Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Genererar akuta och kroniska experimentella modeller av motoriskt tic-uttryck hos råttor

Published: May 27, 2021 doi: 10.3791/61743
Automatic Translation
*1, *1, 1
1The Leslie & Susan Goldschmied (Gonda) Multidisciplinary Brain Research Center, Bar-Ilan University
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterar protokoll för att generera akuta och kroniska experimentella modeller av tic uttryck i fritt beter sig råttor. Modellerna är baserade på striatal kanyl implantation och efterföljande GABAA antagonist tillämpning. Den akuta modellen använder övergående injektioner medan den kroniska modellen använder långvariga infusioner via en subkutan implanterad mini-osmotisk pump.

Abstract

Motor tics är plötsliga, snabba, återkommande rörelser som är de viktigaste symptomen på Tourette syndrom och andra tic störningar. Patofysiologi av tic generation är associerad med onormal hämning av de basala ganglierna, särskilt dess primära input struktur, striatum. I djurmodeller av både gnagare och icke-mänskliga primater inducerar lokal tillämpning av GABA A-antagonister, såsom bicuculline och picrotoxin, i de motoriska delarna av striatum lokala disinhibition som resulterar i uttryck av motor tics.

Här presenterar vi akuta och kroniska modeller av motoriska tics hos råttor. I den akuta modellen framkallar bicuculline microinjections genom en kanyl implanterad i dorsala striatum uttrycket av tics som varar under korta tidsperioder på upp till en timme. Den kroniska modellen är ett alternativ som möjliggör förlängning av tic uttryck till perioder på flera dagar eller till och med veckor, med kontinuerlig infusion av bicuculline via en subkutan mini-osmotic pump.

Modellerna möjliggör studier av beteendemässiga och neurala mekanismerna i tic generation genom hela den kortiko-basala ganglivägen. Modellerna stöder implantation av ytterligare inspelnings- och stimuleringsanordningar utöver injektionskabalerna, vilket möjliggör en mängd olika användningar som elektrisk och optisk stimulering och elektrofysiologiska inspelningar. Varje metod har olika fördelar och brister: den akuta modellen möjliggör jämförelse av rörelsens kinematiska egenskaper och motsvarande elektrofysiologiska förändringar före, under och efter tic-uttrycket och effekterna av kortsiktiga modulatorer på tic-uttrycket. Denna akuta modell är enkel att fastställa; Det är dock begränsat till en kort tidsperiod. Den kroniska modellen, även om den är mer komplex, gör det möjligt att studera tic dynamik och beteendemässiga effekter på tic uttryck under längre perioder. Således driver typen av empirisk fråga valet mellan dessa två kompletterande modeller av tic-uttryck.

Introduction

Tics är det definierande symptomet på Tourette syndrom (TS) och andra tic störningar. Tics beskrivs som plötsliga, snabba, återkommande rörelser (motor tics) eller vokaliseringar (vokal tics)1. Tic uttryck varierar vanligtvis i dess temporala (frekvens)2 och rumsliga (intensitet, kroppsplats)3 egenskaper över flera tidsskalor (timmar, dagar, månader och år). Dessa förändringar påverkas av olika faktorer, såsom miljöfunktioner4,5, beteendetillstånd6,7och frivillig och tillfällig undertryckande8.

Även om den neuronala mekanismen som styr motor tics fortfarande inte är helt förstådd, har ett ökande antal teoretiska och experimentella studier gett nya bevis för dess natur9. För närvarande, pathophysiology av tic generation tros involvera kortiko-basala ganglier (CBG) loop, och specifikt är associerad med onormal hämning av striatum, den primära basala ganglier input kärnan10,11,12. Tidigare studier på gnagare och primater har visat att striatum kan avskräckas genom lokal tillämpning av olika GABA A-antagonister, såsom bicuculline och picrotoxin13,14,15,16,17,18. Denna farmakologiska intervention leder till övergående motoriska tic uttryck i kontralateral sidan till injektionen, vilket etablerar en robust akut modell av tic störningar med ansikte och konstruera giltighet. Den akuta modellen är enkel att inducera och gör det möjligt att studera effekterna av kortsiktig modulering såsom elektrisk och optisk stimulering samtidigt med elektrofysiologiska och kinematiska inspelningar före, under och efter tic uttryck. Den akuta modellen är dock begränsad till den korta tidsperioden efter injektionen. Baserat på den akuta modellen föreslog vi nyligen en kronisk modell av tic generation hos råttor som använder en långvarig, fast hastighet infusion av bicuculline till striatum via en subkutan implanterad mini-osmotic pump19. Den här modellen utökar perioden för tic-uttryck till flera dagar/veckor. Den ständiga frisättningen av bicuculline under en lång tidsperiod möjliggör undersökning av effekterna av en mängd olika faktorer såsom farmakologiska behandlingar och beteendemässiga tillstånd på tic uttryck.

Här presenterar vi protokoll för att generera de akuta och kroniska modellerna av tic uttryck hos råttor. Som en funktion av den specifika forskningsfrågan möjliggör protokollen finjustering av parametrarna inklusive ensidig kontra bilateral implantation, ticsplatsen (enligt striatumens somatotopiska organisation)18 och vinkeln på implantatbalken (beroende på platsen för ytterligare implanterade enheter). Metoden som används i den kroniska modellen är delvis baserad på kommersiella produkter men med kritiska justeringar för att passa tic-modellen. Den här artikeln beskriver de justeringar som behövs för att anpassa dessa tic-modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden godkändes och övervakades av den institutionella kommittén för djurs vård och användning och följdes av National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och Bar-Ilan University Guidelines for the Use and Care of Laboratory Animals in Research. Detta protokoll godkändes av Den nationella kommittén för försök med försök med försök med försök med försöksdjur vid hälsoministeriet.

