Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von fibro-adipogenen Vorläufern (FAPs) und myogenen Vorläufern (MPs) in der Skelettmuskulatur der Ratte

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von fibro-adipogenen Vorläufern (FAPs) und myogenen Vorläufern (MPs) aus dem Skelettmuskel der Ratte. Die Verwendung der Ratte in Muskelverletzungsmodellen bietet eine erhöhte Gewebeverfügbarkeit von atrophischen Muskeln für die Analyse und ein größeres Repertoire an validierten Methoden zur Beurteilung von Muskelkraft und Gang bei frei beweglichen Tieren.

Abstract

Fibro-adipogene Vorläufer (FAPs) sind residente interstitielle Zellen in der Skelettmuskulatur, die zusammen mit myogenen Vorläufern (MPs) eine Schlüsselrolle bei der Homöostase, Verletzung und Reparatur von Muskeln spielen. Aktuelle Protokolle zur Identifizierung und Isolierung von FAPs verwenden Durchflusszytometrie/Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) und Studien zur Bewertung ihrer Funktion in vivo wurden bisher ausschließlich an Mäusen durchgeführt. Die größere inhärente Größe der Ratte ermöglicht eine umfassendere Analyse von FAPs in Skelettmuskelverletzungsmodellen, insbesondere bei stark atrophischen Muskeln oder wenn Forscher eine erhebliche Gewebemasse benötigen, um mehrere nachgeschaltete Assays durchzuführen. Die Ratte bietet zusätzlich eine größere Auswahl an Muskelfunktionsassays, die keine Sedierung oder Tötung von Tieren erfordern, wodurch die Morbidität und der Tiereinsatz minimiert werden, indem sie serielle Bewertungen ermöglicht. Die für Mäuse optimierten Durchflusszytometrie/FACS-Protokolle sind speziesspezifisch und insbesondere durch die Eigenschaften kommerziell erhältlicher Antikörper eingeschränkt. Sie wurden nicht für die Trennung von FAPs von Ratten oder stark fibrotischen Muskeln optimiert. Es wurde ein Durchflusszytometrie/FACS-Protokoll zur Identifizierung und Isolierung von FAPs und MPs sowohl aus gesunden als auch aus entferneten Rattenskelettmuskeln entwickelt, das sich auf die differentielle Expression der Oberflächenmarker CD31, CD45, Sca-1 und VCAM-1 stützt. Da rattenspezifische, durchflusszytometrie-validierte primäre Antikörper stark begrenzt sind, wurde eine interne Konjugation des Antikörpers, der auf Sca-1 abzielt, durchgeführt. Mit diesem Protokoll wurde die erfolgreiche Sca-1-Konjugation bestätigt und die durchflusszytometrische Identifizierung von FAPs und MPs durch Zellkultur und Immunfärbung von FACS-isolierten FAPs und MPs validiert. Schließlich berichten wir über einen neuartigen FAPs-Zeitverlauf in einem verlängerten (14 Wochen) Rattendenervierungsmodell. Diese Methode bietet den Forschern die Möglichkeit, FAPs in einem neuartigen Tiermodell zu untersuchen.

Introduction

Fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) sind eine Population von residenten multipotenten Vorläuferzellen in der Skelettmuskulatur, die eine entscheidende Rolle bei der Homöostase, Reparatur und Regeneration von Muskeln spielen und umgekehrt auch pathologische Reaktionen auf Muskelverletzungen vermitteln. Wie der Name schon sagt, wurden FAPs ursprünglich als Vorläuferpopulation mit dem Potenzial identifiziert, sich in Fibroblasten und Adipozyten zu differenzieren¹ und galten als die Schlüsselmediatoren der Fibrofettinfiltration der Skelettmuskulatur bei chronischen Verletzungen und Krankheiten. Weitere Studien ergaben, dass FAPs zusätzlich zur Osteogenese und Chondrogenese^fähigsind 2^,3,4. So werden sie in der Literatur weiter gefasst als mesenchymale oder stromale Vorläufer 3 ,^5,6,7,8. Bei akuten Skelettmuskelverletzungen helfen FAPs indirekt bei der regenerativen Myogenese, indem sie sich vorübergehend vermehren, um eine günstige Umgebung für aktivierte Muskelsatellitenzellen und ihre nachgeschalteten myogenen Vorläufer (MPs) -Gegenstücke^1,9,^10zuschaffen. Parallel zur erfolgreichen Regeneration durchlaufen FAPs eine Apoptose und bringen ihre Anzahl auf die Ausgangswerte^1,9,10,11zurück. Im Gegensatz dazu überschreiben FAPs bei chronischen Muskelverletzungen pro-apoptotische Signale, was zu ihrer Persistenz⁹, 10^{, 11}und abnormaler Muskelreparatur führt.

In vivo-Studien, die die zellulären und molekularen Mechanismen, mit denen FAPs Muskelreaktionen vermitteln, bewerten, haben bis heute murine Tiermodelle^{verwendet 1,7,9,}10^,11,12,13,14. Während gentechnisch veränderte Mäuse leistungsfähige Werkzeuge für diese Analysen sind, begrenzt die geringe Größe des Tieres die Gewebeverfügbarkeit für Studien in langfristigen lokalisierten Verletzungsmodellen, in denen Muskelschwund tiefgreifend sein kann, wie z.B. traumatische Denervierung. Darüber hinaus erfordert die Messung der Muskelkraft und der körperlichen Funktion Ex-vivo- oder In-situ-Messungen, die eine Beendigung der Maus erfordern, oder In-vivo-Methoden, die eine Operation und/oder eine Vollnarkose erfordern, um die Beurteilung der kontraktilen Muskelleistung zu ermöglichen^{15,16,17,18,19,20} . Bei Ratten existieren gut validierte und global genutzte Muskelfunktionsanalysen sowie Analysen für komplexere motorische Verhaltensweisen wie Ganganalysen (z. B. Ischiasfunktionsindex, CatWalk-Analyse) und werden bei wachen und sich spontan bewegenden Tieren durchgeführt^21,22,23,24 . Dies optimiert zusätzlich die Prinzipien der minimalen Morbidität im Tierversuch und die Anzahl der verwendeten Versuchstiere. Die Ratte bietet dem FAPs-Forscher dadurch die zusätzliche Flexibilität eines größeren verletzten Muskelvolumens für Protein- und Zellanalysen und die Möglichkeit, serielle Bewertungen der statischen und dynamischen funktionellen Aktivität und des Verhaltens von Muskelkomplexen im Alarmtier durchzuführen.

FAPs wurden in erster Linie identifiziert und aus ganzen Muskelproben mittels Durchflusszytometrie bzw. Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) isoliert. Dies sind laserbasierte Assays, die in der Lage sind, mehrere spezifische Zellpopulationen basierend auf charakteristischen Merkmalen wie Größe, Granularität und einer spezifischen Kombination von Zelloberfläche oder intrazellulären Markern zu identifizieren²⁵. Dies ist sehr vorteilhaft bei der Untersuchung eines Organsystems wie der Skelettmuskulatur, da Homöostase und Regeneration komplexe, multifaktorielle Prozesse sind, die von einer Vielzahl von Zelltypen koordiniert werden. Eine bahnbrechende Studie identifizierte SOWOHL FAPs als auch MPs unter Verwendung durchflusszytometrischer Methoden in der Skelettmuskulatur der Maus¹. Sie zeigten, dass FAPs mesenchymaler Natur sind, da ihnen Oberflächenantigene fehlten, die für Zellen aus endothelialen (CD31), hämatopoetischen (CD45) oder myogenen (Integrin-α7 [ITGA7]) Ursprüngen spezifisch waren, aber den mesenchymalen Stammzellmarker Sca-1 (Stammzellantigen 1)¹ exprimierten und in Kultur in fibrogene und adipogene Zellen differenzierten. Andere Studien zeigten eine erfolgreiche Isolierung von mesenchymalen Vorläuferzellen im Muskel basierend auf der Expression eines alternativen Stammzellmarkers, des aus Thrombozyten abgeleiteten Wachstumsfaktorrezeptors alpha (PDGFRα)^2,7,8, und weitere Analysen ergaben, dass es sich wahrscheinlich um die gleiche Zellpopulation wie FAPs^{3 handelt.} FAPs werden jetzt häufig in der Durchflusszytometrie identifiziert, indem entweder Sca-1 oder PDGFRα als positiver Selektionsmarker^{1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31} . Die Verwendung von PDGFRα ist jedoch für menschliches Gewebe bevorzugt, da ein direkter menschlicher Homolog von murinem Sca-1 noch identifiziert werden muss³². Darüber hinaus wurden andere Zelloberflächenproteine als Marker für MPs (z. B. VCAM-1) berichtet, die eine potenzielle Alternative zu ITGA7 als Indikator für Zellen myogener Abstammung während der FAPs-Isolierung³³darstellen.

Während die Durchflusszytometrie / FACS eine leistungsfähige Methodik zur Untersuchung der Rolle und des pathogenen Potenzials von FAPs in der Skelettmuskulatur^1,9^,10,11,13,29ist sie technisch durch die Spezifität und Optimierung der erforderlichen Reagenzien begrenzt. Da die durchflusszytometrische Identifizierung und Isolierung von FAPs in den Maustiermodellen^1,9,10,11,29entwickelt und durchgeführt wurde, stellt dies Forscher, die FAPs in anderen Modellorganismen untersuchen möchten, vor Herausforderungen. Viele Faktoren - wie die optimale zu verarbeitende Gewebegröße sowie die Reagenzien- und/oder Antikörperspezifität und -verfügbarkeit - unterscheiden sich je nach verwendeter Spezies.

Zusätzlich zu den technischen Hindernissen für die Untersuchung von FAPs in einem neuartigen Tiermodell wurden sie weitgehend in einem akuten, toxischen Umfeld untersucht - in der Regel durch intramuskuläre chemische Injektion oder Cardiotoxin. Die Bewertung der langfristigen Dynamik von FAPs beschränkt sich in erster Linie auf die Beurteilung der Duchenne-Muskeldystrophie unter Verwendung des mdx-Mausmodells^9,10,11und Modellen von Kombinationsmuskelverletzungen wie massivem Rotatorenmanschettenriss, bei dem gleichzeitige Sehnentransfektion und Denervierung an der Schultermuskulatur durchgeführt wird^26,27,28 . Die Reaktion der FAPs auf die alleinige Beleidigung der chronischen traumatischen Denervierung, ein häufiges Auftreten bei Arbeitsunfällen in der Schwerindustrie, der Landwirtschaft und bei Geburtstraumata (Plexus brachialis)^34,35,36,37 mit signifikanter Morbidität, wurde nicht so gut charakterisiert, oft auf einen kurzfristigen Zeitrahmen beschränkt^11,38.

Wir beschreiben eine Methode zur Identifizierung und Isolierung von FAPs und MPs aus gesunden sowie stark atrophischen und fibrotischen Skelettmuskeln bei der Ratte. Zunächst wird die Identifizierung von CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-FAPs und CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+-MPs unter Verwendung eines Gewebeaufschluss- und Durchflusszytometrie-Färbeprotokolls demonstriert und die anschließende Validierung unserer Ergebnisse erfolgt durch Kultur und immunzytochemische Färbung von FACS-isolierten Zellen. Mit dieser Methode berichten wir auch über einen neuartigen FAPs-Zeitverlauf in einem langfristigen isolierten Denervierungsverletzungsmodell bei der Ratte.

Protocol

Ermittler, die dieses Protokoll durchführen, müssen die Erlaubnis ihres örtlichen Tierethikrates / Pflegeausschusses einholen. Alle Tierarbeiten wurden vom St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Animal Care Committee (ACC #918) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care (CCAC) durchgeführt. Ein Schema des Durchflusszytometrieprotokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Wenn die nachgeschaltete Anwendung FACS und nachfolgende Zellkultur ist, sollten alle Schritte mit der richtigen aseptischen Technik abgeschlossen werden.

1. Muskelaufbau

1. Betäuben Sie Ratten mit einem geeigneten Anästhetikum und Opfer gemäß den Richtlinien des örtlichen Vivariums und des Tierethikrats. Dieses Protokoll erntet beispielsweise den Musculus gastrocnemius von erwachsenen weiblichen Lewis-Ratten (200-250 g). Ratten wurden mit 2-3% Isofluran betäubt und durch intrakardiale Injektion von T61 geopfert.
2. Sobald das Tier geopfert wurde, rasieren Sie das gesamte Hinterbein, um die Position des Muskels zu erleichtern und die Fellkontamination des geernteten Gewebes zu minimieren.
3. Machen Sie mit einem sterilen Skalpell zwei Schnitte in der Haut: den ersten um den Umfang des Sprunggelenks und den zweiten entlang der Mittellinie des medialen Aspekts des Hinterbeins vom Knöchel bis zur Hüfte.
4. Schälen Sie die Haut und die oberflächlichen Muskelschichten zurück, um den darunter liegenden Gastrocnemius zu enthüllen, der an den medialen und lateralen Kondylen des Femurs entspringt und an der Achillessehne eingesetzt wird.
5. Verwenden Sie stumpfe Dissektion, um den Gastrocnemius vom umgebenden Gewebe zu trennen, und behandeln Sie den Muskel nur durch die Sehne, um eine Quetschverletzung zu vermeiden.
6. Trennen Sie den Gastrocnemius von seiner Einführung, indem Sie die Achillessehne so distal wie möglich mit einer scharfen Schere durchschneiden. Einmal geschnitten, greifen Sie die Achillessehne mit einer Pinzette und schälen Sie den Gastrocnemius vorsichtig vom darunter liegenden Knochen. Halten Sie den Muskel immer noch mit einer Pinzette in einer Hand, lokalisieren Sie die beiden Ursprünge des Gastrocnemius und schneiden Sie an den medialen und lateralen Femurkondylen.
7. Tupfen Sie den ausgeschnittenen Gastrocnemius sanft gegen ein steriles Stück Gaze, um so viel Blut wie möglich zu entfernen. Trimmen Sie den Muskel auf einer sterilen Oberfläche und entfernen Sie überschüssiges Bindegewebe sowie die Achillessehne.
8. Legen Sie Muskeln in ein Wiegeboot und wiegen Sie mit einer Präzisionswaage. Dieses Protokoll ist optimiert, um Muskeln mit einem Nassgewicht von 200-600 mg zu verdauen. Die Anwender können überschüssiges entnommenes Gewebe auf Wunsch für andere nachgelagerte Assays unterteilen.
9. Teilen Sie den geernteten Muskel, der für die Durchflusszytometrie verwendet werden soll, vorsichtig in 3-4 kleinere Stücke (ca. 1-2 cm³⁾und tauchen Sie ihn in eiskalte 1x PBS ein. Auf Eis kalt halten, bis alle Proben geerntet wurden.

2. Muskelverdauung

1. Entfernen Sie den Muskel von PBS und legen Sie ihn in eine sterile 10 cm Zellkulturschale. Reißen und zerkleinern Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette, bis die Stücke etwa^{3-4 mm3}betragen, wobei so viel Bindegewebe wie möglich entfernt wird. Nach gründlichem Zerkleinern in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen mit 6 ml DMEM + 1% Penicillin/Streptomycin (P/S) überführen.
2. 10 μL 300 mM_{CaCl2-Lösung} zu 365 μL Collagenase II-Lösung (Stammkonzentration 4800 U/ml) geben, um das Kollagenase-Enzym zu aktivieren. Geben Sie die aktivierte Kollagenase-II-Lösung in das 50 ml konische Röhrchen, das die Gewebeschlämme enthält. Die endgültige Kollagenase-II-Konzentration beträgt 250 U / ml.
3. Inkubieren Sie Röhrchen in einem Shaker für 1 h bei 37 ° C, 240 x g, wobei Sie sicherstellen, dass Sie alle 15 Minuten manuell schwenken, um Gewebe zu entfernen, das an der Seite des Röhrchens haften geblieben ist.
4. Entfernen Sie nach 1 h die Röhrchen aus dem Shaker und fügen Sie pro Probe Folgendes hinzu: 100 μL Collagenase II (4.800 U/ml) und 50 μL Dispase (4,8 U/ml).
5. Proben mit einer serologischen Pipette 15-20 mal pipettieren, bis die Lösung homogen ist. Wenn Sie mehrere Proben verarbeiten, verwenden Sie für jede Probe eine separate sterile Pipette, um eine Kreuzkontamination der Probe zu vermeiden.
6. Erneut in einem Shaker für 30 min bei 37 °C und 240 x g inkubieren. Nach 15 Minuten schütteln Sie die Proben von Hand, um anhaftendes Gewebe von der Seite des Röhrchens zu entfernen.

3. Erzeugung einer Einzelzellsuspension

1. Scheren Sie Proben langsam durch eine 10 ml Spritze mit einer 20 G Nadel für 10 Zyklen.
   HINWEIS: Ein Zyklus beinhaltet die Aufnahme von Muskellösung in die Spritze und die Injektion zurück in die Röhre. Stellen Sie sicher, dass Sie alle Blasen minimieren, indem Sie das Scheren langsam abschließen, da übermäßiges Schäumen zusätzlichen Zelltod verursachen kann³⁹.
2. Legen Sie ein 40 μm Zellsieb auf ein steriles 50 ml konisches Rohr und befeuchten Sie es durch Pipettieren von 5 ml DMEM + 10% FBS & 1% P / S.
3. 1 ml der Probe gleichzeitig durch das Zellsieb pipettieren.
4. Waschen Sie das Zellsieb, indem Sie DMEM mit 10% FBS und 1% P / S durch das Sieb pipettieren, um das Gesamtvolumen im Röhrchen auf 25 ml zu bringen.
5. 25 ml der Probe gleichmäßig in zwei konische 15-ml-Röhrchen aufteilen und bei 15 °C, 400 x g für 15 min zentrifugieren.
   HINWEIS: Das Aufteilen der Muskellösung in zwei konische 15-ml-Röhrchen gewährleistet eine bessere Zellerholung nach der Zentrifugation im Vergleich zu einem einzelnen Röhrchen.
6. Den Überstand aspirieren und das Pellet in 1 ml 1x RBC-Lysepuffer (siehe Ergänzungsdatei)bei Raumtemperatur für 7 min erneut suspendieren, um Erythrozyten zu eliminieren.
7. Mit 9 mL Waschpuffer (siehe Ergänzungsdatei) das Volumen auf 10 mL erhöhen und Röhrchen bei 400 x g,15 °C für 15 min drehen.
8. Aspirieren Sie den Überstand und rekombinieren Sie die Pellets durch erneutes Suspendieren in 1 ml Waschpuffer.
9. Übertragen Sie ein geeignetes Zellvolumen in ein separates 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie es mit trypanblauem Farbstoff. Zählen Sie lebende Zellen auf einem Lichtmikroskop mit einem Hämozytometer.

4. Antikörperfärbung für die Durchflusszytometrie

HINWEIS: Der Sca-1-Antikörper muss vor Durchflusszytometrie-/FACS-Experimenten gemäß den Anweisungen des Herstellers mit APC konjugiert werden. Die Leistung muss für jede Charge von Konjugaten validiert werden (Abbildung 2). Endkonjugationen können in 20 μL Aliquots bei -20 °C gelagert werden und sind drei Wochen haltbar. Das vollständige Konjugationsprotokoll finden Sie in der Ergänzungsdatei.

1. Für die Durchflusszytometrie werden 1-2 x 10⁶ Zellen pro experimenteller Probe in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Bringen Sie das Volumen mit Waschpuffer auf bis zu 1 ml und legen Sie es auf Eis.
2. Richten Sie für jedes Experiment die folgenden erforderlichen Kontrollen ein: i) nicht gefärbte und ii) Lebensfähigkeitskontrollen zur genauen Auswahl für die lebende Zellpopulation; iii) Fluoreszenz minus eins (FMO) Kontrollen an Einzelzellsuspensionen, um genaue Gatter für CD31-/CD45-Fraktionen, FAPs und MPs festzulegen; und iv) einfach gefärbte Kompensationsperlen zur Korrektur des Fluoreszenz-Spillovers zwischen den Kanälen.
   1. Für alle Zellkontrollen aliquot 5 x 10⁵ - 1 x 10⁶ Zellen in 1 ml Waschpuffer in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis legen.
   2. Für die Perlenkontrolle fügen Sie jedem markierten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen^{1 Tropfen positive} Kompensationsperlen (~ 1,5 x 10 5 Perlen pro Tropfen) hinzu. Die gesamte Palette der Kontrollen ist in Tabelle 1aufgeführt.
      HINWEIS: Wenn das Experiment zum ersten Mal durchgeführt wird, führen Sie für jeden konjugierten Antikörper einzelngefärbte Kontrollen auf Einzelzellsuspensionen durch (zusätzlich zu den nicht gefärbten, lebensfähigen, einfach gefärbten Kompensationsperlen- und FMO-Kontrollen), um die positiv gefärbte Population in Zellen zu bewerten und die an Kompensationsperlen beobachtete Färbung zu validieren. Validieren Sie jedes frisch konjugierte Sca-1::APC-Präparat, indem Sie einzeln Kompensationsperlen und Einzelzellsuspensionen färben. Eine vollständige Liste der Färbekontrollen finden Sie in Tabelle 1.
3. Um die Lebensfähigkeitskontrolle vorzubereiten, übertragen Sie die Hälfte des Zellvolumens aus dem "Lebensfähigkeitsröhrchen" in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Beschriften Sie diese Tube mit "Dead".
4. "Dead" -Röhrchen bei 65 ° C für 2-3 min inkubieren, um die Zellen abzutöten, und dann auf Eis legen. Kombinieren Sie nach 2-3 min erneut tote Zellen mit lebenden Zellen, die im Lebensfähigkeitskontrollrohr verbleiben. Diese Zellpopulation wird verwendet, um Kompensationswerte (falls erforderlich) festzulegen und Tore für den Lebensfähigkeitsfarbstoff richtig zu setzen.
5. Zentrifugieren Sie die Einzelzellsuspensionen (experimentelle Proben und Kontrollen) bei 500 x g, 4 °C für 5 min.
6. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellpellets in 100 μL Waschpuffer.
7. Fügen Sie Antikörper hinzu, abhängig von der experimentellen Probe oder Kontrolle. Informationen zu Antikörperkombinationen und -mengen finden Sie in der Färbematrix (Tabelle 2).
8. Streichen Sie jede Probe vorsichtig, um ein vollständiges Mischen zu gewährleisten, und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang im Dunkeln auf Eis. Für Ausgleichsperlen 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
9. Für Einzelzellsuspensionsexperimente und Kontrollproben ist das Volumen durch Zugabe von 900 μL Waschpuffer auf 1 ml zu erhöhen. Für Kompensationsperlensteuerungen erhöhen Sie das Volumen auf 1 ml mit 900 μL 1x PBS.
10. Zentrifugieren Sie Einzelzellsuspensionsproben bei 500 x g, 4 °C für 5 min. Zentrifugenkompensations-Wulstkontrollen bei 300 x g, 4 °C für 5 min.
11. Für alle Einzelzellsuspensionsproben aspiratieren und verwerfen Sie Überstands- und Resuspensionszellpellets in 300 μL Waschpuffer. Für die Kompensationsperlenkontrolle den Überstand absaugen und verwerfen, das Pellet in 300 μL 1x PBS wieder suspendieren und dann 1 Tropfen (~ 1,5 x 10^{5) negativer}Kompensationsperlen hinzufügen.
12. Bewahren Sie alle Einzelzellsuspensionsproben auf Eis unter Aluminiumfolie auf und fahren Sie mit der durchflusszytometrischen Erfassung fort. Kompensationsperlensteuerungen sollten ebenfalls vor Licht geschützt sein, können aber bei Raumtemperatur gehalten werden.
    HINWEIS: Wenn der experimentelle Endpunkt die FAPs-Identifizierung mittels Durchflusszytometrie ist, führen Sie bitte die Schritte 5.1.1-5.1.11 aus. Wenn der Endpunkt die Zellisolierung über FACS für Kultur und Färbung ist, befolgen Sie bitte die Schritte 5.2.1-5.2.9 und abschnitte 6-7.

5. Durchflusszytometrie und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)

1. Durchflusszytometrie
   HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet ein Tisch-Durchflusszytometer, das mit 405 nm-, 488 nm- und 640 nm-Lasern ausgestattet ist, die in der Lage sind, gleichzeitig 10 verschiedene Farben zu unterscheiden. Bandpassfilter und die zugehörigen Fluorochrome, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind wie folgt: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) und 670/30 (APC). Die Spannungen für jeden Detektor sind wie folgt: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX Blau 360; APC 570. Stellen Sie sicher, dass Sie vor der Verwendung in der ordnungsgemäßen Bedienung des Durchflusszytometers oder Zellsortierers geschult sind.
   1. Stellen Sie sicher, dass das Zytometer vor Gebrauch 10-20 Minuten lang eingeschaltet und durch sequentielle Reinigung mit sauberen, Spül- und Mantelflüssigkeitslösungen für jeweils 30-45 s grundiert wurde. Beenden Sie mit einer Spülung mit dH₂O. Stellen Sie sicher, dass dem Vorratsbehälter ein ausreichendes Volumen an Mantelflüssigkeit zugesetzt wurde, um den ordnungsgemäßen Probenfluss während der gesamten Erfassung aufrechtzuerhalten.
   2. Richten Sie die Gating-Strategie ein, um FAPs und MPs zu identifizieren, wie in Abbildung 3 dargestellt.
      HINWEIS: FAPs und MPs werden durch die folgende hierarchische Gating-Strategie identifiziert: i) SSC-A vs FSC-A (Seitenzellenstreufläche versus Vorwärtszellstreufläche zur Trennung von Zellen vs. Trümmern), ii) FSC-W vs FSC-H (Vorwärtszellstreubreite versus Vorwärtszellstreuhöhe, um Singuletts von Dubletten im FSC-Parameter zu unterscheiden), iii) SSC-W vs SSC-H (Seitenzellstreubreite versus Seitenzellstreuhöhe, um Singuletts von Dubletten im SSC-Parameter zu unterscheiden), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (zur Unterscheidung von lebenden und toten Singlets), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (um CD31+ und CD45+ Zellen von der weiteren Analyse auszuschließen), und vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E von der CD31-/CD45- (Lineage; Lin-) Bevölkerung (Identifizierung von FAPs und Abgeordneten). FAPs werden als CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-Ereignisse und MPs als CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+-Ereignisse identifiziert.
   3. Führen Sie zuerst jede einzelgefärbte Kompensationsperlensteuerung mit niedriger Geschwindigkeit durch das Zytometer, um Kompensationswerte zu erzeugen, die zur Korrektur von Fluoreszenz-Spillover zwischen Kanälen verwendet werden. Bewerten Sie die Kompensation, indem Sie das Fluoreszenzsignal jedes Steuerelements in seinem eigenen Detektor (z. B. SSC-A vs APC für Sca-1::APC-Einzelgefärbte Perlen) sowie alle anderen Detektoren vergleichen. Es sollte zwei verschiedene Populationen (eine mit negativem und eine mit positivem Signal) im entsprechenden Detektor und nur eine negative Population in allen anderen Detektoren geben. Stellen Sie das Stopptor auf 10.000 Kompensationsperlenereignisse ein und zeichnen Sie die Daten auf.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie zwischen der Aufnahme jeder Probe dH 2 O für_10-20Sekunden durch das Zytometer laufen lassen, um eine Kontamination von Probe zu Probe zu vermeiden.
   4. Als nächstes verarbeiten Sie die nicht gefärbten und Lebensfähigkeitskontrollproben, um lebende Einzelzellen richtig zu schützen. Stellen Sie das Stopptor auf 10.000 Singlet-Ereignisse ein und zeichnen Sie Daten auf.
      ANMERKUNG: Etwa 5 min vor der Entnahme jeder Einzelzellsuspensionsprobe mit Ausnahme der ungefärbten Probe 1 μL SYTOX Blue Lebensfähigkeitsfarbstoff (300 μM Arbeitskonzentration verdünnt von 1 mM Stammlösung) zu jeder Probe geben und vorsichtig mischen (Endkonzentration 1 μM).
   5. Anschließend werden die verbleibenden Einzelzellsuspensionskontrollproben entnommen. Bewerten Sie jedes FMO-Steuerelement mit dem entsprechenden Diagramm in der Gating-Strategie (Abbildung 3). Bewerten Sie beispielsweise das FITC-Signal des CD31+CD45 FMO, um ein genaues CD31-/CD45-Gate sicherzustellen. Ein optimales Beispiel ist in Abbildung 3G dargestellt. Wenn das Protokoll zum ersten Mal durchgeführt wird, sollten einzeln gefärbte Kontrollen auf Zellen vor dem Erwerb von FMO-Kontrollen ausgeführt werden.
   6. Bewerten Sie das Fluoreszenzsignal jeder einzelnen gefärbten Zellprobe in ihrem geeigneten Detektor sowie in allen anderen Detektoren, um die ordnungsgemäße Kompensation zu validieren. Stellen Sie das Stopptor auf 10.000 Live-Singlet-Ereignisse ein und zeichnen Sie es in der Software auf.
   7. Sobald alle Kontrollen (Einzelzellsuspensionen und Kügelchen) verarbeitet sind, bereiten Sie alle experimentellen Proben vor, indem Sie zuerst das Volumen jeder Probe messen und aufzeichnen. Diese Messungen werden verwendet, um FAPs und MPs genau zu quantifizieren, wie in Schritt 5.1.11 beschrieben. Fügen Sie dann 50 μL Präzisionszählperlen hinzu und mischen Sie vorsichtig, indem Sie 2-3 Mal nach oben und unten pipettieren.
   8. Führen Sie kurz die erste experimentelle Probe durch, um die Identifizierung der zählenden Perlenpopulation zu validieren. Diese Population erscheint als ein kleiner, von der allgemeinen Zellpopulation getrennter Cluster auf dem FSC-A vs SSC-A-Diagramm(Abbildung 3A,roter Kasten). Erstellen Sie ein Tor um die zählende Perlenpopulation. Erfassen Sie dann Daten für jede experimentelle Probe, indem Sie mit niedriger Geschwindigkeit durch das Zytometer verarbeiten. Setzen Sie das Stopptor auf 10.000 Zählperlenereignisse und zeichnen Sie auf.
      HINWEIS: Die Ermittler können alternativ Zählperlen identifizieren, indem sie ein zusätzliches Diagramm einrichten, das SSC-A im Vergleich zu einem der Detektoren bewertet, da die zählenden Kügelchen in allen Detektoren fluoreszierend sind.
   9. Nachdem alle Proben verarbeitet wurden, reinigen Sie das Zytometer mit den entsprechenden Protokollen. Exportieren Sie alle Daten zur Analyse.
   10. Öffnen Sie alle Datendateien in einer geeigneten Durchflusszytometrie-Analysesoftware. Legen Sie die für die Datenerfassung verwendete Gating-Strategie wie in Schritt 5.1.2 beschrieben fest. Untersuchen Sie die Kontrollen in der gleichen Reihenfolge wie bei der Datenerfassung (z. B. ungefärbt, Lebensfähigkeit, Einzelfleck, dann FMO-Kontrollen), um die Gating-Strategie erneut zu validieren. Sobald genaue Gatter mit FMO-Kontrollen festgelegt wurden, wenden Sie die Gatter auf alle experimentellen Proben an. Exportieren Sie Rohdaten als Kalkulationstabelle zur Quantifizierung.
   11. Berechnen Sie die Anzahl der FAPs und MPs in jeder experimentellen Probe mit den Zählkügelchen:
       
       wobei Acquired Cell Count die Anzahl der aufgezeichneten Ereignisse der relevanten Zellpopulation (z. B. FAPs oder MPs) auf der Erfassungssoftware ist; Acquired Bead Count ist die Anzahl der aufgezeichneten Ereignisse der Zählung von Perlen auf der Akquisitionssoftware; Counting Beads Volume ist das Volumen der Zählperlenlösung, das in Schritt 5.1.7 hinzugefügt wurde; Das Probenvolumen ist das Volumen jeder gefärbten experimentellen Probe vor der Zugabe von Zählperlen. Die Perlenkonzentration ist die Anzahl der Kügelchen pro μL-Lösung; Dieser Wert befindet sich im Produktdatenblatt.
2. FACS - Sortierung für Zellkultur
   HINWEIS: Dieses Protokoll führt FACS auf einem Zellsortierer durch, der mit 4 Lasern (UV, Violett, Blau, Rot) ausgestattet ist und gleichzeitig 11-14 Farben unterscheiden kann. Befolgen Sie das Protokoll der experimentellen Probenfärbung (Abschnitt 4) und der Durchflusszytometrie, mit Ausnahme der unten beschriebenen Schritte 1 bis 3, um den FACS-Workflow zu optimieren:
   1. Erhöhen Sie die Konzentration der Zellen in den zu sortierenden experimentellen Proben auf 7 x 10⁶ Zellen/ml, um robuste Ausbeuten an FAPs und MPs zu erzeugen.
   2. Um diesem signifikanten Anstieg der Zellkonzentration Rechnung zu tragen, verdoppeln Sie alle Antikörperkonzentrationen in den zu sortierenden Versuchsproben.
   3. Verarbeiten Sie die endgültigen gefärbten Zellproben durch eine 40 μM-Zellsiebkappe, die unmittelbar vor der Sortierung an einem 5-ml-Polystyrolröhrchen befestigt ist, um die Zellverklumpung zu reduzieren und die Sortierausbeute zu erhöhen.
   4. Sammeln Sie einzelne, lebende Ratten-FAPs und MPs direkt aus dem Zellsortierer in einem 5-ml-Polypropylen-Sammelröhrchen, das 1 ml steriles, 100% fetales Rinderserum (FBS) enthält. Halten Sie die Zellen auf Eis, bis die Sortierung abgeschlossen ist.
      HINWEIS: Wenn Sie FACS an einem externen Standort durchführen, übertragen Sie alle sortierten Zellen auf Eis und in einem gesicherten, abgedeckten Behälter.
   5. Wenn Sie in einer sterilen Biosicherheitswerkbank (BSC) arbeiten, bringen Sie das Volumen der sortierten Zellen mit geeigneten Wachstumsmedien (z. B. FAP-Wachstumsmedien (FAP GM) für sortierte FAPs und MP-Wachstumsmedien (MP GM) für sortierte MPs auf bis zu 7 ml und zentrifugieren Sie bei 500 x g, 4 ° C für 7 min, um so viel Restwaschpuffer wie möglich zu entfernen.
   6. Resuspenieren Sie Pellets in 1 ml geeignetem Wachstumsmedium und eine Platte in eine 12-Well-Platte, die einen sterilen, kollagenbeschichteten 12 mm Glasdeckglas/-well zur anschließenden Immunfärbung enthält (siehe Abschnitt 6).
      HINWEIS: Bei immunzytochemischer Färbung für Kollagen sortierte die Platte Zellen in eine 12-Well-Platte, die einen sterilen, Laminin-beschichteten 12-mm-Glasdecker / -brunnen anstelle von kollagenbeschichtet enthält. Wenn immunzytochemische Experimente mit sofort isolierten Vorläufern erforderlich sind, säen Sie FAPs und MPs mit einer Dichte von 15.000 Zellen pro cm² aus und fahren Sie direkt mit Schritt 6.1 fort. Für Langzeitkulturen, um die Differenzierung des Vorläufers zu induzieren, samen FAPs mit einer Dichte von 5.000 Zellen pro cm²und MPs mit einer Dichte von 7.500 Zellen pro cm^2.
   7. Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C und 5% CO2 in_einem Zellkultur-Inkubator. Nach 72 Stunden in der Kultur ändern Sie die Hälfte der Medien. Wechseln Sie die Medien alle 2-4 d danach vollständig.
   8. Um die Entwicklung von Myozyten zu induzieren, wechseln Sie die MPs-Kulturen am Tag 9 der Kultur auf das Medium MP-Differenzierung (MD). Um Adipozyten zu induzieren, schalten Sie die FAPs-Kulturen am Tag 10 der Kultur auf FAP-Adipogen-Differenzierungsmedium (AD) um.
   9. Um die Fibrogenese zu induzieren, können FAPs zu variablen Zeitpunkten während der Kultur auf fibrogene Differenzierungsmedien (FD) umgestellt oder alternativ nach der Isolierung (Schritt 5.2.6) direkt in FD-Medien ausgesät werden (siehe Ergänzende Datei für alle Medienrezepte).

6. Immunzytochemie von kultivierten FAPs und MPs

1. Um die Zellsortierung zu validieren und die Reinheit von FAPs und MPs-Kulturen nachzuweisen, Immunostain mit zelltypspezifischen Markern, einschließlich PDGFRα (FAPs-Marker), Pax-7 (Muskelstamm [Satelliten] Zellmarker), Fibroblasten-spezifischem Protein (FSP-1, Fibroblastenmarker), Perilipin-1 (Plin-1, Adipozytenmarker), Kollagen Typ 1 (Col1a1, Indikator für Fibrose), Myosin Heavy Chain (MHC, reifer Myozytenmarker).
   1. Zur Immunfärbung frisch sortierter Zellen die 12-Well-Platte bei 200 x g für 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren, um die Haftung der Zellen am Deckglas/ Well zu erleichtern. Dieser Schritt ist für Langzeitkulturen nicht notwendig. Entfernen Sie Kulturmedien.
   2. Zur Immunfärbung mit FSP-1 fixieren Sie die Zellen mit 1 ml 100% Methanol (MeOH) für 2 min bei 4 °C. Bei Immunfärbung für PDGFRα, Plin-1, Pax7 oder Col1a1 Zellkulturen mit 1 ml 4% PFA in 1x PBS für 15 min bei Raumtemperatur fixieren. MHC Immunostaining verträgt beide Fixiermittel.
      HINWEIS: Überspringen Sie bei Methanol-fixierten Zellen Schritt 6.2 und fahren Sie mit Schritt 6.3 fort.
2. Saugen Sie 4% PFA ab und waschen Sie Zellkulturen 3-4 mal schnell mit 1x PBS. 1 mL 100 mM Glycin in 1x PBS geben und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren, um resteigene PFA zu inaktivieren. Aspirieren und waschen Sie 1-2 mal mit 1x PBS.
   HINWEIS: Die Zellen können in diesem Stadium in 2 ml 1x PBS belassen, in Frischhaltefolie eingewickelt und maximal 7-10 Tage bei 4 ° C gelagert werden.
3. Nach dem Waschen 1 mL 0,1% Triton-X in 1x PBS geben und 20 min inkubieren, um die Zellmembranen zu permeabilisieren.
4. Waschen Sie die Wells 2-3 mal mit 1-2 ml 1x PBS und blockieren Sie dann zellen mit 1 mL 1x PBS + 3% BSA pro Vertiefung für 1 h bei Raumtemperatur.
5. 80 μL primärer Antikörper, verdünnt in 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 pur, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/ml) auf ein Stück Parafilm, das auf einen mobilen Behälter geklebt ist. Heben Sie mit einer sterilen feinen Pinzette den Deckglas vorsichtig aus dem Brunnen und kehren Sie ihn auf den Tropfen Der Antikörperlösung um. Inkubieren Sie das Deckglas mit zwei nassen Stücken Papiertuch und decken Sie den Behälter in Kunststofffolie ab, um die Verdunstung der Antikörperlösung zu vermeiden. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   HINWEIS: Das Färben von Deckblättern aus dem Bohrloch verwendet weniger Antikörper (~ 80 μL) als das Färben im Bohrloch (mindestens 500 μL).
6. Lassen Sie an Tag 2 die Deckgläser bei Raumtemperatur 30 Minuten zum Aufwärmen. Verwenden Sie die Pinzette vorsichtig rechts und übertragen Sie die Deckgläser zurück zu ihren jeweiligen Vertiefungen (Zellen nach oben) und waschen Sie 2-3 mal mit 1-2 ml 1x PBS für jeweils 2 min, um so viel primären Antikörper wie möglich zu entfernen.
7. Mit der gleichen Färbetechnik wie bei der primären Antikörperfärbung färben Sie Zellen mit ziegenfeindlichem Alexa Fluor 488 sekundärem Antikörper (1:400) zum Nachweis von FSP-1, Plin-1, Col1a1 oder PDGFRα und Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor 555 Sekundärantikörper (1:300), um MHC oder Pax-7 nachzuweisen. Inkubieren Sie Zellen für 1 h bei Raumtemperatur und halten Sie die Zellen vor Licht geschützt.
8. Bringen Sie die Zellen zum Brunnen zurück und inkubieren Sie die Zellen mit Hoechst (1:10.000) für 2-4 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen weitere 2-3 Mal mit 1x PBS für jeweils 2 min, um überschüssiges Hoechst zu entfernen.
9. Befestigen Sie Deckgläser mit einem anti-fade fluoreszierenden Montagemedium auf Glasobjektträgern und lassen Sie die Dias über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur trocknen. Montierte Deckgläser bei 4 °C im Dunkeln aufbewahren.

7. Oil Red O (ORO) Färbung von kultivierten FAPs und MPs

1. OrO-Färbung auf nicht permeabilisierten Zellen durchführen, da die Permeabilisierung der Zellmembran zu einer unspezifischen/unerwünschten Färbung von nicht-adipogenen Zelltypen führen kann. Bereiten Sie vor Beginn der Färbung einen ORO-Arbeitsstoff vor (siehe Ergänzungsdatei für das Rezept) und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
2. Nach 20 min wird die Lösung mit einem 0,2 μm-Filter filtriert, um ungelöste Aggregate zu entfernen.
3. Saugen Sie medien aus der Vertiefung ab und fügen Sie 1 ml 10% neutrales gepuffertes Formalin (10% NBF) hinzu. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   HINWEIS: Die Zellkonfluenz kann zu einem Lifting aus dem Bohrloch / Deckglas führen. Seien Sie vorsichtig beim Ansaugen/Hinzufügen von Lösungen.
4. Aspiratieren und 1 ml frisches 10% NBF hinzufügen und mindestens 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
   HINWEIS: Das Protokoll kann an dieser Stelle gestoppt werden, da Zellen über Nacht in 10% NBF belassen werden können.
5. Waschen Sie die Vertiefungen einmal schnell mit 1 ml 60% Isopropanol, aspirieren Sie dann und lassen Sie die Vertiefungen vollständig trocknen (ca. 2 min).
6. Fügen Sie 400 μL Oil Red O Arbeitsmaterial pro Bohrloch hinzu und inkubieren Sie für 10 min bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass kein ORO an den Wänden der Platte pipettiert wird.
7. Entfernen Sie das gesamte Oil Red O und waschen Sie den Brunnen schnell 4 mal mit dH₂O.
   HINWEIS: Wenn gebeizte Vertiefungen Deckgläser enthalten, montieren Sie sie mit der gleichen Technik wie in Schritt 6.9 beschrieben.
8. Stellen Sie entweder montierte Deckgläser oder den gebeizten Brunnen mit einem Hellfeldmikroskop vor.

8. Gewebefärbung von kontralateralen und denervaten Ratten-Gastrocnemius-Abschnitten

1. Picrosirius Rot (PSR)
   1. PsR-Färbung auf 5 μm dicken, formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Ratten-Gastrocnemius histologischen Abschnitten wie zuvor beschrieben⁴⁰.
2. Öl Rot O (ORO)
   1. 5 μm dicke isopentangefrorene Ratten-Gastrocnemius histologische Schnitte in 4% PFA für 10 min fixieren, in 60% Isopropylalkohol für 1 min inkubieren.
   2. Färben Sie mit ORO-Arbeitsmaterial für 12 min. In 60% Isopropylalkohol für 1 min inkubieren, 10 min in dH 2 O waschen. Mit_einemwasserlöslichen Montagemedium auf Deckgläser montieren.
3. Sca-1 und Laminingewebe fluoreszierende Immunhistochemie (IHC)
   1. Führen Sie fluoreszierende IHC auf 5 μm dicken isopentangefrorenen Ratten-Gastrocnemius-histologischen Abschnitten durch.
   2. Hydratisieren Sie Proben in 1x PBS für 5 min, fixieren Sie in 4% PFA für 10 min und inkubieren Sie dann Proben in Gewebe IF-Blockierungslösung (siehe Ergänzende Datei) für 90 min.
   3. Inkubieren mit Anti-Sca-1 Primärantikörper (1:500), verdünnt in 1x PBS + 0,05% Tween bei 4 °C über Nacht.
   4. An Tag 2 dreimal in 1x PBS + 0,05% Tween für jeweils 5 min waschen, dann in Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 555 (1:500) für 1 h inkubieren.
   5. Erneut waschen (wie zuvor), mit Blocklösung für 1 h inkubieren, dann Anti-Laminin-Primärantikörper (1:500) in 1x PBS + 0,05% Tween für 1 h hinzufügen.
   6. Erneut waschen (wie zuvor), dann in Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 (1:500) für 1 h (für Laminin) inkubieren.
   7. Erneut waschen (wie zuvor) und dann in DAPI (1:10.000) für 4 min inkubieren. Waschen und montieren Sie sie mit einem Anti-Fade-Montagemedium auf Deckgläsern.

Representative Results

Identifizierung von FAPs und MPs mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines neuartigen Antikörperpanels einschließlich Sca-1 und VCAM-1
Die Gating-Strategie zur Identifizierung von FAPs im Rattenmuskel basiert auf Durchflusszytometrie-Protokollen in der Maus²⁹, die auf CD31 (Endothel) und CD45 (hämatopoetische) positive Zellen (die sogenannte Abstammung [Lin]) gelangen und das fluoreszierende Profil des FAPs-Markers Sca-1 und des MPs-Markers ITGA7 aus der linage-negativen (Lin-) Population untersuchen. In Ermangelung kommerziell verfügbarer, fluorophorkonjugierter und durchflusszytometrievalidierter Antikörper für Ratten-Sca-1 und ITGA7 konjugierten wir einen Ratten-Sca-1::APC-Antikörper selbst und unternahmen eine alternative Strategie zur Identifizierung der MPs. Da sich VCAM-1 kürzlich als effizienter einzeln positiver Selektionsmarker für die Isolierung von Ratten-MPs³³ erwiesen hat und ein rattenspezifischer, konjugierter, durchflusszytometrie-validierter Antikörper verfügbar ist, der auf VCAM-1 abzielt, haben wir VCAM-1 verwendet, um MPs im Gegensatz zu ITGA7 zu identifizieren.

Wir bestätigten die erfolgreiche Konjugation und Leistung des Sca-1:APC-Antikörpers mit Einzelfärbung von Kompensationsperlen und Zellsuspensionen, die aus gesundem Ratten-Gastrocnemius erzeugt wurden (Abbildung 2A,B). Eine Fünf-Punkte-Titration von Sca-1::APC (Abbildung 2C) wurde zusätzlich zu allen anderen Antikörpern (CD31::FITC, CD45::FITC, VCAM-1:PE) durchgeführt, die im Protokoll verwendet werden (Ergänzende Abbildung 1), um die optimalen Konzentrationen zu identifizieren. Unter Verwendung dieses neuartigen Paneldesigns wurden gleichzeitig vermeintliche FAPs und MPs aus gesundem Gastrocnemius identifiziert (Abbildung 3), wobei Zellen, die für Sca-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) einfach positiv waren, als FAPs (Red Box) und Zellen als Single-Positive für VCAM-1 (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) als MPs (Blue Box) bezeichnet wurden. Wir identifizierten auch eine Population von Zellen, die doppelt positiv für Sca-1 und VCAM-1 waren (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+)(Abbildung 3F; oberer rechter Quadrant).

Validierung der Identifizierung von FAPs und MPs durch FACS und Zellkultur
Um das vorgestellte Protokoll zur durchflusszytometrischen Identifizierung von FAPs und MPs in der Skelettmuskulatur von Ratten zu validieren, versuchten wir, lebende Zellen für die Kultur in vitrozu isolieren. Mittels FACS wurden lebensfähige FAPs und MPs mit der gleichen Gating-Strategie wie bei der durchflusszytometrischen Analyse isoliert. Etwa 20.000-40.000 FAPs und 30.000-50.000 MPs wurden für die Zellkultur aus einem einzelnen Gastrocnemius-Muskel von einer 230 g schweren Ratte gesammelt.

Um die Reinheit jeder Population zu bestätigen, haben wir frisch sortierte FAPs und MPs für PDGFRα und Pax7 mit immungefärbt. PDGFRα ist neben Sca-1 der zweite mesenchymale Vorläufermarker, der üblicherweise zur Identifizierung der FAPs^2,7,8verwendet wird. Pax-7 ist ein bekannter und weit verbreiteter Marker von Muskelsatellitenzellen (Stammzellen)⁴¹. Die sortierte Population von FAPs zeigte eine positive Färbung für PDGFRα ohne Kontamination durch Pax7-positive Zellen(Abbildung 4A; obere Reihe). Umgekehrt wurde die sortierte Population von MPs, die positiv auf Pax7 gefärbt wurden, ohne PDGFRα-positive Zellen (Abbildung 4A; untere Reihe), was die Fähigkeit von Lin-/Sca-1+/VCAM-1- und Lin-/Sca-1-/VCAM-1+-Zelloberflächenantigenprofilen zur Isolierung reiner Populationen von FAPs bzw. MPs bestätigt.

Als nächstes kultivierten wir sortierte FAPs und MPs über einen Zeitraum von 10-12 Tagen unter Bedingungen, um eine adipogene, fibrogene und myogene Differenzierung zu induzieren. Am Tag 12 enthielten FAPs-Kulturen, die adipogenen Bedingungen ausgesetzt waren, Zellen mit entweder einer fibroblastenartigen Morphologie oder einer multilokulären Morphologie, die der von weißen Präadiipozyten mit Fetttröpfchen ähnelte (Daten nicht gezeigt). Die Immunfärbung für Fibroblasten-spezifisches Protein-1 (FSP-1) bestätigte die Fibroblastendifferenzierung, während die Färbung für Plin-1 (Perilipin-1; ein Adipozytenmarker)⁴² und Ölrot O die Differenzierung von Adipozyten und das Vorhandensein von neutralen Triglyceriden bzw. Lipiden bestätigte (Abbildung 4B). Das Fehlen kontaminierender Zellen aus einer myogenen Linie in den FAPs-Kulturen wurde durch Co-Immunfärbung für Myosin Heavy Chain (MHC), einen Marker für differenzierte Myozyten, bestätigt. FAPs-Kulturen, die einer fibrogenen Differenzierung (FD) unterzogen wurden, wurden für die Expression von Kollagen Typ 1 (Col1a1) bewertet, eines der wichtigsten FAPs-abgeleiteten Kollagene⁸. Die Co-Immunfärbung für Col1a1 und MHC an Tag 11 zeigte eine robuste Kollagen-Typ-1-Expression ohne kontaminierende MHC-positive Zellen (Abbildung 4B). Die endgültige Bestätigung der Reinheit der FAPs-Population wurde durch die Kultivierung von FAPs in myogenen Medien durchgeführt, um das Wachstum von kontaminierenden Abgeordneten zu fördern. Es wurden keine MHC-positiven Zellen beobachtet (Ergänzende Abbildung 2A).

MP-Kulturen, die myogenen Bedingungen ausgesetzt waren, zeigten MHC-exprimierende reife Myozyten und mehrkernige Myotuben 12 Tage nach der Beschichtung(Abbildung 4C). Die Co-Immunfärbung der MP-Kulturen mit FSP-1 und Plin-1 zeigte das Fehlen kontaminierender Fibroblasten bzw. Adipozyten. Ebenso zeigte die ORO-Färbung keine Lipidkontamination (Abb. 4C). Es wurde auch berichtet, dass Col1a1, das stark von Fibroblasten exprimiert wird, in geringerem Maße von myogenen Vorläufern und Myoblasten produziert wird, obwohl es diesbezüglich widersprüchliche Daten in der Literatur gibt^8,43,44. Während die Co-Immunfärbung von MPs mit Col1a1 und MHC eine Myozytendifferenzierung unserer MP-Kultur zeigte, wurden keine Hinweise auf eine Immunpositivität von Col1a1 gefunden (Abbildung 4C). Um die Reinheit der Population weiter zu bestätigen, wurden MP-Kulturen adipogenen oder fibrogenen Bedingungen unterzogen, um das Wachstum von Adipozyten und Fibroblasten zu fördern (Ergänzende Abbildung 2B). Es wurden keine kontaminierenden Zellen aus der FAPs-Linie beobachtet.

Während wir die Fähigkeit gezeigt hatten, reine Populationen von FAPs und MPs aus dem Rattenmuskel zu identifizieren und zu sortieren, versuchten wir als nächstes, die Identität der Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ (doppelt positiven) Zellen zu bestimmen. Da die Sca-1-Expression bei einem sehr kleinen Anteil von MPs (ca. 3%) in gesunden Muskeln⁴⁵ berichtet wurde und ähnlich wenige FAPs (ca. 4%) VCAM-1 in gesunden Muskeln¹⁰exprimieren, wurde eine Immunfärbung von frisch sortierten Lin-/Sca-1+/VCAM-1+-Zellen für PDGFRα und Pax7 zusammen mit der Kultivierung in myogenen, adipogenen, und fibrogene Bedingungen, um Myogenese, Adipogenese bzw. Fibrogenese zu induzieren. Es wurde festgestellt, dass die doppelt positiven Zellen eine gemischte Population von MPs und FAPs waren, wobei frisch sortierte Zellen entweder für PDGFRα oder Pax7 immunhaltig waren(ergänzende Abbildung 3A)und kultivierte Zellen, die sich in reife Myozyten, Adipozyten oder Fibroblasten unterschieden(ergänzende Abbildung 3B, C).

ITGA7 vs VCAM-1 zur Identifizierung von MPs während der identifizierung von durchflusszytometrischen FAPs
Während ein erfolgreiches Protokoll für die durchflusszytometrische Identifizierung von Ratten-FAPs und MPs unter Verwendung von Sca-1 bzw. VCAM-1 etabliert wurde, versuchten wir festzustellen, ob ein selbstkonjugierter ITGA7-Antikörper in ähnlicher Weise zur Identifizierung von MPs anstelle von VCAM-1 verwendet werden könnte, wie es bei der Maus Standard ist. Ein rattenspezifischer ITGA7-Antikörper wurde an PE-Cy7 konjugiert (siehe Supplementary File) und die Leistung des Antikörpers wurde an kommerziellen Kompensationsperlen und Einzelzellsuspensionen validiert, die aus Ratten-Gastrocnemius erzeugt wurden (Ergänzende Abbildung 4A-C). Der ITGA7::P E-Cy7-Antikörper funktionierte ausreichend bei Einzelfärbungs- und FMO-Experimenten (Ergänzende Abbildung 4D). Bei der vollständigen Färbung von Gastrocnemius-Zellsuspensionen mit CD31::FITC, CD45::FITC, Sca-1::APC und ITGA7::P E-Cy7 wurde jedoch eine Wechselwirkung zwischen den Antikörpern Sca-1::APC und ITGA7::P E-Cy-7 deutlich. Die anschließende Kultur sowohl der FACS-sortierten Lin-/Sca-1+/ITGA7-Zellen (angebliche FAPs) als auch der Lin-/Sca-1-/IGTA7+-Zellen (angebliche MPs)(ergänzende Abbildung 4E)ergab überwiegend FAPs und mit wenigen MPs (Ergänzende Abbildung 4F), was darauf hindeutet, dass die Interaktion zwischen Sca-1::APC und ITGA7::P E-Cy-7-Antikörpern die Spezifität der Zellidentifikation negativ beeinflusste.

Ein neuartiger FAPs-Zeitverlauf in der langfristigen denervatisierten Skelettmuskulatur
Da die FAPs-Dynamik im Kontext der kurzfristigen traumatischen Denervierung in den murinen Modellen^11,38untersucht wurde, versuchten wir, die Leistung unserer Methode zur FAPs-Isolierung von gesunden und stark atrophischen, fibrotischen Muskeln zu validieren. Ratten wurden einer traumatischen Langzeitdenervierungsverletzung ausgesetzt, wobei das gut validierte einseitige Tibianerventransektionsmodell⁴⁶ mit Gastrocnemius-Muskel zu vier seriellen Zeitpunkten über 14 Wochen nach der Denervierung aus der denervaten Extremität und der kontralateralen innervierten Extremität (um als interne Kontrolle zu dienen) entnommen wurde. Wie bereits berichtet wurde, zeigte der denervate Muskel im Laufe der Zeit eine fortschreitende Atrophie (Abbildung 5A,B) mit zunehmender Fibrose und Fettablagerung (Abbildung 5C-F)⁴⁷.

Unser Protokoll erzeugte eine ausreichende Anzahl von Zellen für die durchflusszytometrische Analyse, obwohl 12 und 14 Wochen dichtere Gastrocnemius etwa 0,2-0,3 g (15-20% des jeweiligen kontralateralen Kontrollmuskels) wogen(Abbildung 5B). Wir beobachteten eine Hochregulierung von FAPs im denervatisierten Gastrocnemius-Muskel im Vergleich zum innervierten kontralateralen Kontrollmuskel, der für die 14-wöchige Dauer des Experiments aufrechterhalten wurde (Abbildung 6A,B), konkordiert mit der progressiven Muskelfibrose und Fettablagerung. Die Sca-1-Immunfärbung von histologischen Muskelquerschnitten bestätigte die Lokalisation von Sca-1-exprimierenden Zellen in Bereichen mit fibro-fettiger Veränderung im 14 Wochen lang denervatisierten Muskel (Abbildung 5G), zusätzlich zur Ausgangsexpression im Interstitium zwischen Myofibern in gesunden Muskeln. Eine ausgeprägte Untergruppe von Zellen entstand in der FAPs-Population im Laufe der Zeit nach der Denervierung, die durch einen robusten Anstieg des Sca-1-Signals (Sca-1 hoch; Abbildung 6A, roter Kasten) zur durchflusszytometrischen Analyse im Vergleich zur basalen Sca-1-Expression der FAPs (Sca-1 Med/Low; Abbildung 6A, grüner Kasten). Die Quantifizierung dieser Subpopulationen ergab eine differentielle Dynamik im Laufe der Zeit; Sca-1 Hohe FAPs stiegen signifikant nach 12 und 14 Wochen nach der Denervierung an (Abbildung 6B), die etwa die Hälfte der gesamten FAPs-Population ausmachten (Abbildung 6C). Im Gegensatz dazu waren Sca-1 Med/Low FAPs die dominante Subpopulation nach 2 und 5 Wochen nach der Denervierung (Abbildung 6C) und zeigten nur einen vorübergehenden Anstieg der Spiegel früh nach der Denervierung (Abbildung 6B).

Im Gegensatz zur anhaltenden Anwesenheit von FAPs in langfristigen denervatisierten Muskeln zeigten die Abgeordneten eine erwartete biphasische Reaktion auf Denervierung. Anfangs nahmen die Abgeordneten den denervaten Muskel über den in der Kontrollgliedmaße zu, aber 5 Wochen nach der Denervierung begann die Population zu sinken (Abbildung 6D). Im Einklang mit der bekannten Erschöpfung der Muskelsatellitenzellpopulation im langfristigen denervatisierten Muskel⁴⁷, um 12 Wochen waren die MPs entweder auf oder unter dem Ausgangsniveau nach der Tibialnerventransektion.

Wir analysierten auch die Dynamik der Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ Population (Ergänzende Abbildung 3D-E). Während die Häufigkeit doppelt positiver Zellen im Vergleich zur Lin-Population im Laufe der Zeit im verarmten Muskel progressiv abnahm, wurde bei Bestimmung der absoluten Zellzahl pro Gramm Muskel ein vorübergehender Anstieg der doppelt positiven Population beobachtet, bevor sie 14 Wochen nach der Denervierung auf oder unter das Ausgangsniveau fiel.

Abbildung 1: Grafischer Schaltplan für die Identifizierung, Isolierung und Kultur von FAPs und MPs: Grafischer Schaltplan, der die Identifizierung von FAPs und MPs aus Ratten-Gastrocnemius darstellt. Die Proben werden geerntet und mechanisch zerkleinert, bevor zwei aufeinanderfolgende enzymatische Aufschlüsse durchgeführt werden. Gewebepräparate werden dann verarbeitet und gefiltert, um eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen. Jeder Probe wird ein Cocktail aus fluoreszierend konjugierten Antikörpern zugesetzt, der dann durch ein Durchflusszytometer oder einen Zellsortierer geführt wird, um FAPs bzw. MPs zu identifizieren oder zu isolieren.

Abbildung 2: Sca-1::APC selbstkonjugierte Antikörpervalidierung und Titration. Validierung der Sca-1::APC-Antikörperkonjugation durch Einzelfärbung auf kommerziellen Kompensationsperlen (A) und Einzelzellsuspensionen, die aus einem gesunden Gastrocnemius-Muskel der Ratte erzeugt werden (B). Unterschiedliche Populationen sowohl von Sca-1-markierten Perlen als auch von Zellen sind offensichtlich (Black Boxes). Die Antikörpertitration wurde durchgeführt, indem fünf verschiedene Konzentrationen von Sca-1::APC an Einzelzellsuspensionen (C) getestet wurden. Die optimale Konzentration wurde basierend auf der größten Fluoreszenzintensität mit minimaler Hintergrundfärbung ausgewählt und als chargenabhängig befunden. Eine repräsentative Titration wird mit der chargenspezifischen optimalen Konzentration angezeigt, die durch die rote Box angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Durchflusszytometrie-Identifizierung von FAPs und MPs in Ratten-Gastrocnemius. (A-F) Gating-Strategie für die durchflusszytometrische Analyse von FAPs und MPs. (A) Die Proben werden zunächst zum Ausschluss von Ablagerungen (Black Box) sowie zum Gate zum Zählen von Kügelchen (Red Box) gesperrt. Die Zellen werden dann gatediert, um Dubletten sowohl durch Frontstreuung (FSC) (B) als auch durch Seitenstreuung (SSC)(C) auszuschließen. Die Lebensfähigkeit der resultierenden Einzelzellen wird durch Färbung mit SYTOX Blue (D) beurteilt. SYTOX Blue negative (live) Singulette werden dann auf das FITC-Signal zur Identifizierung von CD31 und CD45 (Lineage; Lin), um Lin+-Fraktionen von der weiteren Analyse auszuschließen (Blackbox-Lin-Zellen) (E). Die Lin-Population wird dann auf Sca-1::APC im Vergleich zu VCAM-1::P E-Signal (F) bewertet. FAPs werden als Lin-/Sca-1+/VCAM-1- (F; red box) identifiziert, während MPs als Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ Events (F; blue box) identifiziert werden. Eine Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ doppelt positive Population ist ebenfalls offensichtlich (oberer rechter Quadrant). (G) FMO (Fluorescence Minus One) Kontrollen für CD31::FITC und CD45::FITC zeigen eine korrekte Kompensation und Gating für Lin-Zellen. (H-I) Sca-1::APC versus VCAM-1::P E-Plots von FMO-Kontrollen zeigen eine angemessene Kompensation und Gating für FAPs (Sca-1 FMO) und MPs (VCAM-1 FMO). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Sortierte FAPs und MPs Zellkultur und Immunfärbung. (A) Co-Immunostaining für PDGFRα (grün) und Pax7 (rot) auf frisch sortierten FAPs (obere Reihe) und MPs (untere Reihe). Kerne färben sich blau mit DAPI. FAPs exprimieren ausschließlich PDGFRα und keine Pax7-positiven Zellen sind offensichtlich, während MPs ausschließlich Pax7 ohne PDGFRα-positive Zellkontamination exprimieren, was die Reinheit beider sortierter Populationen zeigt. (B) FAPs an Tag 12 in adipogenen Differenzierungsmedien (AD) Färbung positiv auf Fibroblasten-spezifisches Protein 1 (FSP-1; grün) und Perilipin-1 (Plin-1; grün), was differenzierte Fibroblasten bzw. Adipozyten zeigt. Kerne werden mit DAPI (blau) gefärbt. Ölrot O (ORO) Färbung (rot) zeigt das Vorhandensein von neutralen Triglyceriden und Lipiden an, die aus reifen Adipozyten am Tag 12 entstehen. FAPs, die fibrogenen Differenzierungsmedien (FD) ausgesetzt sind, zeigen die Expression von FAPs-abgeleitetem Kollagen Typ 1 (Col1a1; grün). FAPs, die entweder in adipogenen oder fibrogenen Medien kultiviert werden, enthalten keinen Co-Immunostain für die schwere Myosinkette (MHC, rot), was auf das Fehlen kontaminierender Myozyten hinweist. (C) MPs, die an Tag 12 in myogenen Differenzierungsmedien (MD) gezüchtet wurden, zeigen eine MHC-positive (rote) Färbung, die das Vorhandensein reifer Myozyten und fusionierter mehrkerniger Myotuben zeigt. Kerne werden mit DAPI (blau) gefärbt. MP-Kulturen waren frei von Fibroblasten- und Adipozytenkontamination, was durch das Fehlen einer Co-Immunfärbung für FSP-1 (grün), Plin-1 (grün) und ORO-Färbung angezeigt wird. MPs, die auf Laminin gezüchtet wurden, um die Co1a1-Immunfärbung aufzunehmen, zeigen bis Tag 12 nicht den gleichen Grad an Myotube-Fusion wie bei Kollagen. Col1a1 (grün) fehlt in MP-Kulturen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5:Atrophie, Fibrose und Fettinfiltration des langfristig denervatisierten Muskels. (A) Repräsentativ geerntete Gastrocnemius-Muskeln zu vier seriellen Zeitpunkten nach der Denervierung. Gastrocnemius bezeichnet als CONTRA ist eine repräsentative kontralaterale Extremitätenprobe von einem zweiwöchigen, denervatisierten Tier. (B) Quantifizierung der Muskelatrophie nach der Denervierung, ausgedrückt als Verhältnis des denervaten (DEN) Gastrocnemius-Nassgewichts zu dem der kontralateralen (CONTRA) Extremität. (C) Picrosirius Red (PSR) gefärbte histologische Querschnitte von Gastrocnemius, die 2 oder 14 Wochen nach der Denervierung geerntet wurden, zeigen eine fortschreitende Fibrose. Muskelflecken gelb, Kollagenflecken rot. (D) Fibrose quantifiziert durch Bestimmung der Fläche des PSR-positiven Gewebes im Verhältnis zur gesamten Gewebefläche. (E) Ölrot O (ORO) gefärbte Querschnitte von Gastrocnemius, die 2- oder 14 Wochen nach der Denervierung geerntet wurden, gegengefärbt mit Hämatoxylin. Lipide färben sich rot. (F) Fettinfiltration quantifiziert durch Bestimmung der Fläche des ORO-gefärbten Gewebes im Verhältnis zur gesamten Gewebefläche. (G) Gastrocnemius histologische Querschnitte, die 2 oder 14 Wochen nach der Denervierung geerntet wurden, immungefärbt für Laminin (grün) und Sca-1 (rot). Laminin färbt die Basallamina, die einzelne Myofiber umgibt, positiv. Sca-1 identifiziert mehrere Vorläuferzelltypen. Kerne werden mit DAPI (blau) gefärbt. Inset zeigt die Lokalisation von Sca-1+ Zellen außerhalb der Basallamina in gesunden Muskeln; gelbe Pfeile bezeichnen das Vorhandensein von Sca-1+ Zellen in fibrotischen Bereichen. (Die Daten sind Mittelwert +/- S.D; n=3 für 2- und 14-Wochen-Zeitpunkte. Daten in Panel B, analysiert durch Einweg-ANOVA, Daten in Panels D und F, analysiert durch Bidirektional-ANOVA. Der Post-hoc-Sidak-Test wurde durchgeführt, um mehrere Vergleiche zu korrigieren. * = P<0,05 zwischen CONTRA und DEN; # = P<0.05 zwischen den Stichproben) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: FAPs und MP Dynamik in langfristigen denervated Ratten Gastrocnemius. (A) Repräsentative Sca-1::APC versus VCAM-1::P E Panels der Lin- (CD31-/CD45-) Population aus Muskelproben, die 2-, 5-, 12- oder 14 Wochen nach der Denervierung geerntet wurden. Die obere Reihe zeigt Diagramme aus dem denervated (DEN) Gastrocnemius, während die untere Reihe diejenigen aus dem kontralateralen, unoperierten (CONTRA) Gastrocnemius zeigt. Lin-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs (Total) sind in Sca-1 High (red box) und Sca-1 Med/Low (green box) Fraktionen unterteilt, während Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ MPs in der blauen Box angezeigt werden. (B) Quantifizierung von FAPs (Total, Sca-1 High, Sca-1 Med/Low) zu jedem Zeitpunkt nach der Denervierung, angegeben als die Häufigkeit (%) der Lin-Zellen (obere Reihe) und die Anzahl der Zellen pro Gramm Muskel (untere Reihe), normalisiert auf die kontralaterale Kontroll gastrocnemius. (C) Relative Anteile der Sca-1 High und Sca-1 Med/Low Subpopulationen an der Gesamtpopulation der FAPs. (D) Quantifizierung der MP zu jedem Zeitpunkt nach der Denervierung, die als Häufigkeit (%) der Lin-Zellen (linke Grafik) und als Anzahl der Zellen pro Gramm Muskel (rechte Grafik) normalisiert auf die kontralaterale Kontrolle angegeben wird. (Die Daten sind Mittelwert +/- S.D.; n=4 für 2- und 12-Wochen-Zeitpunkte; n=5 für 5-Wochen-Zeitpunkte; n=2 für 14-Wochen-Zeitpunkte. Daten, die durch Unidirektional-ANOVA analysiert werden; Post-hoc-Sidak-Test zur Korrektur mehrerer Vergleiche. # = P<0.05.) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Antikörpervalidierung und Titration. Validierung von kommerziell konjugierten Antikörpern CD31::FITC (A-C), CD45::FITC (D-F) und VCAM-1::P E (G-I) auf Kompensationsperlen (A,D,G) und einzelligen Suspensionen aus gesunden Gastrocnemius-Muskeln der Ratte (B,E,H). Jeder Antikörper wurde in 5 verschiedenen Konzentrationen (C,F,I) titriert. Die optimale Konzentration wurde basierend auf der größten Fluoreszenzintensität mit minimaler Hintergrundfärbung (rote Kästchen) ausgewählt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2:Sortierte FAPs und MPs in umgekehrten Differenzierungskulturbedingungen. (A)FAPs, die an Tag 12 in myogenen Differenzierungsmedien (MD) kultiviert wurden und für FSP-1 (grün), Plin-1 (grün) oder Col1a1 (grün) und MHC (rot) co-immunoniert wurden, weisen keine Myozytenkontamination auf. Positive FSP-1- und Col1a1-Färbung zeigen die Differenzierung von FAPs zu Fibroblasten. Die ORO-Färbung (rot) zeigt die Lipidproduktion, obwohl Plin-1-positive Adipozyten nicht ohne weiteres sichtbar sind. Mit DAPI (blau) gefärbte Kerne. B)MdEP, die adipogenen Differenzierungsmedien ausgesetzt waren, starben. MPs, die 12 Tage lang in FAP Growth Media (FAP GM) kultiviert und für FSP-1 (grün) oder Plin-1 (grün) und MHC (rot) co-immunogefärbt wurden, zeigen differenzierte Myozyten und Myotuben ohne FSP-1- oder Plin-1-positive Zellen. Das Fehlen einer ORO-Färbung bestätigt den Mangel an adipogenen Zellen in Kultur. MPs, die in fibrogenen Differenzierungsmedien (FD) gezüchtet und für Col1a1 und MHC co-immungefärbt wurden, zeigen reife Myozyten und das Fehlen von Col1a1-positiven Zellen. MPs, die auf Laminin gezüchtet wurden, um Col1a1-Immunfärbung aufzunehmen, zeigen nach 12 Tagen in Kultur nicht den gleichen Fusionsgrad zu Myotuben wie kollagen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Lin-/Sca-1+/VCAM-1+Zellen sind eine gemischte Population vonFAPs und MPs. (A) PDGFRα und Pax7 Co-Immunfärbung von frisch isolierten Lin-/Sca-1+/VCAM-1+-Zellen zeigen eine gemischte Population von PDGFRα-Einzelpositivzellen (weiße Pfeile) und Pax7-Einzelpositivzellen (gelber Pfeil), die FAPs bzw. MPs identifizieren. (B) Lin-/Sca-1+/VCAM-1+-Kulturen an Tag 12, die in myogenen Differenzierungsmedien (MD) gezüchtet wurden, enthalten sowohl FSP-1 einzeln positive (grün) als auch MHC-einzelpositive (rote) Zellen, die Fibroblasten bzw. Myozyten/Röhrchen identifizieren. Das Fehlen von Plin-1 (grün) und ORO (rot) Färbung weist auf das Fehlen reifer Adipozyten hin. Co-Immunostaining für Col1a1 (grün) und MHC (rot) zeigen reife Myozyten und Fibroblasten. (C) Lin-/Sca-1+/VCAM-1+-Zellen an Tag 12, die in adipogenen Differenzierungsmedien (AD) gezüchtet wurden, zeigen ebenfalls eine Mischung aus FSP-1 (grün) einzelnen positiven und MHC (roten) einzelpositiven Zellen, aber auch mit Plin-1 (grün) einzelnen positiven Zellen und ORO-Färbung, was die Differenzierung von Fibroblasten, Myozyten und Adipozyten bestätigt. Kulturen, die in fibrogenen Differenzierungsmedien (FD) gezüchtet wurden, zeigen reife Myozyten und Col1a1 einzelne positive Zellen (Fibroblasten). (D) Repräsentative Sca-1::APC versus VCAM-1::P E-Panels der Lin- (CD31-/CD45-) Population aus entwurzelten Muskelproben, die 2-, 5-, 12- oder 14 Wochen nach der Denervierung geerntet wurden; Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ Population sind im violetten Kasten angegeben. (E) Quantifizierung von Lin-/Sca-1+/VCAM-1+-Zellen über vier serielle Zeitpunkte nach der Denervierung, berichtet als die Häufigkeit von Lin-Zellen (linke Grafik) und Zellen pro Gramm Muskel (rechte Grafik), normalisiert auf den kontralateralen Gastrocnemius. (Die Daten sind Mittelwert +/- S.D.; n=4 für 2- und 12-Wochen-Zeitpunkte; n=5 für 5-Wochen-Zeitpunkte; n=2 für 14-Wochen-Zeitpunkte. Die Daten wurden mittels Unidirektional-ANOVA analysiert; Post-hoc-Sidak-Test zur Korrektur mehrerer Vergleiche; # = P<0.05.) Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: ITGA7 als Marker myogener Zellen in der Durchflusszytometrie der Skelettmuskulatur von Ratten. Validierung der ITGA7::P E-Cy7-Antikörperkonjugation durch Einzelfärbung auf kommerziellen Kompensationsperlen (A) und Einzelzellsuspensionen, die aus einem gesunden Gastrocnemius-Muskel der Ratte erzeugt werden (B). Populationen sowohl von ITGA7-markierten Kügelchen als auch von Zellen sind offensichtlich (Black Boxes) (C) Die Antikörpertitration wurde durchgeführt, indem fünf verschiedene Konzentrationen an Einzelzellsuspensionen getestet wurden. Rotes Kästchen zeigt ideale Konzentration an. (D) Plots von Fluoreszenz Minus Eins (FMO) Kontrollen zeigen das Fehlen von Fluoreszenz-Spillover über die Antikörperkonjugate, aber die vollständige Färbung von Zellsuspensionen zeigt eine unspezifische Wechselwirkung zwischen Sca-1::APC und ITGA7::P E-Cy7 (grüner Kasten). Gating (E) zur Trennung von Lin-/Sca-1+/ITGA7-Zellen (angebliche "FAPs") und Lin-/Sca-1-/IGTA7+-Zellen (angebliche "MPs"). (F) Die Co-Immunfärbung von FACS-sortierten Zellkulturen 12 Tage nach der Beschichtung mit Perilipin-1 (grün) und MHC (rot) zeigt, dass beide Gruppen von sortierten Zellen überwiegend zu Adipozyten mit wenigen myozyten gereift sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

1. Unbefleckt

2. Lebensfähigkeitskontrolle

3. CD31 + CD45 FMO

4. Sca-1 FMO

5. VCAM-1 FMO

6. CD31 + CD45 Einzelfleck (Perlen)

7. CD31 + CD45 Einzelfärbung (Zellen)

8. Sca-1 Einzelfleck (Perlen)

9. Sca-1 Einzelfärbung (Zellen)

10. VCAM-1 Einzelfleck (Perlen)

11. VCAM-1 Einzelfärbung (Zellen)

Tabelle 1: Durchflusszytometrie-Antikörper-Färbekontrollen. Vollständige Ergänzung der Antikörper-Färbekontrollen. Wenn das Experiment zum ersten Mal durchgeführt wird, sollten einzelne gefärbte Kontrollen sowohl auf Kompensationsperlen als auch auf Einzelzellsuspensionen durchgeführt werden. Für alle nachfolgenden Experimente müssen einzelne gefärbte Kontrollen nur auf Kompensationsperlen ausgeführt werden.

	CD31::FITC (μg)	CD45::FITC (μg)	Sca-1::APC (μg)*	VCAM-1::P E (μg)	SYTOX Blau (μM; Endkonzentration)
Unbefleckte Kontrolle
	--	--	--	--	--
Einfach gefärbte Bedienelemente
SYTOX Blue (Lebensfähigkeitskontrolle)	--	--	--	--	1
CD31 und CD45	0.5	0.25	--	--	1
Sca-1	--	--	0.25	--	1
VCAM-1	--	--	--	0.25	1
Fluoreszenz Minus Eins (FMO)
CD31 und CD45	--	--	0.25	0.25	1
Sca-1	0.5	0.25	--	0.25	1
VCAM-1	0.5	0.25	0.25	--	1
Experimentelle Proben
Voller Fleck	0.5	0.25	0.25	0.25	1

Tabelle 2: Durchflusszytometrie-Antikörper-Färbematrix. Die Antikörpermenge zur Färbung von Versuchs- und Kontrollproben für die Durchflusszytometrie wird angezeigt. Die gesamte Färbung erfolgt in einem Gesamtvolumen von 100 μL Waschpuffer. *Die optimale Menge an selbstkonjugiertem Sca-1::APC-Antikörper kann je nach verwendeter Charge variieren. Alle frisch konjugierten Sca-1::APC-Chargen sollten zunächst validiert werden, indem sowohl Kompensationsperlen als auch Einzelzellsuspensionen einzelfärbt werden.

Ergänzende Datei: Reagenzrezepte. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Ein optimiertes, validiertes FAPs-Isolationsprotokoll für den Rattenmuskel ist für Forscher unerlässlich, die Verletzungsmodelle untersuchen möchten, die bei der Maus aus biologischen oder technischen Gründen nicht durchführbar sind. Zum Beispiel sind Mäuse kein optimales Tiermodell, um chronische lokale oder neurodegenerative Verletzungen wie langfristige Denervierung zu untersuchen. Biologisch machen es die kurze Lebensdauer und die schnelle Alterung von Mäusen schwierig, die Muskelsequenzen aufgrund der Denervierung durch den Störfaktor des Alterns genau abzugrenzen. Aus technischer Sicht wäre die drastisch reduzierte Muskelmasse aufgrund einer schweren Atrophie für eine effektive durchflusszytometrische Analyse nicht ausreichend. Tatsächlich schlagen Maus-FAPs-Isolationsprotokolle vor, gesunde Muskeln zu gruppieren, um die Ausbeute sortierter FAPs besser zu erhöhen²⁹. Während dies die technische Barriere löst, adäquates Muskelgewebe für die Analyse zu erhalten, hindert es die Forscher gleichzeitig daran, FAPs auf muskelspezifischer Ebene zu bewerten. Da spezifische Muskelgruppen beispielsweise in ihrer Fasertypzusammensetzung, dem Grad der Vaskularisierung und den mitochondrialen Zahlen⁴⁷ von Natur aus variieren, verhindert die Kombination mehrerer verschiedener Muskeln für die durchflusszytometrische Analyse eine muskelspezifische FAPs-Charakterisierung. Im Gegensatz dazu zeigen wir, dass sowohl gesunder als auch langfristig denervater, atrophischer und fibrotischer Ratten-Gastrocnemius eine ausreichende Menge an Ausgangsmaterial für eine effektive Durchflusszytometrie liefern. Darüber hinaus kann in gesunden Proben der Muskelüberschuss für mehrere nachgeschaltete Assays weiter unterteilt werden, so dass die Forscher gleichzeitig die zellulären, molekularen und histologischen Merkmale desselben Gewebes analysieren können. Schließlich stehen für Experimente zur Manipulation von FAPs in Verletzungsmodellen mit Therapeutika gut validierte Analysen der körperlichen Funktion und des Ganges bei wachen und aktiven Ratten zur Verfügung^21,22,23,24, die eine serielle Beurteilung der Muskelfunktion ohne die Notwendigkeit einer Beendigung des Tieres ermöglichen.

Ein Haupthindernis bei der Erstellung eines optimierten FAPs-Isolationsprotokolls für die Ratte war die Verfügbarkeit von Antikörpern. Unser ursprünglicher Ansatz zielte darauf ab, das Antikörperpanel und die Gating-Strategieprotokolle zu^kopieren,die in der Maus¹,^{7,8,9,10,11,12,13},^14weitverbreitet sind. Während kommerziell erhältliche, konjugierte, durch die Durchflusszytometrie getestete und validierte Antikörper, die Ratten erkennen, für die Linienmarker CD31 und CD45 verfügbar waren, gab es keine für positive FAPs, die die Marker Sca-1 oder PDGFRα identifizierten, sowie für den negativen Selektionsmarker ITGA7. Unkonjugierte, primäre Antikörper, die für diese Marker spezifisch sind und angeblich in der Durchflusszytometrie wirksam sind, waren verfügbar, aber von den FAPs-Markern Sca-1 und PDGFRα war nur der Sca-1-Antikörper in der veröffentlichten Literatur in der durchflusszytometrischen Analyse von Rattenzellen validiert worden⁴⁸. Wir haben daher Sca-1 als positiven Selektionsmarker für FAPs ausgewählt. Die Aussicht, sekundäre Antikörper zur Abgrenzung von Sca-1- und ITGA7-Markern zu verwenden, war aus mehreren Gründen nicht möglich, vor allem aber, weil die einzigen rattenspezifischen Antikörper für Sca-1 und ITGA7, die für die Durchflusszytometrie validiert wurden, in derselben Wirtsspezies erzeugt wurden. Daher war die verbleibende Option die Selbstkonjugation beider Antikörper unter Verwendung kommerziell erhältlicher Kits.

Der Prozess der Auswahl eines optimalen Kits für die Antikörperkonjugation war umfangreich, da viele Kits vollständig oder teilweise intolerant gegenüber verschiedenen Pufferverdünnungsmitteln (z. B. Glycin, Glycerin, BSA, Natriumazid) sind, die in primären Antikörpern vorhanden sind. Darüber hinaus muss der bereitgestellte Fluorophor mit den Lasern kompatibel sein, die in dem dem Prüfer zur Verfügung stehenden Durchflusszytometer/Zellsortierer ausgestattet sind, und darf nicht mit einer ähnlichen Wellenlänge wie andere Fluorophore emittieren, die zur Identifizierung anderer Zelltypen in der Probe verwendet werden. Das Vorhandensein von Verdünnungskomponenten in den rattenspezifischen PDGFRα-Primärantikörpern, die schlecht mit den Konjugationskits kompatibel waren, war eine zusätzliche Überlegung bei der Wahl von Sca-1 als positiver FAPs-Selektionsmarker in diesem Protokoll. Während diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl Sca-1::APC- als auch ITGA7::P E-Cy7-Konjugationen zur Identifizierung eindeutiger positiv gefärbter Populationen sowohl auf Kompensationsperlen als auch auf Zellen führten, wurde festgestellt, dass erstere früher als vom Hersteller beworben zerfallen. Es wird dringend empfohlen, dass Forscher Sca-1::APC gemäß den Anweisungen des Herstellers unmittelbar vor der ersten Anwendung (z. B. am Tag vor dem Experiment) konjugieren, um ein robustes Signal zu gewährleisten, Experimente entsprechend planen, so dass eine einzelne Charge konjugierter Antikörper innerhalb des Wirksamkeitsfensters des Antikörpers verwendet werden kann, und jede Charge durch Einzelfärbung von Kompensationsperlen und Titrierung auf Einzelzellsuspensionen validieren. Noch wichtiger ist jedoch, dass die kritische Interaktion zwischen Sca-1::APC und ITGA7::P E-Cy7 die genaue Abgrenzung von Populationen von FAPs vs. MPs verhinderte, was den Einsatz einer alternativen Strategie erforderlich machte.

Boscolo Sesillo et al. demonstrierten kürzlich die erfolgreiche durchflusszytometrische Isolierung von Rattenmuskelstammzellen unter Verwendung von VCAM-1 als einzelnem positiven Selektionsmarker³³ in CD31-, CD45- und CD11b-negativen Zellen. Mit VCAM-1 als MP-Selektionsmarker verwendeten wir ein neuartiges Antikörperpanel zur Identifizierung von FAPs (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) und MPs (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) und validierten den Ansatz mit In-vitro-Kultur von FACS-sortierten Zellen aus gesunden Gastrocnemius-Muskeln. Frisch isolierte FAPs und MPs immunontifiziert ausschließlich für ihre jeweiligen alternativen Marker PDGFRα und Pax7. Kultivierte FAPs differenzierten sich in Populationen reifer Fibroblasten und Adipozyten und MPs in reife Myozyten / Myotuben. Es kam zu keiner Kreuzkontamination von FAPs und Abgeordneten innerhalb der Kulturen. Die Immunfärbung histologischer Querschnitte bestätigte die Infiltration von Bereichen des Fibro-Fettabbaus in den denervatierten Muskeln mit Sca-1-positiven Zellen.

Während wir eine durchflusszytometrische Analyse des langfristigen denervatisierten Muskels durchführten, um unser Protokoll in stark atrophischen, fibrotischen und fettinfiltrierten Muskeln zu validieren, beobachteten wir zufällig die Entstehung einer FAPs-Subpopulation mit erhöhtem Sca-1-Signal (bezeichnet als Sca-1 High) im Vergleich zur Sca-1-Ausgangsexpression (bezeichnet als Sca-1 Med/ Low) im Laufe der Zeit. Sca-1 Hohe FAPs stiegen signifikant spät nach der Denervierung (12 Wochen plus), während Sca-1 Med / Low FAPs früh nach 5 Wochen ihren Höhepunkt erreichten, bevor sie wieder auf das Ausgangsniveau zurückgingen. Heterogenität im FAPs-Phänotyp wurde berichtet^10,30. Es wurde gezeigt, dass FAPs mit höherer Sca-1-Expression leichter in Adipozyten differenzieren, und wenn sie einer fibrogenen Stimulation ausgesetzt wurden, erhöhte sich die Expression von Col1a1^30,49. Die hier beobachtete Dynamik der FAPs-Subpopulationen scheint im Einklang mit dem Zeitverlauf der denervationsinduzierten Folgeerscheinungen und der Regenerationsfähigkeit des Muskels zu stehen⁴⁷ und kann somit FAPs-Subpopulationen mit unterschiedlichen zellulären Programmen charakterisieren. Sca-1 Hohe FAPs werden zu späten Zeitpunkten gleichzeitig mit einer Fibro- / Fettinfiltration und einem Rückgang des regenerativen Potenzials hochreguliert, während Sca-1 Med / Low FAPs während des regenerativen Fensters des Muskels hochreguliert werden und zu einer effektiven regenerativen Myogenese beitragen können. Das hier vorgestellte FAPs-Isolationsprotokoll bietet den Forschern die Möglichkeit, diese verschiedenen Populationen für zukünftige Studien zu identifizieren und zu isolieren.

Wir identifizierten eine Population von Zellen, die sowohl für Sca-1 als auch für VCAM-1 positiv färbten (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) und stellten fest, dass diese doppelt positive Population eine Mischung aus FAPs und MPs ist. Malecova und Kollegen berichteten über eine Subpopulation von VCAM-1, die FAPs exprimiert, die in gesunden Muskeln fast fehlen, vorübergehend mit akuter Entzündung erhöht sind, und ihre Persistenz in mdx-Mäusen (Modell der Muskeldystrophie) war mit chronischen Muskelentzündungen und Fibrose assoziiert¹⁰. Im Gegensatz dazu, und obwohl es sich nicht um eine reine FAPs-Population handelt, fanden wir heraus, dass die Lin-/Sca-1+/VCAM-1+-Population mit chronischer Muskelfibrose 12- und 14 Wochen nach der Denervierung auf oder unter das Ausgangsniveau sank. Die Denervierung induziert nicht die gleichen Entzündungsreaktions- und Zyklusregenerationsversuche, die von mdx-Mäusen erlebt werden, was die Unterschiede in unseren Ergebnissen erklären könnte. Unsere Identifizierung von MPs in der Lin-/Sca-1+/ VCAM-1+-Zellpopulation steht im Einklang mit dem Bericht über die Sca-1-Expression bei einem sehr kleinen Anteil von MPs in gesunden Muskeln, mit einem vorübergehenden Anstieg nach einer Verletzung während der Myoblastenproliferation und dem anschließenden Rückzug aus dem Zellzyklus⁴⁵. Während unsere Antikörpermarkierungs- und FACS-Gating-Strategie also erfolgreich reine Populationen von FAPs und MPs für Studien isoliert, können Experimente, die eine auf Durchflusszytometrie basierende Quantifizierung dieser Populationen erfordern, ihre Anzahl aufgrund des geringen Prozentsatzes von Zellen in beiden Vorläuferlinien, die Sca-1 und VCAM-1 koexprimieren, leicht unterschätzen. Unabhängig davon zeigt das aktuelle Protokoll deutlich die klassische biphasische Reaktion der Abgeordneten auf Denervierungsverletzungen mit kurzfristiger Hochregulierung und anschließender Erschöpfung der Bevölkerung in langfristigen denervatisierten Muskeln. In ähnlicher Weise wird der Anstieg der FAPs, der bei isolierten kurzfristigen Denervierungsverletzungen berichtet wurde, hier rekapituliert und gezeigt, dass er unter Verwendung des langfristigen Tibianerventransektionsmodells weiter aufrechterhalten wird.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll den Forschern ein bisher unerforschtes Tier, die Ratte, zur Verfügung stellt, bei dem sie mit durchflusszytometrischen Methoden gleichzeitig FAPs und MPs untersuchen können. Experimente an Mäusen, die durch die Menge der Skelettmuskulatur begrenzt sind, und die häufige Notwendigkeit, terminale Experimente zur Beurteilung der Muskelkraft und -funktion durchzuführen, können leicht bei der größeren Ratte und mit einer breiteren Palette von nicht-tödlichen Kraft- und Funktionsbewertungsmethoden durchgeführt werden. Insgesamt könnten FAPs-Studien an rattenartigen Rollen dieser wichtigen Vorläuferpopulation bei akuten und chronischen Muskel- und peripheren Nerventraumata und -erkrankungen aufdecken und anschließend das Potenzial für die Entwicklung zellspezifischer Therapien erhöhen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	Falcon	352235
10 cm cell culture dishes	Sarstedt	83.3902
12-well cell culture plate	ThermoFisher	130185
12 mm glass coverslips, No.2	VWR	89015-724
10 mL Syringe	Beckton Dickenson	302995
15 mL centrifuge tubes	FroggaBio	91014
20 gauge needle	Beckton Dickenson	305176
25mL Serological pipette	Sarstedt	86.1685.001
40µm cell strainer	Fisher Scientific	22363547
50mL centrifuge tubes	FroggaBio	TB50
AbC Total Antibody Compensation Beads	ThermoFisher	A10497
Ammonium Chloride, Reagent Grade	Bioshop	AMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µg	Biotium	92307
Aquatex Aqueous Mounting Medium	Merck	108562
Biolaminin 411 LN	Biolamina	LN411
Bovine Serum Albumin (BSA)	Bioshop	ALB001
Calcium Chloride	Bioshop	CCL444.500
Collagenase Type II	Gibco	17101015
CountBright Plus Absolute Counting Beads	ThermoFisher	C36995
Dexamethasone	Millipore Sigma	D4902
Dispase	Gibco	17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)	Gibco	11995-065	(+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTA	FisherScientific	S311
FACSClean Solution	Beckton Dickenson	340345
FACSDiva Software	Beckton Dickenson	--
FACSRinse Solution	Beckton Dickenson	340346
Fetal Bovine Serum	Sigma	F1051
Flow Cytometry Sheath Fluid	Beckton Dickenson	342003
FlowJo Software	Beckton Dickenson	--
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody	Invitrogen	A21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody	Invitrogen	A21429
Goat Serum	Gibco	16210-064
Ham's F10 Media	ThermoFisher	11550043	(+) Phenol Red (+) L-Glutamine (-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)	Multicell	311-513-CL
Heat Inactivated Horse Serum	Gibco	26050-088
Hemocytometer	Reichert	N/A
HEPES, minimum 99.5% titration	Sigma	H3375
Horse Serum	ThermoFisher	16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1)	Cell Signaling	8915LF
Humulin R	Lilly	HI0210
IBMX	Millipore Sigma	I5879	Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
Isopropanol	Sigma	I9516	Also known as 2-propanol
Lewis Rat, Female	Charles River Kingston	004 (Strain Code)	200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer	Beckton Dickenson	--
Microcentrifuge	Eppendorf	EP-5417R
MoFlo XDP Cell Sorter	Beckman Coulter	--
Mouse Anti-CD31::FITC Antibody	Abcam	ab33858	Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC Antibody	Biolegend	202205	Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE Antibody	Biolegend	200403	Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	N/A	Also known as MF20
Mouse Anti-Pax7 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %	Sigma	HT501128
Oil Red O	Millipore Sigma	O0625
PE-Cy7 Conjugation Kit	Abcam	ab102903
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)	Gibco	10010-023	(-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent Grade	Bioshop	PBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody	Invitrogen	MA5-32347	FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody	Abcam	ab203254
Rabbit Anti-Laminin Antibody	Sigma	L9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody	Abcam	ab3526
Rabbit Anti-Sca-1 Antibody	Millipore Sigma	AB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody	Abcam	ab260043	Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody	Abcam	ab203491
Recombinant Human FGF-basic	Gibco	PHG0266
Sodium Azide	Sigma	S2002
Triton-X-100	Fisher Scientific	BP151
Troglitazone	Millipore Sigma	T2573
Tween-20	Bioshop	TWN510