Summary
该协议概述了一种从大鼠骨骼肌中分离纤维脂肪源性祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的方法。在肌肉损伤模型中利用大鼠为分析提供了来自萎缩肌的组织可用性的增加，以及用于评估自由移动动物的肌肉力量和步态的更多经过验证的方法。
Abstract
纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）是骨骼肌中的常驻间质细胞，与肌原祖细胞（MPs）一起在肌肉稳态，损伤和修复中起关键作用。目前用于FAPs鉴定和分离的方案使用流式细胞术/荧光激活细胞分选（FACS），迄今为止 在体内 评估其功能的研究仅在小鼠中进行。大鼠较大的固有尺寸允许对骨骼肌损伤模型中的FAPs进行更全面的分析，特别是在严重萎缩的肌肉中，或者当研究人员需要大量的组织质量进行多次下游测定时。大鼠还提供了更多不需要动物镇静或牺牲的肌肉功能测定选择，从而通过进行连续评估来最大限度地减少发病率和动物使用。针对小鼠优化的流式细胞术/ FACS方案具有物种特异性，特别是受市售抗体特性的限制。它们尚未针对将FAPs与大鼠或高度纤维化肌肉分离进行优化。基于表面标志物CD31，CD45，Sca-1和VCAM-1的差异表达，开发了一种流式细胞术/ FACS方案，用于从健康和去神经化大鼠骨骼肌中鉴定和分离FAPs和MP。由于大鼠特异性，流式细胞术验证的一抗受到严重限制，因此进行了靶向Sca-1的抗体的内部偶联。使用该协议，确认了成功的Sca-1偶联，并通过细胞培养和FACS分离的FAP和MP的免疫染色来验证FAP和MP的流式细胞术鉴定。最后，我们在延长（14周）大鼠去神经支配模型中报告了一种新的FAPs时间过程。这种方法为研究人员提供了在新型动物模型中研究FAPs的能力。
Introduction
纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）是骨骼肌中常驻的多能祖细胞群，在肌肉稳态，修复和再生中起关键作用，相反，还介导对肌肉损伤的病理反应。顾名思义，FAPs最初被确定为具有分化成成纤维细胞和脂肪细胞1的潜力的祖细胞群体，并且据称是慢性损伤和疾病中骨骼肌纤维脂肪浸润的关键介质。进一步的研究表明，FAPs还具有成骨和软骨形成2，3，4的能力。因此，它们在文献中被更广泛地标记为间充质或基质祖3，5，6，7，8。在急性骨骼肌损伤中，FAPs通过短暂增殖间接帮助再生肌生成，为激活的肌肉卫星细胞及其下游肌原祖（MPs）对应物1，9，10提供有利的环境。在成功再生的同时，FAPs经历凋亡，使其数量恢复到基线水平1，9，10，11。相反，在慢性肌肉损伤中，FAPs会覆盖促凋亡信号，这导致它们持续存在9，10，11和异常的肌肉修复。
评估FAPs介导肌肉反应的细胞和分子机制的体内研究利用了迄今为止的小鼠动物模型1，7，9，10，11，12，13，14。虽然基因工程小鼠是用于这些分析的强大工具，但动物的小尺寸限制了在长期局部损伤模型中研究的组织可用性，其中肌肉萎缩可能是深刻的，例如创伤性去神经支配。此外，肌肉力量和身体功能的测量需要需要终止小鼠的离体或原位测量，或需要手术和/或全身麻醉的体内方法，以评估肌肉收缩性能15，16，17，18，19，20.在大鼠中，除了对更复杂的运动行为（例如步态分析，例如坐骨神经痛功能指数，CatWalk分析）的分析之外，还存在经过良好验证和全球利用的肌肉功能分析，并在清醒和自发移动的动物中进行21，22，23，24.这还优化了动物实验中最低发病率的原则，以及使用的研究动物的数量。因此，大鼠为FAPs研究者提供了更大的损伤肌肉体积的灵活性，用于蛋白质和细胞分析，并且能够对警觉动物中的肌肉复合物静态和动态功能活动和行为进行连续评估。
FAPs主要分别使用流式细胞术和荧光激活细胞分选（FACS）从全肌肉样品中鉴定和分离。这些是基于激光的测定，能够根据特征特征（例如大小，粒度以及细胞表面或细胞内标记物的特定组合）鉴定多个特定细胞群25。这在骨骼肌等器官系统的研究中非常有利，因为稳态和再生是由大量细胞类型协调的复杂多因素过程。一项开创性的研究确定了FAPs以及MP，在小鼠骨骼肌中使用流式细胞术方法1。他们证明FAPs本质上是间充质的，因为它们缺乏来自内皮（CD31），造血（CD45）或肌源性（整合素-α7 [ITGA7]）起源的细胞特异性的表面抗原，但表达间充质干细胞标志物Sca-1（干细胞抗原1）1并在培养物中分化成纤维化和脂肪生成细胞。其他研究表明，基于替代干细胞标志物，血小板衍生的生长因子受体α（PDGFRα）2，7，8的表达，成功分离肌肉间充质祖细胞，进一步的分析显示这些可能与FAPs3相同。FAPs现在通常在流式细胞术中使用Sca-1或PDGFRα作为阳性选择标记物1，9，10，11，12，13，14，26，27，28，29，30，31.PDGFRα的使用对人体组织是首选的，然而，作为小鼠Sca-1的直接人类同系物尚未被鉴定32。此外，其他细胞表面蛋白已被报道为MP的标志物（例如，VCAM-1），为ITGA7提供了一种潜在的替代方案，作为FAPs分离期间肌源谱系细胞的指标33。
虽然流式细胞术/FACS是研究FAPs在骨骼肌1、9、10、11、13、29中的作用和致病潜力的强大方法，但它在技术上受到其所需试剂的特异性和优化的限制。由于流式细胞术鉴定和分离FAPs已经在小鼠动物模型1、9、10、11、29中得到开发和进行，这给希望在其他模式生物中研究FAPs的研究人员带来了挑战。许多因素 - 例如要处理的最佳组织尺寸，以及试剂和/或抗体特异性和可用性 - 因所用物种而异。
除了在新型动物模型中研究FAPs的技术障碍外，它们在很大程度上是在急性有毒环境中研究的 - 通常通过肌内化学注射或心脏毒素。对FAPs长期动力学的评估主要限于评估杜氏肌营养不良症，使用mdx小鼠模型9，10，11和组合肌肉损伤模型，如巨大的肩袖撕裂，其中同时在肩部肌肉组织上进行肌腱横断和去神经支配26，27，28.FAPs对慢性创伤性去神经支配的唯一侮辱的反应，在重工业，农业和出生创伤（臂丛神经损伤）34，35，36，37中常见的工作场所事故中发生，具有显着的发病率，尚未得到很好的表征，通常仅限于短期时间范围11，38。
我们描述了一种从大鼠的健康以及严重萎缩和纤维化骨骼肌中识别和分离FAPs和MP的方法。首先，使用组织消化和流式细胞术染色方案鉴定CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-FAPs和CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+MPs，并通过对FACS分离的细胞进行培养和免疫细胞化学染色，随后对我们的发现进行验证。使用这种方法，我们还在大鼠的长期孤立去神经支配损伤模型中报告了一种新的FAPs时程。
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Protocol
执行该协议的调查人员必须获得当地动物伦理委员会/护理委员会的许可。所有动物工作均由圣迈克尔医院团结健康多伦多动物护理委员会（ACC #918）批准，并根据加拿大动物护理委员会（CCAC）制定的指导方针进行。流式细胞术方案的示意图如图 1所示。如果下游应用是FACS和随后的细胞培养，则应使用适当的无菌技术完成所有步骤。
1. 肌肉收割
- 根据当地动物饲养场和动物伦理委员会指南，使用适当的麻醉剂和牺牲对大鼠进行麻醉。例如，该协议从成年雌性刘易斯大鼠（200-250g）收获腓肠肌。使用2-3%异氟醚麻醉大鼠，并通过心内注射T61来处死大鼠。
- 一旦动物被处死，剃掉整个后肢，以促进肌肉的位置，并尽量减少收获组织的毛皮污染。
- 使用无菌手术刀，在皮肤上做两个切口：第一个切口在踝关节的周长周围，第二个在从脚踝到臀部的后肢内侧的中线。
- 剥离皮肤和浅表肌肉层，露出下方的腓肠肌，它起源于股骨的内侧和外侧髁，插入跟腱。
- 使用钝性夹层将腓肠肌与周围组织分开，仅通过肌腱处理肌肉，以避免挤压伤。
- 用锋利的剪刀将跟腱尽可能远端切除，将腓肠肌腱与其插入分开。切开后，用镊子抓住跟腱，轻轻地将腓肠肌从下层骨上剥离。仍然用一只手用镊子握住肌肉，找到腓肠肌的两个起源，并在内侧和外侧股骨髁处切开。
- 将切除的腓肠肌轻轻擦拭在无菌纱布上，以尽可能多地去除血液。修剪无菌表面上的肌肉，去除任何多余的结缔组织以及跟腱。
- 将肌肉放在称重艇中，并使用精密秤称重。该协议经过优化，可消化湿重为200-600毫克的肌肉。如果需要，操作员可以将多余的收获组织细分为其他下游检测。
- 轻轻地进一步将收获的肌肉分成3-4个较小的块（约1-2 cm3），并浸没在冰冷的1x PBS中。在冰上保持冷藏，直到所有样品都收获完毕。
2. 肌肉消化
- 从PBS中取出肌肉，并置于无菌的10cm细胞培养皿中。用镊子轻轻撕开并切碎组织，直到碎片约3-4毫米3，去除尽可能多的结缔组织。一旦完全切碎，转移到含有6 mL DMEM + 1%青霉素/链霉素（P / S）的无菌50 mL锥形管中。
- 将10μL300mM CaCl2溶液加入365μL胶原酶II溶液（储备浓度4800 U / mL）以激活胶原酶酶。将活化的胶原酶II溶液加入含有组织浆液的50mL锥形管中。最终胶原酶 II 浓度为 250 U/mL。
- 将管子在37°C，240 x g的摇摇杯中孵育1小时，确保每15分钟手动旋转一次，以移走粘附在管子侧面的任何组织。
- 1小时后，从摇摇杯中取出试管，并为每个样品加入以下内容：100μL胶原酶II（4，800 U / mL）和50μLDispase（4.8 U / mL）。
- 使用血清学移液器移液样品15-20次，直到溶液均质。如果处理多个样品，请为每个样品使用单独的无菌移液器，以避免样品交叉污染。
- 在37°C和240×g的振荡器中再次孵育30分钟。 15分钟后，用手摇动样品，将粘附组织从管的侧面移开。
3. 单细胞悬浮液的产生
- 用 20 G 针头通过 10 mL 注射器缓慢剪切样品 10 个循环。
注意：一个周期涉及将肌肉溶液吸收到注射器中，然后将其注射回管中。确保通过缓慢完成剪切来最小化任何气泡，因为过多的泡沫会导致额外的细胞死亡39。 - 将40μm细胞过滤器放在无菌的50mL锥形管上，并通过移液5mL DMEM + 10%FBS和1%P / S将其润湿。
- 通过细胞过滤器一次移取1mL样品。
- 通过过滤器用10%FBS和1%P / S移液DMEM来洗涤细胞过滤器，以使管中的总体积达到25mL。
- 将25mL样品平分成两个15mL锥形管，并在15°C，400×g下离心15分钟。
注意：与单管相比，将肌肉溶液分成两个15 mL锥形管可确保离心后更好的细胞恢复。 - 在室温下吸出上清液并将沉淀重新悬浮在1mL 1x红细胞裂解缓冲液（参见 补充文件）中7分钟以消除红细胞。
- 用9 mL洗涤缓冲液（见补充文件）将体积调高至10 mL，并在400 x g，15°C下旋转管15分钟。
- 通过重新悬浮在1mL洗涤缓冲液中吸出上清液并重新组合沉淀。
- 将适当体积的细胞转移到单独的1.5mL微量离心管中，并与台盼蓝染料混合。使用血细胞计数器在光学显微镜上计数活细胞。
4. 流式细胞术的抗体染色
注意：根据制造商的说明，在流式细胞术/FACS 实验之前，Sca-1 抗体必须与 APC 偶联。必须验证每批偶联物的性能（图2）。最终偶联可以在-20°C下储存在20μL等分试样中，并稳定三周。有关完全共轭协议，请参阅补充文件。
- 对于流式细胞术，将每个实验样品1-2×106 个细胞转移到无菌的1.5mL微量离心管中。用洗涤缓冲液将容量提高至 1 mL，然后放在冰上。
- 对于每个实验，设置以下必需的对照：i）未染色和ii）活力对照，以准确选择活细胞群;iii）单细胞悬浮液上的荧光减一（FMO）对照，为CD31-/CD45-级分、FAP和MP设置准确的门;iv）单染色补偿珠，以校正通道之间的荧光溢出。
- 对于所有细胞对照，在1.5 mL微量离心管中的1 mL洗涤缓冲液中等分5 x 10 5 - 106个细胞，并置于冰上。
- 对于磁珠对照，将1滴正补偿微珠（每滴约1.5 x10 5颗微珠）加入每个标记的1.5 mL微量离心管。 表 1中列出了完整的控件。
注意：如果实验是首次进行，请在单细胞悬浮液（除了未染色的、活力的、单染色的补偿球和FMO对照外）上对每种偶联抗体进行单染色对照，以评估细胞中阳性染色群体并验证在补偿微珠上观察到的染色。通过对补偿微珠和单细胞悬浮液进行单染色来验证每个新鲜偶联的Sca-1：：APC制备。有关染色对照的完整列表，请参阅表1。
- 为了准备活力控制，将一半体积的细胞从"活力"管转移到新的1.5mL微量离心管中。将此管标记为"死"。
- 将"死"管在65°C下孵育2-3分钟以杀死细胞，然后放在冰上。2-3分钟后，将死细胞与存活控制管中剩余的活细胞重新组合。该细胞群将用于设置补偿值（如果需要）并正确设置活性染料的门。
- 将单细胞悬浮液（实验样品和对照）在500×g，4°C下离心5分钟。
- 吸出上清液并将细胞沉淀重新悬浮在100μL洗涤缓冲液中。
- 根据实验样品或对照组添加抗体。请参阅染色基质（表2）以获取有关抗体组合和量的信息。
- 轻轻轻拂每个样品，以确保完全混合并在黑暗中的冰上孵育15分钟。对于补偿珠，在室温下在黑暗中孵育15分钟。
- 对于单细胞悬浮液实验和对照样品，通过加入900μL洗涤缓冲液将体积调高至1mL。对于补偿微球控制，用900 μL的1x PBS将体积调高至1 mL。
- 将单细胞悬浮液样品在500×g，4°C下离心5分钟。 离心机补偿珠在300×g，4°C下控制5分钟。
- 对于所有单细胞悬浮样品，吸出并弃去上清液，并将细胞沉淀重新悬浮在300μL洗涤缓冲液中。对于补偿微粒对照，吸出并丢弃上清液，将沉淀重新悬浮在300μL的1x PBS中，然后加入1滴（〜1.5×105）负补偿微珠。
- 将所有单细胞悬浮液样品保存在铝箔下的冰上，然后进行流式细胞仪采集。补偿珠控制装置也应避光，但可以保持在室温下。
注意：如果实验终点是通过流式细胞术鉴定FAPs，请遵循步骤5.1.1-5.1.11。如果终点是通过FACS分离细胞以进行培养和染色，请遵循步骤5.2.1-5.2.9和第6-7节。
5. 流式细胞术和荧光激活细胞分选（FACS）
- 流式细胞术
注：本方案采用配备405 nm、488 nm和640 nm激光器的台式流式细胞仪，能够同时区分10种不同的颜色。该协议中使用的带通滤光片及其相关荧光染料如下：450/50（SYTOX蓝），530/30（FITC），575/25（PE）和670/30（APC）。每个探测器的电压如下：FSC 700;SSC 475;FITC 360;PE 460;聚乙烯-氰7 600;SYTOX 蓝 360;APC 570.在使用前，确保您接受过流式细胞仪或细胞分选仪正确操作的培训。- 确保在使用前将细胞仪打开10-20分钟，并通过用清洁，冲洗和鞘液溶液依次清洁30-45秒来启动。最后用dH2O冲洗，确保将足够体积的护套液添加到储存容器中，以在整个采集过程中保持适当的样品流量。
- 设置门控策略以识别 FAC 和 MP，如图 3所示。
注意：FAP和MP通过以下分层门控策略识别：i）SSC-A与FSC-A（侧细胞散射面积与前置细胞散射面积，以分隔细胞与碎片），ii）FSC-W与FSC-H（前向细胞散射宽度与前向细胞散射高度，以区分FSC参数中的双线链），iii）SSC-W与SSC-H（侧细胞散射宽度与侧细胞散射高度，以区分SSC参数中的双线态）， iv） SSC-A vs SYTOX Blue （以區分活的與死的背心）， v） SSC-A vs CD31/45：：FITC （從進一步的分析中排除 CD31+ 和 CD45+ 細胞），以及 vi） Sca-1：：APC vs VCAM-1：:P E 來自 CD31-/CD45- （血系;Lin-）人口（FAP和MP的身份）。FAPs被识别为CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-事件，MP被识别为CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+事件。 - 首先通过细胞仪以低速运行每个单染色补偿微球控制，以生成补偿值，用于校正通道之间的任何荧光溢出。通过比较每个对照器自身检测器（例如，SCA-1：：APC 单染色珠的 SSC-A 与 APC）以及所有其他检测器中的荧光信号来评估补偿。在适当的检测器中应该有两个不同的群体（一个为阴性，一个具有阳性信号），而在所有其他探测器中只有一个阴性群体。将停止门设置为10，000个补偿珠事件并记录数据。
注意：在采集每个样品之间，确保通过细胞仪运行dH2O 10-20秒，以避免样品间污染。 - 接下来处理未染色和活力的对照样品，以正确门禁活的单细胞。将停止门设置为 10，000 个单线态事件并记录数据。
注意：在采集每个单细胞悬浮液样品（未染色样品除外）前约5分钟，向每个样品中加入1μLSYTOX Blue活性染料（从1mM储备溶液稀释的300μM工作浓度），轻轻轻地混合（最终浓度1μM）。 - 然后获取剩余的单细胞悬浮液对照样品。在门控策略中用适当的图评估每个FMO对照（图3）。例如，评估 CD31+CD45 FMO 的 FITC 信号，以确保 CD31-/CD45- 门的准确性。一个最佳示例如图 3G所示。如果首次执行该方案，则应在获取FMO对照之前运行细胞上的单染色对照。
- 在适当的检测器以及所有其他检测器中评估每个单染色细胞样品的荧光信号，以验证适当的补偿。将停止门设置为 10，000 个实时单线态事件，并在软件上记录。
- 处理完所有对照（单细胞悬浮液和磁珠）后，通过首先测量和记录每个样品的体积来制备所有实验样品。这些测量值将用于准确量化 FAP 和 MP，如步骤 5.1.11 中所述。然后，加入50μL精密计数微球，并通过上下移液2-3次轻轻混合。
- 简要运行第一个实验样本，以验证计数珠群的鉴定。该群体在FSC-A与SSC-A图上显示为一个与一般细胞群分开的小而独特的簇（图3A，红框）。在计数珠子种群周围创建一个门。然后通过低速通过细胞仪处理每个实验样品的数据。将停止门设置为 10，000 个计数珠事件并记录。
注意：研究人员可以通过设置额外的绘图来评估SSC-A与任何检测器，从而识别计数微球，因为计数微球在所有检测器中都是荧光的。 - 处理完所有样品后，使用适当的实验方案清洁细胞仪。导出所有数据进行分析。
- 在适当的流式细胞术分析软件上打开所有数据文件。设置用于数据采集的门控策略，如步骤 5.1.2 中所述。以与数据采集相同的顺序检查对照（例如，未染色、活力、单染色，然后是FMO对照），以重新验证门控策略。使用FMO对照设置精确门后，将门应用于所有实验样品。将原始数据导出为电子表格以进行量化。
- 使用计数珠计算每个实验样品中的FAP和MP的数量：
其中，获得细胞计数是采集软件上相关细胞群（例如FAP或MP）的记录事件的数量;采集的磁珠计数是采集软件上记录的计数珠子的事件数;计数珠体积是步骤5.1.7中添加的计数珠溶液的体积;样品体积是添加计数珠之前每个染色的实验样品的体积。磁珠浓度是每μL溶液的磁珠数;此值可在产品数据表上找到。
- FACS - 细胞培养的分选
注意：该协议在配备4种激光（UV，紫色，蓝色，红色）的细胞分选机上执行FACS，能够同时区分11-14种颜色。遵循实验样品染色（第4节）和流式细胞术方案，但下面描述的步骤1至3除外，以优化FACS工作流程：- 将要分选的实验样品中细胞的浓度提高到7 x 106个细胞/ mL，以产生FAP和MP的稳定产量。
- 为了解释细胞浓度的显着增加，要分类的实验样品中的所有抗体浓度加倍。
- 在分选之前，立即通过贴在5 mL聚苯乙烯管上的40μM细胞过滤器盖处理最终染色的细胞样品，以减少细胞结块并提高分选产量。
- 直接从细胞分选机收集单个活鼠FAP和MP到含有1mL无菌100%胎牛血清（FBS）的5mL聚丙烯收集管中。将细胞放在冰上，直到分类完成。
注：如果在场外位置进行流式细胞流动反应，请将所有分类的细胞转移到冰上和安全的有盖容器中。 - 在无菌生物安全柜（BSC）中工作，使用适当的生长培养基（例如，用于分选的FAP的FAP生长培养基（FAP GM）和用于分选MP的MP生长培养基（MP GM））使分选细胞的体积达到7 mL;参见食谱的补充文件），并在500 x g，4°C下离心7分钟，以尽可能多地去除残留的洗涤缓冲液。
- 将沉淀重悬于1mL适当生长培养基和板中，放入含有无菌，胶原包衣的12mm玻璃盖玻片/孔的12孔板中，以进行随后的免疫染色（见第6节）。
注意：如果对胶原蛋白进行免疫细胞化学染色，将板将细胞分类到含有无菌，层粘连蛋白包被的12毫米玻璃盖玻片/孔的12孔板中，而不是胶原包被。如果需要立即分离的祖细胞的免疫细胞化学实验，则以每cm2的15，000个细胞的密度进行种子FAP和MP，并直接进入步骤6.1。对于诱导祖细胞分化的长期培养物，每厘米2的密度为5，000个细胞的种子FAPs和密度为每厘米27，500个细胞的MP。 - 在细胞培养箱中以37°C和5%CO2孵育细胞。培养72小时后，更换一半的培养基。之后每 2-4 天完全更换一次介质。
- 为了诱导肌细胞发育，在培养的第9天将MP培养物切换到MP分化（MD）培养基。为了诱导脂肪细胞，在培养的第10天将FAPs培养物切换到FAP脂肪性分化（AD）培养基。
- 为了诱导纤维化，FAPs可以在培养过程中的可变时间切换到纤维化分化（FD）培养基，或者可以在分离后直接接种到FD培养基中（步骤5.2.6）（所有培养基配方参见 补充文件 ）。
6. 培养的FAP和MP的免疫细胞化学
- 为了验证细胞分选并证明FAPs和MP培养物的纯度，使用细胞类型特异性标记物进行免疫染色，包括PDGFRα（FAPs标记），Pax-7（肌肉干[卫星]细胞标记），成纤维细胞特异性蛋白（FSP-1，成纤维细胞标记），Perilipin-1（Plin-1，脂肪细胞标记），胶原1型（Col1a1，纤维化指标），肌球蛋白重链（MHC，成熟肌细胞标记物）。
- 对于新鲜分拣的细胞的免疫染色，在室温下以200×g离心12孔板3分钟，以促进细胞粘附到盖玻片/孔中。对于长期培养，此步骤不是必需的。移除培养基。
- 对于使用FSP-1进行免疫染色，用1mL 100%甲醇（MeOH）在4°C下固定细胞2分钟。 如果对PDGFRα，Plin-1，Pax7或Col1a1进行免疫染色，请在室温下用1mL 4%PFA在1x PBS中固定细胞培养物15分钟。MHC 免疫染色可耐受任一固定剂。
注意：对于甲醇固定细胞，请跳过步骤6.2并继续步骤6.3。
- 吸出 4% PFA，并用 1x PBS 快速洗涤细胞培养物 3-4 次。在1x PBS中加入1mL 100mM甘氨酸，并在室温下孵育10分钟以灭活残留的PFA。吸出并用1x PBS洗涤1-2次。
注意：细胞可以在此阶段留在2 mL的1x PBS中，包裹在保鲜膜中并在4°C下储存最多7-10天。 - 洗涤后，在1x PBS中加入1mL0.1%Triton-X，孵育20分钟以透化细胞膜。
- 用1-2 mL的1x PBS洗涤孔2-3次，然后在室温下用1mL的1x PBS + 3%BSA在每孔中阻断细胞1小时。
- 将80μL一抗以1x PBS + 3%BSA（PDGFRα 1：100，Pax7纯，FSP-1 1：50，Plin-1 1：400，Col1a1 1：250，MHC 3μg/ mL）稀释到一块贴在移动容器上的副膜上。使用无菌细镊子，小心地将盖玻片从孔中取出，倒置到抗体溶液的液滴上。用两张湿纸巾孵育盖玻片，并将容器盖在塑料薄膜中，以避免抗体溶液蒸发。在4°C下孵育过夜。
注意：与孔内染色（最小500μL）相比，从孔中染色盖玻片使用更少的抗体（〜80μL）。 - 第2天，将盖玻片在室温下放置30分钟以加热。使用镊子小心地向右移走并将盖玻片移回各自的孔（细胞朝上），并用1-2 mL的1x PBS洗涤2-3次，每次2分钟，以去除尽可能多的一抗。
- 使用与一抗染色相同的染色技术，用山羊抗兔Alexa Fluor 488二抗（1：400）染色细胞，以检测FSP-1，Plin-1，Col1a1或PDGFRα和山羊抗小鼠Alexa Fluor 555二抗（1：300）以检测MHC或Pax-7。在室温下孵育细胞1小时，并保持细胞免受光照。
- 将细胞返回孔中，并在室温下用Hoechst（1：10，000）孵育细胞2-4分钟。用1x PBS洗涤细胞2-3次，每次2分钟，以除去多余的Hoechst。
- 使用防褪色荧光安装介质将盖玻片安装到载玻片上，并使载玻片在室温下在黑暗中干燥过夜。将安装的盖玻片存放在4°C的黑暗中。
7. 培养的FAPs和MP的油红O（ORO）染色
- 对非透化细胞进行ORO染色，因为细胞膜的透化可导致非脂肪性细胞类型的非特异性/不希望的染色。在开始染色之前，准备一个ORO工作储备（参见食谱的 补充文件）并在室温下孵育20分钟。
- 20分钟后，使用0.2μm过滤器过滤溶液，以除去任何未溶解的聚集体。
- 从孔中吸取培养基，加入1 mL 10%中性缓冲福尔马林（10%NBF）。在室温下孵育5分钟。
注意：细胞汇合可能导致从孔/盖玻片中抬起。吸气/添加溶液时要小心。 - 吸出并加入1 mL新鲜的10%NBF，并在室温下孵育至少1小时。
注意：此时可以停止该协议，因为细胞可以在10%NBF中过夜。 - 用1mL 60%异丙醇快速洗涤孔一次，然后吸出并让孔完全干燥（约2分钟）。
- 每孔加入400μL油红O工作液，并在室温下孵育10分钟，确保避免移液板壁上的任何ORO。
- 除去所有油红O，用dH2O快速清洗孔4次。
注：如果染色的孔中含有盖玻片，请使用步骤 6.9 中所述的相同技术进行安装。 - 使用明场显微镜对安装的盖玻片或染色的孔进行成像。
8. 对侧和去神经凋亡大鼠腓肠肌切片的组织染色
-
Picrosirius Red （PSR）
- 如前所述，对5μm厚，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）大鼠腓肠肌组织学切片进行PSR染色。
-
油红 O （ORO）
- 将5μm厚的异戊烷冷冻大鼠腓肠肌组织切片固定在4%PFA中10分钟，在60%异丙醇中孵育1分钟。
- 用ORO工作底液染色12分钟。在60%异丙醇中孵育1分钟，在dH2O中洗涤10分钟，使用水溶性安装介质安装在盖玻片上。
-
Sca-1 和层粘连蛋白组织荧光免疫组化 （IHC）
- 对5μm厚的异戊烷冷冻大鼠腓肠肌组织学切片进行荧光IHC。
- 将样品在1x PBS中水合5分钟，在4%PFA中固定10分钟，然后将样品在组织IF封闭溶液中孵育90分钟。
- 用抗Sca-1一抗（1：500）在4°C下稀释在1x PBS + 0.05%吐温中孵育过夜。
- 在第2天，在1x PBS + 0.05%吐温中洗涤三次，每次5分钟，然后在山羊抗兔Alexa Fluor 555（1：500）中孵育1小时。
- 再次洗涤（如以前一样），用封闭溶液孵育1小时，然后加入抗层粘连蛋白一抗（1：500），在1x PBS + 0.05%吐温中稀释1小时。
- 再次洗涤（像以前一样），然后在山羊抗兔Alexa Fluor 488（1：500）中孵育1小时（用于层粘连蛋白）。
- 再次洗涤（像以前一样），然后在DAPI（1：10，000）中孵育4分钟。使用防褪色安装介质清洗并安装到盖玻片上。
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Representative Results
使用包括 Sca-1 和 VCAM-1 在内的新型抗体组合，通过流式细胞术鉴定 FAP 和MP
用于识别大鼠肌肉中FAPs的门控策略基于小鼠29的流式细胞术方案，其门控CD31（内皮）和CD45（造血）阳性细胞（称为谱系[Lin]），并检查来自谱系阴性（Lin-）群体的FAPs标志物Sca-1和MP标记ITGA7的荧光谱。在缺乏市售的荧光团偶联和流式细胞术验证的大鼠Sca-1和ITGA7抗体的情况下，我们自偶联了大鼠Sca-1：：APC抗体，并采取了替代策略来鉴定MP。由于VCAM-1最近被证明是分离大鼠MPS33 的有效单一阳性选择标记物，并且可以使用靶向VCAM-1的大鼠特异性，偶联，流式细胞术验证的抗体，因此我们使用VCAM-1来鉴定MP，而不是ITGA7。
我们证实了Sca-1：APC抗体与健康大鼠腓肠杆菌产生的补偿珠和细胞悬浮液的单染色的成功偶联和性能（图2A，B）。除了方案中使用的所有其他抗体（CD31：：FITC，CD45：：FITC，VCAM-1：PE）外，还进行了Sca-1：：APC（图2C）的五点滴定（图1），以确定最佳浓度。使用这种新颖的面板设计，从健康的腓肠肌中同时鉴定出推定的FAPs和MP（图3），其中Sca-1（Lin-/Sca-1 + / VCAM-1-）的单阳性细胞被指定为FAPs（红框），VCAM-1（Lin-/Sca-1-/VCAM-1 +）的单阳性细胞被指定为MP（蓝框）。我们还确定了Sca-1和VCAM-1（Lin-/Sca-1 + / VCAM-1 +）的双阳性细胞群（图3F;右上象限）。
通过 FACS 和细胞培养验证 FAP 和 MP 的鉴定
为了验证用于大鼠骨骼肌中FAPs和MP的流式细胞术鉴定方案，我们试图分离活细胞用于 体外培养。使用FACS，使用与流式细胞术分析相同的门控策略分离可行的FAP和MP。从230g大鼠的单个腓肠肌中收集约20，000-40，000个FAPs和30，000-50，000 MPs进行细胞培养。
为了确认每个群体的纯度，我们共同免疫染色了PDGFRα和Pax7的新鲜分选的FAP和MP。PDGFRα是除Sca-1之外的第二个间充质祖细胞标志物，通常用于鉴定FAPs 2，7，8。Pax-7是一种广为人知且广泛使用的肌肉卫星（干细胞）细胞标记41。对FAPs进行排序的群体显示PDGFRα染色阳性，没有Pax7阳性细胞污染（图4A;顶行）。相反，对Pax7染色阳性且没有PDGFRα阳性细胞的MP群体进行排序（图4A;底行），验证了Lin-/Sca-1+/VCAM-1-和Lin-/Sca-1-/VCAM-1+细胞表面抗原谱分别分离纯FAP和MP群体的能力。
接下来，我们在10-12天的时间内培养了经过分类的FAP和MP，以诱导脂肪性，纤维化和肌源性分化。到第12天，经受脂肪生成条件的FAPs培养物含有具有成纤维细胞样形态或多位域形态的细胞，类似于具有脂肪滴的白色前脂肪细胞（数据未显示）。成纤维细胞特异性蛋白-1（FSP-1）的免疫染色证实了成纤维细胞的分化，而Plin-1（Perilipin-1;脂肪细胞标志物）42和O油红O的染色分别证实了脂肪细胞的分化以及中性甘油三酯和脂质的存在（图4B）。通过对肌球蛋白重链（MHC）（分化肌细胞的标志物）的共免疫染色，证实了FAPs培养物中肌原谱系中污染细胞的缺失。对经受纤维化分化（FD）的FAPs培养物进行评估，以检测胶原蛋白1型（Col1a1）表达，这是FAPs衍生的主要胶原蛋白之一8。第11天Col1a1和MHC的共免疫染色显示1型胶原蛋白表达强劲，没有污染MHC阳性细胞（图4B）。FAPs群体纯度的最终确认是通过在肌源培养基中培养FAPs来进行的，以鼓励任何污染MP的生长。没有观察到MHC阳性细胞（补充图2A）。
接受肌原条件的MP培养物在接种后12天显示出表达MHC的成熟肌细胞和多核肌管（图4C）。MP培养物与FSP-1和Plin-1的共同免疫染色分别表明没有污染成纤维细胞或脂肪细胞。同样，ORO染色也没有显示出脂质污染（图4C）。Col1a1由成纤维细胞高度表达，据报道，它也在较小程度上由肌原前体和成肌细胞产生，尽管文献中在这方面存在矛盾的数据8，43，44。虽然与Col1a1和MHC的MP的共同免疫染色揭示了我们MP培养物的肌细胞分化，但没有发现Col1a1免疫阳性的证据（图4C）。为了进一步确认群体的纯度，MP培养物受到脂肪生成或纤维化条件，以促进脂肪细胞和成纤维细胞的生长（补充图2B）。没有观察到来自FAPs谱系的污染细胞。
虽然我们已经证明了从大鼠肌肉中识别和分类FAP和MP纯种群的能力，但我们接下来试图确定Lin-/Sca-1 + / VCAM-1 +（双阳性）细胞的身份。由于据报道，Sca-1在健康肌肉45中非常小比例的MP（约3%）和类似的少数FAPs（约4%）被报道在健康肌肉10中表达VCAM-1，因此对PDGFRα和Pax7进行了新鲜分选的Lin-/Sca-1 + / VCAM-1 +细胞的免疫染色，并将它们培养成肌源性， 和纤维化条件分别诱导肌生成，脂肪生成和纤维化。发现双阳性细胞是MP和FAPs的混合群体，新鲜分拣的细胞对PDGFRα或Pax7的免疫染色呈阳性（补充图3A），培养的细胞分化成成熟的肌细胞，脂肪细胞或成纤维细胞（补充图3B，C）。
ITGA7 与 VCAM-1 在流式细胞术 FAP 鉴定过程中识别 MP
虽然建立了分别使用Sca-1和VCAM-1对大鼠FAPs和MP进行流式细胞术鉴定的成功方案，但我们试图确定自偶联ITGA7抗体是否可以类似地用于鉴定MP而不是VCAM-1，这是小鼠的标准。将大鼠特异性ITGA7抗体与PE-Cy7偶联（见 补充文件），并在大鼠腓肠杆菌产生的商业补偿珠和单细胞悬浮液上验证了抗体的性能（补充图 4A-C）。ITGA7：:P E-Cy7抗体在单次染色和FMO实验中表现良好（补充图 4D）。然而，当用CD31：：FITC，CD45：：FITC，SCA-1：：APC和ITGA7：:P E-Cy7对腓肠细胞悬浮液进行全面染色时，Sca-1：：APC和ITGA7：:P E-Cy-7抗体之间的相互作用变得明显。FACS分选的Lin-/Sca-1+/ITGA7-细胞（据称的FAPs）和Lin-/Sca-1-/IGTA7+细胞（据称的MP）（补充图 4E）的后续培养主要产生FAPs，并且MP很少（补充图 4F），表明Sca-1：APC和ITGA7：:P E-Cy-7抗体之间的相互作用对细胞鉴定的特异性产生了负面影响。
一种新型FAPs在长期去神经化骨骼肌中的时间过程
由于FAPs动力学已经在短期创伤性去神经支配的背景下进行了评估，在小鼠模型11，38中，我们试图验证我们的FAPs方法从健康和严重萎缩的纤维化肌肉中分离的性能。使用经过充分验证的单侧胫骨神经横断模型46对大鼠进行创伤性长期去神经支配损伤，其中腓肠肌在去神经支配后14周内从去神经支配肢体和对侧支配肢体在四个连续时间点收获（作为内部对照）。如前所述，去神经支配的肌肉表现出进行性萎缩（图5A，B），随着时间的推移，纤维化和脂肪沉积增加（图5C-F）47。
我们的方案产生了足够数量的细胞用于流式细胞术分析，即使12周和14周去神经凋零的腓肠肌重约0.2-0.3g（各自对侧对照肌肉的15-20%）（图5B）。我们观察到去神经化腓肠肌中FAPs的上调与支配的对侧对照肌相比，维持了14周的实验持续时间（图6A，B），与进行性肌肉纤维化和脂肪沉积一致。肌肉组织学横截面的Sca-1免疫染色证实了表达Sca-1的细胞在14周去神经支配的肌肉中纤维脂肪变化区域的定位（图5G），以及健康肌肉中肌纤维化物间质的基线表达。在去神经支配后一段时间内，FAPs群体中出现了一个独特的细胞亚群，其特征在于Sca-1信号的强劲增加（Sca-1高;图6A，红框）在流式细胞术分析中，与FAPs基础Sca-1表达（Sca-1 Med/Low;图6A，绿色框）。对这些亚群的量化揭示了随时间变化的差异动态;Sca-1高FAPs在去神经支配后12周和14周显着增加（图6B），约占FAPs总人群的一半（图6C）。相比之下，Sca-1 Med/Low FAPs是去神经支配后2周和5周的主要亚群（图6C），并且仅在去神经支配后早期显示水平的短暂增加（图6B）。
与长期去神经支配肌肉中FAPs的持续存在相反，国会议员表现出对去神经支配的预期双相反应。最初，MP的去神经支配肌肉增加，高于对照肢，但在去神经支配后5周，人口开始下降（图6D）。为了与众所周知的长期去神经化肌肉中肌肉卫星细胞群的疲惫相一致，到12周时，国会议员在胫骨神经横断后处于或低于基线水平。
我们还分析了Lin-/Sca-1+/VCAM-1+群体的动态（补充图 3D-E）。虽然双阳性细胞相对于Lin-群体的频率随着时间的推移在去神经支配的肌肉中逐渐降低，但当确定每克肌肉的绝对细胞计数时，观察到双阳性群体的暂时增加，然后在去神经支配后14周降至或低于基线水平。
图1：FAP和MP识别，隔离和培养的 图形示意图：描绘大鼠腓肠的FAP和MP识别的图形示意图。在进行两次连续的酶消化之前，先收获样品并机械切碎。然后对组织制剂进行处理和过滤以产生单细胞悬浮液。将荧光偶联抗体的混合物添加到每个样品中，然后通过流式细胞仪或细胞分选器分别鉴定或分离FAP和 MP。请单击此处查看此图的放大版本。
图2：Sca-1：：APC自偶联抗体验证和滴定。 通过对商业补偿珠（A）和健康大鼠腓肠肌（B）产生的单细胞悬浮液进行单染色来验证Sca-1：：APC抗体偶联。Sca-1标记的珠子和细胞的不同群体是显而易见的（黑匣子）。通过在单细胞悬浮液（C）上测试五种不同浓度的Sca-1：：APC进行抗体滴定;根据最大荧光强度和最少的背景染色选择最佳浓度，并发现其与批次相关。标示了具有代表性的滴定，用红色框指示的批次特定最佳浓度。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：流式细胞术鉴定大鼠腓肠肌中的FAPs和MP。（A-F）（A）首先对样品进行门控以排除碎屑（黑匣子）以及用于计数微珠的门控（红盒）。然后通过前散射（FSC）（B）和侧散射（SSC）特征（C）对细胞进行门控以排除二倍体。通过用SYTOX蓝（D）染色来评估所得单细胞的活力。然后评估SYTOX蓝色阴性（活）背心的FITC信号识别CD31和CD45（谱系;Lin）以从进一步的分析中排除Lin+级分（黑盒Lin-细胞）（E）。然后评估Lin-群体的Sca-1：：APC与VCAM-1：:P E信号（F）的比较。FAPs被识别为Lin-/Sca-1+/VCAM-1-（F;红色框），而MP被标识为Lin-/Sca-1-/VCAM-1+事件（F;蓝框）。Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ 双阳性群体也很明显（右上象限）。（G） CD31：：FITC 和 CD45：：FITC 的 FMO （荧光减去 1） 对 Lin 细胞进行适当的补偿和门控。（H-I）FMO 对照的 Sca-1：：APC 与 VCAM-1：:P E 图显示了 FAP （Sca-1 FMO） 和 MP （VCAM-1 FMO） 的适当补偿和门控。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：分类的FAP和MP细胞培养和免疫染色。 （A） 对新分类的FAP（顶行）和MP（下排）的PDGFRα（绿色）和Pax7（红色）进行共免疫染色。细胞核用DAPI染成蓝色。FAPs仅表达PDGFRα，没有明显的Pax7阳性细胞，而MP仅表达Pax7，没有PDGFRα阳性细胞污染，证明了两种分类群体的纯度。（B） 第 12 天在脂肪生成分化培养基 （AD） 中的 FAPs 对成纤维细胞特异性蛋白 1 （FSP-1;绿色） 和 Perilipin-1 （Plin-1; 绿色） 染色呈阳性，分别显示分化的成纤维细胞和脂肪细胞。细胞核用DAPI（蓝色）染色。油红O（ORO）染色（红色）表明到第12天存在由成熟脂肪细胞产生的中性甘油三酯和脂质。经受纤维化分化培养基（FD）的FAPs显示FAPs衍生的1型胶原蛋白（Col1a1;绿色）的表达。在脂肪性或纤维化培养基中培养的FAPs不会共同免疫染色肌球蛋白重链（MHC，红色），表明没有污染的肌细胞。（C） 第 12 天在肌源分化培养基 （MD） 中生长的 MPS 显示 MHC 阳性（红色）染色，表明存在成熟肌细胞和融合的多核肌管。细胞核用DAPI（蓝色）染色。MP培养物没有成纤维细胞和脂肪细胞污染，如FSP-1（绿色），Plin-1（绿色）和ORO染色没有共免疫染色所表明的那样。在层粘连蛋白上生长以适应Co1a1免疫染色的MP在第12天时不会显示出与胶原蛋白上相同的肌管融合程度。Col1a1（绿色）在 MP 培养中不存在。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：长期去神经支配肌肉的萎缩，纤维化和脂肪浸润。（A）代表性地在去神经支配后的四个连续时间点收获的腓肠肌。视神经动脉表示 CONTRA 是来自两周去角化动物的代表性对侧肢体样本。（B） 去神经支配后肌肉萎缩的量化，表示为去神经支配（DEN）腓肠肌湿重与对侧（CONTRA）肢体的比值。（C） 去神经支配后 2 或 14 周收获的腓肠肌组织学横截面 （PSR） 染色的 Picrosirius Red （PSR） 显示进行性纤维化。肌肉染成黄色，胶原蛋白染成红色。（D）通过确定PSR阳性组织相对于总组织面积的面积来量化纤维化。（E） 去神经支配后 2 周或 14 周收获的腓肠肌油红 O （ORO） 染色的横截面，用苏木精复染。脂质染成红色。（F）脂肪浸润通过确定ORO染色组织的面积相对于总组织面积来量化。（G） 在去神经支配后 2 周或 14 周收获的腓肠肌组织学横截面，免疫染色为层粘连蛋白（绿色）和 Sca-1（红色）。层粘连蛋白可对单个肌纤维周围的基底薄片进行正染色。Sca-1可识别多种祖细胞类型。细胞核用DAPI（蓝色）染色。插图显示健康肌肉基底外Sca-1 +细胞的定位;黄色箭头表示纤维化区域内存在Sca-1 +细胞。（数据均值为 +/- S.D;对于 2 周和 14 周的时间点，n=3。面板B中的数据由单因子方差分析，面板D和F中的数据由双向方差分析。执行事后 Sidak 的测试以校正多重比较。* = CONTRA 和 DEN 之间的 P<0.05;# = P<样品之间为 0.05）请单击此处查看此图的放大版本。
图6：长期去神经化大鼠腓肠杆菌的FAPs和MP动态。 （A） 代表性 Sca-1：：APC 与 VCAM-1：:P E 组的 Lin-（CD31-/CD45-）群体，这些样本来自去神经支配后 2 周、5 周、12 周或 14 周采集的肌肉样本。顶行显示来自去神经衰变 （DEN） 腓肠肌的图，而下排显示来自对侧未手术 （CONTRA） 腓肠肌的图解。Lin-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs（总计）细分为 Sca-1 高（红框）和 Sca-1 Med/Low（绿框）分数，而 Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ MP 显示在蓝色框中。（B）去神经支配后每个时间点的FAPs（总计，Sca-1高，Sca-1 Med /低）的定量，报告为Lin细胞的频率（%）和每克肌肉的细胞数量（下排）归一化到对侧对照腓肠肌。（C） Sca-1高和Sca-1地中海/低亚群占FAPs总种群的相对比例。（D）去神经支配后每个时间点的MP定量报告为Lin细胞的频率（%）（左图）和每克肌肉的细胞数（右图）归一化到对侧对照。（数据均值为 +/- S.D;对于 2 周和 12 周时间点，n=4;对于 5 周时间点，n=5;对于 14 周时间点，n=2。通过单因子方差分析分析的数据;事后 Sidak 测试，以纠正多重比较。# = P<0.05。 请点击此处查看此图的放大版本。
补充图1：抗体验证和滴定。 CD31：：FITC （A-C）、CD45：：FITC （D-F） 和 VCAM-1：:P E （G-I） 在健康大鼠腓肠肌 （B，E，H） 的补偿珠 （A，D，G） 和单细胞悬浮液上的商业化偶联抗体的验证。每种抗体以5种不同的浓度（C，F，I）滴定。根据最大荧光强度和最小的背景染色（红色框）选择最佳浓度。 请点击此处下载此文件。
补充图2：反向分化培养条件下的FAP和MP的分类。 （A） 在第 12 天共免疫染有 FSP-1 （绿色）、Plin-1 （绿色） 或 Col1a1 （绿色） 和 MHC （红色） 的肌原分化培养基 （MD） 培养的 FAPs 未显示肌细胞污染。FSP-1 阳性和 Col1a1 染色显示 FAPs 与成纤维细胞的分化。ORO 染色（红色）显示脂质生成，但 Plin-1 阳性脂肪细胞不易见。用DAPI染色的细胞核（蓝色）。（B）受到脂肪生成分化培养基的国会议员死亡。在FAP生长培养基（FAP GM）中培养12天并共同免疫染色FSP-1（绿色）或Plin-1（绿色）和MHC（红色）的MP显示分化肌细胞和肌管，没有FSP-1或Plin-1阳性细胞。没有ORO染色进一步证实了培养物中缺乏脂肪细胞。在纤维化分化培养基（FD）中生长的MP和Col1a1和MHC的共同免疫染色显示成熟的肌细胞和没有Col1a1阳性细胞。在层粘连蛋白上生长以适应Col1a1免疫染色的MP在培养12天时与肌管的融合程度与胶原蛋白相同。 请点击此处下载此文件。
补充图3：Lin-/Sca-1+/VCAM-1+细胞是FAP和MP的混合群体。（A） PDGFRα 和 Pax7 对新分离的 Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ 细胞的共同免疫染色显示，PDGFRα 单阳性（白色箭头）和 Pax7 单阳性（黄色箭头）细胞的混合群体分别识别 FAP 和 MP。（B） 在肌源分化培养基 （MD） 中生长的第 12 天的 Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ 培养物含有 FSP-1 单阳性（绿色）和 MHC 单阳性（红色）细胞，分别识别成纤维细胞和肌细胞/管。Plin-1（绿色）和ORO（红色）染色的缺失表明不存在成熟的脂肪细胞。Col1a1（绿色）和MHC（红色）的共同免疫染色显示成熟的肌细胞和成纤维细胞。（C）Lin-/Sca-1+/VCAM-1+细胞在第12天在脂肪生成分化培养基（AD）中生长，同样显示出FSP-1（绿色）单阳性和MHC（红色）单阳性细胞的混合物，但也存在Plin-1（绿色）单阳性细胞和ORO染色，证实了成纤维细胞，肌细胞和脂肪细胞的分化。在纤维化分化培养基（FD）中生长的培养物显示成熟的肌细胞和Col1a1单阳性细胞（成纤维细胞）。（D） 代表性 Sca-1：：APC 与 VCAM-1：:P E 组的 Lin-（CD31-/CD45-）群体，这些样本来自去神经支配后 2 周、5 周、12 周或 14 周收获的去神经支配后;Lin-/Sca-1+/VCAM-1+群体显示在紫色框中。（E） 在去神经支配后四个连续时间点上对 Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ 细胞进行定量，报告为 Lin 细胞（左图）和每克肌肉细胞的频率（右图）归一化为对侧腓肠肌。（数据均值为 +/- S.D;对于 2 周和 12 周时间点，n=4;对于 5 周时间点，n=5;对于 14 周时间点，n=2。通过单因子方差分析分析数据;事后 Sidak 测试，以纠正多重比较;# = P<0.05。请点击此处下载此文件。
补充图4：ITGA7 作为大鼠骨骼肌流式细胞术中肌原细胞的标志物。 通过对商业补偿微珠（A）和健康大鼠腓肠肌（B）产生的单细胞悬浮液进行单染色来验证ITGA7：:P E-Cy7抗体偶联。ITGA7标记的微珠和细胞的群体是显而易见的（黑匣子）（C）抗体滴定是通过在单细胞悬浮液上测试五种不同浓度来进行的。红色框表示理想浓度。（D） 荧光减一 （FMO） 对照图显示抗体偶联物中没有荧光溢出，但细胞悬浮液的完全染色显示 Sca-1：：APC 和 ITGA7：:P E-Cy7（绿色框）之间存在非特异性相互作用。门控（E）用于分离Lin-/Sca-1+/ITGA7-细胞（据称"FAPs"）和Lin-/Sca-1-/IGTA7+电池（据称为"MP"）。（F） 在接种后 12 天对 FACS 分选的细胞培养物进行共免疫染色，显示两组分选的细胞主要成熟为脂肪细胞，肌细胞很少。 请点击此处下载此文件。
| 1. 未染色 |
| 2. 生存能力控制 |
| 3. CD31 + CD45 FMO |
| 4. SCA-1 FMO |
| 5. VCAM-1 FMO |
| 6. CD31 + CD45 单色淀（珠） |
| 7. CD31 + CD45 单色染色剂（细胞） |
| 8. SCA-1 单色污渍（珠子） |
| 9. SCA-1单色染色剂（细胞） |
| 10. VCAM-1 单色淀（珠） |
| 11. VCAM-1 单色染色剂（细胞） |
表1：流式细胞术抗体染色对照。 全套抗体染色对照。如果实验是首次进行，则应在补偿珠和单细胞悬浮液上运行单染色对照。对于所有后续实验，单个染色的对照只需要在补偿珠上运行。
| CD31：：FITC （μg） | CD45：：FITC （μg） | SCA-1：：APC （μg）* | VCAM-1：:P E （μg） | SYTOX 蓝 （μM;最终浓度） |
|
| 未染色的控制 | |||||
| -- | -- | -- | -- | -- | |
| 单染色对照 | |||||
| SYTOX蓝（活力控制） | -- | -- | -- | -- | 1 |
| CD31 & CD45 | 0.5 | 0.25 | -- | -- | 1 |
| 断续器-1 | -- | -- | 0.25 | -- | 1 |
| 断续器-1 | -- | -- | -- | 0.25 | 1 |
| 荧光减一 （FMO） | |||||
| CD31 & CD45 | -- | -- | 0.25 | 0.25 | 1 |
| 断续器-1 | 0.5 | 0.25 | -- | 0.25 | 1 |
| 断续器-1 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | -- | 1 |
| 实验样品 | |||||
| 完全染色 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 1 |
表2：流式细胞术抗体染色基质。 显示了用于流式细胞术的实验和对照样品染色的抗体量。所有染色均在总体积为100μL的洗涤缓冲液中进行。*自偶联Sca-1：：APC抗体的最佳量可能因使用的批次而异。所有新鲜偶联的Sca-1：：APC批次应首先通过单染色补偿珠和单细胞悬浮液进行验证。
补充文件：试剂配方。请点击此处下载此文件。
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Discussion
对于希望研究由于生物学或技术原因在小鼠中不可行的损伤模型的研究人员来说，针对大鼠肌肉的优化，经过验证的FAPs分离方案至关重要。例如，小鼠不是研究慢性局部或神经退行性损伤（如长期去神经支配）的最佳动物模型。从生物学上讲，小鼠的短寿命和快速衰老使得由于衰老混杂因素的去神经支配而难以准确描绘肌肉特征。从技术角度来看，由于严重萎缩导致的肌肉质量急剧减少不足以进行有效的流式细胞术分析。事实上，小鼠FAPs分离方案建议将健康的肌肉组合在一起，以更好地增加分类FAPs29的产量。虽然这解决了获得足够的肌肉组织进行分析的技术障碍，但它同时限制了研究人员在肌肉特定水平上评估FAPs。例如，由于特定肌肉群的纤维类型组成、血管化程度和线粒体数47存在固有的差异，因此组合多个不同的肌肉进行流式细胞术分析可防止肌肉特异性FAPs表征。相比之下，我们表明，健康和长期去雾化，萎缩和纤维化大鼠胃肠为有效的流式细胞术提供了足够量的起始材料。此外，在健康样品中，多余的肌肉可以进一步细分为多个下游测定，使研究人员能够同时分析同一组织的细胞，分子和组织学特征。最后，对于用治疗方法操纵损伤模型中FAPs的实验，可以对警觉和活跃的大鼠的身体功能和步态进行验证的分析21，22，23，24，从而可以连续评估肌肉功能而无需终止动物。
为大鼠创建优化的FAPs分离方案的一个关键障碍是抗体的可用性。我们最初的方法试图复制广泛用于小鼠1，7，8，9，10，11，12，13，14的抗体组合和门控策略方案。虽然市售的、偶联的、经过流式细胞术测试和验证的识别大鼠的抗体可用于谱系标记CD31和CD45，但对于识别标记Sca-1或PDGFRα的阳性FAPs以及阴性选择标记ITGA7，则不存在。未结合的，这些标记物特异性且据称在流式细胞术中有效的一抗是可用的，但是在FAPs标记Sca-1和PDGFRα中，只有Sca-1抗体在已发表的文献中得到了验证 流式细胞术分析大鼠细胞48。因此，我们选择Sca-1作为FAPs的阳性选择标记。使用二抗来描绘Sca-1和ITGA7标记的前景是不可行的，原因有几个，但主要是因为唯一经过验证的用于流式细胞术的Sca-1和ITGA7的大鼠特异性抗体是在同一宿主物种中产生的。因此，剩下的选择是使用市售试剂盒对两种抗体进行自偶联。
选择抗体偶联的最佳试剂盒的过程非常广泛，因为许多试剂盒对一抗中存在的各种缓冲稀释剂（例如甘氨酸、甘油、BSA、叠氮化钠）完全或部分不耐受。此外，提供的荧光团必须与研究者可用的流式细胞仪/细胞分选器中配备的激光器兼容，并且不能以与用于鉴定样品中其他细胞类型的其他荧光团相似的波长发射。大鼠特异性PDGFRα一抗中存在稀释剂组分，与偶联试剂盒相容性差，是选择Sca-1作为该方案中阳性FAPs选择标记的另一个考虑因素。虽然这些结果表明，Sca-1：：APC和ITGA7：:P E-Cy7偶联都导致在补偿微珠和细胞上鉴定出不同的阳性染色群体，但前者被发现在荧光中表现出比制造商宣传的更早的衰变。强烈建议研究人员根据制造商的说明，在首次使用前一刻（例如，实验前一天）结合Sca-1：APC，以确保可靠的信号，相应地计划实验，以便在抗体的有效性窗口内使用单批偶联抗体，并通过单染色补偿珠和在单细胞悬浮液上滴定来验证每批抗体。然而，更重要的是，Sca-1：APC和ITGA7：:P E-Cy7之间的关键相互作用阻止了FAP与MP群体的准确划分，因此需要采用替代策略。
Boscolo Sesillo等人最近证明了使用VCAM-1作为CD31，CD45和CD11b阴性细胞中单个阳性选择标记33成功分离大鼠肌肉干细胞的流式细胞术。以VCAM-1作为MP选择标记，我们利用一种新型抗体小组来鉴定FAPs（Lin-/Sca-1+/VCAM-1-）和MP（Lin-/Sca-1-/VCAM-1+），并通过 体外 培养来自健康腓肠肌的FACS分选细胞来验证该方法。新鲜分离的FAP和MP仅针对其各自的替代标志物PDGFRα和Pax7进行免疫染色。培养的FAPs分化为成熟成纤维细胞和脂肪细胞的群体，MPs分化为成熟的肌细胞/肌管。培养物内没有发生FAP和MP的交叉污染。组织学横截面的免疫染色证实，Sca-1 阳性细胞浸润去神经支配肌肉中纤维脂肪降解区域。
虽然我们对长期去神经支配的肌肉进行了流式细胞术分析，以验证我们在严重萎缩，纤维化和脂肪浸润的肌肉中的方案，但我们偶然观察到随着时间的推移，与基线Sca-1表达（表示Sca-1 Med / Low）相比，出现了具有增加Sca-1信号（表示Sca-1 High）的FAPs亚群。Sca-1高FAPs在去神经支配后晚期（12周以上）显着增加，而Sca-1 Med / Low FAPs在5周早期达到峰值，然后下降到基线水平。FAPs表型的异质性已有报道10，30。具有较高Sca-1表达的FAPs被证明更容易分化成脂肪细胞，并且当暴露于纤维化刺激时增加Col1a130，49的表达。这里观察到的FAPs亚群的动力学似乎与去神经支配诱导的后遗症和肌肉再生能力的时间过程一致47，因此可能表征具有不同细胞程序的FAPs亚群。Sca-1 高 FAPs 在晚期时间点上调，伴有纤维/脂肪浸润和再生电位下降，而 Sca-1 Med/低 FAPs 在肌肉再生窗口期间上调，可能有助于有效的再生肌生成。这里介绍的FAPs分离方案为研究人员提供了识别和分离这些不同群体以供将来研究的能力。
我们鉴定出一组Sca-1和VCAM-1（Lin-/Sca-1+/VCAM-1+）染色阳性的细胞群，并确定该双阳性细胞群是FAPs和MP的混合物。Malecova及其同事报告了表达VCAM-1的FAPs亚群，该亚群在健康肌肉中几乎不存在，随着急性炎症而短暂增加，并且它们在mdx小鼠（肌肉萎缩症模型）中的持久性与慢性肌肉炎症和纤维化有关10。相比之下，虽然不是纯粹的FAPs人群，但我们发现Lin-/Sca-1 +/VCAM-1+人群在去神经支配后12周和14周时降至或低于基线水平，伴有慢性肌肉纤维化。去神经支配不会诱导与mdx小鼠相同的炎症反应和循环再生尝试，这可以解释我们结果的差异。我们在Lin-/Sca-1 + / VCAM-1 +细胞群中对MP的鉴定与Sca-1在健康肌肉中极少数MP上的表达报告一致，在成肌细胞增殖期间受伤并随后从细胞周期中撤出后短暂增加45。因此，虽然我们的抗体标记和FACS门控策略成功地分离出FAP和MP的纯群体进行研究，但需要对这些群体进行流式细胞术定量的实验可能会略微低估它们的数量，因为两个祖系中共表达Sca-1和VCAM-1的细胞百分比很小。无论如何，目前的方案清楚地表明了国会议员对去神经支配损伤的典型双相反应，短期上调和随后长期去神经支配肌肉中的人群消耗。同样，本文总结了孤立性短期去神经支配损伤中报告的FAPs的增加，并使用长期胫骨神经横断模型显示为进一步持续。
总之，该协议为研究人员提供了一种以前未探索过的动物，即大鼠，其中使用流式细胞术方法同时研究FAPs和MP.在小鼠中受骨骼肌数量限制的实验，以及频繁需要进行终端实验以评估肌肉力量和功能，可以很容易地在较大的大鼠中进行，并具有更广泛的非致死性强度和功能评估方法。总体而言，对大鼠的FAPs研究可能揭示这一关键祖细胞群体在急性和慢性肌肉和周围神经创伤和疾病中的新作用，从而增加开发细胞特异性疗法的潜力。
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Disclosures
作者没有冲突要披露。
Acknowledgments
我们要感谢渥太华大学的流式细胞术核心设施和基南生物医学科学研究中心（KRC），多伦多圣迈克尔斯医院Unity Health在优化本手稿中介绍的流式细胞术/ FACS方案方面的专业知识和指导。这项工作由医学设计新想法2018年基金（MbDNI-2018-01）资助给JB。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 10 cm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3902 | |
| 12-well cell culture plate | ThermoFisher | 130185 | |
| 12 mm glass coverslips, No.2 | VWR | 89015-724 | |
| 10 mL Syringe | Beckton Dickenson | 302995 | |
| 15 mL centrifuge tubes | FroggaBio | 91014 | |
| 20 gauge needle | Beckton Dickenson | 305176 | |
| 25mL Serological pipette | Sarstedt | 86.1685.001 | |
| 40µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50mL centrifuge tubes | FroggaBio | TB50 | |
| AbC Total Antibody Compensation Beads | ThermoFisher | A10497 | |
| Ammonium Chloride, Reagent Grade | Bioshop | AMC303.500 | |
| APC Conjugation Kit, 50-100µg | Biotium | 92307 | |
| Aquatex Aqueous Mounting Medium | Merck | 108562 | |
| Biolaminin 411 LN | Biolamina | LN411 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Bioshop | ALB001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop | CCL444.500 | |
| Collagenase Type II | Gibco | 17101015 | |
| CountBright Plus Absolute Counting Beads | ThermoFisher | C36995 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 17105041 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | (+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L Sodium Pyruvate |
| EDTA | FisherScientific | S311 | |
| FACSClean Solution | Beckton Dickenson | 340345 | |
| FACSDiva Software | Beckton Dickenson | -- | |
| FACSRinse Solution | Beckton Dickenson | 340346 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | |
| Flow Cytometry Sheath Fluid | Beckton Dickenson | 342003 | |
| FlowJo Software | Beckton Dickenson | -- | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S302380-2 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21424 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | |
| Ham's F10 Media | ThermoFisher | 11550043 | (+) Phenol Red (+) L-Glutamine (-) HEPES |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) | Multicell | 311-513-CL | |
| Heat Inactivated Horse Serum | Gibco | 26050-088 | |
| Hemocytometer | Reichert | N/A | |
| HEPES, minimum 99.5% titration | Sigma | H3375 | |
| Horse Serum | ThermoFisher | 16050130 | |
| Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) | Cell Signaling | 8915LF | |
| Humulin R | Lilly | HI0210 | |
| IBMX | Millipore Sigma | I5879 | Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | Also known as 2-propanol |
| Lewis Rat, Female | Charles River Kingston | 004 (Strain Code) | 200-250 grams used |
| LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer | Beckton Dickenson | -- | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP-5417R | |
| MoFlo XDP Cell Sorter | Beckman Coulter | -- | |
| Mouse Anti-CD31::FITC Antibody | Abcam | ab33858 | Clone TLD-3A12 |
| Mouse Anti-CD45::FITC Antibody | Biolegend | 202205 | Clone OX-1 |
| Mouse Anti-CD106::PE Antibody | Biolegend | 200403 | Also known as VCAM-1 |
| Mouse Anti-MHC Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | Also known as MF20 |
| Mouse Anti-Pax7 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | |
| Neutral Buffered Formalin, 10 % | Sigma | HT501128 | |
| Oil Red O | Millipore Sigma | O0625 | |
| PE-Cy7 Conjugation Kit | Abcam | ab102903 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | (-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride |
| Potassium Bicarbonate, Reagent Grade | Bioshop | PBC401.250 | |
| Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody | Invitrogen | MA5-32347 | FSP-1 also known as S100A4 |
| Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody | Abcam | ab203254 | |
| Rabbit Anti-Laminin Antibody | Sigma | L9393 | |
| Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody | Abcam | ab3526 | |
| Rabbit Anti-Sca-1 Antibody | Millipore Sigma | AB4336 | |
| Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody | Abcam | ab260043 | Also known as Col1a1 |
| Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody | Abcam | ab203491 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Gibco | PHG0266 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Troglitazone | Millipore Sigma | T2573 | |
| Tween-20 | Bioshop | TWN510 |
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