OBS: Detta protokoll använder kvinnliga Long-Evans råttor (akuta och kroniska modeller) och kvinnliga Sprague Dawley råttor (akut modell) i åldern 3-10 månader, 280-350 g. Implementeringen av dessa modeller i andra stammar, vikter eller åldrar bör testas noggrant för olika reaktioner.

1. Akut modell

  1. Förberedelse före operationen
    1. Beredning av implantat kanyl
      OBS: Implantat-kanyl möjliggör lokala bikuculline injektioner i striatum.
      1. Kapa ett hyporör av rostfritt stål, 25 G (OD 0,02', ID 0,015') för att erhålla en implantatkantyl(figur 1,#1). Använd ett roterande verktyg för att uppnå raka kanter. Kanylens längd beror på implantationsmålets djup, vinkeln på kanylimplantationen och den slutliga cementerade lockhöjden. Implantationsmålets djup måste vara 2 mm (0,079') högre än det slutliga injektionsmålet för att förhindra vävnadsskador.
        OBS: Det högsta objektet som implanteras bestämmer lockets höjd.
      2. Sanda och jämna ut implantatkanylkanterna, vilket förhindrar ytterligare mekanisk friktion i hjärnan. För in en nål på 30 G (0,01'' ) genom den för att avlägsna eventuella inre hinder.
    2. Dummy förberedelse
      OBS: Provdockan är en avtagbar inre tråd placerad inuti den implanterade kanylen. Provdockan förseglar den implanterade kanylen, vilket förhindrar dess obstruktion.
      1. Gör en docka genom att kapa en 0,013'' tråd med ett roterande verktyg. Provdockan ska vara 3 mm längre än implantatets kanyllängd(figur 1,enheten #2).
      2. Sätt in provdockan i implantat-kanylen tills den når slutet. Böj överflödig tråd genom att nypa den mot kanylen. Den böjda delen ska vara i linje med implantat-kanylen för att förhindra att provdockan faller ut ur den implanterade kanylen och för att förhindra att råttan tar bort den.
    3. Beredning av injektorer
      OBS: Injektorn, som består av ett flexibelt rör och en injektions-kanyl(figur 1,#3), möjliggör direkt bikukulininjektion i striatum.
      1. Kapa ett flexibelt polymermikroborrör med en böjt polymerrör på 70 cm (OD 0,06'' , ID 0,02'')(figur 1, #3.1).
        OBS: Längden på det flexibla röret definieras av avståndet mellan experimentburen och infusionspumpmaskinens placering. Det måste vara tillräckligt långt för att möjliggöra fri rörlighet för råttan under injektionsperioden, men inte för länge, för att undvika att råttan trasslar in sig i den (se figur 3A).
      2. Kapa ett hyporör av rostfritt stål, 30 G (OD 0.012'' , ID 0.007'') för att erhålla injektions-kanyl(figur 1,#3.2). Använd ett roterande verktyg för att uppnå raka kanter. Den bör mäta 5 mm (0,197') längre än implantatbalkylen: 2 mm (0,079') längre än den implanterade kanylen i hjärnan för att nå det slutliga injektionsmålet och 3 mm (0,118'') för att föra in den i det flexibla röret.
      3. Slipa och jämna ut spetsen på injektionskanylen, vilket förhindrar ytterligare mekanisk friktion i hjärnan. Sätt i en tråd som mäter diametern 0,005 för att kontrollera att den är fri.
      4. Sätt in 3 mm (0,118') av injektionsbalken i det flexibla röret och limma fogen mellan dem för att få en injektor. Använd cyanoakrylatlim och CA-accelerator.
      5. Fäst en spruta med 25 G nål (0,018') fylld med sterilt vatten på injektorn och tvätta den igenom. Detta säkerställer att flödesorienteringen som kommer ut ur injektions-kanylen är rak och enkel. Om flödet inte är rakt, använd spetsen på nålen på 30 G (OD 0,01') för att avlägsna eventuella hinder och förstora injektionsnans kanylhål och kontrollera flödet igen.
    4. Beredning av kanylhållare
      OBS: Kanylhållaren är ansluten till stereotaxiska armen och håller implantatbaljan under implantationen. Kanylhållaren består av kanylhållare och kanylhållare, som limmas ihop(figur 1,enheten #4). Under implantationen är kanylhållarbasen fäst vid stereotaxiska armen, och kanylhållarens ledning är fäst vid implantat-kanylen.
      1. Kanylhållare: Kapa 10 cm (3,947'') rostfritt stål, 22 G (OD 0,028'', ID 0.017'') hyporör(figur 1,anordning #4.1).
      2. Kanylhållare: Kapa 0,013''-tråden till en längd av 3 mm längre än önskad implantat-kanyl(figur 1,anordningen #4.2).
      3. För in kanylhållarens bly i kanylhållarens bas och limma fogen mellan dem med CA-lim och CA-accelerator. Ledningen ska vara 1 mm (0,039') kortare än implantat-kanylen, för att undvika vävnadsskador under implantationen.
    5. Bikukulinpreparat: Lös upp bikucullin methiodid i fysiologisk saltlösning eller konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF) till en slutlig koncentration på 1 μg/μL. Dela upp den upplösta bicuculline i 1 ml sprutor, täck med aluminiumfolie och frys vid -20 °C tills det behövs. Tina vid behov sprutan före användning.
  2. kirurgi
    1. Inducera initial anestesi genom att placera råttan i en konstruerad kammare och leverera 4-5% isofluran blandat med syre med en hastighet av 0,5-1 L/min. Injicera sedan råttan intramuskulär (IM eller IP) med Ketamin och Xylazin (100 respektive 10 mg/kg) blandning.
    2. Raka råttans huvud med hjälp av en elektrisk klippare.
    3. Lägg lidokaingel i råttans öron. Sätt petroleumgel på råttans ögon för att förhindra hornhinnans torkning och trauma.
    4. Fäst råttan i stereotaktiska ramen med öronstänger och tandstång.
    5. Svabba råttans hårbotten med povidonejod och sedan med alkoholservett för att sterilisera området. Infiltrera längs önskad snittlinje med 0,5 - 1% lidokainlösning subkutant (SC). Använd ett skalpellblad, gör ett snitt längs hårbotten.
    6. Dra fascian mot kanterna för att öppna operationsområdet.
    7. Rengör skallen med steril saltlösning med bomullspinne. Vid blödning, använd en cauterizer för att cauterize blodkapillary. Detta steg är avgörande för cap stability över tid.
