Identificatie, isolatie en karakterisering van fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en myogene voorlopercellen (MP's) in skeletspieren bij de rat

Summary

Dit protocol schetst een methode om Fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en myogene voorlopers (MP's) te isoleren uit de skeletspieren van ratten. Het gebruik van de rat in spierletselmodellen zorgt voor een verhoogde beschikbaarheid van weefsel van atrofische spieren voor de analyse en een groter repertoire van gevalideerde methoden om spierkracht en gang bij vrij bewegende dieren te beoordelen.

Abstract

Fibro-adipogene voorlopers (FAP's) zijn residente interstitiële cellen in skeletspieren die, samen met myogene voorlopers (MP's), een sleutelrol spelen bij spierhomeostase, letsel en herstel. De huidige protocollen voor FAPs-identificatie en -isolatie maken gebruik van flowcytometrie / fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en studies die hun functie in vivo tot nu toe evalueren, zijn uitsluitend bij muizen uitgevoerd. De grotere inherente grootte van de rat maakt een uitgebreidere analyse van FAPs in skeletspierletselmodellen mogelijk, vooral in ernstig atrofische spieren of wanneer onderzoekers aanzienlijke weefselmassa nodig hebben om meerdere downstream-assays uit te voeren. De rat biedt bovendien een grotere selectie van spier functionele assays die geen dierlijke sedatie of opoffering vereisen, waardoor morbiditeit en diergebruik worden geminimaliseerd door seriële beoordelingen mogelijk te maken. De flowcytometrie/FACS-protocollen die voor muizen zijn geoptimaliseerd, zijn soortspecifiek, met name beperkt door de kenmerken van commercieel beschikbare antilichamen. Ze zijn niet geoptimaliseerd voor het scheiden van FAPs van ratten of zeer fibrotische spieren. Een flowcytometrie/FACS-protocol voor de identificatie en isolatie van FAPs en MP's van zowel gezonde als gedenerveerde rattenskeletspieren werd ontwikkeld, afhankelijk van de differentiële expressie van oppervlaktemarkers CD31, CD45, Sca-1 en VCAM-1. Omdat ratspecifieke, flowcytometrie-gevalideerde primaire antilichamen ernstig beperkt zijn, werd interne conjugatie van het antilichaam gericht op Sca-1 uitgevoerd. Met behulp van dit protocol werd succesvolle Sca-1-conjugatie bevestigd en flowcytometrische identificatie van FAPs en MP's werd gevalideerd door celkweek en immunostaining van FACS-geïsoleerde FAPs en MP's. Ten slotte rapporteren we een nieuw FAPs-tijdsverloop in een langdurig (14 weken) rattendenervatiemodel. Deze methode biedt de onderzoekers de mogelijkheid om FAPs te bestuderen in een nieuw diermodel.

Introduction

Fibro-adipogene voorlopercellen (FAP's) zijn een populatie van residente multipotente voorlopercellen in skeletspieren die een cruciale rol spelen bij spierhomeostase, reparatie en regeneratie, en omgekeerd ook pathologische reacties op spierletsel bemiddelen. Zoals de naam al doet vermoeden, werden FAP's oorspronkelijk geïdentificeerd als een voorloperpopulatie met het potentieel om te differentiëren in fibroblasten en adipocyten¹ en werden ze verondersteld de belangrijkste mediatoren te zijn van fibro-vette infiltratie van skeletspieren bij chronisch letsel en ziekte. Verder onderzoek toonde aan dat FAPs bovendien in staat zijn tot osteogenese en chondrogenese^2,3,4. Zo worden ze in de literatuur breder genoteerd als mesenchymale of stromale voorlopers^3,5,6,7,8. Bij acuut skeletspierletsel helpen FAPs indirect bij regeneratieve myogenese door zich tijdelijk te vermenigvuldigen om een gunstige omgeving te bieden voor geactiveerde spiersatellietcellen en hun downstream myogene voorloper (MP's) tegenhangers^1,9,10. Parallel aan succesvolle regeneratie ondergaan FAPs apoptose, waarbij hun aantal terugkeert naar basislijnniveaus^1,9,10,11. Bij chronisch spierletsel daarentegen overschrijven FAP's pro-apoptotische signalen, wat resulteert in hun persistentie^9,10,11 en abnormaal spierherstel.

In vivo studies die de cellulaire en moleculaire mechanismen evalueren waarmee FAPs spierresponsen bemiddelen, hebben tot op heden gebruik gemaakt van muizendiermodellen^{1,7,9,10,11,12,13,14.} Hoewel genetisch gemanipuleerde muizen krachtige hulpmiddelen zijn voor gebruik in deze analyses, beperkt de kleine omvang van het dier de beschikbaarheid van weefsel voor onderzoek in langdurige gelokaliseerde letselmodellen waar spieratrofie diepgaand kan zijn, zoals traumatische denervatie. Bovendien vereist het meten van spierkracht en fysieke functie ex vivo of in situ metingen die beëindiging van de muis vereisen, of in vivo methoden die een operatie en/of een algemene verdoving vereisen om evaluatie van spiercontractiele prestaties mogelijk te maken^{15,16,17,18,19,20} . Bij ratten bestaan er goed gevalideerde en wereldwijd gebruikte spierfunctieanalyses, naast analyses voor complexer motorisch gedrag zoals loopanalyse (bijv. Ischiasfunctie-index, CatWalk-analyse) en worden uitgevoerd bij wakkere en spontaan bewegende dieren^21,22,23,24 . Dit optimaliseert bovendien de principes van minimale morbiditeit in dierproeven en het aantal gebruikte onderzoeksdieren. De rat biedt de FAPs-onderzoeker daardoor de extra flexibiliteit van een groter gewond spiervolume voor eiwit- en cellulaire analyses en de mogelijkheid om seriële beoordelingen uit te voeren van spiercomplex statische en dynamische functionele activiteit en gedrag, in het alerte dier.

FAPs zijn voornamelijk geïdentificeerd en geïsoleerd uit hele spiermonsters met behulp van respectievelijk flowcytometrie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Dit zijn op laser gebaseerde testen die in staat zijn om meerdere specifieke celpopulaties te identificeren op basis van karakteristieke kenmerken zoals grootte, granulariteit en een specifieke combinatie van celoppervlak of intracellulaire markers²⁵. Dit is zeer voordelig bij de studie van een orgaansysteem zoals skeletspieren, omdat homeostase en regeneratie complexe, multifactoriële processen zijn die worden gecoördineerd door een overvloed aan celtypen. Een baanbrekende studie identificeerde FAPs, evenals MP's, met behulp van flowcytometrische methoden in de skeletspieren van muizen¹. Ze toonden aan dat FAPs mesenchymaal van aard zijn, omdat ze geen oppervlakte-antigenen hadden die specifiek zijn voor cellen van endotheel (CD31), hematopoietische (CD45) of myogene (Integrin-α7 [ITGA7]) oorsprong, maar de mesenchymale stamcelmarker Sca-1 (stamcelantigeen 1) 1 tot expressie brachten en in cultuur werden^{gedifferentieerd} tot fibrogene en adipogene cellen. Andere studies toonden succesvolle isolatie van mesenchymale voorlopercellen in spieren aan op basis van de expressie van een alternatieve stamcelmarker, van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor alfa (PDGFRα)^2,7,8 en verdere analyse onthulde dat deze waarschijnlijk dezelfde celpopulatie zijn als FAPs³. FAPs worden nu vaak geïdentificeerd in flowcytometrie met behulp van Sca-1 of PDGFRα als een positieve selectiemarker^{1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31} . Het gebruik van PDGFRα heeft echter de voorkeur voor menselijk weefsel, omdat een directe menselijke homoloog van murine Sca-1 nog moet worden geïdentificeerd³². Bovendien zijn andere celoppervlakeiwitten gerapporteerd als markers van PARLEMENTSLEDEN (bijv. VCAM-1), wat een potentieel alternatief biedt voor ITGA7 als een indicator van cellen van myogene afstamming tijdens FAPs-isolatie³³.

Hoewel flowcytometrie / FACS een krachtige methodologie is voor het bestuderen van de rol en het pathogene potentieel van FAPs in skeletspieren^{1,9,10,11,13,29,}wordt het technisch beperkt door de specificiteit en optimalisatie van de vereiste reagentia. Aangezien flowcytometrische identificatie en isolatie van FAPs is ontwikkeld en uitgevoerd in muisdiermodellen^{1,9,10,11,29,}vormt dit uitdagingen voor onderzoekers die FAPs in andere modelorganismen willen bestuderen. Veel factoren - zoals optimale weefselgrootte die moet worden verwerkt, evenals reagens- en / of antilichaamspecificiteit en beschikbaarheid - verschillen afhankelijk van de gebruikte soort.

Naast de technische barrières voor het bestuderen van FAPs in een nieuw diermodel, zijn ze grotendeels bestudeerd in een acute, toxische omgeving - meestal via intramusculaire chemische injectie of cardiotoxine. Evaluatie van de langetermijndynamiek van FAPs is voornamelijk beperkt tot beoordeling in Duchenne's spierdystrofie, met behulp van het mdx-muismodel^9,10,11en modellen van gecombineerd spierletsel zoals massieve rotator cuff-scheur waarbij gelijktijdige peestranssectie en denervatie wordt uitgevoerd op schoudermusculatuur^26,27,28 . De reactie van FAPs op de enige belediging van chronische traumatische denervatie, een veel voorkomend verschijnsel bij ongevallen op de werkplek in de zware industrie, landbouw en bij geboortetrauma's (brachiale plexusletsel)^34,35,36,37 met aanzienlijke morbiditeit, is niet zo goed gekarakteriseerd, vaak beperkt tot een kortetermijntijdframe^11,38.

We beschrijven een methode voor het identificeren en isoleren van FAPs en PARLEMENTSLEDEN van gezonde, maar ook ernstig atrofische en fibrotische skeletspieren bij de rat. Ten eerste wordt identificatie van CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs en CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ MP's met behulp van een weefselverterings- en flowcytometriekleuringsprotocol aangetoond en wordt de daaropvolgende validatie van onze bevindingen uitgevoerd door middel van kweek en immunocytochemische kleuring van FACS-geïsoleerde cellen. Met behulp van deze methode rapporteren we ook een nieuw FAPs-tijdsverloop in een langdurig geïsoleerd denervatieletselmodel bij de rat.

Protocol

Onderzoekers die dit protocol uitvoeren, moeten toestemming krijgen van hun lokale commissie voor dierenethiek / zorgcommissie. Al het dierwerk werd goedgekeurd door het St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Animal Care Committee (ACC # 918) en werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care (CCAC). Een schema van het flowcytometrieprotocol is weergegeven in figuur 1. Als de downstream-toepassing FACS en de daaropvolgende celkweek is, moeten alle stappen worden voltooid met de juiste aseptische techniek.

