Summary
우리는 쥐를 자유롭게 행동하여 틱 발현의 급성 및 만성 실험 모델을 생성하기위한 프로토콜을 제시합니다. 모델은 줄무늬 캐뉼라 이식 및 후속 GABAA 길항제 응용 프로그램을 기반으로합니다. 급성 모델은 일시적인 주사를 사용하는 반면 만성 모델은 피하 이식 된 미니 삼투압 펌프를 통해 장기간 주입을 사용합니다.
Abstract
모터 틱은 투렛 증후군 및 기타 틱 장애의 주요 증상인 갑작스럽고, 급속하고, 재발하는 운동입니다. tic 생성의 병리생리학은 기저 신경의 비정상적인 억제, 특히 주요 입력 구조, 줄무늬와 관련이 있습니다. 설치류와 비인간 영장류의 동물 모델에서, GABAA 길항제의 로컬 응용 프로그램, bicuculline 및 피크로톡신과 같은, striatum의 모터 부분에, 모터 틱의 발현의 결과로 로컬 억제를 유도.
여기에서, 우리는 쥐에 있는 모터 tics의 급성 및 만성 모형을 제시합니다. 급성 모델에서, 등막 줄무늬에 이식된 캐뉼라를 통한 양성골 미세분사술은 최대 1시간 의 짧은 시간 동안 지속되는 틱의 발현을 유도한다. 만성 모델은 하위 가산 미니 삼투압 펌프를 통해 비큐컬린의 지속적인 주입을 활용하여 며칠 또는 몇 주까지 틱 발현을 연장할 수 있는 대안입니다.
이 모델은 코르티코-기저 신경질 통로 전반에 걸쳐 tic 생성의 행동 및 신경 메커니즘에 대한 연구를 가능하게 합니다. 이 모델은 주입 칸누라 이외에 추가 기록 및 자극 장치의 이식을 지원하므로 전기 및 광학 자극 및 전기 생리적 기록과 같은 다양한 사용이 가능합니다. 각 방법은 다른 장점과 단점을 가지고 : 급성 모델은 운동의 운동 특성과 틱 발현 중 및 후 해당 전기 생리학적 변화의 비교와 틱 발현에 단기 변조기의 효과를 할 수 있습니다. 이 급성 모델은 설정하기 쉽습니다. 그러나 짧은 기간으로 제한됩니다. 만성 모델, 더 복잡 한 동안, 실현 가능한 틱 역학 및 장기간 동안 틱 표현에 행동 효과. 따라서 경험적 쿼리 유형은 이러한 두 가지 보완모델 간의 선택(tic expression)을 유도합니다.
Introduction
Tics는 투렛 증후군 (TS) 및 기타 틱 장애의 정의 증상입니다. Tics는 갑작스럽고 빠른 재발하는 움직임(모터 틱) 또는 발성(vocal tics)1로설명된다. 틱 발현은 전형적으로 시간적(주파수)2 및 공간(강도, 신체 위치)3 특성에서 여러 시간 척도(시간, 일, 월 및 연도)에 따라 변동합니다. 이러한 변화는 환경적 특징4,5,행동 상태6,7,자발적 및 임시 억제8과같은 다양한 요인에 의해 영향을 받습니다.
비록 운동 틱을 지배 하는 신경 메커니즘은 여전히 완전히 이해 되지 않습니다., 이론 및 실험 연구의 증가 수는 그것의 자연에 관해서는 새로운 증거를 제공했다 9. 현재, tic 세대의 병리생리학은 코르티코-기저 신경리아(CBG) 루프를 수반하는 것으로 생각되며, 특히 주기질 신경리아 입력 핵10,11,12의비정상적인 억제와 관련이 있다. 설치류 및 영장류에 대한 이전 연구는 비큐컬린 및피크로톡신13,14,15,16,17,18과같은 다른 GABAA 길항제의 로컬 적용에 의해 줄무늬가 억제될 수 있음을 입증했다. 이러한 약리학적 개입은 대문자 측에서 일시적인 운동 틱 발현을 주입하여 얼굴과 구조 유효성을 가진 틱 장애의 강력한 급성 모델을 확립합니다. 급성 모델은 자극이 간단하고 전기 생리및 운동성 기록과 동시와 같은 전기 및 광학 자극과 같은 단기 변조의 효과를 연구할 수 있게 한다. 그러나, 급성 모델은 주입 후 짧은 기간으로 제한됩니다. 급성 모델을 기반으로, 우리는 최근에 피하 이식 미니 삼투성 펌프(19)를통해 줄무늬에 양성선의 장기간 고정 속도 주입을 활용하는 쥐에서 tic 생성의 만성 모델을 제안했다. 이 모델은 틱 식 기간을 며칠/주로 연장합니다. 긴 기간 동안 비큐컬린의 일정한 방출은 약리학적 치료 및 행동 상태와 같은 다양한 요인의 효과를 틱 발현에 검사할 수 있게 합니다.
여기서, 우리는 쥐에서 틱 발현의 급성 및 만성 모델을 생성하기위한 프로토콜을 제시한다. 특정 연구 질문의 함수로서, 프로토콜은 일방적 대 양자 이식, 틱 부위(striatum의 소마티움 조직에 따라)및 임플란트 캐뉼라의 각도(추가 이식 장치의 위치에 따라)를 포함하는 파라미터의 미세 조정을 가능하게 한다. 만성 모델에 사용되는 방법은 부분적으로 상용 제품을 기반으로하지만 tic 모델에 맞게 중요한 조정을 사용합니다. 이 문서에서는 이러한 tic 모델을 맞춤 제작하는 데 필요한 조정 사항을 자세히 설명합니다.
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Protocol
모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인및 감독되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건 원 및 연구 실험실 동물의 사용 및 치료를위한 바 일란 대학 지침을 준수했습니다. 이 프로토콜은 보건부에서 실험실 동물 실험에 대한 국가위원회에 의해 승인되었다.