    8. Kläm fascian med fyra böjda hemostats (två främre, två bakre) för att förstora operationsstället.
    9. Mät koordinaterna bregma och lambda. Utjämna de dorsoventrala (DV) koordinaterna för de två punkterna, så att de ligger inom ett intervall på 100 μm.
    10. Mät och markera koordinaterna för de intresseområden och ankarskruvar som ska implanteras med hjälp av stereotaxiska apparaten. De raka implantations cannula koordinaterna för tic induktion i förbensområdet är: AP: +1 till +1,5, mL: ±2,5, DV: 3; hindlimb område: AP: -0,4 till -0,5, mL: ±3,5, DV:318,20.
      OBS: Vid implantation av flera enheter som förhindrar implantering av kanyl rakt, ändra vinkeln på kanylimplantation och dess koordinater i enlighet därmed (förbenskoordinater: AP: +2,7, mL: ±2,5, DV: 3, vinkel 15° från främre till bakre).
    11. Borra hål i skallen under mikroskopet. Använd en tandborrmaskin med 1/4-1/2 bit hårdmetall rundborr. För att minimera risken för hjärnskador, justera borrhastigheten efter borrningsfärdigheter och undvik mekaniskt tryck. Borra tills hjärnan är synlig, i ca 1 mm. Absorbera eventuellt blod med en bomullspinne och tvätta med steril saltlösning.
      OBS: Ankarskruvarna tjänar till att stabilisera locket. Se till att skruvarna är placerade på båda halvkloten och längs den främre bakre axeln.
    12. Kanylimplantation
      1. Skruva fast ankarskruvarna i hålen. Använd skruvar av rostfritt #0 x 1/8 storlek.
        OBS: Antalet ankarskruvar beror på det totala antalet implanterade enheter. Jordskruvar (t.ex. för elektriska inspelningar eller elektriska stimuleringar) bör nå hjärnytan.
      2. Fäst kanylhållaren på stereotaxiska armen.
      3. Skjut implantatkanylen på kanylhållaren. Placera långsamt implantat-kanylen ovanför hålet tills den når hjärnan.
      4. Mät DV-koordinaterna från hjärnytan. Sänk implantat-kanylen upp till implantationsmålet. Absorbera eventuellt blod som kommer ut ur hålet med en bomullspinne, tvätta med steril saltlösning och torka sedan noggrant.
      5. Limma den implanterade kanylen på skallen med gellim. Vänta tills det är torrt.
      6. Applicera dental cement längs den implanterade kanylen för att fästa den på skallen. Låt 2 mm (0,079'') sträcka sig från den övre änden för att möjliggöra provdocka. Vänta tills det är torrt.
        OBS: Sätt inte cement på kanylhållaren.
      7. Lyft kanylhållaren och lämna den implanterade kanylen på plats.
      8. Sätt in provdockan i den implanterade kanylen.
      9. Implantera alla andra enheter som inspelningsmatriser, optiska fibrer, stimuleringselektroder etc. Applicera dental cement över resten av skallen, som täcker alla implantat.
      10. Injicera 3 ml rumstemperatur Ringers lösning och karprofen 5 mg/kg SC21.
      11. Övervaka råttan tills den återfår medvetandet (djuret är upprätt, har kontroll över sin luftväg och är inte i fara för aspiration). Sätt tillbaka råttan i hemburen för fullständig återhämtning.
  3. Mikroinjektioner
    OBS: Under injektionen är det viktigt att kontrollera att bicucullinens flöde är intakt. Detta kan göras genom att låta en liten luftbubbla bildas i injektorn och övervaka dess rörelse. Injektorns återstående volym kan fyllas med saltlösning, så att ingen bikukulin slösas bort.
    1. Fäst injektorn på en bikuculline spruta med en 25 G nål (OD 0,018'' ). Fyll ~ 1/3-1/2 av injektorn och ta bort sprutan, vilket möjliggör bildandet av en liten luftbubbla.
    2. Fäst injektorn på en steril saltlösningsfylld spruta med en 25 G-nål (OD 0,018'' ). Fyll injektorn tills bicuculline når slutet och en liten droppe kommer ut ur den.
    3. Ta bort kolven på en 10 μL precisionsglasmikrosyring.
    4. Kapa och fäst ett kortflexibelt polymerrör (~3 cm, 1,181'') på precisionsglasmikrosyringen.
    5. Anslut den andra änden av det kortflexibla röret till en 1 ml spruta, 25 G nål (OD 0,018'') fylld med sterilt vatten.
    6. Injicera vatten genom det kortflexibla röret i precisionsglasmikrosyringen tills vatten kommer ut ur det. Koppla bort det kortflexibla röret.
    7. Sätt tillbaka kolven tills den når ~7 μL-märket på precisionsglasmikrosyringen.
    8. Sätt in precisionsglasmikrosyringen i den avsedda öppningen i infusionspumpmaskinen.
    9. Fäst injektorn på precisionsglasmikrosyringen och konfigurera inställningarna till en hastighet av 0,35 μL/min och en total volym på 0,35 μL.
    10. Lägg en pappersservett under injektorspetsen. Markera luftbubblans placering på injektorn, starta infusionspumpmaskinen och kontrollera att en bikuculline droppe visas. Efter injektionen, markera luftbubblans läge igen.
      OBS: Skillnaden mellan de två märkena motsvarar önskad skillnad under den experimentella injektionen.
    11. Lägg råttan i den experimentella buren och ta bort dockan.
    12. För in injektorn i den implanterade kanylen genom änden (se figur 3A).
    13. Starta infusionspumpmaskinen. Kontrollera att luftbubblan rör sig. Starta stoppuret för att hålla reda på tic initierings- och avslutningstider.
    14. En minut efter injektionen, ta bort injektorn och sätt långsamt tillbaka provdockan.
      OBS: Om du för in provdockan efter injektionen trycks biklinen in i injektionsmålet.
  4. Efter injektion
    1. Koppla bort injektorn från precisionsglasmikrosyringen.
    2. Tvätta bort den återstående lösningen från injektorn med en luftfylld spruta. Rengör injektorn med sterilt vatten och dränera den sedan genom att injicera luft genom injektorn.
    3. Koppla bort precisionsglasmikrosyringen från infusionspumpmaskinen och rengör den med sterilt vatten.