1. Spierballen oogsten

1. Verdoving ratten met behulp van een geschikt verdovingsmiddel en offer volgens de lokale richtlijnen van de vivarium- en dierenethiekcommissie. Dit protocol oogst de gastrocnemiusspier van volwassen vrouwelijke Lewis-ratten (200-250 g), als voorbeeld. Ratten werden verdoofd met 2-3% isofluraan en werden geofferd door intracardiale injectie van T61.
2. Zodra het dier is geofferd, scheert u de hele achterpoot om de locatie van de spier te vergemakkelijken en de vachtbesmetting van het geoogste weefsel te minimaliseren.
3. Maak met behulp van een steriel scalpel twee incisies in de huid: de eerste rond de omtrek van het enkelgewricht en de tweede de middellijn van het mediale aspect van de achterpoot van de enkel naar de heup.
4. Pel de huid en oppervlakkige spierlagen af om de onderliggende gastrocnemius te onthullen, die ontstaat bij de mediale en laterale condylen van het dijbeen en inserts bij de achillespees.
5. Gebruik stompe dissectie om de gastrocnemius van het omliggende weefsel te scheiden en behandel de spier alleen bij de pees om verbrijzelingsletsel te voorkomen.
6. Scheid de gastrocnemius van het inbrengen door de achillespees zo distaal mogelijk met een scherpe schaar door te snijden. Eenmaal gesneden, pak je de achillespees vast met een tang en pel je de gastrocnemius voorzichtig van het onderliggende bot. Nog steeds met de spier met een tang in één hand, lokaliseer de twee oorsprongen van de gastrocnemius en snijd bij de mediale en laterale femorale condylen.
7. Dep de weggesneden gastrocnemius voorzichtig tegen een steriel stuk gaas om zoveel mogelijk bloed te verwijderen. Trim de spier op een steriel oppervlak en verwijder overtollig bindweefsel en de achillespees.
8. Plaats spieren in een weegboot en weeg met behulp van een precisieweegschaal. Dit protocol is geoptimaliseerd om spieren te verteren met een nat gewicht variërend van 200-600 mg. Exploitanten kunnen overtollig geoogst weefsel desgewenst onderverdelen voor andere stroomafwaartse assays.
9. Verdeel de geoogste spier voor flowcytometrie voorzichtig verder in 3-4 kleinere stukjes (ongeveer 1-2 cm³⁾en dompel onder in ijskoude 1x PBS. Koud houden op ijs totdat alle monsters zijn geoogst.

2. Spiervertering

1. Verwijder de spieren van PBS en plaats in een steriele celkweekschaal van 10 cm. Scheur en gehakt weefsel voorzichtig met een tang tot stukjes ongeveer 3-4 mm³zijn, waarbij zoveel mogelijk bindweefsel wordt verwijderd. Eenmaal grondig gehakt, overgebracht naar een steriele conische buis van 50 ml met 6 ml DMEM + 1% penicilline / streptomycine (P / S).
2. Voeg 10 μL van 300 mM CaCl_2-oplossing toe aan 365 μL Collagenase II-oplossing (voorraadconcentratie 4800 U/ml) om het collagenase-enzym te activeren. Voeg de geactiveerde collagenase II-oplossing toe aan de conische buis van 50 ml die de weefselslib bevat. De uiteindelijke Collagenase II concentratie is 250 U/ml.
3. Incubeer buizen in een shaker gedurende 1 uur bij 37 °C, 240 x g, zorg ervoor dat u elke 15 minuten handmatig wervelt om weefsel los te maken dat zich aan de zijkant van de buis heeft gehecht.
4. Verwijder na 1 uur de buisjes uit de shaker en voeg het volgende per monster toe: 100 μL Collagenase II (4.800 E/ml) en 50 μL Dispase (4,8 E/ml).
5. Pipetteer monsters met een serologische pipet 15-20 keer totdat de oplossing homogeen is. Als u meerdere monsters verwerkt, gebruik dan een afzonderlijke steriele pipet voor elk monster om kruisbesmetting van het monster te voorkomen.
6. Incubeer opnieuw in een shaker gedurende 30 min bij 37 °C en 240 x g. Schud na 15 minuten monsters met de hand om het aanhangende weefsel van de zijkant van de buis los te maken.

3. Generatie van eencellige suspensie

1. Schuif monsters langzaam door een spuit van 10 ml met een naald van 20 G gedurende 10 cycli.
   OPMERKING: Eén cyclus omvat het opnemen van spieroplossing in de spuit en het terug injecteren in de buis. Zorg ervoor dat u eventuele bubbels minimaliseert door het knippen langzaam te voltooien, omdat overmatig schuimen extra celdood kan veroorzaken³⁹.
2. Plaats een celzeef van 40 μm op een steriele conische buis van 50 ml en maak deze nat door 5 ml DMEM + 10% FBS & 1% P / S te pipetteren.
3. Pipetteer 1 ml van het monster per keer door de celzeef.
4. Was de celzeef door DMEM met 10% FBS en 1% P/S door de zeef te pipetteren om het totale volume in de buis op 25 ml te brengen.
5. Splits 25 ml van het monster gelijkmatig in twee conische buizen van 15 ml en centrifugeer bij 15 °C, 400 x g gedurende 15 minuten.
   OPMERKING: Het splitsen van de spieroplossing in twee conische buizen van 15 ml zorgt voor een beter celherstel na centrifugatie in vergelijking met een enkele buis.
6. Zuig het supernatant op en suspensie de pellet opnieuw in 1 ml 1x RBC Lysis-buffer (zie aanvullend bestand) bij kamertemperatuur gedurende 7 minuten om erytrocyten te elimineren.
7. Breng het volume op 10 ml met 9 ml wasbuffer (zie aanvullend bestand)en spinbuizen op 400 x g,15 °C gedurende 15 minuten.
8. Zuig het supernatant op en recombineer pellets door opnieuw te suspensie in een wasbuffer van 1 ml.
9. Breng een geschikt volume cellen over in een afzonderlijke microcentrifugebuis van 1,5 ml en meng met trypanblauwe kleurstof. Tel levende cellen op een lichtmicroscoop met behulp van een hemocytometer.

4. Antilichaamkleuring voor flowcytometrie

OPMERKING: Het Sca-1-antilichaam moet worden geconjugeerd aan APC voorafgaand aan flowcytometrie / FACS-experimenten, volgens de instructies van de fabrikant. De prestaties moeten voor elke partij conjugaten worden gevalideerd(figuur 2). De uiteindelijke vervoegingen kunnen worden bewaard in aliquots van 20 μL bij -20 °C en zijn drie weken stabiel. Raadpleeg het aanvullend dossier voor het volledige vervoegingsprotocol.

1. Breng voor flowcytometrie 1-2 x 10⁶ cellen per experimenteel monster over naar een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml. Breng het volume tot 1 ml met wasbuffer en plaats het op ijs.
2. Stel voor elk experiment de volgende vereiste controles in: i) niet-gekleurd en ii) levensvatbaarheidscontroles om nauwkeurig te selecteren voor de levende celpopulatie; iii) fluorescentie minus één (FMO) controles op eencellige suspensies om nauwkeurige poorten in te stellen voor CD31-/CD45-fracties, FAPs en parlementsleden; en iv) enkelgekleurde compensatieparels om te corrigeren voor fluorescentieoverloop tussen kanalen.
   1. Voor alle celcontroles, aliquot 5 x 10⁵ - 1 x 10⁶ cellen in 1 ml wasbuffer in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en op ijs plaatsen.
   2. Voeg voor kraalcontroles 1 druppel positieve compensatieparels (~ 1,5 x 10⁵ kralen per druppel) toe aan elke gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 ml. Het volledige pakket controles is opgenomen in tabel 1.
      OPMERKING: Als het experiment voor de eerste keer wordt uitgevoerd, voert u single-stained controles uit voor elk geconjugeerd antilichaam op eencellige suspensies (naast ongekleurde, levensvatbaarheid, enkelgekleurde compensatiekraal en FMO-controles) om de positief gekleurde populatie in cellen te beoordelen en kleuring te valideren die is waargenomen op compensatieparels. Valideer elk vers geconjugeerd Sca-1::APC-preparaat door enkelvoudige kleuring uit te voeren op compensatieparels en eencellige suspensies. Raadpleeg tabel 1 voor een volledige lijst van kleuringscontroles.
3. Om de levensvatbaarheidscontrole voor te bereiden, brengt u de helft van het volume cellen over van de "levensvatbaarheidsbuis" naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. Label deze buis "Dood".
4. Incubeer "Dead" buis bij 65 ° C gedurende 2-3 minuten om de cellen te doden en plaats ze vervolgens op ijs. Na 2-3 minuten, combineer dode cellen opnieuw met levende cellen die achterblijven in de levensvatbaarheidscontrolebuis. Deze populatie van cellen zal worden gebruikt om compensatiewaarden in te stellen (indien nodig) en op de juiste manier poorten te instellen voor de levensvatbaarheidskleurstof.
5. Centrifugeer de eencellige suspensies (experimentele monsters en controles) gedurende 5 minuten bij 500 x g, 4 °C.
6. Zuig het supernatant op en suspensie celkorrels opnieuw in een wasbuffer van 100 μL.
7. Voeg antilichamen toe, afhankelijk van het experimentele monster of de controle. Raadpleeg de kleuringsmatrix (tabel 2) voor informatie over antilichaamcombinaties en hoeveelheden.
8. Veeg voorzichtig met elk monster om een volledige menging te garanderen en incubeer gedurende 15 minuten op ijs in het donker. Voor compensatieparels, incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 15 minuten.
9. Voor experimentele en controlemonsters met eencellige suspensie brengt u het volume op 1 ml door een wasbuffer van 900 μL toe te voegen. Voor compensatiekraalcontroles brengt u het volume op 1 ml met 900 μL 1x PBS.
10. Centrifugeer eencellige suspensiemonsters bij 500 x g,4 °C gedurende 5 minuten. Centrifugecompensatieparel regelt bij 300 x g,4 °C gedurende 5 minuten.
11. Voor alle eencellige suspensiemonsters, aspirateer en gooi supernatant en opnieuw suspensiecelkorrel in 300 μL wasbuffer. Voor compensatiekraalcontroles, aspirateer en gooi het supernatant weg, suspensie de pellet opnieuw in 300 μL van 1x PBS en voeg vervolgens 1 druppel (~ 1,5 x 10⁵) negatieve compensatieparels toe.
12. Bewaar alle eencellige suspensiemonsters op ijs onder aluminiumfolie en ga verder met flowcytometrische acquisitie. Compensatiekraalbedieningen moeten ook worden beschermd tegen licht, maar kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard.
    OPMERKING: Als het experimentele eindpunt FAPs-identificatie door flowcytometrie is, volg dan de stappen 5.1.1-5.1.11. Als het eindpunt celisolatie via FACS voor kweek en kleuring is, volg dan de stappen 5.2.1-5.2.9 en rubrieken 6-7.