참고: 이 프로토콜은 3-10개월, 280-350g의 여성 롱 에반스 쥐(급성 및 만성 모델)와 암컷 스프라그 Dawley 쥐(급성 모델)를 사용합니다. 다른 긴장, 무게 또는 나이에 이러한 모델의 구현은 다른 반응을 위해 주의 깊게 테스트되어야한다.
1. 급성 모델
- 수술 전 준비
- 임플란트 캐뉼라 제제
참고: 임플란트 캐뉼라는 줄무늬에 국소 비큐컬린 주사를 가능하게 합니다.- 스테인레스 스틸, 25G(OD 0.02', ID 0.015') 저혈압을 잘라 임플란트 캐뉼라(그림1,장치 #1)를 획득한다. 로터리 도구를 사용하여 직선 가장자리를 달성합니다. 캐뉼라의 길이는 이식 대상 깊이, 캐뉼라 이식 각도 및 최종 시멘트 캡 높이에 따라 달라집니다. 이식 대상 깊이는 조직 손상을 방지하기 위해 최종 주입 대상보다 2mm(0.079') 더 높을 필요가 있다.
참고: 이식된 물체가 가장 높은 물체가 캡 높이를 결정합니다. - 모래와 임플란트 캐뉼라 가장자리를 부드럽게, 뇌에 추가 역학 마찰을 방지. 내부 장애물을 제거하기 위해 30 G (0.01')) 바늘을 삽입합니다.
- 스테인레스 스틸, 25G(OD 0.02', ID 0.015') 저혈압을 잘라 임플란트 캐뉼라(그림1,장치 #1)를 획득한다. 로터리 도구를 사용하여 직선 가장자리를 달성합니다. 캐뉼라의 길이는 이식 대상 깊이, 캐뉼라 이식 각도 및 최종 시멘트 캡 높이에 따라 달라집니다. 이식 대상 깊이는 조직 손상을 방지하기 위해 최종 주입 대상보다 2mm(0.079') 더 높을 필요가 있다.
- 더미 준비
참고 : 더미는 이식 된 캐뉼라 내부에 배치 된 탈착식 내부 와이어입니다. 더미는 이식된 캐뉼라를 밀봉하여 방해를 방지합니다.- 회전 도구로 0.013'의 와이어를 절단하여 더미를 확인합니다. 더미는 임플란트 캐뉼라길이(도 1,장치 #2)보다 3mm(0.118') 더 길어야 합니다.
- 더미를 임플란트 캐뉼라에 삽입하여 끝에 도달할 때까지 삽입합니다. 캐뉼라에 꼬집어 여분의 와이어를 구부립니다. 구부러진 부분은 더미가 이식 된 캐뉼라에서 떨어지는 것을 방지하고 쥐가 제거하지 못하도록 임플란트 캐뉼라와 플러시해야합니다.
- 인젝터 준비
참고: 유연한 튜브와 주사 캐뉼라(도1,장치 #3)로 구성된 인젝터는 줄무늬로 직접 비큐컬린 주입을 가능하게 합니다.- 70cm(27.559') 유연한 폴리머 마이크로보어 튜브(OD 0.06', ID 0.02')(그림1,장치 #3.1)를 잘라냅니다.
참고: 유연한 튜브의 길이는 실험 케이지와 주입 펌프 기계 위치 사이의 거리에 의해 정의됩니다. 그것은 주입 기간 동안 쥐의 자유로운 움직임을 가능하게 하기에 충분히 길어야 한다, 하지만 너무 길지 않다, 쥐가 그것에 얽히지 않도록 (그림 3A참조). - 스테인레스 스틸, 30 G (OD 0.012', ID 0.007') 하이포 튜브를 잘라 주사 캐뉼라(그림 1,장치 #3.2)를 얻었다. 로터리 도구를 사용하여 직선 가장자리를 달성합니다. 임플란트 캐뉼라보다 5mm(0.197') 더 길어져야 합니다: 최종 주사 목표에 도달하기 위해 뇌 내의 이식된 캐뉼라보다 2mm(0.079') 더 길고, 3mm(0.118')는 유연한 튜브에 삽입한다.
- 모래와 주입 캐뉼라의 끝을 부드럽게, 뇌에 추가 역학 마찰을 방지. 직경 0.005''를 측정하는 와이어를 삽입하여 방해받지 않았는지 확인합니다.
- 3mm(0.118')의 주입 캐뉼라를 유연한 튜브에 삽입하고 그 사이의 조인트를 접착제로 하여 인젝터를 얻습니다. 시아노아크릴레이트(CA) 접착제와 CA 가속기를 사용하십시오.
- 멸균물로 채워진 25G 바늘(0.018')을 주입대에 부착하여 세척합니다. 이렇게 하면 사출 캐뉼라에서 나오는 흐름 방향이 직선적이고 쉽게 사용할 수 있습니다. 결정적으로, 흐름이 직선이 아닌 경우, 30 G (OD 0.01')의 끝을 사용하여 장애물을 제거하고 주입 캐뉼라 구멍을 확대하고 흐름을 다시 확인하십시오.
- 70cm(27.559') 유연한 폴리머 마이크로보어 튜브(OD 0.06', ID 0.02')(그림1,장치 #3.1)를 잘라냅니다.
- 캐뉼라 홀더 준비
참고: 캐뉼라 홀더는 스테레오탁스 암에 연결되어 있으며 이식 중에 임플란트 캐뉼라를 보관합니다. 캐뉼라 홀더는 캐뉼라 홀더 베이스와 캐뉼라 홀더 리드로 구성되어 있으며, 이 납은 함께 접착됩니다(그림1,장치 #4). 이식 하는 동안, 캐뉼라 홀더 베이스는 스테레오 탁스 암에 부착 되고, 캐뉼라 홀더 납은 임플란트 캐뉼라에 부착됩니다.- 캐뉼라 홀더 베이스: 스테인리스 스틸 10cm(3.947') 절단, 22G(OD 0.028', ID 0.017') 저혈압(그림1,기기 #4.1).
- 캐뉼라 홀더 리드: 0.013'와이어를 원하는 임플란트 캐뉼라보다 3mm(0.118') 더 길게 잘라냅니다(그림1,장치 #4.2).
- 캐뉼러 홀더 리드를 캐뉼라 홀더 베이스에 삽입하고 CA 접착제와 CA 가속기를 사용하여 그 사이의 조인트를 접착제로 넣습니다. 납은 이식 중 조직 손상을 피하기 위해 임플란트 캐뉼라보다 1mm(0.039') 짧아야 합니다.
- Bicuculline 제제: 생리식염수 또는 인공 뇌척수액(ACSF)에서 비큐컬린 메티오디드를 1 μg/μL의 최종 농도로 용해합니다. 용존 비큐컬라인을 1mL 주사기로 나누고 알루미늄 호일로 덮고 필요할 때까지 -20°C에서 동결합니다. 필요한 경우 사용하기 전에 주사기를 해동하십시오.
- 임플란트 캐뉼라 제제
- 외과
- 설계 챔버에 쥐를 배치하여 초기 마취를 유도하고 0.5-1 L/min의 속도로 산소와 혼합된 4-5%의 이소플루란을 전달한다. 그런 다음 케타민과 자일라진(각각 100 mg/kg) 혼합물을 통해 쥐 내 근육(IM 또는 IP)을 주입한다.
- 전기 클리퍼를 사용하여 쥐의 머리를 면도합니다.
- 리도카인 젤을 쥐의 귀에 넣습니다. 각막 건조와 외상을 방지하기 위해 쥐의 눈에 석유 젤리를 넣어.
- 이어 바와 이쑤시개(toothbar)를 사용하여 스테레오테틱 프레임의 쥐를 고정합니다.
- 쥐의 두피를 포비도오요오드로 면봉한 다음 알코올 닦아 부위를 살균합니다. 0.5 - 1 % 리도카인 용액 (SC)으로 원하는 절개 선을 따라 침투합니다. 메스 블레이드를 사용하여 두피를 따라 절개를 합니다.
- 근막을 가장자리쪽으로 당겨 수술 영역을 엽니다.
- 면 봉면을 사용하여 멸균 식염수로 두개골을 청소하십시오. 출혈의 경우, 혈액 모세관을 소작하기 위해 소작을 사용합니다. 이 단계는 시간이 지남에 따라 캡 안정성에 매우 중요합니다.
- 수술 부위를 확대하기 위해 4개의 곡선 된 헤모스트 (전방 2 개, 후방 2 개)로 근막을 고정하십시오.
- 브레그마와 람다 좌표를 측정합니다. 두 점의 dorsoventral(DV) 좌표를 레벨화하여 100 μm 범위 내에 있도록 합니다.
- 스테레오탁스 장치를 사용하여, 이식할 관심 영역과 앵커 나사의 좌표를 측정하고 표시한다. 앞다리 영역에서 틱 유도를 위한 직선 이식 캐뉼라 좌표는 다음과 같습니다: AP: +1 ~ +1.5, mL: ±2.5, DV: 3; 뒷다리 지역: AP: -0.4 ~ -0.5, mL: ±3.5, DV:318,20.
참고: 캐뉼라를 똑바로 이식하는 것을 방지하는 여러 장치의 이식의 경우, 캐뉼라 이식 각도와 그에 따라 좌표의 각도를 변경합니다(AP: +2.7, mL: ±2.5, DV: 3, 각도 15° 전방에서 후방까지). - 현미경 아래 두개골에 구멍을 뚫습니다. 1/4-1/2 비트 크기의 초경 둥근 버가있는 치과 드릴 기계를 사용합니다. 뇌 손상의 위험을 최소화하려면 드릴 기술에 따라 드릴 속도를 조정하고 정비사 압력을 피하십시오. 뇌가 보일 때까지 약 1mm 동안 드릴. 면봉으로 혈액을 흡수하고 멸균 식염수로 씻어.
참고: 앵커 나사는 캡을 안정화하는 역할을 합니다. 나사가 반구와 전방 후방 축모두에 있는지 확인합니다. - 캐뉼라 이식
- 앵커 나사를 구멍에 나사로 고정합니다. 스테인레스 스틸 #0 x 1/8 크기의 나사를 사용하십시오.
참고: 앵커 나사의 수는 이식된 장치의 총 수에 따라 달라집니다. 지상 나사(예: 전기 기록 또는 전기 자극)는 뇌 표면에 도달해야 합니다. - 입체 암에 캐뉼라 홀더를 부착합니다.
- 임플란트 캐뉼라를 캐뉼라 홀더에 밀어 내십시오. 임플란트 캐뉼라가 뇌에 도달할 때까지 천천히 구멍 위에 놓습니다.
- 뇌 표면에서 시작하는 DV 좌표를 측정합니다. 임플란트 캐뉼라를 이식 대상까지 낮추습니다. 면봉으로 구멍에서 나오는 혈액을 흡수하고 멸균 식염수로 씻은 다음 철저히 건조하십시오.
- 이식된 캐뉼라를 젤 접착제를 사용하여 두개골에 붙입니다. 건조할 때까지 기다립니다.
- 이식된 캐뉼라를 따라 치과 시멘트를 발라 두개골에 부착합니다. 더미 삽입을 가능하게하기 위해 상층부에서 2mm (0.079')를 둡니다. 건조할 때까지 기다립니다.
참고 : 캐뉼라 홀더에 시멘트를 넣지 마십시오. - 캐뉼라 홀더를 들어 올려 이식된 캐뉼라를 제자리에 놓습니다.
- 더미를 이식된 캐뉼라에 삽입합니다.
- 기록 어레이, 광섬유, 자극 전극 등과 같은 다른 모든 장치를 임플란트. 모든 임플란트를 덮고, 두개골의 나머지 부분에 치과 시멘트를 적용합니다.
- 실온 링거 용액 3mL을 주입하고 5 mg / kg SC21을카프로펜하십시오.
- 쥐가 의식을 되찾을 때까지 모니터링하십시오 (동물은 똑바로 서 있고, 기도를 통제하고, 포부의 위험에 있지 않습니다). 완전한 회복을 위해 쥐를 홈 케이지로 돌려놓습니다.
- 앵커 나사를 구멍에 나사로 고정합니다. 스테인레스 스틸 #0 x 1/8 크기의 나사를 사용하십시오.
- 미세 주입
참고 : 주입 하는 동안, 비큐컬라인의 흐름이 손상 되지 않은 지 확인 하는 것이 중요 하다. 이것은 인젝터에 작은 기포 형태를 허용하고 그 움직임을 모니터링하여 수행 할 수 있습니다. 인젝터의 나머지 부피는 식염수로 채워져 bicuculline이 낭비되지 않도록 할 수 있습니다.- 25G 바늘(OD 0.018')으로 바이큐컬린 주사기에 인젝터를 부착합니다. 인젝터의 ~1/3-1/2를 채우고 주사기를 제거하여 작은 기포가 형성될 수 있습니다.
- 25G 바늘(OD 0.018')을 사용하여 멸균 식염수 채워진 주사기에 인젝터를 부착합니다. 바이큐컬라인이 끝에 도달하고 작은 드롭이 나올 때까지 인젝터를 채웁니다.
- 10 μL 정밀 유리 현미경의 플런저를 제거합니다.
- 정밀 유리 마이크로시링에 짧은 유연한 폴리머 튜브(~3cm, 1.181')를 잘라 부착합니다.
- 짧은 유연한 튜브의 다른 쪽 끝을 멸균물로 채워진 1mL 주사기, 25 G 바늘(OD 0.018')에 연결합니다.
- 짧은 유연한 튜브를 통해 물이 나올 때까지 정밀 유리 미세 주사기에 물을 주입하십시오. 짧은 유연한 튜브를 분리합니다.
- 정밀 유리 현미경의 ~7 μL 마크에 도달할 때까지 플런저를 다시 삽입합니다.
- 주입 펌프 기계의 운명 슬롯에 정밀 유리 현미경을 삽입합니다.
- 인젝터를 정밀 유리 현미경에 부착하고 0.35 μL/min 의 속도와 총 부피 0.35 μL로 설정을 구성합니다.
- 인젝터 팁 아래에 종이 닦아 넣습니다. 인젝터의 기포 위치를 표시하고 주입 펌프 기계를 시작하고 비큐컬린 드롭이 나타나는지 확인합니다. 주입 후, 다시 기포 위치를 표시합니다.
참고: 두 마크 간의 차이는 실험 주사 중 원하는 차이에 해당합니다. - 실험 케이지에 쥐를 넣고 더미를 제거합니다.
- 인젝터를 끝까지 이식된 캐뉼라에 삽입합니다(그림 3A참조).
- 주입 펌프 기계를 시작합니다. 기포가 움직이는지 확인합니다. 스톱워치를 시작하여 틱 시작 및 종료 시간을 추적합니다.
- 주입 후 1 분, 인젝터를 제거하고 천천히 더미를 다시 삽입.
참고: 주사 후 더미를 삽입하면 바이큐컬린을 주입 대상으로 밀어 넣습니다.
- 포스트 주입
- 정밀 유리 현미경주사기에서 인젝터를 분리합니다.
- 공기가 채워진 주사기를 사용하여 인젝터에서 나머지 용액을 씻어내보시면 됩니다. 멸균물로 인젝터를 청소한 다음 인젝터를 통해 공기를 주입하여 배수합니다.
- 주입 펌프 기계에서 정밀 유리 현미경을 분리하고 멸균 물로 청소하십시오.
2. 만성 모델
- 수술 전 준비
- 캐뉼라 가이드 준비
참고: 캐뉼라 가이드는 주입 튜브의 일부이며 이식 중에 수분 홀더에 주입 캐뉼라를 부착하는 데 사용됩니다.- 스테인레스 스틸 12mm(0.472')를 자르고, 25G(OD 0.02', ID 0.015') 저혈압을 사용하여 캐뉼라가이드(도 2,장치 #1)를 획득한다. 로터리 도구를 사용하여 직선 가장자리를 달성합니다.
- 1.1.4 단계에서 설명한 대로 캐뉼러 홀더를 준비한다. 캐뉼라 홀더를 캐뉼라 가이드에 삽입하여 제대로 부착되었는지 확인하고 제거합니다.
- 주입 캐뉼라 준비
참고: 주입 캐뉼라는 주입 튜브의 일부이기도 합니다. 그것은 줄무늬의 최종 목표에 이식하고 양성분의 초점 주입을 허용합니다.- 컷 스테인레스 스틸, 30 G (OD 0.012', ID 0.007') 주혈 캐뉼라를 얻기 위해 하이포 튜브. 로터리 도구를 사용하여 직선 가장자리를 달성합니다. 총 주입 캐뉼라 길이는 원하는 이식 깊이와 안전 인자(~1-2mm)의 합이며, 0.039'-0.079'), 주입 캐뉼라 벤트 부분(2mm, 0.079'), 캐뉼라 가이드(3mm, 0.118')와 겹치는 것, 수평 부분(4mm, 0.157')(그림 2,장치 #2).
참고: 급성 모델과 달리 이식 깊이는 최종 주입 대상과 같습니다. - 0.005''직경 와이어를 주입 캐뉼라에 삽입하고 의도한 위치에서 L 모양으로 구부립니다. 수직 부품은 원하는 이식 깊이와 4-5mm(0.157'-0.197')에 해당하며, 수평 부품은 4mm(0.157')입니다.
참고: 내부 와이어를 삽입하면 굽힘 중에 캐뉼라가 방해되지 않습니다.
- 컷 스테인레스 스틸, 30 G (OD 0.012', ID 0.007') 주혈 캐뉼라를 얻기 위해 하이포 튜브. 로터리 도구를 사용하여 직선 가장자리를 달성합니다. 총 주입 캐뉼라 길이는 원하는 이식 깊이와 안전 인자(~1-2mm)의 합이며, 0.039'-0.079'), 주입 캐뉼라 벤트 부분(2mm, 0.079'), 캐뉼라 가이드(3mm, 0.118')와 겹치는 것, 수평 부분(4mm, 0.157')(그림 2,장치 #2).
- 유연한 카테터 튜빙 준비
참고 : 그것은 또한 주입 튜브의 구성 요소입니다. 주입 캐뉼러를 튜빙 어댑터를 통해 미니 삼투압 펌프에 연결합니다.- 폴리에틸렌(PE)-10 튜브(ID 0.011', OD 0.025')의 8cm(3.149')를잘라냅니다(그림 2,장치 #3).
참고: 카테터의 길이는 이식 대상과 펌프 위치 사이의 거리에 의해 결정되어 쥐의 머리와 목의 자유로운 이동을 허용합니다(그림 3B참조).
- 폴리에틸렌(PE)-10 튜브(ID 0.011', OD 0.025')의 8cm(3.149')를잘라냅니다(그림 2,장치 #3).
- 주입 튜브의 조립
참고: 주입 튜브는 미니 삼투압 펌프에서 뇌로 양성선을 수행합니다. 그것은 캐뉼라 가이드, 주입 캐뉼라, 유연한 카테터 튜브, 튜브 어댑터 및 흐름 중재자(그림 2)로구성됩니다.- 주입 캐뉼라에서 내부 와이어를 제거합니다. 현미경의 밑에 캐뉼라를 검사하여 가장자리가 양쪽에 열려 있고 깨끗한지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 30 G(OD 0.01') 바늘을 사용하여 엽니다.
- CA 접착제와 CA 가속기를 사용하여 3mm(0.118')가 겹치는 구부러진 부분 근처의 주입 캐뉼라의 수직 섹션에 캐뉼러 가이드를 붙입니다.
- 주입 캐뉼라의 수평 부분을 유연한 카테터 튜브에 삽입합니다. 겹치는 것은 최소 2mm(0.079')여야 합니다.
- 펌프 유량 중재자의 반투명 캡을 배출합니다. 이것은 짧은 스테인레스 스틸 캐뉼라 튜브(그림 2,장치 #5.1)를 드러낼 것이다.
참고: 유량 중재자는 미니 삼투압 펌프 키트의 일부입니다. 반투명 캡, 짧은 캐뉼라 부분, 흰색 플랜지 및 긴 캐뉼라 부분으로 구성됩니다. 긴 캐뉼러 부분은 미니 삼투압 펌프에 삽입되며 짧은 캐뉼라 부분은 튜브 어댑터를 통해 카테터 튜빙에 연결됩니다. - 튜브 어댑터(그림2,장치 #4)를 70% 알코올로 담급니다. 재료가 팽창 할 수 있도록 몇 분 기다립니다.
- 튜브 어댑터를 유동 중재자의 짧은 캐뉼라 부분에 부착하여 흰색 플랜지(그림2,장치 #5.2)에 닿을 때까지 연결합니다. 튜브 어댑터는 공기 중으로 축소되어 밀폐된 연결을 형성합니다.
- 유연한 카테터 튜빙을 튜빙 어댑터의 열린 끝에 삽입하여 유동 중재자의 짧은 캐뉼러 부분에 닿을 때까지 삽입합니다.
- 클립 스탠드를 사용하여 긴 캐뉼라부분(그림 2,장치 #5.3)을 잡고 모든 연결을 접착제로 고정합니다. 연결은 튜빙 어댑터와 흰색 플랜지, 튜빙 어댑터 및 유연한 카테터 튜빙, 그리고 마지막으로 유연한 카테터 튜빙과 주입 캐뉼라의 수평 부분 사이에 있습니다. 접착제가 완전히 건조 될 때까지 몇 시간을 기다립니다 (접착제 유형에 따라 다름).
참고: PE 호환 접착제를 사용하여 연결이 느슨해지 않도록 합니다. - 27 G (0.014')의 무딘 바늘주사기를 사용하여 주입 튜브의 긴 캐뉼라 부분을 통해 멸균 물을 주입하십시오. 주입 캐뉼라를 통해 물이 원활하게 흐르는지 확인합니다. 주입 튜브를 통해 공기를 주입하여 물을 배출합니다.
- 미니 삼투압 펌프의 프라이밍
참고: 프라이밍은 펌프가 이식 직후 주입을 시작할 수 있는 시동 절차입니다.- 체온(~37°C)에서 물로 가열목욕을 채우는 경우. 멸균 식염수로 작은 비커를 채우고 난방 욕조에 놓습니다.
- 미니 삼투압 펌프를 종이 닦아로 감싸고 클립 홀더 스탠드를 사용하여 개구부를 위쪽으로 향하여 수직으로 고정합니다.
- 27 G (0.014')) 무딘 바늘 주사기를 사용하여 ACSF로 펌프를 채웁니다. 주사기를 제거하는 동안 공기가 유입되는 것을 방지하기 위해 ACSF를 계속 주입하십시오. ACSF 버블이 펌프의 조리개에 나타납니다.
참고: 초기 ACSF 주입은 tics가 유도되기 전에 쥐가 수술에서 완전히 회복할 수 있게 합니다. 선택적으로, 비큐컬린 채워진 펌프는 다음 펌프 교체를 피하기 위해 1차 수술 중에 이식될 수 있지만, 최적19는아니다. - 주사기, 27 G(0.014') 무딘 바늘을 주입 튜브의 긴 캐뉼라 부분에 부착하고 ACSF를 주입합니다. 주사기를 제거하는 동안, 공기가 유입되는 것을 방지하기 위해 ACSF를 계속 주입하십시오. ACSF 버블은 긴 캐뉼라 부분에 나타납니다.
- 긴 캐뉼라 부분을 펌프에 삽입하고 거품을 거품으로 넣습니다. ACSF 버블은 주입 캐뉼라의 끝에 나타나야 합니다.
- 펌프를 비커에 놓습니다. 주입 튜브에 부착된 펌프를 펌프 이식 전 최소 4-6시간(~37°C)에 프라임합니다. 펌프만 식염수에 닿는지 확인합니다.
- 펌프 이식 수술
- 마취 프로토콜에 따라 쥐를 마취한다. 1.2.1 단계를 참조하십시오.
- 쥐의 머리와 등을 면도하고, 전기 클리퍼를 사용하여, 견갑골에 약간 후방.
- 1.2.3-1.2.11 단계에 설명된 대로 수술의 기본 단계를 수행하십시오. 절개는 후두뼈까지 두피를 따라 있어야 합니다.
- 오토클레이브에서 큰 헤모스타트(길이 14cm, 5.512')를 살균합니다. 절개를 통해 헤모스타를 삽입하고 중견선을 통해 피부 밑으로 번갈아 열고 닫음으로써 쥐 의 등에 피하 포켓을 만듭니다.
참고 : 포켓은 펌프를 포함하고 약간 움직일 수있을만큼 커야합니다.
- 미니 삼투압 펌프 및 주입 튜브 이식
- 입체 암에 캐뉼라 홀더를 부착하고 이식을 위해 원하는 위치에 놓습니다.
- 가열 욕조에서 펌프를 제거하고 종이 닦아로 덮여 쥐의 뒷면에 배치합니다.
- 캐뉼라 홀더에 주입 튜브의 캐뉼라 가이드를 밀어.
- 펌프를 헤스트로 잡고 피하 주머니에 부드럽게 삽입합니다.
- 앵커 나사를 이식합니다.
참고: 펌프를 삽입한 후 앵커 나사를 이식하고, 포켓 개구부막을 피하고, 캐뉼라 이식 전에 캐뉼라 변위를 피하십시오. - 대상에 주입 캐뉼라를 이식하고 젤 접착제를 사용하여 두개골에 붙입니다. 건조할 때까지 기다립니다. 앞다리 틱 유도에 대한 좌표는 AP: +1 ~ +1.5, mL: ±2.5, DV: 5.
- 주입 캐뉼라를 따라 치과 시멘트를 적용하여 두개골에 고정하십시오. 건조할 때까지 기다립니다.
- 캐뉼라 홀더를 들어 올려 이식된 캐뉼라를 제자리에 놓습니다.
- 다른 모든 장치를 이식합니다. 모든 임플란트를 덮고, 두개골의 나머지 부분에 치과 시멘트를 적용합니다. 쥐의 자유로운 이동을 가능하게 하기 위해 고정되지 않은 피하 포켓에 충분한 유연한 카테터 튜브를 남겨 둡니다.
참고: 두개골과 포켓 개구부 사이에 노출된 영역이 없고 카테터가 구부러지지 않았는지 확인하십시오. - 1.2.12.10-1.2.12.11 단계에 자세히 설명된 대로 수술을 마무리하십시오.
- 캐뉼라 가이드 준비
- 펌프 교체 수술
참고: 각 소형 삼투압 펌프 유형은 자체 소정의 전달 주입 기간을 가지고 있습니다. 따라서 펌프 교체 수술은 만료 날짜 이전에 수행해야합니다.- 수술 전 준비
- 2.1.5.1-2.1.5.2 단계를 반복합니다.
- 27 G (0.014')) 무딘 바늘 주사기를 사용하여 비큐큘린으로 펌프를 채웁니다. 주사기를 제거하는 동안, 공기가 유입되는 것을 방지하기 위해 비큐컬라인을 계속 주입합니다.
- 펌프 내부에 흐름 중재자(반투명 캡에 부착)를 삽입합니다.
- 펌프를 비커에 놓습니다. 펌프 교체 전 최소 4-6시간(~37°C)에 펌프를 프라임합니다.
- 외과
- 쥐를 마취 (단계 1.2.1.1 참조) 전기 클리퍼를 사용하여 뒷면을 면도.
- 쥐의 등을 포비도오요오드로 뒤로 젖은 다음 알코올 닦아 부위를 살균합니다. 0.5-1% 리도카인 용액(SC)으로 원하는 절개 선을 따라 침투합니다.
- 이식된 펌프 위의 피부에 절개를 합니다. 실온 ACSF로 포켓을 씻고 거즈 패드로 건조시다. 자동 분리 일회용 커튼을 사용하여 절개 근처의 영역을 덮습니다.
- ACSF가 채워진 펌프를 유량 중재자에서 분리하여 기체를 사용하여 폐기합니다.
- 가열 욕조에서 비큐컬린으로 채워진 펌프를 제거합니다. 비큐큘린으로 채워진 펌프에서 유량 중재자를 분리하고 폐기합니다.
- 이식된 유동 중재자에 비큐컬린 으로 채워진 펌프를 부드럽게 부착합니다. 주변 피부에 닿지 마십시오.
참고: 단계 2.2.2.4-2.2.2.6기포를 방지하기 위해 신속하게 수행해야 합니다. 그러나, 펌프는 뇌에 비큐컬라인의 급속한 진입을 방지하기 위해 천천히 삽입되어야한다. - 절개 두 여백을 집게를 사용하여 밀접하게 함께 누릅니다. 조직 접착제로 절개 선을 붙입니다. 대안으로 봉합사를 사용하여 절개를 닫습니다.
- 포비도요오드로 지역을 면봉하고 1.2.12.10-1.2.12.11 단계에 자세히 설명된 대로 수술을 마무리한다.
- 수술 전 준비
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Representative Results
쥐에서 틱 유도에 대 한 급성 및 만성 모델을 생성 하기 위한 프로토콜 위에 제시 되었다. 프로토콜은 수술 및 실험에 대한 전체 준비를 다룹니다(급성 모델의도 1, 만성 모델의 도 2). 비큐컬린을 줄무늬의 모터 영역에 적용하면 진행 중인 모터 틱의 발현이 발생합니다. Tics는 응용 프로그램에 대한 모순측에 나타나며 짧고 반복적인 근육 수축을 특징으로합니다. 줄무늬의 전방 부분에 bicuculline 적용 후, tics는 일반적으로 쥐의 앞다리, 머리 및 턱에서 발현되는 반면, 후방 주사 후, tics는힌드래그(18)에서발현된다. 급성모델(그림 3A)에서틱은 양성선 미세 주입 후 몇 분 후에 나타나기 시작하고, 수십 분 동안 지속되고 결국 부패하고18을중단한다. 만성모델(도 3B)에서tics는 일반적으로 양성골이 채워진 펌프이식(19)에이어 첫날에 나타나기 시작한다. 틱은 낮에는 변동하며, 조용히 깨어있는상태(19)에서가장 명확하게 관찰할 수 있습니다. Tic 발현은 미니 삼투압 펌프의 유형에 따라 며칠 동안 최대 몇 주 동안 진행됩니다.
틱 발현은 비디오, 운동 센서 및신경활동(15,19,22)의동시 녹화에 의해 모니터링 및 정량화될 수 있다. 모터 틱은 가속도계 및 자이로스코프신호(도 4)에서검출될 수 있는 고정관적인 운동적 시그니처를 가지므로 주파수와 강도를 측정할 수 있습니다. 또한 큰 진폭 LFP 과도 스파이크의 출현으로 인해 CBG 경로 전반에 걸쳐 로컬 필드 전위(LFP) 신호를 사용하여 틱타이밍을 평가할 수 있다(도4). 여기에 제시된 결과 및 급성 및 만성 모델의 추가 구현은 전작15,18,19,22,23에서상세히 설명된다. 설치류와 비인간 영장류 모두에서 현악 억제 모델은 모터15,18 및 보컬24 틱 과 다른 행동, 환경 및 약리학적 개입22,25,26에관한 투렛 증후군 및 기타 틱 장애에서 tic 발현의 주요 특성을 복제하였다. 그러나, 기존 사실 인정은 tic 무질서의 복잡한 표현의 빙산의 일각만 형성합니다. 우리는 이 모형이 감각 입력과 같은 환경 효력, 동시 작용 성과 및 다른 처리에 반응과 같은 임상 효력과 같은 행동 효력과 같은 환경 효력에 구역 수색하는 그 같은 요인의 넓은 범위의 연구를 가능하게 할 것이라는 점을 믿습니다.
그림 1: 급성 모델에 사용되는 맞춤형 장치의 회로도 표현입니다. (1) 성수기에 만성적으로 이식되는 임플란트 캐뉼라. (2) 탈착식 내부 와이어인 더미는 이식된 캐뉼라를 밀봉하는 데 사용됩니다. (3) (3.1) 유연한 튜브 및 (3.2) 주사 캐뉼라로 구성된 인젝터는, 줄무늬로 양성선의 급성 전달에 사용된다. (4) (4.1) 염기 및 (4.2) 납으로 구성된 칸눌라 홀더는 이식 중에 임플란트 캐뉼라를 보유하는 데 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 만성 모델에 사용되는 맞춤형 장치와 미니 삼투압 펌프의 회로도 표현. (1) 칸눌라 가이드는 이식 중에 주입 캐뉼라를 보유하는 데 사용됩니다. (2) 주입 캐뉼라는 만성적으로 줄무늬에 이식된다. (3) 유연한 카테터 튜빙은 주입 캐뉼라를 미니 삼투압 펌프에 연결합니다. (4) 튜빙 어댑터는 유연한 카테터 튜빙을 유동 중재자에 연결합니다. (5) 플로우-중재자는 (5.1) 짧은 캐뉼라 부분, (5.2) 흰색 플랜지 및 (5.3) 긴 캐뉼라 부분으로 구성된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 실험 설정의 회로도 표현. 급성 모델에서, tics는 펌프 주입기계(A)를사용하여 양성선 주입에 따라 유도된다. 만성 모델에서, 지속적인 tics는 미니 삼투성 펌프 이식(B)을통해 비큐컬린의 장기간 주입에 의해 달성된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 운동 및 신경 생리학적 기록에서 동기화된 신호의 예입니다. 가속도계, 자이로스코프 및 틱 발현 동안 1차 모터 피질로부터 대응하는 LFP. 대시 회색 선: LFP 신호에 의해 감지된 틱 발병 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 원고에서, 우리는 자유롭게 행동 쥐에 틱 유도에 대한 급성 및 만성 모델의 프로토콜을 자세히 설명했다. 이러한 프로토콜은 특정 연구 요구를 충족하기 위해 사용자 정의에 맞게 조정할 수있는 모든 구성 요소, 수술 및 실험 과정의 준비를 설명합니다. 이러한 모델의 기본 원리는 혈청의 모터 영역에 양성선의 직접적인 로컬 적용이며, 이는10,11,12의혈관생리학에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 두 모델 모두에서 비큐컬린은 맞춤형 이식 된 카누를 통해 대상에게 전달됩니다. 특정 캐뉼라 이식 대상은 틱 발현의 원하는 신체 위치에 따라 달라집니다. striatum은 somatotopically 조직27,28,29,30. 전방 부품에 bicuculline을 적용하면 앞다리, 턱 및 헤드의 틱 발현이 이어지는 반면, 후방 부품에 적용하면 뒷다리틱(18)이발생합니다. 더욱이, 복부 줄무늬(핵 accumbens -NAc)에 적용하면 과잉행동(31)이이어진다. 이 모델은 두 반구와 양자 간 증상을 생산하기 위해 동시 주사를위한 두 가지 줄무늬 표적모두에서 캐뉼라를 이식할 수 있습니다. 이 방법은 tic 발현 모델에도 적용될 뿐만 아니라 신경 활성 화합물의 주사를 필요로 하는 다른 신경 과학 모델에서도 유효합니다.
급성 모델에서는, 표적 부위에 조직 손상을 방지하기 위해 사출 표적 위에 캐뉼라 2mm(0.079')를 이식하는 것이 좋습니다. 사출 캐뉼라에 의한 후속 손상을 최소화하기 위해, 우리는 최종 목표에 도달하기 위해 얇은 30 G 튜브를 사용합니다. 동일한 대상에 대한 다중 주사는 결국 기계적 스트레스로 인한 조직 괴사로 이어질 것이며, 이는 감소된 틱 발현을 유발할 것입니다. 한 가지 가능한 해결책은 후속 주사 중에 인젝터를 더 깊은 표적에 삽입하는 것입니다. 이러한 조직 괴사는 만성 모델에서 발생하지 않으며, 비큐컬린 주입이 정전기를 통해 직접 이식된 주입-캐뉼라를 통해 현액 표적으로 진행되기 때문이다. 만성 주입 캐뉼라 이식으로 인한 잠재적 조직 손상을 최소화하기 위해 30 G 튜브도 사용했습니다. 그러나 유연한 카테터 튜브를 통해 주입 캐뉼라를 유량 중재자에 연결하려면 튜브 어댑터를 사용하여 프로세스의 잠재적 인 실패 지점을 만들어야했습니다. 두꺼운 유연한 카테터 튜브는 유동 중재자에 맞게 사용할 수 있으며, 이는 더 큰 주입 캐뉼라에서 더 큰 조직 손상의 합리적인 비용으로 이어질 수 있습니다.
지난 10년동안 진행 중인 연구를 통해 우리는 비큐컬라인15,18,22,23의특정 농도 및 전달 속도를 정의하여 관찰 가능한 틱 표현의 재현 가능한 행동 현상을 초래했습니다. 이러한 값에서 편차는 더 높은 부피, 농도 또는 주입 비율을 향해, 쥐의 에피소드 발작15,18,32 및 일방적 인 회전을 일으킬 수 있습니다. 낮은 농도는 더 미묘한 결과, 덜 감지 tics, 시간의 짧은 기간에 걸쳐 표현. 만성 모델에서는 전체 기간 동안 발작이 관찰되지 않았습니다. 그러나, 이중질로 채워진 펌프 이식 후 첫날에 광범위한 틱 발현과 일방적 회전 경향이 관찰되었으며, 이는 둘째 날 에 안정화되었다. 이것은, 포스트 뇌 수술 회복과 결합, 동물의 편안함 수준과 웰빙을 방해. 틱 발현으로부터 의 회수 기간을 해리하기 위해 ACSF 가 채워진 펌프선19를이식하는 것이 좋습니다. ACSF 주입의 이 기간은 또한 tic 유도의 앞에 통제 실험을 실시하기 위하여 이용될 수 있습니다. 제어 실험 세션은 또한 ACSF주사(18,33)를활용하여 급성 모델에서 수행될 수 있다.
급성 및 만성 모델 모두 운동 특성과 틱 발현의 신경 상관 관계를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. Tics는 프레임별 오프라인 비디오 분석을 통해 식별할 수 있으며, 이는 시간이 많이 걸리고 정확도가 떨어집니다. 보다 민감한 평가 방법은 전기촬영(EMG) 및 운동 센서(가속도계 및 자이로스코프)(도4)를포함한다. 이를 위해, 운동 장치는 정확한 이동 평가를 위해 신체의 틱 표현 부위 근처에 위치해야 합니다. 상기 신경상관관계는 CBG통로(도 4)를통하여 신경생리학적 기록에 의해 포획될 수 있다. 추가 기록 장치의 이식을 고려할 때, 뇌 내부와 외부의 위치는 주입과의 간섭을 방지하기 위해 신중하게 계획해야합니다.
실험 쿼리의 특성은 틱 식 모델의 선택을 지시해야 합니다. 급성 모델은 간단하고 구현하기 쉽습니다. 여러 일시적인 주사는 비교적 오랜 기간 동안 수행 될 수있다, 여러 뇌 영역에서 동시에 실행할 수 있으며 제어 및 실험 세션을 결합 할 수 있습니다. 만성 모델은 더 복잡하고 쥐의 웰빙의 매일 모니터링이 필요합니다. 그러나 일정하고 장기간의 bicuculline 응용 프로그램은 시간이 지남에 따라 틱 표현의 역학과 변조를 해결할 수있는 기회를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 이스라엘 과학 재단 (ISF) 보조금 (297/18)에 의해 부분적으로 지원되었다. 저자는 M. 브론펠드가 급성 설치류 모델을 확립한 것에 대해 감사하고 M. Israelashvili는 그녀의 의견에 대해 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anchor screws | Micro Fasteners | SMPPS0002 | #0 x 1/8 - Pan Head Sheet Metal Screws |
| Bicuculline methiodide | Sigma Aldrich | 14343 | |
| Cyanoacrylate (CA) accelerator | Zap | PT29 | |
| Cyanoacrylate (CA) glue | BSI | IC-2000 | This glue was found to be stronger than others |
| Dental cement | Coltene | H00322 | Hygenic Perm Repair Material Reline Resin Self Cure |
| Glue gel | Loctite | Ultra Gel Control | |
| Hemostat | WPI | 501242 | Any hemostat sized approximately 14 cm would be sufficient |
| Hypo-tube, extra-thin wall 25G | Component supply company | HTX-25X | |
| Hypo-tube, regular wall 22G | Component supply company | HTX-22R | |
| Hypo-tube, regular wall 30G | Component supply company | HTX-30R | |
| Infusion pump machine | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Mini-osmotic pump | ALZET | 2001 | 1.0µl per hour, 7 days |
| PE compatible adhesive | CEYS | Special difficult plastics (suitable for PE) | |
| PE-10 Catheter Tubing | ALZET | PE-10 | ID = 0.28mm, OD = 0.61mm |
| Precision glass microsyringe, 10µl | Hamilton | 80065 | 1701 RNR 10µl syr (22s/51/3) |
| Tissue adhesive | 3M | 1469Sb | Vetbond |
| Tubing-adapter | CMA | 3409500 | |
| Tygon micro bore tubing, 0.02 inch ID * 0.06 OD | Component supply company | TND80-020 | |
| Wire 0.005-inch | Component supply company | GWX-0050 | |
| Wire 0.013-inch | Component supply company | GWX-0130 |
References
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