2. Kronisk modell

  1. Förberedelse före operationen
    1. Beredning av kanylguide
      OBS: Kanylguiden är en del av infusionsröret och används för att fästa infusionskabaljan på kanylhållaren under implantationen.
      1. Kapa 12 mm (0,472') rostfritt stål, 25 G (OD 0,02'', ID 0,015'') hyporör för att erhålla en kanylstyrning(figur 2,#1). Använd ett roterande verktyg för att uppnå raka kanter.
      2. Bered en kanylhållare enligt beskrivningen i steg 1.1.4. Sätt i kanylhållaren i kanylguiden för att kontrollera att den är ordentligt fastsatt och ta bort den.
    2. Infusion-kanyl beredning
      OBS: Infusionskabalen är också en del av infusionsröret. Det implanteras i det slutliga målet för striatum och möjliggör fokal infusion av bicuculline.
      1. Kapa 30 G hyporör av rostfritt stål (OD 0,012'' , ID 0,007'') för att erhålla en infusions-kanyl. Använd ett roterande verktyg för att uppnå raka kanter. Den totala infusions-kanyllängden är summan av önskat implantationsdjup plus en säkerhetsfaktor (~ 1-2 mm, 0.039'-0.079'), den infusionskanala böjda delen (2 mm, 0,079'), överlappningen med kanylstyrningen (3 mm, 0,118') och den horisontella delen (4 mm, 0,157'' (figur 2,anordning #2).
        OBS: Till skillnad från den akuta modellen är implantationsdjupet lika med det slutliga infusionsmålet.
      2. För in en tråd med diametern 0,005 i infusionsbalk och böj dem i L-form på avsedd plats. Den vertikala delen motsvarar önskat implantationsdjup plus 4–5 mm och den horisontella delen är 4 mm lång.
        OBS: Införandet av den inre tråden förhindrar hinder av kanylen under böjning.
    3. Flexibel beredning av kateterrör
      OBS: Det är också en komponent i infusionsröret. Den ansluter infusions-kanylen till mini-osmotic pumpen via en slangadapter.
      1. Kapa 8 cm polyeten (PE)-10-slang (ID 0,011'' , OD 0,025'')(figur 2,#3).
        OBS: Kateterns längd bestäms av avståndet mellan implantationsmålet och pumpens placering, vilket möjliggör fri rörlighet för råttans huvud och nacke (se figur 3B).
    4. Montering av infusionsröret
      OBS: Infusionsröret leder bicuculline från mini-osmotic pumpen till hjärnan. Den består av kanylguiden, infusionskanan, den flexibla kateterslangen, slangadaptern och flödesmoderatorn (figur 2).
      1. Ta bort den inre tråden från infusionskabaleln. Inspektera kanylen under mikroskopet för att se till att dess kanter är öppna och rena på båda sidor; Om inte, använd en nål på 30 G (OD 0,01') för att öppna den.
      2. Limma kanylguiden på den vertikala delen av infusionsballen, nära den böjda delen, på överlappningen 3 mm (0,118') med CA-lim och CA-accelerator.
      3. För in den horisontella delen av infusionsbaljorna i den flexibla kateterslangen. Överlappningen bör vara minst 2 mm (0,079''
      4. Mata ut pumpflödesmoderatorns genomskinliga lock. Detta kommer att avslöja det korta kanylröret i rostfritt stål(figur 2, enheten #5.1).
        OBS: Flödesmoderatorn är en del av det mini-osmotiska pumppaketet. Den består av ett genomskinligt lock, en kort kanyldel, en vit fläns och en lång kanyldel. Den långa kanyldelen sätts in i mini-osmotic pumpen och den korta kanyldelen ansluts till kateter-slangen via slangadapter.
      5. Sänk ner slangadaptern (Bild 2, enheten #4) i 70% alkohol. Vänta flera minuter för att låta materialet svälla.
      6. Fäst slangadaptern på den korta kanyldelen av flödesmoderatorn tills den vidrör den vita flänsen (bild 2, enheten #5.2). Slangadaptern krymper i luften för att bilda en tät förseglad anslutning.
      7. Sätt in den flexibla kateterslangen i den öppna änden av slangadaptern tills den vidrör den korta kanyldelen av flödesmoderatorn.
      8. Håll den långa kanyldelen (bild 2, enheten #5.3) med hjälp av ett klämstativ och limma alla anslutningar. Anslutningarna är mellan slangadaptern och den vita flänsen, slangadaptern och den flexibla kateterslangen, och slutligen den flexibla kateterslangen och den horisontella delen av infusionskatunnan. Vänta flera timmar tills limet är helt torrt (beroende på limtyp).
        OBS: Använd PE-kompatibelt lim för att förhindra att anslutningarna lossnar.
      9. Injicera sterilt vatten genom infusionsrörets långa kanyldel med en spruta med en trubbig nål på 27 G (0,014'). Kontrollera att vattnet rinner smidigt genom infusionskakanylen. Injicera luft genom infusionsröret för att tömma vattnet.
    5. Priming av mini-osmotic pumpen
      OBS: Evakueringen är ett uppstartsförfarande som gör att pumpen kan starta infusionen omedelbart efter implantationen.
      1. Fyll ett värmebad med vatten vid kroppstemperatur (~37 °C). Fyll en liten bägare med steril saltlösning och placera den i värmebadet.
      2. Linda in mini osmotic pumpen med en pappersservett och fixera den vertikalt med öppningen vänd uppåt med hjälp av ett klämhållarstativ.
      3. Fyll pumpen med ACSF med en spruta med en trubbig nål på 27 G (0,014'). När du tar bort sprutan fortsätter du att injicera ACSF för att förhindra att luft kommer in. En ACSF-bubbla visas i pumpens bländare.
        OBS: Den första ACSF-infusionen gör det möjligt för råttan att återhämta sig helt från operationen innan tics induceras. Som tillval kan den bikuculline-fyllda pumpen implanteras under den primära operationen för att undvika följande pumpbyte, men det är inteoptimalt 19.
      4. Fäst en spruta, 27 G (0,014'') trubbig nål på infusionsrörets långa kanyldel och injicera ACSF genom det. När du tar bort sprutan, fortsätt att injicera ACSF, för att förhindra att luft kommer in. En ACSF-bubbla visas i den långa kanyldelen.
