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Biology

Identificación, aislamiento y caracterización de progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) en el músculo esquelético en la rata

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/61750
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe un método para aislar progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) del músculo esquelético de rata. La utilización de la rata en modelos de lesión muscular proporciona una mayor disponibilidad de tejido del músculo atrófico para el análisis y un repertorio más amplio de métodos validados para evaluar la fuerza muscular y la marcha en animales que se mueven libremente.

Abstract

Los progenitores fibroadiogénicos (FAP) son células intersticiales residentes en el músculo esquelético que, junto con los progenitores miogénicos (MP), desempeñan un papel clave en la homeostasis, lesión y reparación muscular. Los protocolos actuales para la identificación y el aislamiento de LOS FAP utilizan citometría de flujo/clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y los estudios que evalúan su función in vivo hasta la fecha se han realizado exclusivamente en ratones. El mayor tamaño inherente de la rata permite un análisis más exhaustivo de los FAPs en modelos de lesión del músculo esquelético, especialmente en el músculo severamente atrófico o cuando los investigadores requieren una masa de tejido sustancial para realizar múltiples ensayos aguas abajo. La rata también proporciona una selección más amplia de ensayos funcionales musculares que no requieren sedación o sacrificio animal, minimizando así la morbilidad y el uso de animales al permitir evaluaciones en serie. Los protocolos de citometría de flujo/FACS optimizados para ratones son específicos de cada especie, especialmente restringidos por las características de los anticuerpos disponibles comercialmente. No se han optimizado para separar los FAP de la rata o el músculo altamente fibrótico. Se desarrolló un protocolo de citometría de flujo/FACS para la identificación y aislamiento de FAPs y MPs de músculo esquelético de rata sano y denervado, basándose en la expresión diferencial de los marcadores de superficie CD31, CD45, Sca-1 y VCAM-1. Como los anticuerpos primarios validados por citometría de flujo específicos de ratas están severamente limitados, se realizó la conjugación interna del anticuerpo dirigido a Sca-1. Utilizando este protocolo, se confirmó la conjugación exitosa de Sca-1, y la identificación citométrica de flujo de FAPs y MPs fue validada por cultivo celular e inmunotinción de FAPs y MPs aislados de FACS. Finalmente, informamos un nuevo curso de tiempo de FAPs en un modelo prolongado (14 semanas) de denervación de ratas. Este método proporciona a los investigadores la capacidad de estudiar FAPs en un nuevo modelo animal.

Introduction

Las células progenitoras fibroadipogénicas (FAP) son una población de células progenitoras multipotentes residentes en el músculo esquelético que desempeñan un papel crítico en la homeostasis, reparación y regeneración muscular y, por el contrario, también median las respuestas patológicas a la lesión muscular. Como su nombre indica, los FAP se identificaron originalmente como una población progenitora con el potencial de diferenciarse en fibroblastos y adipocitos1 y se pretendía que fueran los mediadores clave de la infiltración fibrograsa del músculo esquelético en lesiones y enfermedades crónicas. Estudios posteriores revelaron que los FAPs son adicionalmente capaces de osteogénesis y condrogénesis2,3,4. Por lo tanto, se anotan más ampliamente en la literatura como progenitores mesenquimales o estromales3,5,6,7,8. En la lesión aguda del músculo esquelético, los FAP ayudan indirectamente en la miogénesis regenerativa al proliferar transitoriamente para proporcionar un ambiente favorable para las células satélite musculares activadas y sus contrapartes progenitoras miogénicas (MP) aguasabajo 1,9,10. En paralelo con la regeneración exitosa, los FAP sufren apoptosis, devolviendo sus números a los niveles basales1,9,10,11. En contraste, en la lesión muscular crónica, los FAP anulan las señales pro-apoptóticas, lo que resulta en su persistencia9,10,11 y reparación muscular anormal.

Los estudios in vivo que evalúan los mecanismos celulares y moleculares por los cuales las FAPs median las respuestas musculares han utilizado modelos animales murinos hasta la fecha1,7,9,10, 11,12,13,14. Si bien los ratones genéticamente modificados son herramientas poderosas para su uso en estos análisis, el pequeño tamaño del animal limita la disponibilidad de tejido para el estudio en modelos de lesiones localizadas a largo plazo donde la atrofia muscular puede ser profunda, como la denervación traumática. Además, la medición de la fuerza muscular y la función física requiere mediciones ex vivo o in situ que requieren la terminación del ratón, o métodos in vivo que requieren cirugía y / o anestesia general para permitir la evaluación del rendimiento contráctil muscular15,16,17,18,19,20 . En ratas, existen análisis funcionales musculares bien validados y utilizados a nivel mundial, además de análisis para comportamientos motores más complejos, como el análisis de la marcha (por ejemplo, índice de función ciática, análisis catwalk) y se realizan en animales despiertos y que se mueven espontáneamente21,22,23,24 . Esto también optimiza los principios de morbilidad mínima en la experimentación con animales y el número de animales de investigación utilizados. De este modo, la rata proporciona al investigador de FAPs la flexibilidad adicional de un mayor volumen muscular lesionado para análisis de proteínas y celulares y la capacidad de realizar evaluaciones en serie de la actividad y los comportamientos funcionales estáticos y dinámicos complejos musculares, en el animal alerta.

Los FAP se han identificado y aislado principalmente de muestras de músculo entero utilizando citometría de flujo y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) respectivamente. Se trata de ensayos basados en láser que son capaces de identificar múltiples poblaciones celulares específicas en función de rasgos característicos como el tamaño, la granularidad y una combinación específica de marcadores intracelulares o de superficie celular25. Esto es muy ventajoso en el estudio de un sistema de órganos como el músculo esquelético, ya que la homeostasis y la regeneración son procesos complejos y multifactoriales coordinados por una gran cantidad de tipos de células. Un estudio seminal identificó FAPs, así como MPs, utilizando métodos citométricos de flujo en el músculo esquelético de ratón1. Demostraron que los FAP son de naturaleza mesenquimal, ya que carecían de antígenos de superficie específicos para las células de origen endotelial (CD31), hematopoyético (CD45) o miogénico (Integrin-α7 [ITGA7]), pero expresaron el marcador de células madre mesenquimales Sca-1 (antígeno de células madre 1)1 y se diferenciaron en células fibrogénicas y adipogénicas en cultivo. Otros estudios demostraron el aislamiento exitoso de progenitores mesenquimales en el músculo basado en la expresión de un marcador alternativo de células madre, el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα)2,7,8 y un análisis posterior reveló que estos probablemente sean la misma población celular que los FAPs3. Los FAP ahora se identifican comúnmente en citometría de flujo utilizando Sca-1 o PDGFRα como un marcador de selección positivo1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Sin embargo, el uso de PDGFRα es preferencial para el tejido humano, ya que aún no se ha identificado un homólogo humano directo de Sca-1 murino32. Además, otras proteínas de la superficie celular han sido reportadas como marcadores de MPs (por ejemplo, VCAM-1), proporcionando una alternativa potencial a ITGA7 como indicador de células de linaje miogénico durante el aislamiento de FAPs33.

Si bien la citometría de flujo/FACS es una metodología poderosa para estudiar el papel y el potencial patogénico de los FAPs en el músculo esquelético1,9,10,11, 13,29,está limitada técnicamente por la especificidad y optimización de sus reactivos requeridos. Dado que la identificación citométrica de flujo y el aislamiento de FAPs se ha desarrollado y llevado a cabo en modelos animalesde ratón 1,9,10, 11,29,esto plantea desafíos para los investigadores que desean estudiar FAPs en otros organismos modelo. Muchos factores, como el tamaño óptimo del tejido a procesar, así como la especificidad y disponibilidad de reactivos y / o anticuerpos, difieren según la especie utilizada.

Además de las barreras técnicas para estudiar los FAP en un nuevo modelo animal, se han estudiado en gran medida en un entorno agudo y tóxico, generalmente a través de una inyección química intramuscular o cardiotoxina. La evaluación de la dinámica a largo plazo de los FAPs se limita principalmente a la evaluación en la distrofia muscular de Duchenne, utilizando el modelo de ratón mdx9,10,11,y modelos de lesión muscular combinada como el desgarro masivo del manguito rotador donde se realiza transección y denervación concurrente del tendón en la musculatura del hombro26,27,28 . La respuesta de los FAP al único insulto de la denervación traumática crónica, una ocurrencia común en accidentes en el lugar de trabajo en la industria pesada, la agricultura y en traumas de nacimiento (lesión del plexo braquial)34,35,36,37 con morbilidad significativa, no se ha caracterizado tan bien, a menudo limitada a un marco de tiempo a corto plazo11,38.

Describimos un método para identificar y aislar FAPs y MPs de músculo esquelético sano, así como severamente atrófico y fibrótico en la rata. En primer lugar, se demuestra la identificación de CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs y CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ utilizando un protocolo de tinción de digestión tisular y citometría de flujo y posterior validación de nuestros hallazgos mediante cultivo y tinción inmunocitoquímica de células aisladas de FACS. Usando este método, también informamos un nuevo curso de tiempo de FAPs en un modelo de lesión por denervación aislada a largo plazo en la rata.

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Protocol

Los investigadores que llevan a cabo este protocolo deben recibir el permiso de su junta local de ética animal / comité de cuidado. Todo el trabajo con animales fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de St. Michael's Hospital Unity Health Toronto (ACC # 918) y se llevó a cabo de acuerdo con las pautas establecidas por el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales (CCAC). Un esquema del protocolo de citometría de flujo se muestra en la Figura 1. Si la aplicación posterior es FACS y el cultivo celular posterior, todos los pasos deben completarse con la técnica aséptica adecuada.