5. Flowcytometrie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)

1. Flowcytometrie
   OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van een benchtop flowcytometer uitgerust met 405 nm, 488 nm en 640 nm lasers die in staat zijn om tegelijkertijd 10 verschillende kleuren te onderscheiden. Bandpass-filters en de bijbehorende fluorchromen die in dit protocol worden gebruikt, zijn als volgt: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) en 670/30 (APC). De spanningen voor elke detector zijn als volgt: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX Blauw 360; APC 570. Zorg ervoor dat u voor gebruik bent getraind in de juiste werking van de flowcytometer of celsorteerder.
   1. Zorg ervoor dat de cytometer gedurende 10-20 minuten voor gebruik is ingeschakeld en is geprimed door achtereenvolgens te reinigen met schone, spoel- en mantelvloeistofoplossingen voor elk 30-45 s. Werk af met een spoeling met dH₂O. Zorg ervoor dat er voldoende hoeveelheid mantelvloeistof aan de opslagcontainer is toegevoegd om de juiste monsterstroom tijdens de acquisitie te behouden.
   2. Stel de gating-strategie in om FAPs en parlementsleden te identificeren zoals beschreven in figuur 3.
      OPMERKING: FAPs en MP's worden geïdentificeerd door de volgende hiërarchische gatingstrategie: i) SSC-A vs FSC-A (zijcelverstrooiingsgebied versus voorwaarts celverstrooiingsgebied naar afzonderlijke cellen versus puin), ii) FSC-W vs FSC-H (voorwaartse celverstrooiingsbreedte versus voorwaartse celverstrooiingshoogte om singlets te onderscheiden van doubletten in de FSC-parameter), iii) SSC-W versus SSC-H (zijcelverstrooiingsbreedte versus zijcelverstrooiingshoogte om singlets te onderscheiden van doubletten in de SSC-parameter), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (om levende versus dode singlets te onderscheiden), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (om CD31+ en CD45+ cellen uit te sluiten van verdere analyse), en vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E van de CD31-/CD45- (Lineage; Lin-) bevolking (identificatie van FAPs en Parlementsleden). FAP's worden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-events en MPs worden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ events.
   3. Voer eerst elke enkelgekleurde compensatieparelcontrole op lage snelheid door de cytometer om compensatiewaarden te genereren die worden gebruikt om te corrigeren voor eventuele fluorescentieoverloop tussen kanalen. Beoordeel de compensatie door het fluorescerende signaal van elke besturing in zijn eigen detector (bijv. SSC-A versus APC voor Sca-1::APC enkelvlekte kralen) en alle andere detectoren te vergelijken. Er moeten twee verschillende populaties zijn (een met negatief en een met positief signaal) in de juiste detector en alleen een negatieve populatie in alle andere detectoren. Stel de stoppoort in op 10.000 compensatiekraalgebeurtenissen en noteer de gegevens.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u tussen de acquisitie van elk monster dH₂O gedurende 10-20 seconden door de cytometer laat lopen om besmetting van monster tot monster te voorkomen.
   4. Verwerk vervolgens de ongekleurde en levensvatbaarheidscontrolemonsters om de levende afzonderlijke cellen goed te sluiten. Stel de stoppoort in op 10.000 singletgebeurtenissen en leg gegevens vast.
      OPMERKING: Voeg ongeveer 5 minuten voordat elk monster van de suspensie van een enkele cel, met uitzondering van het niet-gekleurd monster, 1 μL SYTOX Blue-levensvatbaarheidskleurstof (300 μM werkconcentratie verdund uit 1 mM stamoplossing) aan elk monster toe en veeg zachtjes om te mengen (eindconcentratie 1 μM).
   5. Verkrijg vervolgens de resterende eencellige suspensiecontrolemonsters. Beoordeel elke FMO-controle met de juiste plot in de gating-strategie(figuur 3). Beoordeel bijvoorbeeld het FITC-signaal van de CD31+CD45 FMO om een nauwkeurige CD31-/CD45-gate te garanderen. Een optimaal voorbeeld is weergegeven in figuur 3G. Als het protocol voor de eerste keer wordt uitgevoerd, moeten single-stained controles op cellen worden uitgevoerd voordat FMO-controles worden verkregen.
   6. Beoordeel het fluorescerende signaal van elk enkel gekleurd celmonster in de juiste detector en in alle andere detectoren om de juiste compensatie te valideren. Stel de stoppoort in op 10.000 live singlet-evenementen en neem op in de software.
   7. Zodra alle controles (eencellige suspensies en kralen) zijn verwerkt, bereidt u alle experimentele monsters voor door eerst het volume van elk monster te meten en te registreren. Deze metingen zullen worden gebruikt om FAPs en PARLEMENTSLEDEN nauwkeurig te kwantificeren, zoals beschreven in stap 5.1.11. Voeg vervolgens 50 μL precisietelparels toe en meng voorzichtig door 2-3 keer op en neer te pipetteren.
   8. Voer kort het eerste experimentele monster uit om de identificatie van de tetellende kralenpopulatie te valideren. Deze populatie verschijnt als een kleine afzonderlijke cluster gescheiden van de algemene celpopulatie op de FSC-A vs SSC-A plot(Figuur 3A,rode doos). Maak een poort rond de telkraalpopulatie. Verwerf vervolgens gegevens voor elk experimenteel monster door de cytometer op lage snelheid te verwerken. Stel de stoppoort in op 10.000 tellen van kraalgebeurtenissen en record.
      OPMERKING: Onderzoekers kunnen ook telparels identificeren door een extra plot in te stellen dat SSC-A beoordeelt ten opzichte van een van de detectoren, omdat de telparels fluorescerend zijn in alle detectoren.
   9. Nadat alle monsters zijn verwerkt, reinigt u de cytometer met behulp van de juiste protocollen. Exporteer alle gegevens voor analyse.
   10. Open alle gegevensbestanden op een geschikte flowcytometrie-analysesoftware. Stel de gatingstrategie in zoals gebruikt voor gegevensverzameling zoals beschreven in stap 5.1.2. Onderzoek besturingselementen in dezelfde volgorde als bij gegevensverzameling (bijv. Onbevlekt, levensvatbaarheid, enkele vlek en vervolgens FMO-controles) om de gatingstrategie opnieuw te valideren. Zodra nauwkeurige poorten zijn ingesteld met behulp van FMO-bedieningselementen, past u de poorten toe op alle experimentele monsters. Exporteer onbewerkte gegevens als een spreadsheet voor kwantificering.
   11. Bereken het aantal FAPs en MPs in elke experimentele steekproef met behulp van de telparels:
       
       waarbij het aantal verworven cellen het aantal geregistreerde gebeurtenissen van relevante celpopulatie (bijv. FAPs of parlementsleden) op de acquisitiesoftware is; Acquired Bead Count is het aantal geregistreerde gebeurtenissen van het tellen van kralen op de acquisitiesoftware; Telparels Volume is het volume van de telkraaloplossing dat is toegevoegd in stap 5.1.7; Monstervolume = het volume van elk gekleurd experimenteel monster voorafgaand aan de toevoeging van telparels. Kraalconcentratie is het aantal kralen per μL-oplossing; deze waarde vindt u in het productgegevensblad.
2. FACS - sortering voor celkweek
   OPMERKING: Dit protocol voert FACS uit op een celsorteerder uitgerust met 4 lasers (UV, Violet, Blauw, Rood) die in staat is om tegelijkertijd 11-14 kleuren te onderscheiden. Volg het experimentele monsterkleuring (sectie 4) en het flowcytometrieprotocol, met uitzondering van stap 1 tot en met 3 hieronder, om de FACS-workflow te optimaliseren:
   1. Verhoog de concentratie van cellen in de te sorteren experimentele monsters tot 7 x 10⁶ cellen / ml om robuuste opbrengsten van FAPs en MP's te genereren.
   2. Om deze significante toename van de celconcentratie te verklaren, verdubbelt u alle antilichaamconcentraties in de experimentele monsters die moeten worden gesorteerd.
   3. Verwerk de laatste gekleurde celmonsters door een 40 μM celzeefdop die onmiddellijk voorafgaand aan het sorteren op een polystyreenbuis van 5 ml is aangebracht om celklontering te verminderen en de sorteeropbrengst te verhogen.
   4. Verzamel enkele, levende rat-FAPs en MP's rechtstreeks van de celsorteerder in een polypropyleen verzamelbuis van 5 ml met 1 ml steriel, 100% foetaal runderserum (FBS). Houd cellen op ijs totdat het sorteren is voltooid.
      OPMERKING: Als u FACS uitvoert op een externe locatie, breng dan alle gesorteerde cellen over op ijs en in een beveiligde, overdekte container.
   5. Werk in een steriele bioveiligheidskast (BSC), breng het volume van gesorteerde cellen tot 7 ml met geschikte groeimedia (bijv. FAP-groeimedia (FAP GM) voor gesorteerde FAPs en MP-groeimedia (MP GM) voor gesorteerde parlementsleden; zie Aanvullend bestand voor recepten) en centrifugeer bij 500 x g, 4 °C gedurende 7 minuten om zoveel mogelijk resterende wasbuffer te verwijderen.
   6. Resuspend pellets in 1 ml geschikte groeimedia en plaat in een 12-putplaat met een steriele, met collageen beklede glazen afdekkingslip/put van 12 mm voor daaropvolgende immunostaining (zie rubriek 6).
      OPMERKING: Als immunocytochemische kleuring voor collageen, plaat gesorteerd cellen in een 12 put plaat met een steriele, laminine-gecoate 12 mm glazen coverslip / put, in plaats van collageen-gecoat. Als immunocytochemische experimenten van onmiddellijk geïsoleerde voorlopercellen nodig zijn, zaad FAPs en MP's met een dichtheid van 15.000 cellen per cm² en ga direct door naar stap 6.1. Voor langetermijnculturen om voorloperdifferentiatie te induceren, zaad-FAPs met een dichtheid van 5.000 cellen per cm²en PARLEMENTSLEDEN met een dichtheid van 7.500 cellen per cm².
   7. Incubateer cellen bij 37 °C en 5% CO₂ in een celkweekincubator. Na 72 uur cultuur verander je de helft van de media. Wissel media volledig om de 2-4 d daarna.
   8. Om de ontwikkeling van myocyten te induceren, schakelt u op dag 9 van de cultuur over op MP-differentiatie (MD) medium. Om adipocyten te induceren, schakelt u FAPs-culturen over naar FAP adipogene differentiatie (AD) medium op dag 10 van de cultuur.
   9. Om fibrogenese te induceren, kunnen FAP's worden overgeschakeld op fibrogene differentiatiemedia (FD) op variabele tijdstippen tijdens de kweek, of als alternatief kunnen ze direct in FD-media worden gezaaid na isolatie (stap 5.2.6) (zie aanvullend bestand voor alle mediarecepten).