      5. Sätt in den långa kanyldelen i pumpen, bubbla för att bubbla. En ACSF-bubbla ska visas vid spetsen av infusionskabaleln.
      6. Placera pumpen i bägaren. Prime pumpen, fäst vid infusionsröret, i minst 4-6 timmar (vid ~37 °C) före pumpimplantation. Se till att endast pumpen kommer i kontakt med saltlösningen.
    6. Pumpimplantation kirurgi
      1. Bedöva råttan enligt anestesiprotokollet. Se steg 1.2.1.
      2. Raka råttans huvud och rygg med hjälp av en elektrisk klippare, något bakre till scapulae.
      3. Utför de grundläggande stegen i kirurgi, enligt beskrivningen i steg 1.2.3-1.2.11. Snittet ska vara längs hårbotten upp till det occipitala benet.
      4. Sterilisera en stor hemostat (~14 cm lång, 5.512'') i autoklav. För in hemostaten genom snittet och skapa en subkutan ficka i råttans rygg genom att växelvis öppna och stänga den under huden genom den mellankaptiska linjen.
        OBS: Fickan ska vara tillräckligt stor för att hålla tillbaka pumpen och låta den röra sig något.
    7. Mini-osmotic pump och infusion tube implantation
      1. Fäst kanylhållaren på stereotaxiska armen och placera den i önskat läge för implantation.
      2. Ta bort pumpen från värmebadet och placera den på råttans rygg täckt med en pappersservett.
      3. Skjut kanylguiden för infusionsröret på kanylhållaren.
      4. Håll pumpen med en hemostat och sätt försiktigt in den i den subkutana fickan.
      5. Implantera ankarskruvarna.
        OBS: Implantera ankarskruvarna efter att pumpen har förts in, för att undvika blockering av ficköppningen och före kanylimplantation för att undvika kanylförskjutning.
      6. Implantera infusionskabaleln i målet och limma fast den på skallen med gellim. Vänta tills det är torrt. Koordinaterna för förbenstic induktion är: AP: +1 till +1,5, mL: ±2,5, DV: 5.
      7. Applicera dental cement längs infusions-kanylen för att fixa den till skallen. Vänta tills det är torrt.
      8. Lyft kanylhållaren och lämna den implanterade kanylen på plats.
      9. Implantera alla andra enheter. Applicera dental cement på resten av skallen, som täcker alla implantat. Lämna tillräckligt med flexibla kateterrör i den subkutana fickan fixerad för att möjliggöra fri rörlighet för råttan.
        OBS: Se till att det inte finns några exponerade områden mellan skallen och ficköppningen och att katetern inte är böjd.
      10. Slutför operationen enligt steg 1.2.12.10-1.2.12.11.
  2. Pump ersättning kirurgi
    OBS: Varje mini-osmotisk pumptyp har sin egen förutbestämda infusionsperiod. Därför bör pumpbytesoperationen utföras före utgångsdatumet.
    1. Förberedelse före operationen
      1. Upprepa steg 2.1.5.1-2.1.5.2.
      2. Fyll pumpen med bikukulin med en spruta med en trubbig nål på 27 G (0,014'). När du tar bort sprutan, fortsätt att injicera bikuculline, för att förhindra att luft kommer in.
      3. Sätt in flödesmoderatorn (fäst vid dess genomskinliga lock) inuti pumpen.
      4. Placera pumpen i bägaren. Prime pumpen i minst 4-6 timmar (vid ~37 °C) före pumpbyte.
    2. kirurgi
      1. Bedöva råttan (se steg 1.2.1.1) och raka ryggen med en elektrisk klippare.
      2. Linda råttans rygg med povidonejod och sedan med en alkoholservett för att sterilisera området. Infiltrera längs önskad snittlinje med en 0,5-1% lidokainlösning (SC).
      3. Gör ett snitt på huden ovanför den implanterade pumpen. Tvätta fickan med rumstemperatur ACSF och torka med gasväv. Använd autoklaverade engångsdraperier för att täcka området nära snittet.
      4. Lossa den ACSF-fyllda pumpen från flödesmoderatorn med hjälp av en hemostat och kassera.
      5. Ta bort den bikucullinefyllda pumpen från värmebadet. Lossa och kassera flödesmoderatorn från den bicuculline-fyllda pumpen.
      6. Fäst försiktigt den bicuculline-fyllda pumpen på den implanterade flödesmoderatorn. Undvik att vidröra den omgivande huden.
        OBS: Steg 2.2.2.4-2.2.2.6 bör utföras snabbt för att förhindra luftbubblor. Pumpen bör dock sättas in långsamt för att förhindra snabb ingång av bicuculline i hjärnan.
      7. Tryck tätt ihop snittens två marginaler med tång. Limma snittlinjen med ett vävnadslim. Som ett alternativ, stäng snittet med suturer.
      8. Svabba området med povidone jod och slutför operationen enligt steg 1.2.12.10-1.2.12.11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokoll för att generera de akuta och kroniska modellerna för tic induktion hos råttor presenterades ovan. Protokollen omfattar hela förberedelsen för kirurgi och experiment (figur 1 för den akuta modellen, figur 2 för den kroniska modellen). Tillämpningen av bicuculline i de motoriska områdena i striatum resulterar i uttryck av pågående motor tics. Tics visas på kontralateral sidan av ansökan och kännetecknas av korta och repetitiva muskel sammandragningar. Efter bicuculline ansökan till de främre delarna av striatum, tics uttrycks vanligtvis i råtta framben, huvud och/eller käke, medan efter bakre injektioner, tics uttrycks i hindlimb18. I den akuta modellen (Figur 3A) börjar tics dyka upp flera minuter efter bicuculline microinjection, varar i dussintals minuter och så småningom sönderfall och upphör18. I den kroniska modellen (Figur 3B) börjar tics vanligtvis dyka upp den första dagen efter den bikuculline-fyllda pumpimplantationen19. Tics fluktuerar under dagen och är tydligast observerbara under det tysta vakna tillståndet19. Tic-uttrycket fortsätter under en period av flera dagar och upp till några veckor, beroende på typen av mini-osmotisk pump.