1. Cosecha muscular

  1. Anestesiar a las ratas usando un anestésico apropiado y sacrificar de acuerdo con el vivero local y las pautas de la junta de ética animal. Este protocolo cosecha el músculo gastrocnemio de ratas Lewis hembras adultas (200-250 g), como ejemplo. Las ratas fueron anestesiadas con isoflurano al 2-3% y fueron sacrificadas por inyección intracardíaca de T61.
  2. Una vez sacrificado el animal, afeitar toda la extremidad posterior para facilitar la localización del músculo y minimizar la contaminación del pelaje del tejido cosechado.
  3. Usando un bisturí estéril, haga dos incisiones en la piel: la primera alrededor de la circunferencia de la articulación del tobillo y la segunda en la línea media del aspecto medial de la extremidad posterior desde el tobillo hasta la cadera.
  4. Pelar hacia atrás la piel y las capas musculares superficiales para revelar el gastrocnemio subyacente, que se origina en los cóndilos medial y lateral del fémur y se inserta en el tendón de Aquiles.
  5. Use la disección contundente para separar el gastrocnemio del tejido circundante, manejando el músculo solo por el tendón para evitar lesiones por aplastamiento.
  6. Separe el gastrocnemio de su inserción transectando el tendón de Aquiles lo más distalmente posible con tijeras afiladas. Una vez cortado, agarre el tendón de Aquiles con fórceps y despegue suavemente el gastrocnemio del hueso subyacente. Aún sosteniendo el músculo con fórceps en una mano, localice los dos orígenes del gastrocnemio y corte en los cóndilos femoral medial y lateral.
  7. Seque el gastrocnemio extirpado suavemente contra un trozo estéril de gasa para extraer la mayor cantidad de sangre posible. Recorte el músculo en una superficie estéril y elimine cualquier exceso de tejido conectivo, así como el tendón de Aquiles.
  8. Coloque el músculo en un bote de pesaje y pese con una báscula de precisión. Este protocolo está optimizado para digerir el músculo con un peso húmedo que oscila entre 200-600 mg. Los operadores pueden subdividir el exceso de tejido cosechado para otros ensayos aguas abajo, si lo desean.
  9. Divida suavemente el músculo cosechado para usarlo para la citometría de flujo en 3-4 piezas más pequeñas (aproximadamente 1-2 cm3) y sumérjalo en 1x PBS helado. Mantener frío sobre hielo hasta que todas las muestras hayan sido cosechadas.

2. Digestión muscular

  1. Retire el músculo de PBS y colóquelo en un plato de cultivo celular estéril de 10 cm. Rasgar suavemente y picar el tejido con fórceps hasta que las piezas sean de aproximadamente 3-4 mm3,eliminando la mayor cantidad de tejido conectivo posible. Una vez picado completamente, transfiera a un tubo cónico estéril de 50 ml que contenga 6 ml de DMEM + 1% de penicilina/estreptomicina (P/S).
  2. Añadir 10 μL de solución de CaCl2 de 300 mM a 365 μL de solución de colagenasa II (concentración de stock 4800 U/mL) para activar la enzima colagenasa. Añadir la solución de colagenasa II activada al tubo cónico de 50 ml que contiene la suspensión tisular. La concentración final de colagenasa II es de 250 U/mL.
  3. Incubar los tubos en un agitador durante 1 h a 37 °C, 240 x g,asegurándose de girar manualmente cada 15 minutos para desalojar cualquier tejido que se haya adherido al lado del tubo.
  4. Después de 1 h, retire los tubos del agitador y agregue lo siguiente por muestra: 100 μL de Colagenasa II (4.800 U/mL) y 50 μL de Dispasa (4,8 U/mL).
  5. Muestras de pipeta utilizando una pipeta serológica 15-20 veces hasta que la solución sea homogénea. Si procesa varias muestras, use una pipeta estéril separada para cada muestra para evitar la contaminación cruzada de la muestra.
  6. Incubar de nuevo en un agitador durante 30 min a 37 °C y 240 x g. Después de 15 minutos, agite las muestras a mano para desalojar el tejido adherente del lado del tubo.

3. Generación de suspensión monocelular

  1. Corte lentamente las muestras a través de una jeringa de 10 ml con una aguja de 20 G durante 10 ciclos.
    NOTA: Un ciclo consiste en tomar la solución muscular en una jeringa e inyectarla de nuevo en el tubo. Asegúrese de minimizar cualquier burbuja completando el cizallamiento lentamente, ya que la espuma excesiva puede causar muerte celular adicional39.
  2. Coloque un colador de células de 40 μm en un tubo cónico estéril de 50 ml y moje mediante pipeteo de 5 ml DMEM + 10% FBS y 1% P / S.
  3. Pipetear 1 ml de la muestra a la vez a través del colador celular.
  4. Lave el colador celular pipeteando DMEM con 10% FBS y 1% P / S a través del colador para llevar el volumen total en el tubo a 25 ml.
  5. Dividir 25 ml de la muestra por igual en dos tubos cónicos de 15 ml y centrífuga a 15 °C, 400 x g durante 15 min.
    NOTA: Dividir la solución muscular en dos tubos cónicos de 15 ml garantiza una mejor recuperación celular después de la centrifugación en comparación con un solo tubo.
  6. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 1 mL 1x tampón de lisis de rbc (ver Archivo complementario)a temperatura ambiente durante 7 min para eliminar los eritrocitos.
  7. Suba el volumen a 10 ml con 9 ml de tampón de lavado (consulte el archivo complementario)y escinta los tubos a 400 x g,15 °C durante 15 min.
  8. Aspire el sobrenadante y recombine los gránulos volviendo a suspender en un tampón de lavado de 1 ml.
  9. Transfiera un volumen apropiado de células a un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 ml y mézclelo con tinte azul tripano. Cuente las células vivas en un microscopio de luz utilizando un hemocitómetro.

4. Tinción de anticuerpos para citometría de flujo

NOTA: El anticuerpo Sca-1 debe conjugarse con APC antes de los experimentos de citometría de flujo / FACS, según las instrucciones del fabricante. El rendimiento debe validarse para cada lote de conjugados (Figura 2). Las conjugaciones finales se pueden almacenar en alícuotas de 20 μL a -20 °C y son estables durante tres semanas. Consulte el Archivo suplementario para obtener el protocolo de conjugación completo.

  1. Para la citometría de flujo, transfiera 1-2 x 106 células por muestra experimental a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml. Lleve el volumen hasta 1 ml con tampón de lavado y colóquelo sobre hielo.
  2. Para cada experimento, establezca los siguientes controles requeridos: i) no teñidos y ii) controles de viabilidad para seleccionar con precisión la población de células vivas; iii) controles de fluorescencia menos uno (FMO) en suspensiones de una sola célula para establecer puertas precisas para fracciones CD31- / CD45- , FAPs y MPs; y iv) cuentas de compensación de una sola mancha para corregir el derrame de fluorescencia entre canales.
    1. Para todos los controles celulares, alícuota 5 x10 5 - 1 x 106 celdas en 1 ml de tampón de lavado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y colóquela sobre hielo.
    2. Para los controles de perlas, agregue 1 gota de perlas de compensación positiva (~ 1.5 x 105 cuentas por gota) a cada tubo de microcentrífuga etiquetado de 1.5 ml. El complemento completo de controles se enumera en la Tabla 1.
      NOTA: Si el experimento se realiza por primera vez, ejecute controles de una sola teñida para cada anticuerpo conjugado en suspensiones de células individuales (además de los controles de perlas de compensación no teñidas, viabilidad, de una sola mancha y FMO) para evaluar la población teñida positiva en las células y validar la tinción observada en las perlas de compensación. Valide cada preparación Sca-1::APC recién conjugada realizando tinciones simples en perlas de compensación y suspensiones de una sola célula. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista completa de los controles de tinción.
  3. Para preparar el control de viabilidad, transfiera la mitad del volumen de células del tubo de "viabilidad" a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Etiquete este tubo como "Muerto".
  4. Incubar el tubo "Muerto" a 65 ° C durante 2-3 minutos para matar las células, luego colocarlo en hielo. Después de 2-3 min, vuelva a combinar las células muertas con las células vivas que permanecen en el tubo de control de viabilidad. Esta población de células se utilizará para establecer valores de compensación (si es necesario) y establecer correctamente las puertas para el tinte de viabilidad.
  5. Centrifugar las suspensiones unicelulares (muestras experimentales y controles) a 500 x g,4 °C durante 5 min.
  6. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares en un tampón de lavado de 100 μL.
  7. Añadir anticuerpos, dependiendo de la muestra experimental o control. Consulte la matriz de tinción (Tabla 2) para obtener información sobre combinaciones y cantidades de anticuerpos.
  8. Mueva suavemente cada muestra para asegurar una mezcla completa e incube en hielo en la oscuridad durante 15 minutos. Para las perlas de compensación, incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos.
  9. Para muestras experimentales y de control de suspensión unicelular, eleve el volumen a 1 ml agregando un tampón de lavado de 900 μL. Para los controles de perlas de compensación, suba el volumen a 1 ml con 900 μL de 1x PBS.
  10. Muestras de suspensión unicelular centrífuga a 500 x g,4 °C durante 5 min. Controles de perlas de compensación de centrífugas a 300 x g,4 °C durante 5 min.
  11. Para todas las muestras de suspensión de una sola célula, aspire y deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de célula en un tampón de lavado de 300 μL. Para los controles de perlas de compensación, aspire y deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 300 μL de 1x PBS, luego agregue 1 gota (~ 1.5 x 105) de cuentas de compensación negativa.
  12. Mantenga todas las muestras de suspensión de una sola célula en hielo bajo papel de aluminio y proceda a la adquisición citométrica de flujo. Los controles de perlas de compensación también deben protegerse de la luz, pero se pueden mantener a temperatura ambiente.
    NOTA: Si el criterio de valoración experimental es la identificación de FAPs por citometría de flujo, siga los pasos 5.1.1-5.1.11. Si el criterio de valoración es el aislamiento celular a través de FACS para cultivo y tinción, siga los pasos 5.2.1-5.2.9 y las secciones 6-7.

5. Citometría de flujo y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)

  1. Citometría de flujo
    NOTA: Este protocolo emplea un citómetro de flujo de sobremesa equipado con láseres de 405 nm, 488 nm y 640 nm que son capaces de distinguir simultáneamente 10 colores diferentes. Los filtros de paso de banda y sus fluorocromos asociados utilizados en este protocolo son los siguientes: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) y 670/30 (APC). Los voltajes para cada detector son los siguientes: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX Azul 360; APC 570. Asegúrese de estar capacitado en el funcionamiento adecuado del citómetro de flujo o clasificador celular antes de su uso.
    1. Asegúrese de que el citómetro se haya encendido durante 10-20 minutos antes de su uso y se haya cebado limpiando secuencialmente con soluciones de líquido limpio, enjuague y vaina durante 30-45 s cada una. Termine con un enjuague con dH2O. Asegúrese de que se haya agregado un volumen adecuado de líquido de vaina al recipiente de almacenamiento para mantener el flujo de muestra adecuado durante toda la adquisición.
    2. Configure la estrategia de cierre para identificar los FAPs y los MPs como se delinea en la Figura 3.
      NOTA: Los FAPs y MPs se identifican mediante la siguiente estrategia de gating jerárquico: i) SSC-A vs FSC-A (área de dispersión de celdas laterales versus área de dispersión de celdas hacia adelante para separar celdas vs escombros), ii) FSC-W vs FSC-H (ancho de dispersión de celdas hacia adelante versus altura de dispersión de celdas hacia adelante para discriminar singletes de dobletes en el parámetro FSC), iii) SSC-W vs SSC-H (ancho de dispersión de celda lateral versus altura de dispersión de celda lateral para discriminar singletes de dobletes en el parámetro SSC), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (para distinguir singletes vivos versus muertos), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (para excluir las células CD31+ y CD45+ de análisis posteriores), y vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E del CD31-/CD45- (Linaje; Lin-) población (identificación de FAPs y MPs). Los FAP se identifican como eventos CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- y los MPs se identifican como eventos CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+.
    3. Primero ejecute cada control de perla de compensación de una sola teñida a través del citómetro a baja velocidad para generar valores de compensación utilizados para corregir cualquier derrame de fluorescencia entre canales. Evalúe la compensación comparando la señal fluorescente de cada control en su propio detector (por ejemplo, SSC-A vs APC para Sca-1: : APC cuentas de una sola teñida), así como todos los demás detectores. Debe haber dos poblaciones distintas (una con señal negativa y otra con señal positiva) en el detector apropiado y solo una población negativa en todos los demás detectores. Establezca la puerta de parada en 10,000 eventos de cuentas de compensación y registre los datos.
      NOTA: Entre la adquisición de cada muestra, asegúrese de pasar dH2O a través del citómetro durante 10-20 segundos para evitar la contaminación de muestra a muestra.
    4. A continuación, procese las muestras de control no teñidas y de viabilidad para que se cierren correctamente en células individuales vivas. Establezca la puerta de parada en 10.000 eventos singlet y registre datos.
      NOTA: Aproximadamente 5 minutos antes de la adquisición de cada muestra de suspensión de una sola célula, con la excepción de la muestra no teñida, agregue 1 μL de colorante de viabilidad SYTOX Blue (concentración de trabajo de 300 μM diluida a partir de una solución madre de 1 mM) a cada muestra y mueva suavemente para mezclar (concentración final de 1 μM).
    5. A continuación, adquiera las muestras de control de suspensión de una sola celda restantes. Evaluar cada control FMO con su gráfica apropiada en la estrategia de gating (Figura 3). Por ejemplo, evalúe la señal FITC del FMO CD31+CD45 para garantizar una puerta CD31-/CD45- precisa. Un ejemplo óptimo se muestra en la Figura 3G. Si el protocolo se realiza por primera vez, los controles de una sola teñida en las células deben ejecutarse antes de la adquisición de los controles FMO.
    6. Evalúe la señal fluorescente de cada muestra de célula teñida individualmente en su detector apropiado, así como en todos los demás detectores para validar la compensación adecuada. Establezca la puerta de parada en 10,000 eventos singlet en vivo y grabe en el software.
    7. Una vez que se hayan procesado todos los controles (suspensiones y perlas de una sola célula), prepare todas las muestras experimentales midiendo y registrando primero el volumen de cada muestra. Estas mediciones se utilizarán para cuantificar con precisión los FAPs y MPs, como se describe en el paso 5.1.11. Luego, agregue 50 μL de cuentas de conteo de precisión y mezcle suavemente mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces.
    8. Ejecute brevemente la primera muestra experimental para validar la identificación de la población de cuentas de conteo. Esta población aparece como un pequeño grupo distinto separado de la población celular general en la gráfica FSC-A vs SSC-A(Figura 3A,cuadro rojo). Cree una puerta alrededor de la población de cuentas de conteo. Luego adquiera datos para cada muestra experimental procesando a través del citómetro a baja velocidad. Establezca la puerta de parada en 10,000 eventos de cuentas de conteo y registre.
      NOTA: Los investigadores pueden identificar alternativamente las cuentas de conteo mediante la configuración de una gráfica adicional que evalúe SSC-A frente a cualquiera de los detectores, ya que las cuentas de conteo son fluorescentes en todos los detectores.
    9. Después de que todas las muestras hayan sido procesadas, limpie el citómetro utilizando los protocolos apropiados. Exporte todos los datos para su análisis.
    10. Abra todos los archivos de datos en un software de análisis de citometría de flujo adecuado. Establezca la estrategia de cierre como se utiliza para la adquisición de datos como se describe en el paso 5.1.2. Examine los controles en el mismo orden que en la adquisición de datos (por ejemplo, sin manchar, viabilidad, tinción única, luego controles FMO) para volver a validar la estrategia de cierre. Una vez que se hayan establecido puertas precisas utilizando controles FMO, aplique las puertas a todas las muestras experimentales. Exporte datos sin procesar como una hoja de cálculo para la cuantificación.
    11. Calcule el número de FAPs y MPs en cada muestra experimental usando las cuentas de conteo:
      Equation 1
      donde, Recuento de células adquiridas es el número de eventos registrados de la población celular pertinente (por ejemplo, FAPs o MPs) en el software de adquisición; El recuento de cuentas adquiridas es el número de eventos registrados de conteo de cuentas en el software de adquisición; Counting Beads Volume es el volumen de solución de counting bead agregado en el paso 5.1.7; Volumen de muestra es el volumen de cada muestra experimental teñida antes de la adición de cuentas de conteo. Concentración de perlas es el número de perlas por μL de solución; este valor se encuentra en la hoja de datos del producto.
  2. FACS - clasificación para cultivo celular
    NOTA: Este protocolo realiza FACS en un clasificador celular equipado con 4 láseres (UV, Violeta, Azul, Rojo) que es capaz de distinguir simultáneamente 11-14 colores. Siga el protocolo experimental de tinción de muestras (sección 4) y citometría de flujo, con las excepciones de los pasos 1 a 3 que se describen a continuación, para optimizar el flujo de trabajo de FACS:
    1. Aumentar la concentración de células en las muestras experimentales a clasificar a 7 x 106 células/ml para generar rendimientos robustos de FAPs y MPs.
    2. Para explicar este aumento significativo en la concentración celular, duplique todas las concentraciones de anticuerpos en las muestras experimentales que se clasificarán.
    3. Procese las muestras finales de células teñidas a través de una tapa de filtro de células de 40 μM fijada a un tubo de poliestireno de 5 ml inmediatamente antes de la clasificación para reducir la aglomeración celular y aumentar los rendimientos de clasificación.
    4. Recolecte FAPs y MPs de ratas únicas y vivas directamente del clasificador celular en un tubo de recolección de polipropileno de 5 ml que contenga 1 ml de suero bovino estéril y 100% fetal (FBS). Mantenga las células en hielo hasta que se complete la clasificación.
      NOTA: Si realiza FACS en una ubicación fuera del sitio, transfiera todas las celdas clasificadas en hielo y en un contenedor seguro y cubierto.
    5. Trabajando en un gabinete de bioseguridad estéril (BSC), lleve el volumen de células clasificadas hasta 7 ml con medios de crecimiento apropiados (por ejemplo, medios de crecimiento FAP (FAP GM) para FAP clasificados y medios de crecimiento MP (MP GM) para MPs clasificados; consulte el Archivo complementario para recetas) y centrífuga a 500 x g, 4 ° C durante 7 minutos para eliminar la mayor cantidad posible de tampón de lavado residual.
    6. Resuspend pellets en 1 ml de medios de crecimiento apropiados y placa en una placa de 12 pocillos que contenga una cubierta/pocillo de vidrio estéril recubierto de colágeno de 12 mm para su posterior inmunotinción (ver sección 6).
      NOTA: Si la inmunocitoquímica tiñe para el colágeno, las células clasificadas en placa en una placa de 12 pocillos que contiene una cubierta de vidrio estéril, recubierta de laminina de 12 mm / pozo, en lugar de recubierta de colágeno. Si se requieren experimentos de inmunocitoquímica de progenitores aislados inmediatamente, sembra FAPs y MPs a una densidad de 15,000 células por cm2 y proceda directamente al paso 6.1. Para cultivos a largo plazo para inducir la diferenciación de progenitores, semillas FAPs a una densidad de 5.000 células por cm2, y MPs a una densidad de 7.500 células por cm2.
    7. Incubar células a 37 °C y 5% de CO2 en una incubadora de cultivo celular. Después de las 72 h en cultura, cambia la mitad de los medios de comunicación. Cambie completamente los medios cada 2-4 días después.
    8. Para inducir el desarrollo de miocitos, cambie las culturas de los MP al medio de diferenciación de MP (MD) en el Día 9 de la cultura. Para inducir adipocitos, cambie los cultivos de FAP al medio de diferenciación adipogénica (EA) faP en el día 10 del cultivo.
    9. Para inducir la fibrogénesis, los FAP pueden cambiarse a medios de diferenciación fibrogénica (DF) en momentos variables durante el cultivo o, alternativamente, pueden sembrarse directamente en medios FD después del aislamiento (paso 5.2.6) (Consulte el archivo complementario para todas las recetas de medios).

6. Inmunocitoquímica de FAPs y MPs cultivados

  1. Para validar la clasificación celular y demostrar la pureza de los cultivos DE FAPs y MPs, inmunotinta con marcadores específicos de tipo celular que incluyen PDGFRα (marcador de FAPs), Pax-7 (marcador de células madre muscular [satélite], proteína específica de fibroblastos (FSP-1, marcador de fibroblastos), perilipina-1 (Plin-1, marcador de adipocitos), colágeno tipo 1 (Col1a1, indicador de fibrosis), cadena pesada de miosina (MHC, marcador de miocitos maduros).
    1. Para la inmunotinción de células recién clasificadas, centrifugue la placa de 12 pocillos a 200 x g durante 3 min a temperatura ambiente para facilitar la adherencia de las células a la cubierta / pozo. Este paso no es necesario para las culturas a largo plazo. Quitar medios de cultivo.
    2. Para la inmunotinción con FSP-1, fije las células con 1 ml de metanol 100% (MeOH) durante 2 minutos a 4 °C. Si se inmunotinúa para PDGFRα, Plin-1, Pax7 o Col1a1, fije cultivos celulares con 1 ml de PFA al 4% en 1x PBS durante 15 min a temperatura ambiente. La inmunotinción MHC tolera cualquiera de los dos fijadores.
      NOTA: Para las celdas fijas con metanol, omita el paso 6.2 y continúe con el paso 6.3.
  2. Aspire 4% de PFA y lave rápidamente los cultivos celulares 3-4 veces con 1x PBS. Agregue 1 ml de glicina de 100 mM en 1x PBS e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente para inactivar el PFA residual. Aspire y lave 1-2 veces con 1x PBS.
    NOTA: Las células se pueden dejar en esta etapa en 2 ml de 1x PBS, envueltas en película adhesiva y almacenadas a 4 ° C durante 7-10 días como máximo.
  3. Después del lavado, agregue 1 ml de Triton-X al 0.1% en 1x PBS e incube durante 20 min para permeabilizar las membranas celulares.
  4. Lave los pocillos 2-3 veces con 1-2 ml de 1x PBS y luego bloquee las celdas con 1 mL de 1x PBS + 3% BSA por pozo durante 1 h a temperatura ambiente.
  5. Pipetear 80 μL de anticuerpo primario diluido en 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 neat, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/mL) sobre un trozo de parafilm pegado a un contenedor móvil. Usando fórceps finos estériles, levante cuidadosamente el cobertor del pozo e invierta en la gota de solución de anticuerpos. Incubar el cubrebocas con dos trozos húmedos de toalla de papel y cubrir el recipiente en película de plástico para evitar la evaporación de la solución de anticuerpos. Incubar durante la noche a 4 °C.
    NOTA: La tinción de los cubrebocas fuera del pozo utiliza menos anticuerpos (~ 80 μL) que la tinción dentro del pozo (mínimo de 500 μL).
  6. El día 2, deje los cubrehojas a temperatura ambiente durante 30 minutos para calentarse. Usar fórceps cuidadosamente a la derecha y transferir las hojas de cubierta a sus respectivos pocillos (células hacia arriba) y lavar 2-3 veces con 1-2 ml de 1x PBS durante 2 minutos cada uno para eliminar la mayor cantidad de anticuerpos primarios posible.
  7. Utilizando la misma técnica de tinción que con la tinción primaria de anticuerpos, tiñe las células con el anticuerpo secundario alexa Fluor 488 anti-conejo de cabra (1:400) para detectar FSP-1, Plin-1, Col1a1 o PDGFRα y el anticuerpo secundario anti-ratón de cabra Alexa Fluor 555 (1:300) para detectar MHC o Pax-7. Incubar las células durante 1 h a temperatura ambiente y mantener las células protegidas de la luz.
  8. Devuelva las células al pozo e incube las células con Hoechst (1:10.000) durante 2-4 min a temperatura ambiente. Lave las células otras 2-3 veces con 1x PBS durante 2 minutos cada una para eliminar el exceso de Hoechst.
  9. Monte las fundas en portaobjetos de vidrio utilizando un medio de montaje fluorescente antidesvanecimiento y deje que las diapositivas se sequen durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente. Guarde los cubrecolchas montados a 4 °C en la oscuridad.

7. Tinción de aceite rojo O (ORO) de FAPs y MPs cultivados

  1. Realizar tinción ORO en células no permeabilizadas, ya que la permeabilización de la membrana celular puede resultar en tinción no específica / no deseada de tipos de células no adipogénicas. Antes de comenzar la tinción, prepare un caldo de trabajo ORO (consulte el archivo complementario para la receta) e incube a temperatura ambiente durante 20 min.
  2. Después de 20 min, filtre la solución con un filtro de 0,2 μm para eliminar los agregados no disueltos.
  3. Aspire los medios del pozo y agregue 1 ml de formalina tamponada neutra al 10% (10% NBF). Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
    NOTA: La confluencia celular puede resultar en la elevación del pozo / cubierta. Tenga cuidado al aspirar/agregar soluciones.
  4. Aspirar y añadir 1 mL de NBF fresco al 10% e incubar durante al menos 1 h a temperatura ambiente.
    NOTA: El protocolo se puede detener en este punto, ya que las células se pueden dejar en 10% NBF durante la noche.
  5. Lave rápidamente los pocillos una vez con 1 ml de isopropanol al 60%, luego aspire y deje que los pozos se sequen completamente (aproximadamente 2 min).
  6. Agregue 400 μL de aceite rojo O por pozo e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente, asegurándose de evitar pipetear cualquier ORO en las paredes de la placa.
  7. Retire todo el aceite Rojo O y lave rápidamente el pozo 4 veces con dH2O.
    NOTA: Si los pozos teñidos contienen hojas de cubierta, monte utilizando la misma técnica que se describe en el paso 6.9.
  8. Imagine los labios de cubierta montados o el pozo teñido con un microscopio de campo brillante.

8. Tinción tisular de secciones de gastrocnemio de rata contralateral y denervada

  1. Picrosirius Rojo (PSR)
    1. Realizar tinción PSR en secciones histológicas de parafina gastrocneemius incrustadas en formalina (FFPE) de 5 μm de espesor como se describió anteriormente40.
  2. Aceite Rojo O (ORO)
    1. Fijar secciones histológicas de gastrocnemio de rata congelada con isopentano de 5 μm de espesor en PFA al 4% durante 10 min, incubar en alcohol isopropílico al 60% durante 1 min.
    2. Manchar con material de trabajo ORO durante 12 min. Incubar en alcohol isopropílico al 60% durante 1 min, lavar durante 10 min en dH2O. Montar en fundas utilizando un medio de montaje soluble en agua.
  3. Sca-1 e inmunohistoquímica fluorescente del tejido laminina (IHC)
    1. Realizar IHC fluorescente en secciones histológicas de gastrocneemius de 5 μm de espesor congeladas con isopentano.
    2. Hidrate muestras en 1x PBS durante 5 min, fije en PFA al 4% durante 10 min y luego incube muestras en solución de bloqueo de IF de tejido (ver Archivo suplementario)durante 90 min.
    3. Incubar con anticuerpo primario anti-Sca-1 (1:500) diluido en 1x PBS + 0.05% Tween a 4 °C durante la noche.
    4. El día 2, lavar tres veces en 1x PBS + 0.05% Tween durante 5 min cada uno, luego incubar en cabra anti-conejo Alexa Fluor 555 (1:500) durante 1 h.
    5. Lavar de nuevo (como antes), incubar con solución bloqueadora durante 1 h, luego agregar anticuerpo primario anti-laminina (1:500) diluido en 1x PBS + 0.05% Tween durante 1 h.
    6. Lavar de nuevo (como antes), luego incubar en cabra anti-conejo Alexa Fluor 488 (1:500) durante 1 h (para laminina).
    7. Lavar de nuevo (como antes) y luego incubar en DAPI (1:10.000) durante 4 min. Lave y monte en fundas utilizando un medio de montaje antidesvaneo.

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Representative Results

Identificación de FAPs y MPs a través de citometría de flujo utilizando un nuevo panel de anticuerpos que incluye Sca-1 y VCAM-1
La estrategia de gating para identificar FAPs en músculo de rata se basa en protocolos de citometría de flujo en elratón 29, que se acercan a las células positivas CD31 (endotelial) y CD45 (hematopoyéticas) (denominadas linaje [Lin]) y examina el perfil fluorescente del marcador FAPs Sca-1 y el marcador MPs ITGA7 de la población linage-negativa (Lin-). En ausencia de anticuerpos disponibles comercialmente, conjugados con fluoróforos y validados por citometría de flujo para Sca-1 e ITGA7 de rata, autoconjugamos un anticuerpo Sca-1::APC de rata y emprendimos una estrategia alternativa para identificar a los MP. Como recientemente se demostró que VCAM-1 es un marcador de selección positivo único eficiente para el aislamiento de MPs de rata33 y está disponible un anticuerpo específico de rata, conjugado y validado por citometría de flujo dirigido a VCAM-1, utilizamos VCAM-1 para identificar MPs, a diferencia de ITGA7.

Confirmamos la conjugación y el rendimiento exitosos del anticuerpo Sca-1: APC con tinción única de perlas de compensación y suspensiones celulares generadas a partir de gastrocnemio de rata sana(Figura 2A,B). Se realizó una titulación de cinco puntos de Sca-1::APC(Figura 2C)además de todos los demás anticuerpos (CD31::FITC, CD45::FITC, VCAM-1:PE) utilizados en el protocolo (Figura suplementaria 1),para identificar las concentraciones óptimas. Utilizando este novedoso diseño de panel, se identificaron simultáneamente FAPs y MPs putativos a partir de gastrocnemio sano (Figura 3), por lo que las células monopositivas para Sca-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) fueron designadas FAPs (caja roja) y las células mono-positivas para VCAM-1 (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) fueron designadas MPs (caja azul). También se identificó una población de células doblemente positivas para Sca-1 y VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+)(Figura 3F;cuadrante superior derecho).

Validación de la identificación de FAPs y MPs por FACS y cultivo celular
Para validar el protocolo presentado para la identificación citométrica de flujo de FAPs y MPs en músculo esquelético de rata, se buscó aislar células vivas para cultivo in vitro. Utilizando FACS, se aislaron FAPs y MPs viables utilizando la misma estrategia de gating que en el análisis citométrico de flujo. Se recolectaron aproximadamente 20,000-40,000 FAPs y 30,000-50,000 MPs para cultivo celular de un solo músculo gastrocnemio de una rata de 230 g.

Para confirmar la pureza de cada población, co-inmunotecnizamos FAPs recién clasificados y MPs para PDGFRα y Pax7. PDGFRα es el segundo marcador progenitor mesenquimal, además de Sca-1, comúnmente utilizado para identificar FAPs2,7,8. Pax-7 es un marcador bien reconocido y ampliamente utilizado de células satélite musculares (madre)41. La población clasificada de FAPs mostró tinción positiva para PDGFRα sin contaminación por células positivas Pax7(Figura 4A;fila superior). Por el contrario, la población clasificada de MPs se tiñó positiva para Pax7 con una ausencia de células PDGFRα positivas (Figura 4A;fila inferior), validando la capacidad de lin-/Sca-1+/VCAM-1- y Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ perfiles de antígenos de superficie celular para aislar poblaciones puras de FAPs y MPs respectivamente.

A continuación, cultivamos FAPs y MPs clasificados durante un curso de tiempo de 10-12 días en condiciones para inducir la diferenciación adipogénica, fibrogénica y miogénica. Para el día 12, los cultivos de FAPs sometidos a condiciones adipogénicas contenían células con una morfología similar a la de los fibroblastos o una morfología multilocular similar a la de los preadipocitos blancos con gotas de grasa (datos no mostrados). La inmunotinción para la proteína 1 específica de fibroblastos (FSP-1) confirmó la diferenciación de fibroblastos, mientras que la tinción para Plin-1 (perilipina-1; un marcador de adipocitos)42 y Oil red O confirmó la diferenciación de adipocitos y la presencia de triglicéridos neutros y lípidos, respectivamente (Figura 4B). La ausencia de células contaminantes de un linaje miogénico en los cultivos de FAPs se confirmó mediante coinmunotinción para la cadena pesada de miosina (MHC), un marcador de miocitos diferenciados. Se evaluaron los cultivos de FAPs sometidos a diferenciación fibrogénica (DF) para la expresión de Colágeno tipo 1 (Col1a1), uno de los principales colágenos derivados de FAPs8. La coinmunotinción para Col1a1 y MHC en el día 11 reveló una expresión robusta de colágeno tipo 1 sin células MHC positivas contaminantes(Figura 4B). La confirmación final de la pureza de la población de FAPs se llevó a cabo mediante el cultivo de FAPs en medios miogénicos, para fomentar el crecimiento de cualquier MP contaminante. No se observaron células MHC positivas (Figura suplementaria 2A).

Los cultivos mp sometidos a condiciones miogénicas demostraron miocitos maduros que expresan MHC y miotubos multinucleados 12 días después del recubrimiento (Figura 4C). La coinmunotinción de los cultivos MP con FSP-1 y Plin-1 demostró la ausencia de fibroblastos o adipocitos contaminantes, respectivamente. Del mismo modo, la tinción ORO no demostró contaminación lipídica (Fig. 4C). También se ha informado que Col1a1, que está altamente expresado por fibroblastos, es producido en menor medida por precursores miogénicos y mioblastos, aunque existen datos contradictorios en la literatura al respecto8,43,44. Si bien la coinmunotinción de MPs con Col1a1 y MHC reveló la diferenciación de miocitos de nuestro cultivo de MP, no se encontró evidencia de inmunopositividad de Col1a1(Figura 4C). Para confirmar aún más la pureza de la población, los cultivos de MP se sometieron a condiciones adipogénicas o fibrogénicas para fomentar el crecimiento de adipocitos y fibroblastos(Figura suplementaria 2B). No se observaron células contaminantes del linaje FAPs.

Si bien habíamos demostrado la capacidad de identificar y clasificar poblaciones puras de FAPs y MPs a partir del músculo de la rata, luego buscamos determinar la identidad de las células Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ (doble positivo). Dado que se ha informado que la expresión de Sca-1 en una proporción muy pequeña de MP (aproximadamente el 3%) en músculos sanos45 y, de manera similar, se han reportado pocos FAPs (aprox. 4%) que expresan VCAM-1 en músculos sanos10,se realizó inmunotinción de células Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ recién clasificadas para PDGFRα y Pax7 junto con el cultivo en células miogénicas, adipogénicas, y condiciones fibrogénicas para inducir miogénesis, adipogénesis y fibrogénesis respectivamente. Se encontró que las células doblemente positivas eran una población mixta de MPs y FAPs, con células recién clasificadas inmunotintándose positivas para PDGFRα o Pax7(Figura Suplementaria 3A)y células cultivadas que se diferenciaban en miocitos maduros, adipocitos o fibroblastos(Figura Suplementaria 3B,C).

ITGA7 vs VCAM-1 para identificar MPs durante la identificación de FAPs citométricos de flujo
Si bien se estableció un protocolo exitoso para la identificación citométrica de flujo de FAPs y MPs de rata utilizando Sca-1 y VCAM-1 respectivamente, se buscó determinar si un anticuerpo ITGA7 autoconjugado podría usarse de manera similar para identificar MPs en lugar de VCAM-1, como es estándar en el ratón. Se conjudicó un anticuerpo ITGA7 específico de rata con PE-Cy7 (ver Archivo Complementario)y el rendimiento del anticuerpo se validó en perlas de compensación comercial y suspensiones unicelulares generadas a partir de gastrocnemio de rata(Figura suplementaria 4A-C). El anticuerpo ITGA7::P E-Cy7 se desempeñó adecuadamente en experimentos de tinción única y FMO(Figura suplementaria 4D). Sin embargo, cuando se tiñen completamente las suspensiones de células gastrocnemitas con CD31::FITC, CD45::FITC, Sca-1::APC e ITGA7::P E-Cy7, se hizo evidente una interacción entre los anticuerpos Sca-1::APC e ITGA7::P E-Cy-7. El cultivo posterior tanto de las células Lin-/Sca-1+/ITGA7- clasificadas por FAC (supuestas FAPs) como de las células Lin-/Sca-1-/IGTA7+ (supuestos MPs) (Figura suplementaria 4E) produjo predominantemente FAPs y con pocos MPs (Figura suplementaria 4F), lo que indica que la interacción entre los anticuerpos Sca-1::APC e ITGA7::P E-Cy-7 impactó negativamente en la especificidad de la identificación celular.

Un nuevo curso temporal de FAPs en el músculo esquelético denervado a largo plazo
Como la dinámica de los FAPs se ha evaluado en el contexto de la denervación traumática a corto plazo, en los modelos murinos11,38, buscamos validar el rendimiento de nuestro método para el aislamiento de FAPs tanto del músculo fibrótico sano como de severamente atrófico. Las ratas fueron sometidas a una lesión traumática por denervación a largo plazo utilizando el modelo46 de transección unilateral del nervio tibial bien validado con músculo gastrocnemio cosechado en cuatro puntos de tiempo seriales durante 14 semanas después de la denervación de la extremidad denervada y la extremidad inervada contralateral (para servir como control interno). Como se ha informado anteriormente, el músculo denervado demostró atrofia progresiva (Figura 5A,B), con aumento de la fibrosis y la deposición de grasa (Figura 5C-F) a lo largo del tiempo47.

Nuestro protocolo generó un número adecuado de células para el análisis citométrico de flujo, a pesar de que el gastrocnemio denervado de 12 y 14 semanas pesaba aproximadamente 0.2-0.3 g (15-20% del músculo control contralateral respectivo)(Figura 5B). Observamos una regulación al alza de los FAPs en el músculo gastrocnemio denervado en comparación con el músculo control contralateral inervado, mantenido durante las 14 semanas de duración del experimento(Figura 6A,B),concordante con la fibrosis muscular progresiva y la deposición de grasa. La inmunotinción sca-1 de secciones transversales histológicas musculares confirmó la localización de células que expresan Sca-1 en áreas de cambio fibrograso en músculo denervado de 14 semanas(Figura 5G),además de la expresión basal en el intersticio entre miofibras en músculo sano. Un subconjunto distinto de células surgió en la población de FAPs a lo largo del tiempo después de la denervación caracterizada por un aumento robusto en la señal de Sca-1 (Sca-1 alto; Figura 6A,recuadro rojo) sobre análisis citométrico de flujo, comparado con la expresión basal de Sca-1 de FAPs (Sca-1 Med/Low; Figura 6A,recuadro verde). La cuantificación de estas subpoblaciones reveló dinámicas diferenciales a lo largo del tiempo; Sca-1 Los FAP altos aumentaron significativamente a las 12 y 14 semanas después de la denervación(Figura 6B),que comprende aproximadamente la mitad de la población total de FAP(Figura 6C). En contraste, Sca-1 Med/Low FAPs fueron la subpoblación dominante a las 2 y 5 semanas después de la denervación(Figura 6C)y mostraron solo un aumento transitorio en los niveles tempranos después de la denervación(Figura 6B).

En contraste con la presencia sostenida de FAPs en el músculo denervado a largo plazo, los PARLAMENTARIOS demostraron una respuesta bifásica esperada a la denervación. Inicialmente los parlamentarios aumentaron en músculo denervado por encima del observado en la extremidad de control, pero a las 5 semanas después de la denervación la población comenzó a disminuir (Figura 6D). De acuerdo con el agotamiento bien conocido de la población de células satélite musculares en el músculo denervado a largo plazo47,a las 12 semanas los parlamentarios estaban en o por debajo de los niveles basales posteriores a la transección del nervio tibial.

También se analizó la dinámica de la población Lin-/Sca-1+/VCAM-1+(Figura suplementaria 3D-E). Mientras que la frecuencia de células doblemente positivas en relación con la población Lin- disminuyó progresivamente en el músculo denervado con el tiempo, cuando se determinó el recuento absoluto de células por gramo de músculo se observó un aumento temporal en la población doble positiva, antes de caer a o por debajo de los niveles basales a las 14 semanas posteriores a la denervación.

Figure 1
Figura 1: Esquema gráfico para la identificación, aislamiento y cultivo de FAPs y MPs: Esquema gráfico que representa la identificación de FAPs y MPs a partir de gastrocnemio de rata. Las muestras se cosechan y se pican mecánicamente antes de someterse a dos digestiones enzimáticas secuenciales. Las preparaciones de tejido se procesan y filtran para generar una suspensión de una sola célula. Se agrega un cóctel de anticuerpos conjugados fluorescentemente a cada muestra que luego se ejecuta a través de un citómetro de flujo o un clasificador celular para identificar o aislar respectivamente FAPs y MPs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Sca-1::Validación y titulación de anticuerpos autoconjugados apc. Validación de la conjugación de anticuerpos Sca-1::APC por tinción única en perlas de compensación comercial (A) y suspensiones unicelulares generadas a partir de músculo gastrocnemio de rata sana (B). Las distintas poblaciones de cuentas y células marcadas con Sca-1 son evidentes (cajas negras). La titulación de anticuerpos se realizó mediante la prueba de cinco concentraciones diferentes de Sca-1::APC en suspensiones unicelulares(C); la concentración óptima se eligió en función de la mayor intensidad de fluorescencia con una tinción de fondo mínima y se encontró que dependía del lote. Se muestra una valoración representativa con la concentración óptima específica del lote indicada por la caja roja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Identificación por citometría de flujo de FAPs y MPs en gastrocnemio de rata. (A-F) Estrategia de cierre para el análisis citométrico de flujo de FAPs y MPs. (A) Las muestras se cierran primero para excluir escombros (caja negra), así como a la puerta para contar cuentas (caja roja). Las celdas se cierran para excluir los dobletes tanto por características de dispersión frontal (FSC)(B)como por dispersión lateral(SSC) (C). La viabilidad de las células individuales resultantes se evalúa mediante tinción con SYTOX Blue (D). Los singletes negativos (vivos) de SYTOX Blue se evalúan para la señal FITC que identifica CD31 y CD45 (Linaje; Lin) para excluir las fracciones lin+ de análisis posteriores (celdas Lin de caja negra) (E). La población Lin- se evalúa entonces para Sca-1::APC versus VCAM-1::P E señal (F). Los FAP se identifican como Lin-/Sca-1+/VCAM-1- (F; cuadro rojo) mientras que los MP se identifican como eventos Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ (F; recuadro azul). También es evidente una población doble positiva Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ (cuadrante superior derecho). (G) Los controles FMO (Fluorescencia Menos Uno) para CD31::FITC y CD45::FITC demuestran una compensación y una compuerta adecuadas para las células Lin. (H-I) Sca-1::APC versus VCAM-1::P E los gráficos de los controles FMO demuestran una compensación y una compuerta adecuadas para FAPs (Sca-1 FMO) y MPs (VCAM-1 FMO). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: FaPs ordenados y MPs cultivo celular e inmunotinción. (A) Coinmunotinción para PDGFRα (verde) y Pax7 (rojo) en FAPs recién ordenados (fila superior) y MPs (fila inferior). Los núcleos se tiñen de azul con DAPI. Los FAP expresan únicamente PDGFRα y no hay células positivas pax7 son evidentes, mientras que los parlamentarios expresan exclusivamente Pax7 sin contaminación celular pdgfrα positiva, lo que demuestra la pureza de ambas poblaciones clasificadas. (B) FAPs en el día 12 en medios de diferenciación adipogénica (AD) tinción positiva para proteína 1 específica de fibroblastos (FSP-1; verde) y perilipina-1 (Plin-1; verde), demostrando fibroblastos y adipocitos diferenciados, respectivamente. Los núcleos se tiñen con DAPI (azul). La tinción de Oil Red O (ORO) (rojo) indica la presencia de triglicéridos neutros y lípidos que surgen de los adipocitos maduros en el día 12. Los FAPs sometidos a medios de diferenciación fibrogénica (FD) demuestran la expresión de colágeno tipo 1 derivado de FAPs (Col1a1; verde). Los FAPs cultivados en medios adipogénicos o fibrogénicos no co-inmunotintan para la cadena pesada de miosina (MHC, rojo), lo que indica una ausencia de miocitos contaminantes. (C) Los MPs cultivados en medios de diferenciación miogénica (MD) en el Día 12 muestran tinción MHC positiva (roja) que demuestra la presencia de miocitos maduros y miotubos multinucleados fusionados. Los núcleos se tiñen con DAPI (azul). Los cultivos de MP estaban libres de contaminación por fibroblastos y adipocitos, como lo indica la ausencia de coinmunotinción para la tinción FSP-1 (verde), Plin-1 (verde) y ORO. Los parlamentarios cultivados con laminina para acomodar la inmunotinción de Co1a1 no muestran el mismo grado de fusión de miotubos para el día 12 que ocurre en el colágeno. Col1a1 (verde) está ausente de las culturas MP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Atrofia, fibrosis e infiltración grasa del músculo denervado a largo plazo. (A) Músculos gastrocnemios cosechados representativos en cuatro puntos de tiempo de serie después de la denervación. Gastrocnemius denotado CONTRA es una muestra representativa de una extremidad contralateral de un animal denervado de dos semanas. (B) Cuantificación de la atrofia muscular post-denervación expresada como la relación entre el peso húmedo gastrocnemio denervado (DEN) y el de la extremidad contralateral (CONTRA). (C) Picrosirius Red (PSR) teñido de secciones transversales histológicas de gastrocnemio cosechadas 2 o 14 semanas después de la denervación demuestran fibrosis progresiva. Manchas musculares amarillas, manchas de colágeno rojas. (D) Fibrosis cuantificada mediante la determinación del área de tejido PSR positivo en relación con el área total del tejido. (E) Aceite Rojo O (ORO) secciones transversales teñidas de gastrocnemio cosechado 2 o 14 semanas después de la denervación, contra-teñido con hematoxilina. Los lípidos se tiñen de rojo. (F) Infiltración grasa cuantificada mediante la determinación del área de tejido teñido con ORO en relación con el área total del tejido. (G) Secciones transversales histológicas de Gastrocnemius cosechadas 2 o 14 semanas después de la denervación, inmunoteñidas para laminina (verde) y Sca-1 (rojo). La laminina tiñe positivamente la lámina basal que rodea a las miofibras individuales. Sca-1 identifica múltiples tipos de células progenitoras. Los núcleos se tiñen con DAPI (azul). El recuadro muestra la localización de células Sca-1+ fuera de la lámina basal en el músculo sano; las flechas amarillas denotan la presencia de células Sca-1+ dentro de las áreas fibróticas. (Los datos son medias +/- S.D; n=3 para los puntos de tiempo de 2 y 14 semanas. Datos en el panel B analizados por ANOVA unidireccional, datos en paneles D y F analizados por ANOVA bidireccional. Prueba post-hoc de Sidak realizada para corregir comparaciones múltiples. * = P<0,05 entre CONTRA y DEN; # = P<0.05 entre muestras) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Dinámica de FAPs y MPs en gastrocnemio de rata denervada a largo plazo. (A) Paneles representativos Sca-1::APC versus VCAM-1::P E de la población Lin- (CD31-/CD45-) a partir de muestras musculares cosechadas 2, 5, 12 o 14 semanas después de la denervación. La fila superior muestra las gráficas del gastrocnemio denervado (DEN), mientras que la fila inferior muestra las del gastrocnemio contralateral no operado (CONTRA). Lin-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs (Total) se subdividen en fracciones Sca-1 High (caja roja) y Sca-1 Med/Low (caja verde), mientras que los MP Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ se muestran en el cuadro azul. (B) Cuantificación de FAPs (Total, Sca-1 Alto, Sca-1 Med/Bajo) en cada punto temporal post-denervación, reportado como la frecuencia (%) de lin-células (fila superior) y el número de células por gramo muscular (fila inferior) normalizado al gastrocnemio control contralateral. (C) Proporciones relativas de las subpoblaciones Sca-1 Alta y Sca-1 Med/Baja de la población total de FAPs. (D) Cuantificación de MPs en cada punto de tiempo post-denervación reportado como la frecuencia (%) de lin- células (gráfico izquierdo) y como el número de células por gramo de músculo (gráfico derecho) normalizado al control contralateral. (Los datos son medias +/- S.D; n=4 para los puntos de tiempo de 2 y 12 semanas; n=5 para el punto de tiempo de 5 semanas; n=2 para el punto de tiempo de 14 semanas. Datos analizados por ANOVA unidireccional; Prueba post-hoc de Sidak para corregir comparaciones múltiples. # = P<0.05.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1:Validación y titulación de anticuerpos. Validación de anticuerpos conjugados comercialmente CD31::FITC (A-C), CD45::FITC (D-F) y VCAM-1::P E (G-I) en perlas de compensación (A,D,G) y suspensiones unicelulares de músculo gastrocnemio de rata sana (B,E,H). Cada anticuerpo se tituló a 5 concentraciones diferentes (C, F, I). La concentración óptima se eligió en función de la mayor intensidad de fluorescencia con una tinción de fondo mínima (cajas rojas). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2:FAPs y MPs ordenados en condiciones de cultura de diferenciación inversa. (A) Los FAPs cultivados en medios de diferenciación miogénica (DM) en el día 12 coinmunosteñidos para FSP-1 (verde), Plin-1 (verde) o Col1a1 (verde) y MHC (rojo) no demuestran contaminación por miocitos. La tinción positiva de FSP-1 y Col1a1 revela la diferenciación de FAPs a fibroblastos. La tinción ORO (rojo) revela la producción de lípidos, aunque los adipocitos Plin-1 positivos no son fácilmente visibles. Núcleos teñidos con DAPI (azul). (B) Los parlamentarios sometidos a medios de diferenciación adipogénica murieron. Los MP cultivados en FAP Growth Media (FAP GM) durante 12 días y coinmunostecidos para FSP-1 (verde) o Plin-1 (verde) y MHC (rojo) demuestran miocitos y miotubos diferenciados con ausencia de células positivas FSP-1 o Plin-1. La ausencia de tinción ORO confirma aún más la falta de células adipogénicas en cultivo. Los MPs cultivados en medios de diferenciación fibrogénica (DF) y co-inmunoteñidos para Col1a1 y MHC muestran miocitos maduros y una ausencia de células Col1a1 positivas. Los parlamentarios cultivados con laminina para acomodar la inmunotinción de Col1a1 no muestran el mismo grado de fusión a los miotubos a los 12 días en cultivo que ocurre en el colágeno. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3:Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ lascélulas son una población mixta de FAPs y MPs. (A) La coinmunotinción PDGFRα y Pax7 de células Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ recién aisladas muestra una población mixta de células PDGFRα single positive (flechas blancas) y Pax7 single positive (flecha amarilla) que identifican FAPs y MPs, respectivamente. (B) Los cultivos Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ del día 12 cultivados en medios de diferenciación miogénica (DM) contienen células FSP-1 positivas únicas (verdes) y MHC positivas (rojas) que identifican fibroblastos y miocitos/tubos, respectivamente. La ausencia de tinción de Plin-1 (verde) y ORO (rojo) indica la ausencia de adipocitos maduros. La coinmunotinción para Col1a1 (verde) y MHC (rojo) muestra miocitos y fibroblastos maduros. (C) Las células Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ del día 12 cultivadas en medios de diferenciación adipogénica (AD) muestran de manera similar una mezcla de células FSP-1 (verde) monopositivas y MHC (rojas) monopositivas, pero también con células positivas únicas Plin-1 (verdes) y tinción ORO presente, lo que confirma la diferenciación de fibroblastos, miocitos y adipocitos. Los cultivos cultivados en medios de diferenciación fibrogénica (DF) muestran miocitos maduros y células positivas únicas Col1a1 (fibroblastos). (D) Paneles representativos Sca-1::APC versus VCAM-1::P E de la población Lin- (CD31-/CD45-) a partir de muestras musculares denervadas cosechadas 2, 5, 12 o 14 semanas después de la denervación; La población Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ se indica en el recuadro morado. (E) Cuantificación de células Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ a través de cuatro puntos de tiempo seriales posteriores a la denervación, reportada como la frecuencia de lin-células (gráfico izquierdo) y células por gramo muscular (gráfico derecho) normalizado al gastrocnemio contralateral. (Los datos son medias +/- S.D; n=4 para los puntos de tiempo de 2 y 12 semanas; n=5 para el punto de tiempo de 5 semanas; n=2 para el punto de tiempo de 14 semanas. Los datos fueron analizados por ANOVA unidireccional; prueba post-hoc de Sidak para corregir comparaciones múltiples; # = P<0.05.) Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4:ITGA7 como marcador de células miogénicas en citometría de flujo del músculo esquelético de rata. Validación de la conjugación de anticuerpos ITGA7::P E-Cy7 por tinción única en perlas de compensación comercial (A) y suspensiones de células individuales generadas a partir del músculo gastrocnemio de rata sana (B). Las poblaciones de perlas y células marcadas con ITGA7 son evidentes (cajas negras) (C) La titulación de anticuerpos se realizó probando cinco concentraciones diferentes en suspensiones de una sola célula. El cuadro rojo indica la concentración ideal. (D) Los gráficos de los controles de fluorescencia menos uno (FMO) demuestran la ausencia de derrame de fluorescencia a través de los conjugados de anticuerpos, pero la tinción completa de suspensiones celulares revela una interacción no específica entre Sca-1::APC e ITGA7::P E-Cy7 (caja verde). Gating (E) para separar las células Lin-/Sca-1+/ITGA7- (supuestas "FAPs") y lin-/Sca-1-/IGTA7+ (supuestas "MPs"). (F) La coinmunotinción de cultivos celulares clasificados por FACS a los 12 días después del recubrimiento con perilipina-1 (verde) y MHC (rojo) demuestra que ambos grupos de células clasificadas maduraron predominantemente en adipocitos con pocos miocitos presentes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

1. Sin mancha
2. Control de viabilidad
3. CD31 + CD45 FMO
4. Sca-1 FMO
5. VCAM-1 FMO
6. CD31 + CD45 Tinción simple (cuentas)
7. CD31 + CD45 Tinción única (células)
8. Sca-1 Tinción única (cuentas)
9. Sca-1 Tinción Única (Células)
10. VCAM-1 Tinción única (cuentas)
11. VCAM-1 Tinción única (células)

Tabla 1: Controles de tinción de anticuerpos de citometría de flujo. Complemento completo de controles de tinción de anticuerpos. Si el experimento se realiza por primera vez, los controles de una sola mancha deben ejecutarse tanto en perlas de compensación como en suspensiones de una sola célula. Para todos los experimentos posteriores, los controles de una sola mancha solo deben ejecutarse en cuentas de compensación.

CD31::FITC (μg) CD45::FITC (μg) Sca-1::APC (μg)* VCAM-1::P E (μg) SYTOX Azul
(μM; Concentración final)
Control no manchado
-- -- -- -- --
Controles monomantados
SYTOX Azul (Control de Viabilidad) -- -- -- -- 1
CD31 y CD45 0.5 0.25 -- -- 1
Sca-1 -- -- 0.25 -- 1
VCAM-1 -- -- -- 0.25 1
Fluorescencia menos uno (FMO)
CD31 y CD45 -- -- 0.25 0.25 1
Sca-1 0.5 0.25 -- 0.25 1
VCAM-1 0.5 0.25 0.25 -- 1
Muestras experimentales
Mancha completa 0.5 0.25 0.25 0.25 1

Tabla 2: Matriz de tinción de anticuerpos de citometría de flujo. Se muestra la cantidad de anticuerpos para la tinción de muestras experimentales y de control para citometría de flujo. Todas las tinciones se realizan en un volumen total de 100 μL de tampón de lavado. *La cantidad óptima de anticuerpos Sca-1::APC autoconjugados puede variar según el lote utilizado. Todos los lotes sca-1::APC recién conjugados deben validarse primero mediante una sola tinción tanto de perlas de compensación como de suspensiones de una sola célula.

Ficha complementaria: Recetas de reactivos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Un protocolo de aislamiento de FAPs optimizado y validado para el músculo de la rata es esencial para los investigadores que desean estudiar modelos de lesiones que no son factibles en el ratón por razones biológicas o técnicas. Por ejemplo, los ratones no son un modelo animal óptimo para estudiar lesiones crónicas locales o neurodegenerativas, como la denervación a largo plazo. Biológicamente, la corta vida útil y el rápido envejecimiento de los ratones dificultan la delineación precisa de las secuaras musculares debido a la denervación del factor de confusión del envejecimiento. Desde un punto de vista técnico, la reducción drástica de la masa muscular debido a la atrofia severa sería insuficiente para un análisis citométrico de flujo efectivo. De hecho, los protocolos de aislamiento de FAPs de ratón sugieren agrupar los músculos sanos para aumentar mejor el rendimiento de los FAPs clasificados29. Si bien esto resuelve la barrera técnica de obtener tejido muscular adecuado para el análisis, al mismo tiempo limita a los investigadores a evaluar los FAP a nivel específico del músculo. Dado que los grupos musculares específicos varían inherentemente en su composición de tipo de fibra, grado de vascularización y números mitocondriales47, por ejemplo, la combinación de múltiples músculos diferentes para el análisis citométrico de flujo evita la caracterización de FAPs específicos del músculo. Por el contrario, mostramos que tanto el gastrocnemio de rata denervado sano como el gastrocnemio denervado a largo plazo, atrófico y fibrótico proporcionan una cantidad adecuada de material de partida para una citometría de flujo efectiva. Además, en muestras sanas, el excedente de músculo se puede subdividir aún más para múltiples ensayos aguas abajo, lo que permite a los investigadores analizar concomitantemente las características celulares, moleculares e histológicas del mismo tejido. Finalmente, para experimentos de manipulación de FAPs en modelos de lesiones con terapéutica, se dispone de análisis bien validados de la función física y la marcha en ratas alertas y activas21,22,23,24,que permiten la evaluación en serie de la función muscular sin necesidad de terminación del animal.

Un obstáculo clave en la creación de un protocolo de aislamiento de FAPs optimizado para la rata fue la disponibilidad de anticuerpos. Nuestro enfoque inicial buscó copiar los protocolos de panel de anticuerpos y estrategia de gating ampliamente empleados en elratón 1,7,8,9,10,11,12,13,14. Si bien los anticuerpos disponibles comercialmente, conjugados, probados por citometría de flujo y validados que reconocen a la rata estaban disponibles para los marcadores de linaje CD31 y CD45, no existía ninguno para los FAP positivos que identificaban los marcadores Sca-1 o PDGFRα, así como para el marcador de selección negativa ITGA7. Se disponía de anticuerpos primarios no conjugados específicos para estos marcadores y que pretendían ser efectivos en la citometría de flujo, pero de los marcadores FAPs Sca-1 y PDGFRα, solo el anticuerpo Sca-1 había sido validado en la literatura publicada en análisis citométrico de flujo de células derata 48. Por lo tanto, seleccionamos Sca-1 como el marcador de selección positivo para los FAPs. La perspectiva de utilizar anticuerpos secundarios para delinear los marcadores Sca-1 e ITGA7 no fue factible por varias razones, pero principalmente porque los únicos anticuerpos específicos de rata para Sca-1 e ITGA7 validados para la citometría de flujo se generaron en la misma especie huésped. Por lo tanto, la opción restante fue la autoconjugación de ambos anticuerpos utilizando kits disponibles comercialmente.

El proceso de elección de un kit óptimo para la conjugación de anticuerpos fue extenso, ya que muchos kits son total o parcialmente intolerantes a varios diluyentes tampón (por ejemplo, glicina, glicerol, BSA, azida de sodio) presentes en los anticuerpos primarios. Además, el fluoróforo proporcionado debe ser compatible con los láseres equipados dentro del citómetro de flujo/clasificador celular disponible para el investigador, y no emitir a una longitud de onda similar a otros fluoróforos utilizados para identificar otros tipos de células en la muestra. La presencia de componentes diluyentes en los anticuerpos primarios PDGFRα específicos de rata que eran poco compatibles con los kits de conjugación, fue una consideración adicional en la elección de Sca-1 como el marcador de selección positivo de FAPs en este protocolo. Si bien estos resultados demuestran que tanto las conjugaciones Sca-1::APC como ITGA7::P E-Cy7 dieron como resultado la identificación de distintas poblaciones teñidas positivamente tanto en cuentas de compensación como en células, se encontró que las primeras exhibían descomposición en fluorescencia antes de lo anunciado por el fabricante. Se recomienda encarecidamente que los investigadores conjuguen Sca-1::APC de acuerdo con las instrucciones del fabricante, inmediatamente antes del primer uso (por ejemplo, el día antes del experimento) para garantizar una señal robusta, planifiquen los experimentos en consecuencia de modo que se pueda usar un solo lote de anticuerpo conjugado dentro de la ventana de efectividad del anticuerpo, y validen cada lote mediante perlas de compensación de tinción única y titulación en suspensiones de una sola célula. Sin embargo, lo que es más importante, la interacción crítica observada entre Sca-1::APC e ITGA7::P E-Cy7 impidió la delimitación precisa de las poblaciones de FAPs vs MPs, lo que requirió que se empleara una estrategia alternativa.

Boscolo Sesillo et al. demostraron recientemente el aislamiento citométrico de flujo exitoso de células madre musculares de rata utilizando VCAM-1 como un único marcador de selección positivo33 en células CD31, CD45 y CD11b negativas. Con VCAM-1 como marcador de selección de MP, utilizamos un nuevo panel de anticuerpos para identificar FAPs (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) y MPs (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) y validamos el enfoque con cultivo in vitro de células clasificadas por FACS a partir de músculo gastrocnemio sano. FAPs y MPs recién aislados inmunoteñidos únicamente para sus respectivos marcadores alternativos PDGFRα y Pax7. Los FAPs cultivados se diferenciaron en poblaciones de fibroblastos y adipocitos maduros, y los MPs en miocitos/miotubos maduros. No se produjo contaminación cruzada de FAPs y MPs dentro de las culturas. La inmunotinción de secciones transversales histológicas confirmó la infiltración de áreas de degradación fibrograsa en músculo denervado con células Sca-1 positivas.

Si bien realizamos un análisis citométrico de flujo del músculo denervado a largo plazo para validar nuestro protocolo en músculos severamente atróficos, fibróticos e infiltrados en grasa, observamos incidentalmente la aparición de una subpoblación de FAPs con una mayor señal de Sca-1 (denotada Sca-1 Alta) en comparación con la expresión basal de Sca-1 (denotada Sca-1 Med / Low) a lo largo del tiempo. Los FAP altos de Sca-1 aumentaron significativamente después de la denervación tardía (más de 12 semanas), mientras que los FAP de Sca-1 Med / Low alcanzaron su punto máximo temprano a las 5 semanas antes de volver a los niveles basales. Se ha reportado heterogeneidad en el fenotipo FAPs10,30. Se demostró que los FAP con mayor expresión de Sca-1 se diferencian más fácilmente en adipocitos, y cuando se exponen a la estimulación fibrogénica aumentan la expresión de Col1a130,49. La dinámica de las subpoblaciones de FAPs observadas aquí parece estar en línea con el curso temporal de las secuelas inducidas por la denervación y la capacidad regenerativa del músculo47 y, por lo tanto, puede caracterizar a las subpoblaciones de FAPs con diferentes programas celulares. Sca-1 Los FAP altos se regulan al alza en los últimos puntos de tiempo concomitantes con la infiltración fibro / grasa y una disminución en el potencial regenerativo, mientras que los FAP Sca-1 Med / Low se regulan al alza durante la ventana regenerativa del músculo y pueden ayudar en la miogénesis regenerativa efectiva. El protocolo de aislamiento de FAPs presentado aquí proporciona a los investigadores la capacidad de identificar y aislar estas diversas poblaciones para futuros estudios.

Identificamos una población de células que se tiñen positivamente tanto para Sca-1 como para VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) y determinamos que esta población doble positiva era una mezcla de FAPs y MPs. La separación de esta población utilizando un tercer marcador - ITGA7 - no fue posible debido a la interacción entre los anticuerpos primarios Sca-1 e ITGA7. Malecova y sus colegas informaron una subpoblación de VCAM-1 que expresa FAPs que está casi ausente en el músculo sano, aumentó transitoriamente con la inflamación aguda, y su persistencia en ratones mdx (modelo de distrofia muscular) se asoció con inflamación muscular crónica y fibrosis10. En contraste, y aunque no es una población de FAPs pura, encontramos que la población Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ disminuyó a o por debajo de los niveles basales con fibrosis muscular crónica a las 12 y 14 semanas después de la denervación. La denervación no induce la misma reacción inflamatoria y los intentos de regeneración de ciclo experimentados por los ratones mdx, lo que puede explicar las diferencias en nuestros resultados. Nuestra identificación de MPs en la población celular Lin-/Sca-1+/ VCAM-1+ está en consonancia con el informe de expresión de Sca-1 en una proporción muy pequeña de MPs en músculo sano, con un aumento transitorio tras la lesión durante la proliferación de mioblastos y posterior retirada del ciclo celular45. Por lo tanto, mientras que nuestra estrategia de marcado de anticuerpos y GATING FACS aísla con éxito poblaciones puras de FAPs y MPs para su estudio, los experimentos que requieren la cuantificación basada en citometría de flujo de estas poblaciones pueden subestimar ligeramente su número debido al pequeño porcentaje de células en ambas líneas progenitoras que coexpresan Sca-1 y VCAM-1. En cualquier caso, el protocolo actual demuestra claramente la respuesta bifásica clásica de los parlamentarios a la lesión por denervación, con una regulación al alza a corto plazo y el posterior agotamiento de la población en el músculo denervado a largo plazo. Del mismo modo, el aumento de los FAPs reportado en la lesión aislada por denervación a corto plazo se recapitula aquí, y se muestra que se mantiene aún más utilizando el modelo de transección del nervio tibial a largo plazo.

En resumen, este protocolo proporciona a los investigadores un animal previamente inexplorado, la rata, en el que utilizar métodos citométricos de flujo para estudiar simultáneamente FAPs y MPs. Los experimentos en ratones limitados por la cantidad de músculo esquelético, y la frecuente necesidad de realizar experimentos terminales para evaluar la fuerza y la función muscular, se pueden realizar fácilmente en la rata más grande y con una gama más extensa de métodos de evaluación funcional y de fuerza no letal. En general, los estudios de FAPs en la rata pueden descubrir nuevos roles de esta población progenitora clave en el trauma y la enfermedad muscular y nerviosa periférica aguda y crónica, aumentando posteriormente el potencial para desarrollar terapias específicas de células.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a las instalaciones centrales de citometría de flujo de la Universidad de Ottawa y al Centro de Investigación Keenan para Ciencias Biomédicas (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto por su experiencia y orientación en la optimización del protocolo de citometría de flujo / FACS presentado en este manuscrito. Este trabajo fue financiado por Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) a JB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap Falcon 352235
10 cm cell culture dishes Sarstedt 83.3902
12-well cell culture plate ThermoFisher 130185
12 mm glass coverslips, No.2 VWR 89015-724
10 mL Syringe Beckton Dickenson 302995
15 mL centrifuge tubes FroggaBio 91014
20 gauge needle Beckton Dickenson 305176
25mL Serological pipette Sarstedt 86.1685.001
40µm cell strainer Fisher Scientific 22363547
50mL centrifuge tubes FroggaBio TB50
AbC Total Antibody Compensation Beads  ThermoFisher A10497
Ammonium Chloride, Reagent Grade Bioshop AMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µg Biotium 92307
Aquatex Aqueous Mounting Medium Merck 108562
Biolaminin 411 LN Biolamina LN411
Bovine Serum Albumin (BSA) Bioshop ALB001
Calcium Chloride Bioshop CCL444.500
Collagenase Type II Gibco 17101015
CountBright Plus Absolute Counting Beads ThermoFisher C36995
Dexamethasone Millipore Sigma D4902
Dispase Gibco 17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Gibco 11995-065 (+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTA FisherScientific S311
FACSClean Solution Beckton Dickenson 340345
FACSDiva Software Beckton Dickenson --
FACSRinse Solution Beckton Dickenson 340346
Fetal Bovine Serum Sigma F1051
Flow Cytometry Sheath Fluid Beckton Dickenson 342003
FlowJo Software Beckton Dickenson --
Fluorescent Mounting Medium Dako S302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody Invitrogen A11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21429
Goat Serum Gibco 16210-064
Ham's F10 Media ThermoFisher  11550043 (+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) Multicell 311-513-CL
Heat Inactivated Horse Serum Gibco 26050-088
Hemocytometer Reichert N/A
HEPES, minimum 99.5% titration Sigma H3375
Horse Serum ThermoFisher 16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) Cell Signaling 8915LF
Humulin R Lilly HI0210
IBMX Millipore Sigma I5879 Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
Isopropanol Sigma I9516 Also known as 2-propanol
Lewis Rat, Female Charles River Kingston 004 (Strain Code) 200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer Beckton Dickenson --
Microcentrifuge Eppendorf EP-5417R
MoFlo XDP Cell Sorter Beckman Coulter --
Mouse Anti-CD31::FITC Antibody Abcam ab33858 Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC Antibody Biolegend 202205 Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE Antibody Biolegend 200403 Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A Also known as MF20
Mouse Anti-Pax7 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 % Sigma HT501128
Oil Red O Millipore Sigma O0625
PE-Cy7 Conjugation Kit Abcam ab102903
Penicillin-Streptomycin Sigma  P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 (-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent Grade Bioshop PBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody Invitrogen MA5-32347 FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody Abcam ab203254
Rabbit Anti-Laminin Antibody Sigma L9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody Abcam ab3526
Rabbit Anti-Sca-1 Antibody Millipore Sigma AB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody Abcam ab260043 Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody Abcam ab203491
Recombinant Human FGF-basic Gibco PHG0266
Sodium Azide Sigma S2002
Triton-X-100 Fisher Scientific BP151
Troglitazone Millipore Sigma T2573
Tween-20 Bioshop TWN510

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Biología Número 172 progenitores mesenquimales progenitores fibroadipogénicos progenitores miogénicos citometría de flujo clasificación celular activada por fluorescencia FACS músculo esquelético denervación traumática crónica rata atrofia muscular fibrosis
Identificación, aislamiento y caracterización de progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) en el músculo esquelético en la rata
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Te, L. J. I., Doherty, C., Correa,More

Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat. J. Vis. Exp. (172), e61750, doi:10.3791/61750 (2021).

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