6. Immunocytochemie van gekweekte FAPs en Parlementsleden

1. Om celsortering te valideren en de zuiverheid van FAPs- en MP-culturen aan te tonen, immunostain met celtypespecifieke markers, waaronder PDGFRα (FAPs-marker), Pax-7 (spierstam [satelliet] celmarker), Fibroblast-specifiek eiwit (FSP-1, fibroblastmarker), Perilipin-1 (Plin-1, adipocytenmarker), Collageentype 1 (Col1a1, indicator van fibrose), Myosine Heavy Chain (MHC, volwassen myocytenmarker).
   1. Voor immunostaining van vers gesorteerde cellen, centrifugeer de 12-well plaat bij 200 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur om de hechting van cellen aan de coverslip / put te vergemakkelijken. Deze stap is niet nodig voor culturen op de lange termijn. Cultuurmedia verwijderen.
   2. Voor immunostaining met FSP-1 fixeert u cellen met 1 ml 100% methanol (MeOH) gedurende 2 minuten bij 4 °C. Als immunostaining voor PDGFRα, Plin-1, Pax7 of Col1a1, fixeer celculturen met 1 ml 4% PFA in 1x PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. MHC immunostaining verdraagt beide fixatieve.
      OPMERKING: Voor methanol-vaste cellen slaat u stap 6.2 over en gaat u verder met stap 6.3.
2. Aspirateer 4% PFA en was celculturen snel 3-4 keer met 1x PBS. Voeg 1 ml 100 mM Glycine toe in 1x PBS en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om resterende PFA te inactiveren. Aspirateer en was 1-2 keer met 1x PBS.
   OPMERKING: Cellen kunnen in dit stadium worden achtergelaten in 2 ml 1x PBS, gewikkeld in vershoudfolie en maximaal 7-10 dagen bij 4 °C bewaard.
3. Voeg na het wassen 1 ml 0,1% Triton-X toe in 1x PBS en incubeer gedurende 20 minuten om celmembranen te permeabiliseren.
4. Was putten 2-3 keer met 1-2 ml 1x PBS en blokkeer vervolgens cellen met 1 ml 1x PBS + 3% BSA per put gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
5. Pipetteer 80 μL primair antilichaam verdund in 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 neat, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/ml) op een stuk parafilm dat op een mobiele container is geplakt. Til met behulp van een steriele fijne tang voorzichtig de deklip uit de put en keer terug op de druppel antilichaamoplossing. Incubeer coverslip met twee natte stukken keukenpapier en dek de container af in plastic folie om verdamping van de antilichaamoplossing te voorkomen. Incubeer een nacht bij 4 °C.
   OPMERKING: Het kleuren van coverslips uit de put maakt gebruik van minder antilichaam (~ 80 μL) dan kleuring in de put (minimaal 500 μL).
6. Laat op dag 2 coverslips 30 minuten op kamertemperatuur staan om op te warmen. Gebruik de tang zorgvuldig naar rechts en breng coverslips terug naar hun respectievelijke putten (cellen naar boven gericht) en was 2-3 keer met 1-2 ml 1x PBS gedurende 2 minuten elk om zoveel mogelijk primaire antilichamen te verwijderen.
7. Met behulp van dezelfde kleuringstechniek als bij primaire antilichaamkleuring, vlekken cellen met geiten anti-konijn Alexa Fluor 488 secundair antilichaam (1:400) om FSP-1, Plin-1, Col1a1 of PDGFRα en geiten anti-muis Alexa Fluor 555 secundair antilichaam (1:300) te detecteren om MHC of Pax-7 te detecteren. Incubeer cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en houd cellen beschermd tegen licht.
8. Breng cellen terug naar de put en incubeer cellen met Hoechst (1:10.000) gedurende 2-4 minuten bij kamertemperatuur. Was cellen nog eens 2-3 keer met 1x PBS gedurende 2 minuten elk om overtollige Hoechst te verwijderen.
9. Monteer coverslips op glazen platen met behulp van een anti-fade fluorescerend montagemedium en laat dia's 's nachts drogen in het donker bij kamertemperatuur. Bewaar gemonteerde coverslips bij 4 °C in het donker.

7. Oil Red O (ORO) kleuring van gekweekte FAPs en Parlementsleden

1. Voer ORO-kleuring uit op niet-gepermeabiliseerde cellen, omdat permeabilisatie van het celmembraan kan resulteren in niet-specifieke / ongewenste kleuring van niet-adipogene celtypen. Voordat u begint met kleuren, bereidt u een ORO-werkvoorraad voor (zie aanvullend bestand voor het recept) en incubeert u gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
2. Filter de oplossing na 20 minuten met een filter van 0,2 μm om eventuele onopgeloste aggregaten te verwijderen.
3. Zuig media uit de put en voeg 1 ml 10% neutraal gebufferd formaline (10% NBF) toe. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: Celconfluentie kan resulteren in het opheffen van de put / coverslip. Wees voorzichtig bij het aanzuigen/toevoegen van oplossingen.
4. Aspirateer en voeg 1 ml verse 10% NBF toe en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gestopt, omdat cellen 's nachts in 10% NBF kunnen worden achtergelaten.
5. Was de putjes snel één keer met 1 ml 60% isopropanol, aspirateer vervolgens en laat de putten volledig drogen (ongeveer 2 min).
6. Voeg 400 μL Oil Red O-werkvoorraad per put toe en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, zorg ervoor dat u geen ORO op de wanden van de plaat pipettert.
7. Verwijder alle Oil Red O en was de put snel 4 keer met dH₂O.
   OPMERKING: Als gekleurde putjes coverslips bevatten, monteer dan met dezelfde techniek als beschreven in stap 6.9.
8. Beeld ofwel gemonteerde coverslips of de gebeitste put met behulp van een brightfield microscoop.

8. Weefselkleuring van contralaterale en gedenervateerde gastrocnemiussecties bij ratten

1. Picrosirius Rood (PSR)
   1. Voer PSR-kleuring uit op 5 μm dikke, formaline-gefixeerde paraffine ingebedde (FFPE) rat gastrocnemius histologische secties zoals eerder beschreven⁴⁰.
2. Olie Red O (ORO)
   1. Fixeer 5 μm dikke isopentane-bevroren rat gastrocnemius histologische secties in 4% PFA gedurende 10 min, incubeer in 60% isopropylalcohol gedurende 1 min.
   2. Beits met ORO-werkvoorraad gedurende 12 min. Incubeer gedurende 1 min in 60% isopropylalcohol, was gedurende 10 min in dH₂O. Monteer op coverslips met behulp van een in water oplosbaar montagemedium.
3. Sca-1 en laminine weefsel fluorescerende immunohistochemie (IHC)
   1. Voer fluorescerende IHC uit op 5 μm dikke isopentane-bevroren rat gastrocnemius histologische secties.
   2. Hydrateer monsters in 1x PBS gedurende 5 minuten, fixeer in 4% PFA gedurende 10 minuten en incubateer monsters vervolgens in weefsel IF-blokkerende oplossing (zie Aanvullend bestand) gedurende 90 minuten.
   3. Incubateer met anti-Sca-1 primair antilichaam (1:500) verdund in 1x PBS + 0,05% Tween bij 4 °C 's nachts.
   4. Was op dag 2 drie keer in 1x PBS + 0,05% Tween gedurende 5 minuten elk en incubeer vervolgens in geit anti-konijn Alexa Fluor 555 (1:500) gedurende 1 uur.
   5. Was opnieuw (zoals voorheen), incubeer met blokkerende oplossing gedurende 1 uur en voeg vervolgens anti-laminine primair antilichaam (1:500) verdund in 1x PBS + 0,05% Tween gedurende 1 uur toe.
   6. Was opnieuw (zoals voorheen) en incubeer vervolgens in geiten anti-konijn Alexa Fluor 488 (1:500) gedurende 1 uur (voor laminine).
   7. Was opnieuw (zoals voorheen) en incubeer vervolgens in DAPI (1:10.000) gedurende 4 min. Was en monteer op coverslips met behulp van anti-fade montagemedium.

Representative Results

Het identificeren van FAPs en MP's via flowcytometrie met behulp van een nieuw antilichaampanel, waaronder Sca-1 en VCAM-1
De gating-strategie voor het identificeren van FAPs in rattenspier is gebaseerd op flowcytometrieprotocollen in de muis²⁹, die poort op CD31 (endotheel) en CD45 (hematopoietische) positieve cellen (de afstamming [Lin] genoemd) en onderzoekt het fluorescerende profiel van FAPs marker Sca-1 en MPs marker ITGA7 van de linage-negatieve (Lin-) populatie. Bij gebrek aan commercieel beschikbare, fluorofoor-geconjugeerde en flowcytometrie-gevalideerde antilichamen voor rat Sca-1 en ITGA7, hebben we zelf een rat Sca-1::APC-antilichaam geconjugeerd en een alternatieve strategie ondernomen om de parlementsleden te identificeren. Omdat onlangs is aangetoond dat VCAM-1 een efficiënte enkele positieve selectiemarker is voor de isolatie van rat-parlementsleden³³ en er een ratspecifiek, geconjugeerd, flowcytometrie-gevalideerd antilichaam gericht op VCAM-1 beschikbaar is, hebben we VCAM-1 gebruikt om parlementsleden te identificeren, in tegenstelling tot ITGA7.

We bevestigden succesvolle conjugatie en prestaties van het Sca-1:APC-antilichaam met enkele kleuring van compensatieparels en celsuspensies gegenereerd door gezonde rat gastrocnemius (Figuur 2A,B). Een vijfpuntstitratie van Sca-1::APC (Figuur 2C) werd uitgevoerd naast alle andere antilichamen (CD31::FITC, CD45::FITC, VCAM-1:PE) die in het protocol werden gebruikt(aanvullende figuur 1), om de optimale concentraties te identificeren. Met behulp van dit nieuwe panelontwerp werden vermeende FAPs en PARLEMENTSLEDEN tegelijkertijd geïdentificeerd van gezonde gastrocnemius (figuur 3), waarbij cellen enkelpositief voor Sca-1 (Lin-/Sca-1 +/VCAM-1-) werden aangewezen als FAPs (rode doos) en cellen enkelpositief voor VCAM-1 (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) werden aangewezen als PARLEMENTSLEDEN (blauwe doos). We identificeerden ook een populatie cellen die dubbel positief waren voor Sca-1 en VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+)(Figuur 3F; kwadrant rechtsboven).

Validatie van identificatie van FAPs en MP's door FACS en celkweek
Om het gepresenteerde protocol voor flowcytometrische identificatie van FAPs en MP's in de skeletspieren van ratten te valideren, probeerden we levende cellen te isoleren voor kweek in vitro. Met behulp van FACS werden levensvatbare FAPs en MP's geïsoleerd met behulp van dezelfde gating-strategie als in de flowcytometrische analyse. Ongeveer 20.000-40.000 FAPs en 30.000-50.000 parlementsleden werden verzameld voor celkweek van een enkele gastrocnemiusspier van een rat van 230 g.

Om de zuiverheid van elke populatie te bevestigen, hebben we vers gesorteerde FAPs en parlementsleden voor PDGFRα en Pax7 mede-immunosgekleurd. PDGFRα is de tweede mesenchymale voorlopermarker, naast Sca-1, vaak gebruikt om FAPs^2,7,8te identificeren. Pax-7 is een bekende en veel gebruikte marker van spiersatelliet (stam)cellen⁴¹. De gesorteerde populatie van FAPs vertoonde positieve kleuring voor PDGFRα zonder besmetting door Pax7-positieve cellen(Figuur 4A; bovenste rij). Omgekeerd kleurde de gesorteerde populatie van parlementsleden positief voor Pax7 met een afwezigheid van PDGFRα-positieve cellen (Figuur 4A; onderste rij), wat het vermogen van Lin-/Sca-1+/VCAM-1- en Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ celoppervlak-antigeenprofielen valideert om zuivere populaties van respectievelijk FAPs en Parlementsleden te isoleren.

Vervolgens kweekten we gesorteerde FAPs en parlementsleden over een tijdsverloop van 10-12 dagen in omstandigheden om adipogene, fibrogene en myogene differentiatie te induceren. Op dag 12 bevatten FAPs-culturen onderworpen aan adipogene aandoeningen cellen met een fibroblastachtige morfologie of een multiloculaire morfologie vergelijkbaar met die van witte pre-adipocyten met vetdruppels (gegevens niet getoond). Immunostaining voor fibroblastspecifiek eiwit-1 (FSP-1) bevestigde fibroblastdifferentiatie, terwijl kleuring voor Plin-1 (Perilipin-1; een adipocytmarker)⁴² en Oil red O de differentiatie van adipocyten en de aanwezigheid van neutrale triglyceriden en lipiden bevestigde (figuur 4B). De afwezigheid van contaminerende cellen uit een myogene afstamming in de FAPs-culturen werd bevestigd door co-immunostaining voor myosine heavy chain (MHC), een marker van gedifferentieerde myocyten. FAPs-culturen onderworpen aan fibrogene differentiatie (FD) werden beoordeeld op collageentype 1 (Col1a1) expressie, een van de belangrijkste van FAPs afgeleide collageen⁸. Co-immunostaining voor Col1a1 en MHC op dag 11 onthulde robuuste collageen type 1 expressie zonder contaminerende MHC-positieve cellen(figuur 4B). De uiteindelijke bevestiging van de zuiverheid van de FAPs-populatie werd uitgevoerd door FAP's te kweken in myogene media, om de uitgroei van eventuele besmettende parlementsleden aan te moedigen. Er werden geen MHC-positieve cellen waargenomen(aanvullende figuur 2A).

MP-culturen onderworpen aan myogene omstandigheden toonden MHC-tot expressie brengende volwassen myocyten en multi-nucleated myotubes 12 dagen na plating(Figuur 4C). Co-immunostaining van de MP-culturen met FSP-1 en Plin-1 toonde de afwezigheid van respectievelijk contaminerende fibroblasten of adipocyten aan. Evenzo vertoonde ORO-kleuring geen lipidebesmetting (fig. 4C). Van col1a1, dat sterk tot expressie komt door fibroblasten, is ook gemeld dat het in mindere mate wordt geproduceerd door myogene voorlopers en myoblasten, hoewel er tegenstrijdige gegevens in de literatuur zijn in dit verband^8,43,44. Terwijl co-immunostaining van parlementsleden met Col1a1 en MHC myocytendifferentiatie van onze MP-cultuur onthulde, werd er geen bewijs van Col1a1-immunopositiviteit gevonden(figuur 4C). Om de zuiverheid van de populatie verder te bevestigen, werden MP-culturen onderworpen aan adipogene of fibrogene omstandigheden om de groei van adipocyten en fibroblasten te stimuleren (aanvullende figuur 2B). Er werden geen contaminerende cellen uit de FAPs-afstamming waargenomen.

Hoewel we het vermogen hadden aangetoond om zuivere populaties van FAPs en PARLEMENTSLEDEN te identificeren en te sorteren op basis van rattenspier, probeerden we vervolgens de identiteit van de Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ (dubbel positieve) cellen te bepalen. Aangezien Sca-1-expressie is gerapporteerd op een zeer klein deel van de parlementsleden (ongeveer 3%) in gezonde spier⁴⁵ en evenzo weinig FAP's (ongeveer 4%) zijn gemeld om VCAM-1 tot expressie te brengen in gezonde spier^10,werd immunostaining van vers gesorteerde Lin-/Sca-1 +/VCAM-1+ cellen uitgevoerd voor PDGFRα en Pax7, samen met het kweken ervan in myogene, adipogene, en fibrogene aandoeningen om respectievelijk myogenese, adipogenese en fibrogenese te induceren. Het bleek dat de dubbelpositieve cellen een gemengde populatie van parlementsleden en FAPs waren, met vers gesorteerde cellen die immunostaining positief waren voor PDGFRα of Pax7 (aanvullende figuur 3A) en gekweekte cellen die differentiëren in volwassen myocyten, adipocyten of fibroblasten (aanvullende figuur 3B, C).

ITGA7 vs VCAM-1 om parlementsleden te identificeren tijdens flowcytometrische FAPs-identificatie
Terwijl een succesvol protocol voor flowcytometrische identificatie van rat-FAPs en MP's met respectievelijk Sca-1 en VCAM-1 werd vastgesteld, probeerden we te bepalen of een zelfgeconjugeerd ITGA7-antilichaam op dezelfde manier kon worden gebruikt om PARLEMENTSLEDEN te identificeren in plaats van VCAM-1, zoals standaard is in de muis. Een ratspecifiek ITGA7-antilichaam werd geconjugeerd aan PE-Cy7 (zie Aanvullend Dossier) en de prestaties van het antilichaam werden gevalideerd op commerciële compensatieparels en eencellige suspensies gegenereerd door rat gastrocnemius (Aanvullende figuur 4A-C). Het ITGA7::P E-Cy7-antilichaam presteerde adequaat op enkelvoudige kleurings- enFMO-experimenten (aanvullende figuur 4D). Echter, bij het volledig kleuren van gastrocnemius cel suspensies met CD31::FITC, CD45::FITC, Sca-1::APC en ITGA7::P E-Cy7, werd een interactie duidelijk tussen de Sca-1::APC en ITGA7::P E-Cy-7 antilichamen. Daaropvolgende kweek van zowel de FACS-gesorteerde Lin-/Sca-1+/ITGA7-cellen (vermeende FAPs) als Lin-/Sca-1-/IGTA7+ cellen (vermeende MPs) (Aanvullende figuur 4E) leverde voornamelijk FAPs op en met weinig MPs(Aanvullende Figuur 4F), wat de interactie tussen Sca-1::APC en ITGA7::P E-Cy-7 antilichamen negatief beïnvloedde de specificiteit van celidentificatie.

Een nieuw FAPs-tijdsverloop in langdurige gedenerveerde skeletspieren
Aangezien de dynamiek van FAPs is beoordeeld in de context van traumatische denervatie op korte termijn, hebben we in murinemodellen^11,38geprobeerd de prestaties van onze methode voor FAPs-isolatie van zowel gezonde als ernstig atrofische, fibrotische spieren te valideren. Ratten werden onderworpen aan traumatisch langdurig denervatieletsel met behulp van het goed gevalideerde unilaterale tibiale zenuwtranssectiemodel⁴⁶ met gastrocnemiusspier geoogst op vier seriële tijdpunten gedurende 14 weken na denervatie van de gedenerveerde ledemaat en contralaterale geïnnerveerde ledemaat (om te dienen als interne controle). Zoals eerder gemeld, vertoonden gedenervatte spieren progressieve atrofie (figuur 5A, B), met toenemende fibrose en vetafzetting ( figuur5C-F) in de loop van de tijd⁴⁷.

Ons protocol genereerde een voldoende aantal cellen voor flowcytometrische analyse, hoewel 12 en 14 weken-gedenervateerde gastrocnemius ongeveer 0,2-0,3 g (15-20% van de respectieve contralaterale controlespier) wogen (Figuur 5B). We observeerden up-regulatie van FAPs in de gedenervateerde gastrocnemiusspier in vergelijking met de geïnnerveerde contralaterale controlespier, gehandhaafd gedurende de 14 weken durende duur van het experiment (Figuur 6A, B), concordant met de progressieve spierfibrose en vetafzetting. Sca-1 immunostaining van spier histologische doorsneden bevestigde lokalisatie van Sca-1 tot expressie brengende cellen naar gebieden van fibro-vetverandering in 14 weken-gedenervateerde spier (Figuur 5G), naast baseline expressie in het interstitium tussen myofiberen in gezonde spieren. Een duidelijke subset van cellen ontstond in de FAPs-populatie in de loop van de tijd na denervatie, gekenmerkt door een robuuste toename van het Sca-1-signaal (Sca-1 hoog; Figuur 6A, rode doos) over flowcytometrische analyse, vergeleken met de FAPs basale Sca-1 expressie (Sca-1 Med/Low; Figuur 6A, groen vak). Kwantificering van deze subpopulaties onthulde differentiële dynamiek in de loop van de tijd; Sca-1 High FAPs namen significant toe 12- en 14-weken na denervatie (figuur 6B), bestaande uit ongeveer de helft van de totale FAPs-populatie (figuur 6C). Daarentegen waren Sca-1 Med/Low FAPs de dominante subpopulatie op 2- en 5 weken na denervatie (figuur 6C) en toonden slechts een voorbijgaande toename van niveaus vroeg na denervatie (figuur 6B).

In tegenstelling tot de aanhoudende aanwezigheid van FAP's in langdurige gedenervatte spieren, toonden parlementsleden een verwachte bifasische respons op denervatie. Aanvankelijk namen de Kamerleden toe in gedenerveerde spieren boven die in de controle ledemaat, maar na 5 weken na denervatie begon de populatie af te nemen (figuur 6D). In overeenstemming met de bekende uitputting van de spiersatellietcelpopulatie in langdurig gedenerveerde spier⁴⁷, waren de parlementsleden met 12 weken op of onder de uitgangswaarden na tibiale zenuwtranssectie.

We analyseerden ook de dynamiek van de Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ populatie(Aanvullende Figuur 3D-E). Terwijl de frequentie van dubbelpositieve cellen ten opzichte van de Lin-populatie in de loop van de tijd geleidelijk afnam in gedenerveerde spieren, werd, wanneer het absolute celgetal per gram spier werd bepaald, een tijdelijke toename van de dubbel positieve populatie waargenomen, voordat deze 14 weken na denervatie tot of onder de uitgangswaarden daalde.

Figuur 1: Grafisch schema voor de identificatie, isolatie en cultuur vanFAPs en MP's: Grafisch schema met de identificatie van FAPs en MP's van rat gastrocnemius. Monsters worden geoogst en mechanisch gehakt voordat ze twee opeenvolgende enzymatische verteringen ondergaan. Weefselpreparaten worden vervolgens verwerkt en gefilterd om een enkele celsuspensie te genereren. Aan elk monster wordt een cocktail van fluorescerend geconjugeerde antilichamen toegevoegd die vervolgens door een flowcytometer of celsorteerder wordt geleid om respectievelijk FAPs en PARLEMENTSLEDEN te identificeren of te isoleren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Sca-1::APC zelfgeconjugeerde antilichaamvalidatie en titratie. Validatie van Sca-1::APC antilichaamconjugatie door single-staining op commerciële compensatieparels (A) en eencellige suspensies gegenereerd uit gezonde rat gastrocnemius spier (B). Verschillende populaties van zowel Sca-1 gelabelde kralen als cellen zijn duidelijk (zwarte dozen). Antilichaamtitratie werd uitgevoerd door vijf verschillende concentraties Sca-1::APC te testen op eencellige suspensies (C); de optimale concentratie werd gekozen op basis van de grootste fluorescentie-intensiteit met minimale achtergrondkleuring en bleek batchafhankelijk te zijn. Een representatieve titratie wordt weergegeven met de batchspecifieke optimale concentratie aangegeven door het rode vak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Flowcytometrie identificatie van FAPs en MP's bij rat gastrocnemius. (A-V) Gating-strategie voor flowcytometrische analyse van FAPs en MP's. (A) Monsters worden eerst afgesloten om puin (zwarte doos) uit te sluiten en om te gaten voor het tellen van kralen (rode doos). Cellen worden vervolgens gated om doubletten uit te sluiten, zowel door front scatter (FSC) (B) als side scatter (SSC) kenmerken (C). De levensvatbaarheid van de resulterende afzonderlijke cellen wordt beoordeeld door kleuring met SYTOX Blue(D). SYTOX Blue negatieve (live) singlets worden vervolgens beoordeeld op FITC-signaalidentificatie VAN CD31 en CD45 (Lineage; Lin) om Lin+-fracties uit te sluiten van verdere analyse (zwarte doos Lin-cellen) (E). De Lin-populatie wordt vervolgens beoordeeld op Sca-1::APC versus VCAM-1::P E signaal (F). FAPs worden geïdentificeerd als Lin-/Sca-1+/VCAM-1- (F; rode doos), terwijl parlementsleden worden geïdentificeerd als Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ gebeurtenissen (F; blauwe doos). Een Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ dubbel positieve populatie is ook duidelijk (kwadrant rechtsboven). (G) FMO (Fluorescence Minus One) controles voor CD31::FITC en CD45::FITC tonen een goede compensatie en gating voor Lin-cellen. (H-I) Sca-1::APC versus VCAM-1::P E plots van FMO-controles tonen de juiste compensatie en gating voor FAPs (Sca-1 FMO) en MP's (VCAM-1 FMO). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Gesorteerde FAPs en MP's celkweek en immunostaining. (A) Co-immunostaining voor PDGFRα (groen) en Pax7 (rood) op vers gesorteerde FAPs (bovenste rij) en PARLEMENTSLEDEN (onderste rij). Kernen kleuren blauw met DAPI. FAPs drukken uitsluitend PDGFRα uit en er zijn geen Pax7-positieve cellen duidelijk, terwijl parlementsleden uitsluitend Pax7 tot expressie brengen zonder PDGFRα-positieve celbesmetting, wat de zuiverheid van beide gesorteerde populaties aantoont. (B)FAPs op dag 12 in adipogene differentiatiemedia (AD) vlekken positief voor Fibroblast-specifieke Protein 1 (FSP-1; groen) en Perilipin-1 (Plin-1; groen), die respectievelijk gedifferentieerde fibroblasten en adipocyten aantonen. Kernen zijn gekleurd met DAPI (blauw). Olie Rode O (ORO) kleuring (rood) duidt op de aanwezigheid van neutrale triglyceriden en lipiden afkomstig van volwassen adipocyten op dag 12. FAP's onderworpen aan fibrogene differentiatiemedia (FD) tonen expressie van FAPs-afgeleid collageen type 1 (Col1a1; groen). FAPs gekweekt in adipogene of fibrogene media co-immunostain niet voor myosine zware keten (MHC, rood), wat wijst op een afwezigheid van contaminerende myocyten. (C)Parlementsleden gekweekt in myogene differentiatiemedia (MD) op dag 12 vertonen MHC-positieve (rode) kleuring die de aanwezigheid van volwassen myocyten en gefuseerde multinucleaire myotubes aantoont. Kernen zijn gekleurd met DAPI (blauw). MP-culturen waren vrij van fibroblast- en adipocytenbesmetting, zoals aangegeven door de afwezigheid van co-immunostaining voor FSP-1 (groen), Plin-1 (groen) en ORO-kleuring. Parlementsleden die op laminine zijn gekweekt om Co1a1-immunostaining te accommoderen, vertonen op dag 12 niet dezelfde mate van myotube-fusie als op collageen. Col1a1 (groen) is afwezig in MP-culturen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Atrofie, fibrose en vetinfiltratie van langdurig gedenerveerde spieren. (A) Representatieve geoogste gastrocnemiusspieren op vier seriële tijdpunten na denervatie. Gastrocnemius aangeduid contra is een representatief contralateraal ledemaatmonster van een twee weken durend gedenervatt dier. B)Kwantificering van spieratrofie na denervatie, uitgedrukt als de verhouding tussen het natte gewicht van de denervated (DEN) gastrocnemius en dat van de contralaterale (CONTRA) ledemaat. (C) Picrosirius Red (PSR) gekleurd histologische doorsneden van gastrocnemius geoogst 2 of 14 weken na denervatie vertonen progressieve fibrose. Spiervlekken geel, collageen kleurt rood. (D) Fibrose gekwantificeerd door het gebied van PSR-positief weefsel te bepalen ten opzichte van het totale weefseloppervlak. (E) Olie rode O (ORO) gekleurde doorsneden van gastrocnemius geoogst 2- of 14-weken na-denervatie, tegengekleurd met hematoxyline. Lipiden kleuren rood. F)Vetinfiltratie gekwantificeerd door het bepalen van het gebied van ORO gekleurd weefsel ten opzichte van het totale weefseloppervlak. (G) Gastrocnemius histologische doorsneden geoogst 2 of 14 weken na denervatie, immunostained voor laminine (groen) en Sca-1 (rood). Laminine kleurt positief de basale lamina die individuele myofibers omringt. Sca-1 identificeert meerdere voorloperceltypen. Kernen zijn gekleurd met DAPI (blauw). Inzet toont lokalisatie van Sca-1 + cellen buiten de basale lamina in gezonde spieren; gele pijlen geven de aanwezigheid van Sca-1+ cellen in fibrotische gebieden aan. (Gegevens zijn gemiddelde +/- S.D; n=3 voor 2 en 14 week tijdpunten. Gegevens in paneel B geanalyseerd door eenrichtingsverkeer ANOVA, gegevens in panelen D en F geanalyseerd door tweerichtings-ANOVA. Post-hoc Sidak's test uitgevoerd om te corrigeren voor meerdere vergelijkingen. * = P<0,05 tussen CONTRA en DEN; # = P<0.05 tussen samples) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Faps en MP-dynamiek in langdurige gedenervateerde rat gastrocnemius. (A) Representatieve Sca-1::APC versus VCAM-1::P E panelen van de Lin- (CD31-/CD45-) populatie uit spiermonsters geoogst 2-, 5-, 12- of 14-weken na denervatie. De bovenste rij toont percelen van de denervated (DEN) gastrocnemius, terwijl de onderste rij die van de contralaterale, niet-geopereerde (CONTRA) gastrocnemius toont. Lin-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs (Totaal) zijn onderverdeeld in Sca-1 High (rode doos) en Sca-1 Med/Low (groene doos) fracties, terwijl Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ MP's worden weergegeven in het blauwe vak. (B) Kwantificering van FAPs (Total, Sca-1 High, Sca-1 Med/Low) op elk tijdstip na denervatie, gerapporteerd als de frequentie (%) van Lin-cellen (bovenste rij) en het aantal cellen per gram spier (onderste rij) genormaliseerd tot de contralaterale controle gastrocnemius. (C) Relatieve verhoudingen van Sca-1 High en Sca-1 Med/Low subpopulaties van de totale FAPs-populatie. DKwantificering van parlementsleden op elk tijdstip na denervatie gerapporteerd als de frequentie (%) van Lin-cellen (linker grafiek) en als het aantal cellen per gram spier (rechter grafiek) genormaliseerd naar de contralaterale controle. (Gegevens zijn gemiddeld +/- S.D; n=4 voor 2 en 12 week tijdpunten; n=5 voor 5 weken tijdpunt; n=2 voor 14 weken tijdpunt. Gegevens geanalyseerd door eenrichtingsverkeer ANOVA; Post-hoc Sidak's test om te corrigeren voor meerdere vergelijkingen. # = P<0,05.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Validatie en titratie van antilichamen. Validatie van CD31::FITC (A-C), CD45::FITC (D-F) en VCAM-1::P E (G-I) commercieel geconjugeerde antilichamen op compensatieparels (A,D,G) en eencellige suspensies van gezonde rat gastrocnemius spier (B,E,H). Elk antilichaam werd getitreerd in 5 verschillende concentraties (C,F,I). De optimale concentratie werd gekozen op basis van de grootste fluorescentie-intensiteit met minimale achtergrondkleuring (rode dozen). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Gesorteerde FAPs en Parlementsleden in omgekeerde differentiatiecultuuromstandigheden. (A)FAPs gekweekt in myogene differentiatiemedia (MD) op dag 12 co-immunostained voor FSP-1 (groen), Plin-1 (groen) of Col1a1 (groen) en MHC (rood) vertonen geen myocytenbesmetting. Positieve FSP-1 en Col1a1-kleuring onthullen FAPs-differentiatie naar fibroblasten. ORO-kleuring (rood) onthult lipideproductie, hoewel Plin-1-positieve adipocyten niet gemakkelijk zichtbaar zijn. Kernen gekleurd met DAPI (blauw). (B) Kamerleden onderworpen aan adipogene differentiatie media stierven. Parlementsleden gekweekt in FAP Growth Media (FAP GM) gedurende 12 dagen en co-immunostained voor FSP-1 (groen) of Plin-1 (groen) en MHC (rood) vertonen gedifferentieerde myocyten en myotubes met een afwezigheid van FSP-1 of Plin-1 positieve cellen. De afwezigheid van ORO-kleuring bevestigt verder het gebrek aan adipogene cellen in cultuur. Parlementsleden gekweekt in fibrogene differentiatiemedia (FD) en co-immunostained voor Col1a1 en MHC vertonen volwassen myocyten en een afwezigheid van Col1a1-positieve cellen. Parlementsleden gekweekt op laminine om Col1a1-immunostaining te accommoderen, vertonen niet dezelfde mate van fusie met myotubes na 12 dagen in cultuur als op collageen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ cellen zijn een gemengde populatie vanFAPs en Parlementsleden. (A) PDGFRα en Pax7 co-immunostaining van vers geïsoleerde Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ cellen vertonen een gemengde populatie van PDGFRα single positive (witte pijlen) en Pax7 single positive (gele pijl) cellen die respectievelijk FAPs en MP's identificeren. (B)Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ culturen op dag 12 gekweekt in myogene differentiatiemedia (MD) bevatten zowel FSP-1 enkelvoudige positieve (groene) als MHC enkele positieve (rode) cellen die respectievelijk fibroblasten en myocyten/buizen identificeren. Een afwezigheid van Plin-1 (groen) en ORO (rood) kleuring duidt op de afwezigheid van volwassen adipocyten. Co-immunostaining voor Col1a1 (groen) en MHC (rood) tonen rijpe myocyten en fibroblasten. (C)Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ cellen op dag 12 gekweekt in adipogene differentiatiemedia (AD) vertonen op dezelfde manier een mix van FSP-1 (groen) enkele positieve en MHC (rode) enkele positieve cellen, maar ook met Plin-1 (groene) enkele positieve cellen en ORO-kleuring aanwezig, wat de differentiatie van fibroblasten, myocyten en adipocyten bevestigt. Culturen gekweekt in fibrogene differentiatiemedia (FD) tonen volwassen myocyten en Col1a1 enkele positieve cellen (fibroblasten). (D) Representatieve Sca-1::APC versus VCAM-1::P E panelen van de Lin- (CD31-/CD45-) populatie uit gedenerveerde spiermonsters geoogst 2-, 5-, 12- of 14-weken na denervatie; Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ populatie zijn aangegeven in het paarse vak. (E)Kwantificering van Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ cellen over vier seriële tijdspunten na denervatie, gerapporteerd als de frequentie van Lin-cellen (linker grafiek) en cellen per gram spier (rechter grafiek) genormaliseerd tot de contralaterale gastrocnemius. (Gegevens zijn gemiddeld +/- S.D; n=4 voor 2 en 12 week tijdpunten; n=5 voor 5 weken tijdpunt; n=2 voor 14 weken tijdpunt. Gegevens werden geanalyseerd door eenrichtingsverkeer ANOVA; post-hoc Sidak's test om te corrigeren voor meerdere vergelijkingen; # = P<0,05.) Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: ITGA7 als marker van myogene cellen in flowcytometrie van de skeletspieren van ratten. Validatie van ITGA7::P E-Cy7 antilichaamconjugatie door single-staining op commerciële compensatieparels (A) en eencellige suspensies gegenereerd uit gezonde rat gastrocnemius spier (B). Populaties van zowel ITGA7-gelabelde kralen als cellen zijn duidelijk (zwarte dozen) (C) Antilichaamtitratie werd uitgevoerd door vijf verschillende concentraties op eencellige suspensies te testen. Rode doos geeft ideale concentratie aan. (D) Plots of Fluorescence Minus One (FMO) controls tonen de afwezigheid van fluorescentie spillover over de antilichaamconjugaten, maar volledige kleuring van celsuspensies onthult een niet-specifieke interactie tussen Sca-1::APC en ITGA7::P E-Cy7 (groene doos). Gating (E) om Lin-/Sca-1+/ITGA7-cellen (vermeende "FAPs") en Lin-/Sca-1-/IGTA7+ cellen (vermeende "MP's") te scheiden. (F)Co-immunostaining van FACS-gesorteerde celculturen 12 dagen na plating met Perilipin-1 (groen) en MHC (rood) toont aan dat beide groepen gesorteerde cellen voornamelijk rijpten tot adipocyten met weinig aanwezige myocyten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

1. Onbevlekt

2. Controle van de levensvatbaarheid

3. CD31 + CD45 FMO

4. Sca-1 FMO

5. VCAM-1 FMO

6. CD31 + CD45 Enkele Vlek (Kralen)

7. CD31 + CD45 Enkele Vlek (Cellen)

8. Sca-1 enkele vlek (kralen)

9. Sca-1 enkele vlek (cellen)

10. VCAM-1 enkele vlek (kralen)

11. VCAM-1 enkele vlek (cellen)

Tabel 1: Flowcytometrie antilichaamkleuringscontroles. Volledige aanvulling van antilichaamkleuringscontroles. Als het experiment voor de eerste keer wordt uitgevoerd, moeten enkele gekleurde controles worden uitgevoerd op zowel compensatieparels als eencellige suspensies. Voor alle volgende experimenten hoeven enkele gekleurde controles alleen op compensatiekralen te worden uitgevoerd.

	CD31::FITC (μg)	CD45::FITC (μg)	Sca-1::APC (μg)*	VCAM-1::P E (μg)	SYTOX Blauw (μM; Eindconcentratie)
Onbevlekte controle
	--	--	--	--	--
Bedieningselementen met één kleur
SYTOX Blue (Viability Control)	--	--	--	--	1
CD31 & CD45	0.5	0.25	--	--	1
SCA-1	--	--	0.25	--	1
VCAM-1	--	--	--	0.25	1
Fluorescentie minus één (FMO)
CD31 & CD45	--	--	0.25	0.25	1
SCA-1	0.5	0.25	--	0.25	1
VCAM-1	0.5	0.25	0.25	--	1
Experimentele monsters
Volledige beits	0.5	0.25	0.25	0.25	1

Tabel 2: Flowcytometrie antilichaamkleuringsmatrix. De hoeveelheid antilichamen voor kleuring van experimentele en controlemonsters voor flowcytometrie wordt getoond. Alle vlekken worden uitgevoerd in een totaal volume van 100 μL wasbuffer. *De optimale hoeveelheid zelfgeconjugeerd Sca-1::APC-antilichaam kan variëren afhankelijk van de gebruikte batch. Alle vers geconjugeerde Sca-1::APC-batches moeten eerst worden gevalideerd door zowel compensatieparels als eencellige suspensies met één kleuring te beitsen.

Aanvullend dossier: Reagensrecepten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Een geoptimaliseerd, gevalideerd FAPs-isolatieprotocol voor rattenspier is essentieel voor onderzoekers die letselmodellen willen bestuderen die om biologische of technische redenen niet haalbaar zijn in de muis. Muizen zijn bijvoorbeeld geen optimaal diermodel om chronische lokale of neurodegeneratieve verwondingen zoals langdurige denervatie te bestuderen. Biologisch gezien maken de korte levensduur en snelle veroudering van muizen het moeilijk om de spiersequalae nauwkeurig af te bakenen als gevolg van denervatie van de verstorende factor van veroudering. Vanuit technisch oogpunt zou de drastisch verminderde spiermassa als gevolg van ernstige atrofie onvoldoende zijn voor een effectieve flowcytometrische analyse. In feite suggereren isolatieprotocollen voor muizen-FAPs om gezonde spieren samen te groeperen om de opbrengst van gesorteerde FAPs beter te verhogen²⁹. Hoewel dit de technische barrière van het verkrijgen van voldoende spierweefsel voor analyse oplost, beperkt het onderzoekers tegelijkertijd om FAPs op een spierspecifiek niveau te beoordelen. Omdat specifieke spiergroepen inherent variëren in hun vezeltypesamenstelling, mate van vascularisatie en mitochondriale nummers⁴⁷ bijvoorbeeld, voorkomt het combineren van meerdere verschillende spieren voor flowcytometrische analyse spierspecifieke FAPs-karakterisering. Daarentegen laten we zien dat zowel gezonde als langdurige gedenervateerde, atrofische en fibrotische rat gastrocnemius een voldoende hoeveelheid uitgangsmateriaal bieden voor effectieve flowcytometrie. Bovendien kan in gezonde monsters het overschot aan spieren verder worden onderverdeeld voor meerdere stroomafwaartse assays, waardoor onderzoekers tegelijkertijd de cellulaire, moleculaire en histologische kenmerken van hetzelfde weefsel kunnen analyseren. Ten slotte zijn voor experimenten die FAPs manipuleren in letselmodellen met therapeutica, goed gevalideerde analyses van fysiek functioneren en lopen bij alerte en actieve ratten beschikbaar^21,22,23,24, waardoor seriële beoordeling van de spierfunctie mogelijk is zonder de noodzaak van beëindiging van het dier.

Een belangrijk obstakel bij het creëren van een geoptimaliseerd FAPs-isolatieprotocol voor de rat was de beschikbaarheid van antilichamen. Onze eerste aanpak was gericht op het kopiëren van het antilichaampanel en de gating-strategieprotocollen die op grote schaal worden gebruikt in de muis^{1,7,8,9,10,11,12,13,14.} Hoewel in de handel verkrijgbare, geconjugeerde, flowcytometrie-geteste en gevalideerde antilichamen die rat herkennen beschikbaar waren voor de afstammingsmarkers CD31 en CD45, bestond er geen voor positieve FAPs die markers Sca-1 of PDGFRα identificeerden, evenals voor de negatieve selectiemarker ITGA7. Ongeconjugeerde, primaire antilichamen die specifiek zijn voor deze markers en waarvan wordt beweerd dat ze effectief zijn in flowcytometrie waren beschikbaar, maar van de FAPs-markers Sca-1 en PDGFRα was alleen het Sca-1-antilichaam gevalideerd in de gepubliceerde literatuur in flowcytometrische analyse van rattencellen⁴⁸. Daarom hebben we Sca-1 geselecteerd als de positieve selectiemarker voor FAPs. Het vooruitzicht van het gebruik van secundaire antilichamen om Sca-1- en ITGA7-markers af te bakenen was om verschillende redenen niet haalbaar, maar vooral omdat de enige ratspecifieke antilichamen voor Sca-1 en ITGA7 die gevalideerd waren voor flowcytometrie werden gegenereerd in dezelfde gastheersoort. Daarom was de resterende optie zelfconjugatie van beide antilichamen met behulp van in de handel verkrijgbare kits.

Het proces van het kiezen van een optimale kit voor antilichaamconjugatie was uitgebreid, omdat veel kits volledig of gedeeltelijk intolerant zijn voor verschillende bufferverdunners (bijv. Glycine, Glycerol, BSA, Sodium Azide) die aanwezig zijn in primaire antilichamen. Bovendien moet de meegeleverde fluorofoor compatibel zijn met de lasers die zijn uitgerust in de flowcytometer/celsorteerder waarover de onderzoeker beschikt, en mag deze niet uitzenden op een golflengte die vergelijkbaar is met andere fluoroforen die worden gebruikt om andere celtypen in het monster te identificeren. De aanwezigheid van verdunningscomponenten in de ratspecifieke PDGFRα primaire antilichamen die slecht compatibel waren met de conjugatiekits, was een extra overweging bij de keuze van Sca-1 als de positieve FAPs-selectiemarker in dit protocol. Hoewel deze resultaten aantonen dat zowel Sca-1::APC als ITGA7::P E-Cy7-vervoegingen resulteerden in de identificatie van verschillende positief gekleurde populaties op zowel compensatieparels als cellen, bleken de eerste eerder verval in fluorescentie te vertonen dan door de fabrikant werd geadverteerd. Het wordt ten zeerste aanbevolen dat onderzoekers Sca-1::APC conjugeren volgens de instructies van de fabrikant, onmiddellijk voorafgaand aan het eerste gebruik (bijv. De dag voor het experiment) om een robuust signaal te garanderen, experimenten dienovereenkomstig te plannen zodat een enkele batch geconjugeerd antilichaam kan worden gebruikt binnen het venster van effectiviteit van het antilichaam, en elke batch valideren door compensatieparels met één kleuring en titreren op eencellige suspensies. Belangrijker is echter dat de kritische interactie tussen Sca-1::APC en ITGA7::P E-Cy7 de nauwkeurige afbakening van populaties van FAPs versus parlementsleden verhinderde, waardoor een alternatieve strategie moest worden gebruikt.

Boscolo Sesillo et al. toonden onlangs de succesvolle flowcytometrische isolatie van rattenspierstamcellen aan met behulp van VCAM-1 als een enkele positieve selectiemarker³³ in CD31-, CD45- en CD11b-negatieve cellen. Met VCAM-1 als MP-selectiemarker gebruikten we een nieuw antilichaampaneel om FAPs (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) en MP's (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) te identificeren en valideerden we de aanpak met in vitro kweek van FACS-gesorteerde cellen uit gezonde gastrocnemiusspier. Vers geïsoleerde FAPs en parlementsleden die uitsluitend immuungekleurd zijn voor hun respectievelijke alternatieve markers PDGFRα en Pax7. Gekweekte FAPs gedifferentieerd in populaties van volwassen fibroblasten en adipocyten, en PARLEMENTSLEDEN in volwassen myocyten / myotubes. Er vond geen kruisbesmetting van FAPs en Kamerleden binnen de culturen plaats. Immunostaining van histologische doorsneden bevestigde infiltratie van gebieden van fibro-vetafbraak in gedenerveerde spieren met Sca-1-positieve cellen.

Terwijl we flowcytometrische analyse van langdurige gedenervatte spieren uitvoerden om ons protocol te valideren in ernstig atrofische, fibrotische en vet-geïnfiltreerde spieren, observeerden we incidenteel de opkomst van een FAPs-subpopulatie met verhoogd Sca-1-signaal (aangeduid met Sca-1 High) in vergelijking met de baseline Sca-1-expressie (aangeduid met Sca-1 Med / Low) in de loop van de tijd. Sca-1 High FAPs namen significant toe laat na denervatie (12 weken plus), terwijl Sca-1 Med / Low FAPs vroeg piekten na 5 weken voordat ze terugvielen naar basislijnniveaus. Heterogeniteit in het FAPs-fenotype is gemeld^10,30. VAN FAPs met een hogere Sca-1-expressie werd aangetoond dat ze gemakkelijker differentiëren in adipocyten en bij blootstelling aan fibrogene stimulatie verhoogde de expressie van Col1a1^30,49. De dynamiek van de HIER waargenomen FAPs-subpopulaties lijkt in lijn te zijn met het tijdsverloop van door denervatie geïnduceerde sequelae en de regeneratieve capaciteit van spieren⁴⁷ en kan dus FAPs-subpopulaties met verschillende cellulaire programma's karakteriseren. Sca-1 High FAPs worden up-gereguleerd op late tijdstippen, gelijktijdig met fibro / vetinfiltratie en een afname van het regeneratieve potentieel, terwijl Sca-1 Med / Low FAPs up-gereguleerd worden tijdens het regeneratieve venster van de spier en kan helpen bij effectieve regeneratieve myogenese. Het HIER gepresenteerde FAPs-isolatieprotocol biedt onderzoekers de mogelijkheid om deze verschillende populaties te identificeren en te isoleren voor toekomstig onderzoek.

We identificeerden een populatie van cellen die positief kleurden voor zowel Sca-1 als VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) en stelden vast dat deze dubbel positieve populatie een mengsel was van FAPs en MP's. Scheiding van deze populatie met behulp van een derde marker - ITGA7 - was niet mogelijk vanwege de interactie tussen Sca-1 en ITGA7 primaire antilichamen. Malecova en collega's rapporteerden een subpopulatie van VCAM-1 die FAPs tot expressie brengt die bijna afwezig is in gezonde spieren, tijdelijk verhoogd met acute ontsteking, en hun persistentie in mdx-muizen (model van spierdystrofie) was geassocieerd met chronische spierontsteking en fibrose¹⁰. Daarentegen, en hoewel geen pure FAPs-populatie, vonden we dat de Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ populatie afnam tot of onder baseline niveaus met chronische spierfibrose op 12- en 14 weken na denervatie. Denervatie induceert niet dezelfde ontstekingsreactie en cyclusregeneratiepogingen als mdx-muizen, wat de verschillen in onze resultaten kan verklaren. Onze identificatie van parlementsleden in de Lin-/Sca-1+/ VCAM-1+ celpopulatie is in overeenstemming met het rapport van Sca-1-expressie op een zeer klein deel van de parlementsleden in gezonde spieren, met een voorbijgaande toename na letsel tijdens myoblastproliferatie en daaropvolgende terugtrekking uit de celcyclus⁴⁵. Dus, terwijl onze antilichaametikettering en FACS-gatingstrategie met succes zuivere populaties van FAPs en MP's isoleren voor studie, kunnen experimenten die op flowcytometrie gebaseerde kwantificering van deze populaties vereisen, hun aantal enigszins onderschatten vanwege het kleine percentage cellen in beide voorloperlijnen die Sca-1 en VCAM-1 co-expresseren. Hoe dan ook, het huidige protocol toont duidelijk de klassieke bifasische reactie van parlementsleden op denervatieletsel, met kortdurende upregulatie en daaropvolgende uitputting van de bevolking in langdurig gedenerveerde spieren. Evenzo wordt de toename van FAPs gemeld bij geïsoleerde denervatieschade op kortere termijn hier samengevat en blijkt deze verder te worden volgehouden met behulp van het langetermijnmodel voor tibiale zenuwtranssectie.

Samenvattend biedt dit protocol onderzoekers een voorheen onontgonnen dier, de rat, om flowcytometrische methoden te gebruiken om tegelijkertijd FAPs en MP's te bestuderen. Experimenten bij muizen beperkt door de hoeveelheid skeletspieren, en de frequente noodzaak om terminale experimenten uit te voeren om spierkracht en -functie te beoordelen, kunnen gemakkelijk worden uitgevoerd bij de grotere rat en met een uitgebreider scala aan niet-dodelijke kracht- en functionele beoordelingsmethoden. Over het algemeen kunnen FAPs-studies bij de rat nieuwe rollen van deze belangrijke voorloperpopulatie blootleggen bij acute en chronische spier- en perifere zenuwtrauma's en -ziekten, waardoor het potentieel voor het ontwikkelen van celspecifieke therapieën toeneemt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	Falcon	352235
10 cm cell culture dishes	Sarstedt	83.3902
12-well cell culture plate	ThermoFisher	130185
12 mm glass coverslips, No.2	VWR	89015-724
10 mL Syringe	Beckton Dickenson	302995
15 mL centrifuge tubes	FroggaBio	91014
20 gauge needle	Beckton Dickenson	305176
25mL Serological pipette	Sarstedt	86.1685.001
40µm cell strainer	Fisher Scientific	22363547
50mL centrifuge tubes	FroggaBio	TB50
AbC Total Antibody Compensation Beads	ThermoFisher	A10497
Ammonium Chloride, Reagent Grade	Bioshop	AMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µg	Biotium	92307
Aquatex Aqueous Mounting Medium	Merck	108562
Biolaminin 411 LN	Biolamina	LN411
Bovine Serum Albumin (BSA)	Bioshop	ALB001
Calcium Chloride	Bioshop	CCL444.500
Collagenase Type II	Gibco	17101015
CountBright Plus Absolute Counting Beads	ThermoFisher	C36995
Dexamethasone	Millipore Sigma	D4902
Dispase	Gibco	17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)	Gibco	11995-065	(+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTA	FisherScientific	S311
FACSClean Solution	Beckton Dickenson	340345
FACSDiva Software	Beckton Dickenson	--
FACSRinse Solution	Beckton Dickenson	340346
Fetal Bovine Serum	Sigma	F1051
Flow Cytometry Sheath Fluid	Beckton Dickenson	342003
FlowJo Software	Beckton Dickenson	--
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody	Invitrogen	A21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody	Invitrogen	A21429
Goat Serum	Gibco	16210-064
Ham's F10 Media	ThermoFisher	11550043	(+) Phenol Red (+) L-Glutamine (-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)	Multicell	311-513-CL
Heat Inactivated Horse Serum	Gibco	26050-088
Hemocytometer	Reichert	N/A
HEPES, minimum 99.5% titration	Sigma	H3375
Horse Serum	ThermoFisher	16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1)	Cell Signaling	8915LF
Humulin R	Lilly	HI0210
IBMX	Millipore Sigma	I5879	Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
Isopropanol	Sigma	I9516	Also known as 2-propanol
Lewis Rat, Female	Charles River Kingston	004 (Strain Code)	200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer	Beckton Dickenson	--
Microcentrifuge	Eppendorf	EP-5417R
MoFlo XDP Cell Sorter	Beckman Coulter	--
Mouse Anti-CD31::FITC Antibody	Abcam	ab33858	Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC Antibody	Biolegend	202205	Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE Antibody	Biolegend	200403	Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	N/A	Also known as MF20
Mouse Anti-Pax7 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %	Sigma	HT501128
Oil Red O	Millipore Sigma	O0625
PE-Cy7 Conjugation Kit	Abcam	ab102903
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)	Gibco	10010-023	(-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent Grade	Bioshop	PBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody	Invitrogen	MA5-32347	FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody	Abcam	ab203254
Rabbit Anti-Laminin Antibody	Sigma	L9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody	Abcam	ab3526
Rabbit Anti-Sca-1 Antibody	Millipore Sigma	AB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody	Abcam	ab260043	Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody	Abcam	ab203491
Recombinant Human FGF-basic	Gibco	PHG0266
Sodium Azide	Sigma	S2002
Triton-X-100	Fisher Scientific	BP151
Troglitazone	Millipore Sigma	T2573
Tween-20	Bioshop	TWN510