Tic uttryck kan övervakas och kvantifieras genom samtidiga inspelningar av video, kinematiska sensorer och neural aktivitet15,19,22. Motor tics har en stereotyp kinematisk signatur som kan detekteras i accelerometern och gyroskopsignalerna (figur 4), vilket möjliggör mätning av deras frekvens och intensitet. Tic timing kan också bedömas med hjälp av den lokala fältpotentialen (LFP) signalen i hela CBG-vägen, på grund av utseendet på stora amplitud LFP övergåendespikar 15 (Figur 4). Resultaten som presenteras här och ytterligare implementeringar av de akuta och kroniska modellerna beskrivs i detalj i våra tidigare verk15,18,19,22,23. Striatal disinhibition modell i både gnagare och icke-mänskliga primater replikerade viktiga egenskaper hos tic uttryck i Tourette syndrom och andra tic störningar som rör både motor15,18 ochvokala 24 tics och deras uttryck efter en annan beteendemässiga, miljömässiga och farmakologiskainterventioner 22,25,26. Befintliga resultat utgör dock endast spetsen av isberget av den komplexa manifestationen av tic störningar.  Vi tror att modellen kommer att möjliggöra studier av ett brett spektrum av sådana faktorer, allt från miljöeffekter som sensorisk input, beteendeeffekter som samtidiga verkningsförmåga och kliniska effekter såsom svar på olika behandlingar.

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av de skräddarsydda enheter som används i den akuta modellen. (1) Implantat-kanyl som är kroniskt implanterad i striatum. (2) Dummy, en avtagbar inre tråd, används för att försegla den implanterade kanylen. (3) Injektorn, som består av (3.1) flexibelt rör och (3.2) injektions-kanyl, används för akut leverans av bicuculline till striatum. (4) Kanylhållaren, som består av (4.1) bas och (4.2) bly, används för att hålla implantat-kanylen under implantationen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Schematisk representation av de skräddarsydda enheterna och den mini-osmotiska pump som används i den kroniska modellen. (1) Kanylguiden används för att hålla infusionskanan under implantationen. (2) Infusions-kanylen implanteras kroniskt i striatum. (3) Flexibla kateterrör förbinder infusionskabinen med mini-osmotisk pump. (4) Slangadaptern ansluter den flexibla kateterslangen till flödesmoderatorn. (5) Flow-moderatorn består av (5.1) kort kanyldel, (5.2) vit fläns och (5.3) lång kanyldel. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Schematisk representation av de experimentella inställningarna. I den akuta modellen induceras tics efter en bikukulinjektion med hjälp av en pumpinfusionsmaskin (A). I den kroniska modellen uppnås pågående tics genom långvarig infusion av bicuculline via mini-osmotic pump implantation (B). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Ett exempel på synkroniserade signaler från kinematiska och neurofysiologiska inspelningar. Accelerometer, gyroskop och motsvarande LFP från primärmotorbarken under tic uttryck. Streckad grå linje: tic inkaststid som detekteras av LFP-signalen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta manuskript beskrev vi protokollen för de akuta och kroniska modellerna för tic induktion i en fritt beter sig råtta. Dessa protokoll beskriver beredningen av alla komponenter, operationen och den experimentella processen som kan anpassas för att möta specifika forskningsbehov. Den primära principen bakom dessa modeller är direkt lokal tillämpning av bicuculline till motorområdena i striatum, som är känd för att spela en nyckelroll i patofysiologin för tic störningar10,11,12. I båda modellerna levereras bicuculline till målet genom skräddarsydda implanterade kanyler. Det specifika cannula implantation målet beror på önskad kroppsplats för tic uttryck. Striatum är somatotopically organiserade27,28,29,30. Applicering av bicuculline på dess främre delar leder till tic uttryck i frambenet, käken och huvudet, medan dess tillämpning på de bakre delarna resulterar i hindlimb tics18. Dessutom leder applicering till ventral striatum (nucleus accumbens – NAc) till hyperaktivitet31. Modellerna möjliggör implantation av kanyler på båda halvkloten och i båda striatala målen för samtidig injektion för att producera bilaterala symtom. Denna metod är inte bara tillämplig på tic uttryck modeller, men också giltigt i andra neurovetenskapliga modeller som kräver injektion av neuroaktiva föreningar.

I den akuta modellen föreslår vi att kanylen implanteras 2 mm (0,079'') ovanför injektionsmålet för att förhindra vävnadsskador på målområdet. För att minimera efterföljande skador av injektions-kanylen använder vi ett tunt 30 G-rör för att nå det slutliga målet. Observera att flera injektioner till samma mål så småningom kommer att leda till vävnadsnekros från mekanisk stress, vilket kommer att orsaka minskat tic-uttryck. En möjlig lösning är att föra in injektorn i djupare mål under de efterföljande injektionerna, så länge de förblir lokaliserade i de motoriska områdena i striatum. Denna vävnad nekros förekommer inte i den kroniska modellen, eftersom bicuculline infusion pågår genom en statisk direkt implanterad infusion-kanyl i striatal målet. För att minimera potentiella vävnadsskador från kronisk infusion-kanylimplantation använde vi också ett 30 G-rör. Men för att ansluta infusionskabaleln till flödesmoderatorn via flexibla kateterrör behövde vi använda en slangadapter, vilket skapade en potentiell felpunkt i processen. Tjockare flexibel kateterrör kan användas för att passa flödesmoderatorn, vilket leder till en rimlig kostnad för en större vävnadsskada från den större infusionskabaleln.

Pågående forskning under de senaste 10 åren har gjort det möjligt för oss att definiera specifika koncentrationer och leveranshastigheter av bicuculline15,18,22,23, vilket resulterar i ett reproducerbart beteendefenomen av observerbart tic uttryck. Avvikelse från dessa värden mot högre volymer, koncentrationer eller injektionshastigheter kan orsaka episodiskaanfall 15,18,32 och ensidiga rotationer av råttorna. Lägre koncentrationer resulterar i mer subtila, mindre detekterbara tics, uttryckta under kortare tidsperioder. I den kroniska modellen observerades inga anfall under hela perioden. omfattande tic uttryck och tendens till ensidiga rotationer observerades dock den första dagen efter bicuculline-fyllda pump implantation, som stabiliserades under den andra dagen. Detta i kombination med återhämtning efter hjärnkirurgi stör djurets komfortnivå och välbefinnande. För att skilja återhämtningsperioden från tic uttryck, föreslår vi implantera en ACSF-fylld pump första19. Denna period av ACSF infusion kan också användas för att utföra kontroll experiment före tic induktion. Kontrollera experimentella sessioner kan också utföras i den akuta modellen, med hjälp av ACSF injektioner18,33.

Både de akuta och kroniska modellerna kan användas för att studera kinematiska egenskaper och neurala korrelater av tic uttryck. Tics kan identifieras genom offlinevideoanalys för bildruta, vilket dock är tidskrävande och mindre exakt. Känsligare utvärderingsmetoder inkluderar elektromyografi (EMG) och kinematiska sensorer (accelerometerometer och gyroskop) (figur 4). För detta ändamål måste de kinematiska enheterna placeras nära den tic-uttryckande platsen på kroppen för korrekt rörelsebedömning. De neurala korrelaterna av tic uttryck kan fångas av neurofysiologiska inspelningar i hela CBG-vägen (Figur 4). När man överväger implantation av ytterligare inspelningsenheter måste deras platser både i och utanför hjärnan planeras noggrant för att förhindra störningar i injektionen.

Den experimentella frågans natur bör diktera valet av modell för tic-uttryck. Den akuta modellen är enkel och enkel att implementera. Flera övergående injektioner kan utföras under en relativt lång tidsperiod, kan köras samtidigt i flera hjärnregioner och möjliggöra kombination av kontroll och experimentella sessioner. Den kroniska modellen är mer komplicerad och kräver daglig övervakning av råttans välbefinnande. Ändå ger den konstanta och långvariga bicuculline-applikationen möjlighet att ta itu med dynamiken i tic-uttrycket och dess modulering över tiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie stöddes delvis av ett anslag från Israel Science Foundation (ISF) (297/18). Författarna tackar M. Bronfeld för att ha etablerat den akuta gnagaremodellen och M. Israelashvili för hennes kommentarer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anchor screws Micro Fasteners SMPPS0002 #0 x 1/8 - Pan Head Sheet Metal Screws
Bicuculline methiodide Sigma Aldrich 14343
Cyanoacrylate (CA) accelerator Zap PT29
Cyanoacrylate (CA) glue BSI IC-2000 This glue was found to be stronger than others
Dental cement Coltene H00322 Hygenic Perm Repair Material Reline Resin Self Cure
Glue gel Loctite Ultra Gel Control
Hemostat WPI 501242 Any hemostat sized approximately 14 cm would be sufficient
Hypo-tube, extra-thin wall 25G Component supply company HTX-25X
Hypo-tube, regular wall 22G Component supply company HTX-22R
Hypo-tube, regular wall 30G Component supply company HTX-30R
Infusion pump machine New Era Pump Systems NE-1000
Mini-osmotic pump ALZET 2001 1.0µl per hour, 7 days
PE compatible adhesive CEYS Special difficult plastics (suitable for PE)
PE-10 Catheter Tubing ALZET PE-10 ID = 0.28mm, OD = 0.61mm
Precision glass microsyringe, 10µl Hamilton 80065 1701 RNR 10µl syr (22s/51/3)
Tissue adhesive 3M 1469Sb Vetbond
Tubing-adapter CMA 3409500
Tygon micro bore tubing, 0.02 inch ID * 0.06 OD Component supply company TND80-020
Wire 0.005-inch Component supply company GWX-0050
Wire 0.013-inch Component supply company GWX-0130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Psychiatric Association. DSM-5. American Psychiatric Association. , (2013).
  2. Peterson, B. S., Leckman, J. F. The temporal dynamics of tics in Gilles de la Tourette syndrome. Biol.Psychiatry. 44, 1337-1348 (1998).
  3. Ganos, C., et al. The somatotopy of tic inhibition: where and how much. Movement Disorders. , (2015).
  4. Barnea, M., et al. Subjective versus objective measures of tic severity in Tourette syndrome - The influence of environment. Psychiatry Research. 242, 204-209 (2016).
  5. Silva, R. R., Munoz, D. M., Barickman, J., Friedhoff, A. J. Environmental Factors and Related Fluctuation of Symptoms in Children and Adolescents with Tourette's Disorder. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 36 (2), 305-312 (1995).
  6. Rothenberger, A., et al. Sleep and Tourette syndrome. Advances in Neurology. 85, 245-259 (2001).
  7. Conelea, C. a, Woods, D. W., Brandt, B. C. The impact of a stress induction task on tic frequencies in youth with Tourette Syndrome. Behaviour Research and Therapy. 49 (8), 492-497 (2011).
  8. Ganos, C., Rothwell, J., Haggard, P. Voluntary inhibitory motor control over involuntary tic movements. Movement Disorders. 33 (6), 937-946 (2018).
  9. Yael, D., Vinner, E., Bar-Gad, I. Pathophysiology of tic disorders. Movement Disorders. 30 (9), 1171-1178 (2015).
  10. Kurvits, L., Martino, D., Ganos, C., Eddy, C. M. Clinical Features That Evoke the Concept of Disinhibition in Tourette Syndrome. Frontiers in Psychiatry. 11, 1-10 (2020).
  11. Mink, J. W. Basal ganglia dysfunction in Tourette's syndrome: a new hypothesis. Pediatric Neurology. 25, 190-198 (2001).
  12. Bronfeld, M., Bar-Gad, I. Tic disorders: what happens in the basal ganglia. The Neuroscientist. 19 (1), 101-108 (2013).
  13. Tarsy, D., Pycock, C. J., Meldrum, B. S., Marsden, C. D. Focal contralateral myoclonus produced by inhibition of GABA action in the caudate nucleus of rats. Brain. 101 (1), 143-162 (1978).
  14. Crossman, A. R., Mitchell, I. J., Sambrook, M. A., Jackson, A. Chorea and Myoclonus in the Monkey Induced By Gamma-Aminobutyric Acid Antagonism in the Lentiform Complex. Brain. 111 (5), 1211-1233 (1988).
  15. McCairn, K. W., Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. The neurophysiological correlates of motor tics following focal striatal disinhibition. Brain. 132 (8), 2125-2138 (2009).
  16. Worbe, Y., et al. Behavioral and movement disorders induced by local inhibitory dysfunction in primate striatum. Cerebral Cortex. 19 (8), 1844-1856 (2009).
  17. Pogorelov, V., Xu, M., Smith, H. R., Buchanan, G. F., Pittenger, C. Corticostriatal interactions in the generation of tic-like behaviors after local striatal disinhibition. Experimental Neurology. 265, 122-128 (2015).
  18. Bronfeld, M., Yael, D., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Motor tics evoked by striatal disinhibition in the rat. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 50 (2013).
  19. Vinner, E., Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Prolonged striatal disinhibition as a chronic animal model of tic disorders. Journal of Neuroscience Methods. 292, 20-29 (2017).
  20. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6, (2007).
  21. Flecknell, P. Analgesia and Post-Operative Care. Laboratory Animal Anaesthesia. , (2016).
  22. Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Corticostriatal divergent function in determining the temporal and spatial properties of motor tics. Journal of Neuroscience. 35 (50), 16340-16351 (2015).
  23. Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Spatial and temporal properties of tic-related neuronal activity in the cortico-basal ganglia loop. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8713-8721 (2011).
  24. McCairn, K. W., et al. A Primary Role for Nucleus Accumbens and Related Limbic Network in Vocal Tics. Neuron. 89 (2), 300-307 (2016).
  25. Rizzo, F., et al. Aripiprazole Selectively Reduces Motor Tics in a Young Animal Model for Tourette's Syndrome and Comorbid Attention Deficit and Hyperactivity Disorder. Frontiers in Neurology. 9, 1-11 (2018).
  26. Vinner, E., Matzner, A., Belelovsky, K., Bar-gad, I. Dissociation of tic expression from its neuronal encoding in the striatum during sleep. bioRxiv. , (2020).
  27. Webster, K. E. Cortico-striate interrelations in the albino rat. Journal of Anatomy. 95, Pt 4 532-544 (1961).
  28. Ebrahimi, A., Pochet, R., Roger, M. Topographical organization of the projections from physiologically identified areas of the motor cortex to the striatum in the rat. Neuroscience Research. 14, 39-60 (1992).
  29. Brown, L. L., Sharp, F. R. Metabolic mapping of rat striatum: somatotopic organization of sensorimotor activity. Brain Research. 686, 207-222 (1995).
  30. Brown, L. L., Smith, D. M., Goldbloom, L. M. Organizing principles of cortical integration in the rat neostriatum: Corticostriate map of the body surface is an ordered lattice of curved laminae and radial points. Journal of Comparative Neurology. 392 (4), 468-488 (1998).
  31. Yael, D., Tahary, O., Gurovich, B., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Disinhibition of the nucleus accumbens leads to macro-scale hyperactivity consisting of micro-scale behavioral segments encoded by striatal activity. The Journal of Neuroscience. , 3120 (2019).
  32. Obeso, J. A., Rothwell, J. C., Marsden, C. D. The spectrum of cortical myoclonus. From focal reflex jerks to spontaneous motor epilepsy. Brain. 108, 124-193 (1985).
  33. Bronfeld, M., et al. Bicuculline-induced chorea manifests in focal rather than globalized abnormalities in the activation of the external and internal globus pallidus. Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3261-3275 (2010).

Tags

Beteende Problem 171 Tic induktion motor tics djurmodeller osmotic pump basala ganglier striatum bicuculline GABA antagonister kronisk modell akut modell Tourette syndrom
Genererar akuta och kroniska experimentella modeller av motoriskt tic-uttryck hos råttor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vinner, E., Belelovsky, K., Bar-Gad, … More

Vinner, E., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Generating Acute and Chronic Experimental Models of Motor Tic Expression in Rats. J. Vis. Exp. (171), e61743, doi:10.3791/61743 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter