden for hjernen planlægges omhyggeligt for at forhindre interferens med injektionen.

Karakteren af den eksperimentelle forespørgsel bør diktere valget af model af tic udtryk. Den akutte model er enkel og nem at implementere. Flere forbigående injektioner kan udføres over en relativt lang periode, kan køres samtidigt i flere hjerneområder og muliggøre kombination af kontrol og eksperimentelle sessioner. Den kroniske model er mere kompliceret og kræver daglig overvågning af rottens velbefindende. Men den konstante og langvarige bicuculline applikation giver mulighed for at adressere dynamikken i tic udtryk og dets graduering over tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev delvist støttet af et tilskud fra Israel Science Foundation (ISF) (297/18). Forfatterne takker M. Bronfeld for at etablere den akutte gnavermodel og M. Israelashvili for hendes kommentarer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anchor screws Micro Fasteners SMPPS0002 #0 x 1/8 - Pan Head Sheet Metal Screws
Bicuculline methiodide Sigma Aldrich 14343
Cyanoacrylate (CA) accelerator Zap PT29
Cyanoacrylate (CA) glue BSI IC-2000 This glue was found to be stronger than others
Dental cement Coltene H00322 Hygenic Perm Repair Material Reline Resin Self Cure
Glue gel Loctite Ultra Gel Control
Hemostat WPI 501242 Any hemostat sized approximately 14 cm would be sufficient
Hypo-tube, extra-thin wall 25G Component supply company HTX-25X
Hypo-tube, regular wall 22G Component supply company HTX-22R
Hypo-tube, regular wall 30G Component supply company HTX-30R
Infusion pump machine New Era Pump Systems NE-1000
Mini-osmotic pump ALZET 2001 1.0µl per hour, 7 days
PE compatible adhesive CEYS Special difficult plastics (suitable for PE)
PE-10 Catheter Tubing ALZET PE-10 ID = 0.28mm, OD = 0.61mm
Precision glass microsyringe, 10µl Hamilton 80065 1701 RNR 10µl syr (22s/51/3)
Tissue adhesive 3M 1469Sb Vetbond
Tubing-adapter CMA 3409500
Tygon micro bore tubing, 0.02 inch ID * 0.06 OD Component supply company TND80-020
Wire 0.005-inch Component supply company GWX-0050
Wire 0.013-inch Component supply company GWX-0130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Psychiatric Association. DSM-5. American Psychiatric Association. , (2013).
  2. Peterson, B. S., Leckman, J. F. The temporal dynamics of tics in Gilles de la Tourette syndrome. Biol.Psychiatry. 44, 1337-1348 (1998).
  3. Ganos, C., et al. The somatotopy of tic inhibition: where and how much. Movement Disorders. , (2015).
  4. Barnea, M., et al. Subjective versus objective measures of tic severity in Tourette syndrome - The influence of environment. Psychiatry Research. 242, 204-209 (2016).
  5. Silva, R. R., Munoz, D. M., Barickman, J., Friedhoff, A. J. Environmental Factors and Related Fluctuation of Symptoms in Children and Adolescents with Tourette's Disorder. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 36 (2), 305-312 (1995).
  6. Rothenberger, A., et al. Sleep and Tourette syndrome. Advances in Neurology. 85, 245-259 (2001).
  7. Conelea, C. a, Woods, D. W., Brandt, B. C. The impact of a stress induction task on tic frequencies in youth with Tourette Syndrome. Behaviour Research and Therapy. 49 (8), 492-497 (2011).
  8. Ganos, C., Rothwell, J., Haggard, P. Voluntary inhibitory motor control over involuntary tic movements. Movement Disorders. 33 (6), 937-946 (2018).
  9. Yael, D., Vinner, E., Bar-Gad, I. Pathophysiology of tic disorders. Movement Disorders. 30 (9), 1171-1178 (2015).
  10. Kurvits, L., Martino, D., Ganos, C., Eddy, C. M. Clinical Features That Evoke the Concept of Disinhibition in Tourette Syndrome. Frontiers in Psychiatry. 11, 1-10 (2020).
  11. Mink, J. W. Basal ganglia dysfunction in Tourette's syndrome: a new hypothesis. Pediatric Neurology. 25, 190-198 (2001).
  12. Bronfeld, M., Bar-Gad, I. Tic disorders: what happens in the basal ganglia. The Neuroscientist. 19 (1), 101-108 (2013).
  13. Tarsy, D., Pycock, C. J., Meldrum, B. S., Marsden, C. D. Focal contralateral myoclonus produced by inhibition of GABA action in the caudate nucleus of rats. Brain. 101 (1), 143-162 (1978).
  14. Crossman, A. R., Mitchell, I. J., Sambrook, M. A., Jackson, A. Chorea and Myoclonus in the Monkey Induced By Gamma-Aminobutyric Acid Antagonism in the Lentiform Complex. Brain. 111 (5), 1211-1233 (1988).
  15. McCairn, K. W., Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. The neurophysiological correlates of motor tics following focal striatal disinhibition. Brain. 132 (8), 2125-2138 (2009).
  16. Worbe, Y., et al. Behavioral and movement disorders induced by local inhibitory dysfunction in primate striatum. Cerebral Cortex. 19 (8), 1844-1856 (2009).
  17. Pogorelov, V., Xu, M., Smith, H. R., Buchanan, G. F., Pittenger, C. Corticostriatal interactions in the generation of tic-like behaviors after local striatal disinhibition. Experimental Neurology. 265, 122-128 (2015).
  18. Bronfeld, M., Yael, D., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Motor tics evoked by striatal disinhibition in the rat. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 50 (2013).
  19. Vinner, E., Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Prolonged striatal disinhibition as a chronic animal model of tic disorders. Journal of Neuroscience Methods. 292, 20-29 (2017).
  20. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6, (2007).
  21. Flecknell, P. Analgesia and Post-Operative Care. Laboratory Animal Anaesthesia. , (2016).
  22. Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Corticostriatal divergent function in determining the temporal and spatial properties of motor tics. Journal of Neuroscience. 35 (50), 16340-16351 (2015).
  23. Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Spatial and temporal properties of tic-related neuronal activity in the cortico-basal ganglia loop. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8713-8721 (2011).
  24. McCairn, K. W., et al. A Primary Role for Nucleus Accumbens and Related Limbic Network in Vocal Tics. Neuron. 89 (2), 300-307 (2016).
  25. Rizzo, F., et al. Aripiprazole Selectively Reduces Motor Tics in a Young Animal Model for Tourette's Syndrome and Comorbid Attention Deficit and Hyperactivity Disorder. Frontiers in Neurology. 9, 1-11 (2018).
  26. Vinner, E., Matzner, A., Belelovsky, K., Bar-gad, I. Dissociation of tic expression from its neuronal encoding in the striatum during sleep. bioRxiv. , (2020).
  27. Webster, K. E. Cortico-striate interrelations in the albino rat. Journal of Anatomy. 95, Pt 4 532-544 (1961).
  28. Ebrahimi, A., Pochet, R., Roger, M. Topographical organization of the projections from physiologically identified areas of the motor cortex to the striatum in the rat. Neuroscience Research. 14, 39-60 (1992).
  29. Brown, L. L., Sharp, F. R. Metabolic mapping of rat striatum: somatotopic organization of sensorimotor activity. Brain Research. 686, 207-222 (1995).
  30. Brown, L. L., Smith, D. M., Goldbloom, L. M. Organizing principles of cortical integration in the rat neostriatum: Corticostriate map of the body surface is an ordered lattice of curved laminae and radial points. Journal of Comparative Neurology. 392 (4), 468-488 (1998).
  31. Yael, D., Tahary, O., Gurovich, B., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Disinhibition of the nucleus accumbens leads to macro-scale hyperactivity consisting of micro-scale behavioral segments encoded by striatal activity. The Journal of Neuroscience. , 3120 (2019).
  32. Obeso, J. A., Rothwell, J. C., Marsden, C. D. The spectrum of cortical myoclonus. From focal reflex jerks to spontaneous motor epilepsy. Brain. 108, 124-193 (1985).
  33. Bronfeld, M., et al. Bicuculline-induced chorea manifests in focal rather than globalized abnormalities in the activation of the external and internal globus pallidus. Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3261-3275 (2010).

Tags

Adfærd Tic induktion motorik dyremodeller osmotisk pumpe basal ganglier striatum bicuculline GABA antagonister kronisk model akut model Tourettes syndrom
Generering af akutte og kroniske eksperimentelle modeller af motorisk tic expression hos rotter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vinner, E., Belelovsky, K., Bar-Gad, … More

Vinner, E., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Generating Acute and Chronic Experimental Models of Motor Tic Expression in Rats. J. Vis. Exp. (171), e61743, doi:10.3791/61743 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter