Summary
このプロトコルは、ラット骨格筋から線維-異量体形成前駆体(FAPs)および筋原性前駆腫(MP)を単離する方法を概説する。筋肉損傷モデルにおけるラットの利用は、分析のための萎縮性筋肉からの組織の可用性の増加と、自由に動く動物の筋力と歩行を評価するための検証された方法のより大きなレパートリーを提供する。
Abstract
線維-異形成前駆体(FAPs)は、筋形成前駆腫(MP)と共に、筋恒常性、傷害、および修復において重要な役割を果たす骨格筋の中に存在する間質細胞である。FAPsの同定および単離のための現在のプロトコルは、フローサイトメトリー/蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用し、これまでの 生体内機能 を評価する研究はマウスのみで行われてきた。ラットの大きな固有のサイズは、骨格筋傷害モデルにおけるFAPsのより包括的な分析を可能にします, 特に重度の萎縮性筋肉で、または研究者が複数の下流アッセイを行うためにかなりの組織質量を必要とする場合.ラットはさらに、動物の沈下や犠牲を必要としない筋肉機能アッセイの選択肢を増やし、連続評価を可能にすることで罹患率と動物の使用を最小限に抑えます。マウスに最適化されたフローサイトメトリー/FACSプロトコルは、種特異的であり、特に市販の抗体の特性によって制限される。それらはラットまたは非常に線維性の筋肉からFAPsを分離するために最適化されていません。.表面マーカーCD31、CD45、Sca-1、およびVCAM-1の微分発現に依存して、健康なラット骨格筋と両方からのFAPsとMPの同定と分離のためのフローサイトメトリー/FACSプロトコルが開発された。ラット特異的として、フローサイトメトリー検証された一次抗体は厳しく制限され、Sca-1を標的とする抗体の社内コンジュゲーションが行われた。このプロトコルを用いて、Sca-1の結合が成功することが確認され、FACS分離されたFAPsおよびMPの細胞培養および免疫染色によって、FAPsおよびMPのフローサイトメトリック同定が検証された。最後に、新しいFAPsのタイムコースを長期(14週間)ラット脱樹モデルで報告します。この方法は、研究者が新しい動物モデルでFAPsを研究する能力を提供する。
Introduction
線維-異形成前駆細胞(FAPs)は、筋肉恒常性、修復、再生に重要な役割を果たす骨格筋中の常駐多能前駆細胞の集団であり、逆に、筋肉損傷に対する病理学的応答を媒介する。その名の通り、FAPはもともと線維芽細胞および脂肪細胞1に分化する可能性のある前駆体集団として同定され、慢性傷害および疾患における骨格筋の線維脂肪浸潤の主要なメディエーターであると言われた。さらなる研究は、FAPsが骨形成および軟骨形成の追加可能であることを明らかにした2、3、4。したがって、それらは間葉または間質前駆子3、5、6、7、8として文献でより広く公示されている。急性骨格筋損傷において、FAPsは、活性化された筋肉衛星細胞およびそれらの下流筋性前駆細胞(MP)の対応する1、9、10に有利な環境を提供するために一過性増殖することによって再生筋形成を間接的に助ける。正常な再生と並行して、FAPsはアポトーシスを受け、その数値をベースラインレベル1、9、10、11に戻します。対照的に、慢性筋損傷では、FAPはプロアポトーシス信号を上書きし、持続性9、10、11および異常な筋肉修復をもたらす。
IN Vivo研究では、現在までに1、7、9、10、11、12、13、14までのマウス動物モデルを利用した、FAPsが筋肉応答を媒介する細胞および分子機構を評価する。遺伝子組み換えマウスはこれらの分析に使用するための強力なツールですが、動物の小さなサイズは、外傷性脱化などの筋肉萎縮が深遠である長期的な局所的な傷害モデルでの研究のための組織の可用性を制限します。さらに、筋力と身体機能の測定には、ex vivoまたはマウスの終了を必要とするその際の測定、または筋肉収縮性能15、16、17、18、19、20の評価を可能にする手術および/または全身麻酔薬を必要とするインビボ法が必要です。 .ラットでは、十分に検証され、世界的に利用された筋肉機能分析、歩行分析などのより複雑な運動行動(例えば、坐骨機能指数、CatWalk分析)の分析に加えて存在し、目を覚まし、動物21、22、23、24で起こって行われる.これはさらに動物実験における最小の罹患率の原理、および使用される研究動物の数を最適化する。ラットはそれによって、FAPsの調査官に、タンパク質および細胞分析のためのより大きな負傷した筋肉容積の追加の柔軟性および警報動物における筋肉複合体静的および動的機能活性および行動の連続評価を行う能力を提供する。
FAPsは、フローサイトメトリーと蛍光活性化細胞分類(FACS)を使用して、主に全筋サンプルから同定され、単離されています。これらは、サイズ、粒度、および細胞表面または細胞内マーカー25の特異的組み合わせなどの特徴に基づいて複数の特定細胞集団を同定することができるレーザーベースのアッセイである。これは、骨格筋などの器官系の研究において非常に有利であり、恒常性および再生は複雑で多因子的なプロセスであり、多くの細胞タイプによって調整される。精細な研究では、マウス骨格筋1のフローサイトメトリック法を使用して、MPと同様にFAPsを同定した。彼らは、内皮(CD31)、造血薬(CD45)、または筋原性(Integrin-α7[ITGA7])由来の細胞に特異的な表面抗原を欠いていたが、間葉系幹細胞マーカーSca-1(幹細胞抗原1)1および線維化細胞細胞に分化された表面抗原を欠いていたため、FAPsが本質的に間葉系であることを実証した。他の研究は、代替幹細胞マーカーの発現に基づいて筋肉中間葉系前駆細胞の分離に成功したことを示した、血小板由来増殖因子受容体α(PDGFRα)2、7、8およびさらなる分析は、これらは、FAPs3と同じ細胞集団である可能性が高いことを明らかにした。正の選択マーカーとしてSca-1またはPDGFRαのいずれかを使用してフローサイトメトリーで一般的に識別される1,9, 10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 .PDGFRαの使用はヒト組織に対して優先的であるが、マウスSca-1の直接的なヒトホモロゲーとしては、まだ32を同定していない。さらに、他の細胞表面タンパク質は、MP(例えば、VCAM−1)のマーカーとして報告されており、FAPsの分離33の間に筋形成系統の細胞の指標としてITGA7に代わる可能性がある。
フローサイトメトリー/FACSは骨格筋1、9、10、11、13、29におけるFAPsの役割と病原性ポテンシャルを研究するための強力な方法論であるが、それは技術的に必要な試薬の特異性と最適化によって制限される。フローサイトメトリック同定とFAPsの単離はマウス動物モデル1、9、10、11、29で開発され、実施されているため、他のモデル生物の中でのFAPsの研究を希望する研究者にとっては課題となっています。処理対象の最適な組織サイズや、試薬や抗体の特異性や入手可能性など、多くの要因は、使用する種によって異なります。
新しい動物モデルでFAPsを研究するための技術的な障壁に加えて、それらは主に急性の有毒な設定で研究されています - 通常、筋肉内化学注射または心毒を介して。FAPsの長期的なダイナミクスの評価は、主にデュシェンヌの筋ジストロフィーの評価に限定され、mdxマウスモデル9、10、11、および肩筋筋症に対して同時腱管切れと脱用が行われる大規模なローテーターカフ涙などの組み合わせ筋損傷のモデル.慢性外傷性脱児の唯一の侮辱に対するFAPsの反応は、重工業、農業、および出生時外傷(上腕神経叢損傷)34、35、36、37で重大な罹患率を有する職場における事故において一般的に起こり、顕著な罹患率を有する、しばしば短期間の期間11、38に限定される。
ラットの腫性および線維性骨格筋の健康から、また重度の萎縮性および線維性骨格筋から、FAPおよびMPを同定し、単離する方法について述べる。まず、組織消化およびフローサイトメトリー染色プロトコルを用いたCD31-/CD45-/Sca-1-FAおよびCD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+MPの同定が実証され、その後の知見の検証は、FACS分離細胞の培養および免疫細胞化学染色を通じて行われる。この方法を用いて、ラットにおける長期隔離された脱用傷害モデルにおける新規のFA時間コースも報告する。
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Protocol
この議定書を実施する調査官は、地元の動物倫理委員会/ケア委員会の許可を受ける必要があります。すべての動物の仕事は、セントマイケルズ病院ユニティヘルストロント動物ケア委員会(ACC #918)によって承認され、カナダ動物ケア評議会(CCAC)が定めたガイドラインに従って行われました。フローサイトメトリープロトコルの概略を 図1に示します。下流のアプリケーションが FACS とその後の細胞培養である場合、すべてのステップは適切な無菌技術で完了する必要があります。
1. 筋肉の収穫
- 局所の生体および動物倫理委員会のガイドラインに従って適切な麻酔薬と犠牲を使用してラットを麻酔します。このプロトコルは、例として、成人雌ルイスラット(200〜250g)から胃頭筋を収穫する。ラットを2-3%イオブルランを用いて麻酔し、T61の心臓内注射によって屠殺した。
- 動物が犠牲になったら、後肢全体を剃って筋肉の位置を容易にし、収穫された組織の毛皮汚染を最小限に抑えます。
- 無菌メスを使用して、皮膚に2つの切開を行います:足首関節の円周の周りの最初の周りと足首から股関節への後肢の内側の正中線上の2番目。
- 皮膚と表面筋層を剥離して、大腿骨の内側および内側顆に由来し、アキレス腱で挿入する基礎となる胃腸炎を明らかにする。
- 鈍い解剖を使用して胃腸を周囲の組織から分離し、腱でのみ筋肉を取り扱い、クラッシュ傷害を避ける。
- 鋭いはさみでアキレス腱をできるだけ遠位に移すことによって、胃腸を挿入から分離する。切断したら、鉗子でアキレス腱をつかみ、下敷きの骨から胃腸を静かに剥がします。それでも筋肉を片手に鉗子で保持し、胃食道の2つの起源を見つけ、内側と内側の大腿骨顆で切断する。
- できるだけ多くの血液を除去するために、無菌のガーゼに対して優しく切除された胃腸をブロットします。無菌表面の筋肉をトリミングし、余分な結合組織だけでなく、アキレス腱を削除します。
- 重量ボートに筋肉を入れ、精密スケールを使用して重量を量る。このプロトコルは、200〜600 mgの範囲の湿った体重で筋肉を消化するように最適化されています。オペレータは、必要に応じて、他の下流アッセイのために過剰な収穫された組織を細分化することができる。
- さらに、流量サイトメトリーに使用する収穫した筋肉をさらに3~4個(約1〜2cm3)に分け、氷冷1x PBSに沈水します。すべてのサンプルが収穫されるまで氷の上で冷たく保ちます。
2. 筋肉の消化
- PBSから筋肉を取り除き、無菌10cm細胞培養皿に入れます。そっと裂け、そして、部分がおよそ3-4 mm3になるまで鉗子でティッシュを軽く引き裂き、できるだけ多くの結合組織を取り除く。十分にみじん切りにしたら、6 mL DMEM + 1% ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を含む無菌50 mL円錐状チューブに移します。
- コラゲナーゼII溶液(ストック濃度4800 U/mL)の365 μLに300 mMCaCl2溶液の10 μLを加え、コラゲナーゼ酵素を活性化します。活性化コラゲラーゼII溶液を、組織スラリーを含む50 mL円錐管に加えます。最終的なコラゲローゼII濃度は250 U/mLです。
- 37°C、240 x gで1時間シェーカーにチューブをインキュベートし、15分ごとに手動で旋回して、チューブの側面に付着した組織を取り除くようにします。
- 1時間後、シェーカーからチューブを取り出し、サンプルごとに100 μL(4,800 U/mL)と50μLのディスパーゼ(4.8 U/mL)を加えます。
- 溶液が均質になるまで血清学的ピペットを15〜20回使用したピペットサンプル。複数のサンプルを処理する場合は、サンプルのクロスコンタミネーションを避けるために、各サンプルに個別の滅菌ピペットを使用してください。
- 37°Cと240 x gで30分間シェーカーに再びインキュベートします。15分後、サンプルを手で振って、チューブの側面から付着組織を外します。
3. 単一細胞懸濁液の生成
- 10 G針の10 mLシリンジを通してサンプルをゆっくりと剪断し、10サイクルで使用します。
注:1サイクルは、注射器に筋肉溶液を取り込み、チューブに戻す必要があります。過度の泡立ちが細胞死を余しにする可能性が高い39の原因となるため、剪断をゆっくりと完了して気泡を最小限に抑えるようにしてください。 - 40 μmのセルストレーナーを無菌50 mL円錐形チューブに置き、5 mL DMEM + 10% FBS + 1% P/Sを湿潤させます。
- ピペット1 mLのサンプルを細胞ストレーナーを介して一度に。
- 10%FBSと1%P/SでDMEMをストレーナーでピペットして、チューブ内の総容積を25mLにして、細胞ストレーナーを洗浄します。
- サンプル25 mLを15°Cの2つの15 mL円錐形管と遠心分離機に均等に分割し、400 x g で15分間分します。
注:筋肉溶液を2つの15 mL円錐形チューブに分割すると、遠心分離後の細胞回復が1本のチューブと比較して向上します。 - 上清を吸引し、赤血球を除去するために7分間室温で1mL 1x RBCリシスバッファー( 補足ファイルを参照)にペレットを再懸濁します。
- 9 mLの洗浄バッファー(補足ファイルを参照)で体積を10 mLに、スピンチューブを400 x g、15°Cで15分間持ち上げてください。
- 上清を吸引し、1mLの洗浄バッファーに再懸濁してペレットを再結合する。
- 適切な量の細胞を別の1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移し、トリパンブルー染料と混ぜます。ヘモサイトメーターを用いて、光顕微鏡で生細胞を数える。
4. フローサイトメトリーの抗体染色
注:Sca-1抗体は、製造者の指示に従って、フローサイトメトリー/FACS実験の前にAPCに結合する必要があります。コンジュゲートのバッチごとにパフォーマンスを検証する必要があります (図 2)。最終的な結合は-20°Cの20 μLアリコートで貯えることができるし、3週間安定している。完全な活用プロトコルについては、補足ファイルを参照してください。
- フローサイトメトリーの場合、実験サンプルあたり1〜2 x 106 細胞を無菌1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。洗浄バッファーで最大 1 mL のボリュームを持ち、氷の上に置きます。
- 各実験に対して、次の必須コントロールを設定します: i) uns染色および ii) 生存率コントロールは、ライブセルの母集団を正確に選択します。iii) 蛍光マイナス 1 (FMO) CD31-/CD45- 画分、FAPs、および MP の正確なゲートを設定する単一細胞懸濁液の制御;iv)チャネル間の蛍光波波及びを補正する単染色補償ビーズ。
- すべての細胞コントロールについて、アリコート5 x 105 - 1 x 106 細胞を1mLの洗浄バッファー内で1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに入れ、氷の上に置く。
- ビーズコントロールの場合、1.5 mLマイクロ遠心チューブに正補正ビーズ(1滴あたり1.5 x 105ビーズ)を1滴追加します。コントロールの完全な補完は 、表 1に示されています。
注:実験が初めて行われる場合は、単一細胞懸濁液(染色されていない、生存率、単染色補償ビーズおよびFMOコントロールに加えて)に対して各共役抗体に対して単染色制御を実行し、細胞内の陽性染色集団を評価し、補償ビーズで観察された染色を検証します。補償ビーズと単一細胞懸濁液に単染色を行うことで、すべての結合したばかりのSca-1::APC調製を検証します。染色コントロールの完全なリストについては、 表 1 を参照してください。
- 生存率制御を準備するには、細胞の体積の半分を「生存率」チューブから新しい1.5 mLマイクロ遠心分離管に移します。このチューブに「デッド」というラベルを付けます。
- 65°Cで「デッド」チューブを2〜3分間インキュベートして細胞を殺し、氷の上に置きます。2〜3分後、生存率制御チューブに残った生細胞と死んだ細胞を再結合する。この細胞の集団は、補償値(必要に応じて)を設定し、生存性染料のゲートを適切に設定するために使用されます。
- 500 x gで単細胞懸濁液(実験サンプルおよびコントロール)を遠心分離し、4°Cで5分間。
- 上清を吸引し、細胞ペレットを100 μLの洗浄バッファーに再懸濁します。
- 実験試料または対照に応じて、抗体を添加する。抗体の組み合わせと量については、染色マトリックス(表2)を参照してください。
- 各サンプルを軽くフリックして完全な混合を確認し、暗闇の中で氷の上で15分間インキュベートします。補償ビーズの場合は、暗闇の中で室温で15分間インキュベートします。
- 単一細胞懸濁液実験および制御サンプルの場合は、900 μLの洗浄バッファーを追加して、ボリュームを 1 mL まで上げてください。補償ビードコントロールの場合は、900 μLの1x PBSでボリュームを1 mLに上げてください。
- 遠心分離機単細胞懸濁液サンプルは500xg、4°Cで5分間用いた。 遠心分離機補償ビードは300 x g、4°Cで5分間コントロールします。
- すべての単一細胞懸濁液サンプルでは、吸引し、300 μLの洗浄バッファーに上清と再懸濁セルの細胞ペレットを廃棄します。補償ビードコントロールの場合、吸引し、上清を捨て、ペレットを1x PBSの300 μLで再中断し、負の補償ビーズを1滴(〜1.5 x 105)加えます。
- すべての単一細胞懸濁液サンプルを氷の上にアルミニウム箔の下に保管し、フローサイトメトリック取得に進みます。補償ビードコントロールも光から保護する必要がありますが、室温で維持することができます。
注: 実験エンドポイントがフローサイトメトリーによるFAPs識別である場合は、手順5.1.1-5.1.11に従ってください。エンドポイントが培養および染色のために FACS を介して細胞分離である場合は、手順 5.2.1-5.2.9 およびセクション 6-7 に従ってください。
5. フローサイトメトリーと蛍光活性化細胞分類(FACS)
- フローサイトメトリー
注:このプロトコルは、10の異なる色を同時に区別することができる405 nm、488 nm、および640 nmレーザーを装備したベンチトップフローサイトメーターを採用しています。バンドパスフィルタおよびこのプロトコルで使用される関連するフルオロクロムは、450/50(SYTOXブルー)、530/30(FITC)、575/25(PE)、および670/30(APC)です。各検出器の電圧は次のとおりです: FSC 700;SSC 475;フィット360;PE 460;PE-Cy7 600;シトークスブルー360;APC 570。使用前にフローサイトメーターまたは細胞選別機の適切な動作についてトレーニングを受けていることを確認してください。- サイトメーターが使用前に10〜20分間オンにされ、それぞれ30〜45 sの清潔、すすがり、シース液溶液でシース液溶液を順次洗浄してプライミングされていることを確認してください。dH 2 O. dH2O. を使用して、十分な量のシース流体を貯蔵容器に追加して、取得中の適切なサンプルフローを維持します。
- 図 3に示すように、ギャティング戦略を設定して、図 3 に示した、MP と MP を識別します。
注: FAPs と MP は、次の階層的な格子化戦略によって識別されます: i) SSC-A 対 FSC-A (側セル散乱領域対前方細胞散乱領域対別セル対デブリス) ii) FSC-W vs FSC-H (前方細胞散乱) FSCパラメータのダブレットからシングルを識別するための幅と前方セル散乱高さ、iii)SSC-W対SSC-H(サイドセル散乱幅対側セル散乱高さ対SSCパラメータのダブレットからシングルを識別する) iv) SSC-A 対 SYTOX ブルー (ライブとデッドシングルを区別するため)、v) SSC-A 対 CD31/45:::FITC (CD31+ および CD45+ セルをさらなる分析から除外する)、および vi) Sca-1:::APC vs VCAM-1::P E から CD31-/CD45- (リネージ;Lin-)個体数(ISPとMPの識別)。FAP は CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- イベントとして識別され、MP は CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ イベントとして識別されます。 - まず、各単染色補償ビードコントロールを低速でサイトメーターを介して実行し、チャネル間の蛍光波及び蛍光の補償値を生成します。独自の検出器(SCa-1:::APC単染色ビーズのSSC-A対APC)および他のすべての検出器で各制御の蛍光シグナルを比較することによって補償を評価します。適切な検出器には2つの異なる集団(1つは陰性、もう1つは正のシグナル)があり、他のすべての検出器には負の集団のみが存在するはずです。停止ゲートを 10,000 個の補正ビード イベントに設定し、データを記録します。
注:各サンプルの取得の間に、サンプルからサンプルへの汚染を避けるために、10〜20秒間サイトメーターを通してdH2Oを実行するようにしてください。 - 次に、未染色および生存率制御サンプルを処理し、生きた単一細胞に適切にゲートします。停止ゲートを 10,000 個のシングルイベントに設定し、データを記録します。
注:染色されていないサンプルを除き、各単一細胞懸濁液サンプルの取得前に約5分、SYTOXブルー生存性染料(300 μMの作業濃度を1 mMストック溶液から希釈)を各サンプルに加え、軽くフリックして混合(最終濃度1μM)します。 - 次に、残りの単一細胞懸濁液対照試料を取得する。各 FMO 制御を、適切なプロットを使用して、適切な区画を評価します (図 3)。例えば、CD31+CD45 FMOのFITC信号を評価して、CD31/CD45-ゲートが正確であることを確認します。最適な例を図 3Gに示します。プロトコルが初めて実行される場合は、FMO コントロールを取得する前に、セルに対して単一の染色コントロールを実行する必要があります。
- 適切な検出器および他のすべての検出器で、各単染色された細胞サンプルの蛍光シグナルを評価し、適切な補償を検証します。停止ゲートを10,000のライブシングルイベントに設定し、ソフトウェアに記録します。
- すべてのコントロール(単一細胞懸濁液およびビーズ)が処理されたら、まず各サンプルの体積を測定し、記録することによって、すべての実験サンプルを準備します。これらの測定値は、ステップ 5.1.11 で説明されているように、FAPs と MP を正確に定量するために使用されます。その後、50 μLの精密カウントビーズを加え、上下に2〜3回ピペットで軽く混ぜます。
- 最初の実験サンプルを簡単に実行して、カウントビードの個体数の識別を検証します。この母集団は、FSC-AとSSC-Aプロットの一般的な細胞集団とは別の小さな別個のクラスタとして表示されます(図3A、赤色のボックス)。カウントビードの母集団の周囲にゲートを作成します。次に、細胞量計を低速で処理して、実験サンプルごとのデータを取得します。停止ゲートを 10,000 個のカウントビード イベントとレコードに設定します。
注:調査官は、カウントビーズがすべての検出器で蛍光を受けているため、SSC-Aと検出器のいずれかを評価する追加のプロットを設定することで、カウントビーズを別の方法で識別することができます。 - すべてのサンプルが処理されたら、適切なプロトコルを使用してサイトメーターを清掃してください。分析のためにすべてのデータをエクスポートします。
- 適切なフローサイトメトリー解析ソフトウェア上のすべてのデータファイルを開きます。ステップ 5.1.2 で説明されているように、データ取得に使用する格言戦略を設定します。データ取得と同じ順序でコントロールを調べ(例えば、未染色、生存率、単一染色、FMO制御)、ゲージ戦略を再検証する。FMO コントロールを使用して正確なゲートを設定したら、すべての実験サンプルにゲートを適用します。未加工データをスプレッドシートとしてエクスポートして定量化します。
- カウントビードを使用して、各実験サンプルのFAおよびMPの数を計算します。
ここで、取得したセル数は、取得ソフトウェア上の関連する細胞集団(例えば、FAまたはMP)の記録されたイベントの数です。取得されたビーズカウントは、取得ソフトウェア上のビーズをカウントする記録されたイベントの数です。ビーズの体積を数えるステップ 5.1.7 で追加されたカウントビードソリューションの量です。サンプルボリュームは、ビーズを数える前の各染色された実験サンプルの体積です。ビーズ濃度は、μL溶液あたりのビーズの数です。この値は製品データシートにあります。
- FACS - 細胞培養のためのソート
注:このプロトコルは、同時に11-14色を区別することができる4レーザー(UV、バイオレット、ブルー、レッド)を装備したセルソーター上のFACSを実行します。FACS ワークフローを最適化するには、下記の手順 1 ~ 3 を除き、実験サンプル染色 (セクション 4) とフロー サイトメトリー プロトコルに従ってください。- 実験サンプル中の細胞濃度を7 x 106細胞/mLに分類して、FAPsとMPの堅牢な収率を生成します。
- この細胞濃度の有意な増加を考慮して、分類される実験サンプル中の全ての抗体濃度を2倍にする。
- 仕分けの直前に5 mLポリスチレンチューブに取り付けられた40 μMの細胞ストレーナーキャップを通して最終的な染色セルサンプルを処理し、細胞の凝集を減らし、ソート収率を高めます。
- 1 mLの無菌、100%牛血清(FBS)を含む5 mLポリプロピレンコレクションチューブに細胞選別機から直接、単一の生きたラットのFAPsとMPを収集します。並べ替えが完了するまで、細胞を氷の上に置きます。
注: オフサイトの場所で FACS を実行する場合は、氷上および安全な覆われたコンテナーに並べ替えられたセルをすべて転送します。 - 無菌バイオセーフティキャビネット(BSC)で働き、ソートされたFAPs用の適切な成長培地(例えば、FAP成長培地(FAP GM)、ソートされたMP用MP成長培地(MP GM)でソートされた細胞の体積を7 mLまで持ち込み、500xgの補足ファイルを参照し、7分間の遠心分離機を7分間で除去し、可能な限り多くの洗浄バッファーを除去します。
- 適切な成長培地およびプレートの1 mLのペレットを、その後の免疫染色のために無菌、コラーゲンコーティングされた12mmガラスカバースリップ/ウェルを含む12ウェルプレートに再懸濁します(セクション6参照)。
注:コラーゲンの免疫細胞化学染色の場合、プレートは、コラーゲンコーティングの代わりに、無菌、ラミニンコーティングされた12mmガラスカバースリップ/ウェルを含む12ウェルプレートに細胞を選別しました。すぐに単離された前駆物質の免疫細胞化学実験が必要な場合、1cm2当たり15,000細胞の密度で種のFAPsとMPを、ステップ6.1に直接進みます。前駆細胞分化を誘導する長期培養のために、播種のFAPsはcm2あたり5,000細胞の密度で、およびMPはcmあたり7,500細胞/cm2の密度で。 - 細胞培養インキュベーターで37°Cおよび5%CO2で細胞をインキュベートする。培養時間が72時間後、メディアの半分を変更します。2-4 dの後にメディアを完全に変更してください。
- 筋細胞の発達を誘導するために、培養9日目にMP分化(MD)培地にMP培養を切り替える。アディポサイトを誘導するには、培養10日目にファップ培養液をFAPアディポ原性分化(AD)培地に切り替える。
- 線維形成を誘導するために、培養中に可変時間にFAPsを線維化分化(FD)培地に切り替えてもよいし、あるいは、分離後のFD培地に直接播種してもよい(ステップ5.2.6)(すべての培地レシピについては 補足ファイル を参照)。
6. 培養したFAPSとMPの免疫細胞化学
- 細胞の並べ替えを検証し、FAPs および MP カルチャの純度を実証するには、 PDGFRα(FAPsマーカー)、Pax-7(筋幹[衛星]細胞マーカー)、線維芽細胞特異的タンパク質(FSP-1、線維芽細胞マーカー)、ペリリピン-1(プリン-1、脂肪細胞マーカー)、コラーゲンタイプ1(Col1a1、線維症の指標)、ミオスイン重鎖(MHC、成熟ミオックテ)を含む免疫染色剤。
- 選別された細胞の免疫染色では、12ウェルプレートを室温で3分間200 x gで遠心分離し、カバースリップ/ウェルへの細胞の付着を容易にします。このステップは、長期文化には必要ありません。カルチャ メディアを削除します。
- FSP-1による免疫染色の場合、4°Cで2分間1mL100%メタノール(MeOH)を有する細胞を固定します。 PDGFRα、プリン-1、Pax7またはCol1a1に対する免疫染色の場合、室温で1x PBSで1mL4%PFAで細胞培養を15分間固定します。MHC免疫染色は、いずれかの固定性を許容する。
メモ: メタノール固定セルの場合、ステップ 6.2 をスキップして、ステップ 6.3 に進みます。
- 吸引4%PFAを、1x PBSで細胞培養物を3~4回素早く洗浄した。1x PBSに100mMグリシンを1mL加え、室温で10分間インキュベートして残留PFAを不活性化します。吸引し、1x PBSで1〜2回洗浄します。
注:細胞は、1x PBSの2 mLでこの段階で残すことができます, クリングフィルムに包まれ、7-10日間の最大で4°Cで保存. - 洗浄後、1x PBSに0.1%トリトン-Xを1mL加え、20分間インキュベートして細胞膜を透過させます。
- 1-2 mLの1x PBSで2〜3回ウェルを洗浄し、室温で1時間1倍の1x PBS + 3%BSAの1mLで細胞をブロックします。
- ピペット80μLの一次抗体を1x PBS+3%BSA(PDGFRα 1:100、Pax7 neat、FSP-1 1:50、プリン-1 1:400、Col1a1 1:250、MHC 3 μg/mL)に1個のパラフィルムに切り替え、移動容器にテープでつないだ。滅菌微細鉗子を使用して、慎重にウェルからカバースリップを持ち上げ、抗体溶液の滴に反転します。抗体溶液の蒸発を避けるために、2枚の濡れたペーパータオルとカバー容器をプラスチックフィルムにインキュベートします。4°Cで一晩インキュベートする。
注:カバーリップをよく取り出す場合、ウェル内で染色する(最小500 μL)よりも抗体(約80 μL)が少なくなります。 - 2日目には、カバースリップを室温で30分間温めます。鉗子を慎重に使用し、カバースリップをそれぞれのウェル(上を向いている細胞)に戻し、1〜2 mLの1x PBSで2〜3回洗浄し、それぞれ2分間洗浄して、できるだけ多くの一次抗体を除去します。
- 一次抗体染色と同様の染色法を用いて、ヤギ抗ウサギアレクサフルオール488二次抗体(1:400)を有する染色細胞を検出し、FSP-1、プリン-1、Col1a1、またはPDGFRαおよびヤギ抗マウスアレクサFluor555二次抗体(1:300)を検出してMHCまたはPax-7を検出する。室温で細胞を1時間インキュベートし、細胞を光から保護します。
- 細胞をウェルに戻し、室温で2〜4分間、Hoechst(1:10,000)で細胞をインキュベートします。細胞を1x PBSで2〜3回それぞれ2分間洗浄し、余分なHoechstを除去します。
- アンチフェード蛍光実装媒体を使用してガラススライドにカバースリップを取り付け、スライドを室温で暗闇の中で一晩乾燥させます。暗闇の中で4°Cでカバースリップを取り付けました。
7. オイルレッドO(ORO)培養されたFAPsとMPの染色
- 細胞膜の透過化は非異形成細胞タイプの非特異的/望ましくない染色をもたらす可能性があるとして、非透過細胞に対してORO染色を行う。染色を行う前に、ORO作業ストックを準備し(レシピについては 補足ファイルを参照)、室温で20分間インキュベートします。
- 20分後、0.2 μmフィルターを使用して溶液をフィルターし、未溶解の凝集を除去します。
- よくから培地を吸引し、10%中性緩衝ホルマリン(10%NBF)の1 mLを加える。室温で5分間インキュベートします。
注:細胞の合流は井戸/カバースリップから持ち上がる可能性がある。ソリューションを吸引/追加する場合は注意してください。 - 吸引し、1mLの新鮮な10%NBFを加え、室温で少なくとも1時間インキュベートします。
注: セルは一晩で 10% NBF に残すことができるので、プロトコルはこの時点で停止することができます。 - 60%イソプロパノールの1 mLで1mLでウェルを1回素早く洗い、吸引し、井戸を完全に乾燥させます(約2分)。
- 井戸あたり400 μLオイルレッドO作業ストックを追加し、室温で10分間インキュベートし、プレートの壁にOROをピペット化しないようにします。
- オイルレッドOをすべて取り外し、dH2Oで4回素早く洗浄します。
注: 染色されたウェルにカバースリップが含まれている場合は、ステップ 6.9 で説明したのと同じ手法を使用してマウントします。 - 画像は、明視野顕微鏡を使用してカバースリップまたは染色されたいずれかの方法を示します。
8. 逆側および脱税ラット胃腸切片の組織染色
-
ピクロシリウスレッド (PSR)
- 5μm厚のホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)ラット胃腸組織学的切片にPSR染色を行う40.
-
オイルレッドO(オロ)
- 5μm厚のイソペンタン凍結ラット胃腸組織切片を4%PFAに10分間固定し、60%イソプロピルアルコール中で1分間インキュベートする。
- ORO作業ストックで12分間ステイン。60%イソプロピルアルコールで1分間インキュベートし、水溶性の取り付け媒体を使用してカバースリップに10分間洗浄します。
-
Sca-1およびラミニン組織蛍光免疫組織化学(IHC)
- 5μm厚のイソペンタン冷凍ラット胃腸組織学的切片に蛍光IHCを行います。
- 1x PBSで5分間のサンプルを水和し、4%PFAに10分間固定し、90分間組織IFブロッキング溶液中のサンプルをインキュベートします( 補足ファイルを参照)。
- 抗Sca-1一次抗体(1:500)を1x PBS+0.05%トウィーンで一晩4°Cでインキュベートする。
- 2日目には、1x PBS + 0.05% Tweenでそれぞれ5分間3回洗浄し、ヤギの抗ウサギアレクサフルオール555(1:500)で1時間インキュベートします。
- 再度(前と同様に)洗浄し、ブロッキング溶液を1時間インキュベートし、1x PBS+ 0.05%Tweenで1時間希釈した抗ラミニン一次抗体(1:500)を加えます。
- (以前と同様に)もう一度洗い、ヤギの抗ウサギアレクサフルーオール488(1:500)で1時間(ラミニン)インキュベートします。
- もう一度(以前と同様に)洗い、DAPI(1:10,000)で4分間インキュベートします。アンチフェードマウントメディアを使用してカバーリップに洗浄して取り付けます。
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Representative Results
Sca-1およびVCAM-1を含む新規抗体パネルを用いたフローサイトメトリーによるFAおよびMPの同定
ラット筋のFAPsを同定するためのゲーティング戦略は、マウス29のフローサイトメトリープロトコルに基づいており、CD31(内皮)およびCD45(造血)陽性細胞(系統[Lin]と呼ばれます)のゲートであり、リンジ陰性(Lin-陰性)からのFAPsマーカーSca-1およびMP MarkerGA7の蛍光プロファイルを調べる。市販のフルオロフォア結合、およびラットSca-1およびITGA7に対するフローサイトメトリー検証抗体がない場合、ラットSca-1::APC抗体を自己結合し、MPを同定するための代替戦略を実施しました。VCAM-1は、最近、ラットMP33 およびラット特異的な、共役した、フローサイトメトリー検証抗体を標的とするVCAM-1の単一の選択マーカーであることが示されたように、ITGA7とは対照的に、VCAM-1を利用してMPを同定した。
我々は、健康ラット胃腸から発生した報酬ビーズおよび細胞懸濁液の単染色を伴うSca-1:APC抗体の正常な結合および性能を確認した(図2A、B)。Sca-1::APC(図2C)の5点滴定は、プロトコル(補足図1)で使用される他のすべての抗体(CD31::FITC、CD45:::FITC、VCAM-1:PE)に加えて行われ、最適な濃度を特定しました。この新しいパネルデザインを使用して、健康な胃食道(図3)から同時に同定されたPSとMPを同定し、Sca-1(Lin-/Sca-1+/VCAM-1-)の細胞は単一陽性であり、VCAM-1(Lin-/Sca-1-/VCAM-1+)の細胞は単一陽性(赤いボックス)に指定された(Lin-/Sca-1-/VCAM-1+)が指定された。また、Sca-1およびVCAM-1(Lin-/Sca-1+/VCAM-1+)の細胞の2倍の陽性の集団を同定しました(図3F;右上象限)。
FACSおよび細胞培養による、FAPSとMPの同定の検証
ラット骨格筋におけるFAPsおよびMPのフローサイトメトリック同定に関するプロトコルを検証するために、我々は、培養用の生細胞を インビトロで単離することを求めた。FACSを使用して、実行可能なFAおよびMPを、フローサイトメトリック分析と同じ格子戦略を使用して単離した。230gラットから1回の胃腸筋から約20,000-40,000個のFAPと30,000-50,000 MPを細胞培養のために収集した。
各集団の純度を確認するために、PDGFRαおよびPax7の新たに選別されたFAおよびMPを共免疫化した。PDGFRαは、第2間葉前駆体マーカーであり、Sca-1以外に、一般的にFA2、7、8を同定するために使用される。Pax-7は、筋衛星(stem)細胞41のよく知られ、広く使用されているマーカーである。PAX7陽性細胞による汚染のないPDGFRαの並べ替えされた集団は、陽性細胞(図4A;上列)に陽性染色を示した。逆に、PDGFRα陽性細胞の不在でPax7の並べ替えられた集団は陽性に染色された(図4A;下行)、Lin-/Sca-1+/VCAM-1-およびLin-Sca-1-/VCAM-1+細胞表面抗原プロファイルがそれぞれFAPおよびMPの純粋な集団を単離する能力を検証した。
次に、10~12日間の経時に、色素、線維原性、および筋原性分化を誘導する条件で、並べ替えられたFAPとMPを培養しました。12日目までに、脂肪形成状態に供したFAPs培養物には、線維芽細胞様形態または脂肪滴を有する白い前脂肪細胞と同様の多形形態の細胞が含まれていた(データは示されていない)。線維芽細胞特異的タンパク質-1(FSP-1)に対する免疫染色は、繊維芽細胞分化を確認し、プリイン-1(ペリリピン-1;脂肪細胞マーカー)42及びオイルレッドOの染色中に、脂肪細胞の分化と中性トリグリセリドおよび脂質の存在をそれぞれ確認した(図4B)。FAPs培養における筋原性系統からの汚染細胞の存在は、分化した筋細胞のマーカーであるミオシン重鎖(MHC)に対する共免疫染色によって確認された。線維化分化(FD)を行ったFAPs培養物は、コラーゲン型1(Col1a1)発現について評価した、主なFAPs由来コラーゲン8の1つである。11日目のCol1a1とMHCの共同免疫染色は、MHC陽性細胞を汚染しない強いコラーゲンタイプ1発現を明らかにした(図4B)。FAPs集団の純度の最終確認は、汚染されたMPの成長を促すために、筋形成培地でのFAPsの培養によって行われた。MHC陽性細胞は認められなかった(補助図2A)。
筋原性の条件を受けたMP培養物は、MHC発現成熟筋細胞および多核筋管を12日後めの12日目に実証した(図4C)。FSP-1とのMP培養物の共免疫染色、およびPlin-1は、それぞれ、線維芽細胞または有数細胞を汚染することの欠如を実証した。同様に、ORO染色は脂質汚染を実証しなかった(図4C)。線維芽細胞によって高発現されるCol1a1は、筋原性前駆体および筋芽細胞によってより少ない程度に産生されることも報告されているが、この点に関して文献には8、43、44に関する矛盾したデータがある。Col1a1とMHCとのMPの共同免疫染色は、私たちのMP培養の筋細胞分化を明らかにしたが、Col1a1免疫陽性の証拠は見つからなかった(図4C)。さらに、集団の純度を確認するために、MP培養物は、有数体細胞および線維芽細胞の増殖を促す、有数化または線維形成状態を行った(補助図2B)。FAPs系統からの汚染細胞は認められなかった。
ラットの筋肉からFAPsとMPの純粋な集団を識別して並べ替える能力を実証しましたが、次にLin-/Sca-1+/VCAM-1+(二重陽性)細胞の同一性を決定しようとしました。Sca-1発現は健康筋45の非常に小さな割合(約3%)で報告されており、同様に少数のFA(約4%)が健康筋10でVCAM-1を発現すると報告されているので、並べ替えたばかりのLin-Sca-1+/VCAM-1+細胞の免疫染色は、それらを培養するとともにPDGFRαおよびPax7に対して行われました。 筋形成、脂質形成および線維形成をそれぞれ誘導する線維形成状態。二重陽性細胞は、MPとFAPsの混合集団であり、PDGFRαまたはPax7(補足図3A)および成熟した筋細胞、椎細胞または線維芽細胞に分化する培養細胞(補足図3A)に対して陽性の免疫染色を行った新しい細胞を有することが判明した(補足図3B,C)。
フローサイトメトリックの FAP 識別中に MP を識別する ITGA7 vs VCAM-1
それぞれSca-1とVCAM-1を使用したラットのFAPsとMPのフローサイトメトリック同定のプロトコルが確立された一方で、マウスで標準であるように、自己共役ITGA7抗体をVCAM-1の代わりにMPを同定するために同様に使用できるかどうかを判断しようとしました。ラット特異的ITGA7抗体をPE-Cy7に結合させ( 補足ファイルを参照)、ラット胃腸管炎から発生した商業的補償ビーズおよび単一細胞懸濁液に対する抗体の性能を検証した(補足図 4A-C)。ITGA7::P E-Cy7抗体は、単染色およびFMO実験で十分に行われた(補足図 4D)。しかし、CD31::FITC、CD45::FITC、Sca-1::APC、およびITGA7::P E-Cy7で完全染色胃細胞懸濁液を染色すると、Sca-1:::APCとITGA7::P E-Cy-7抗体の間で相互作用が明らかになりました。FACSのその後の培養は、Lin-sca-1+/ITGA7細胞(疑い付きのFAPs)およびLin-Sca-1-/IGTA7+細胞(補足図 4E)が主にFAPsを生み出し、少数のMP(補足図 4F)を含む、Sca-1::APCとITGA7 :P:APC-7特異的な細胞特異的同定の間の相互作用を示す。
長期的な脱熱骨格筋における新しいFAPsタイムコース
FAPsのダイナミクスは、短期的な外傷性脱用の文脈で評価されているように、マウスモデル11、38では、健康で重度の萎縮性、線維性筋の両方からFAPs分離のための方法の性能を検証しようとしました。ラットは、十分に検証された一方的な脛骨神経切除モデル46を使用して外傷性長期脱樹傷害を受け、消化管四肢および反側内肢からの脱化後14週間にわたって4つの連続した時点で収穫された胃内欠筋と、逆側の内在肢を用いた(内部制御として機能する)。既に報告されているように、デネルバテドマッスルは、進行性萎縮を示した(図5A、B)、線維化および脂肪沈着の増加を伴う(図5C-F)時間47に及ぶ。
我々のプロトコルは、12および14週のデンネル化胃腸炎が約0.2-0.3 g(それぞれの対側制御筋肉の15〜20%)であったにもかかわらず、フローサイトメトリック分析のために十分な数の細胞を生成した(図5B)。我々は、内臓性対側対照筋と比較して、内臓胃頭筋におけるFAPのアップレギュレーションを観察し、実験の14週間の持続期間(図6A、B)、進行性筋線維症および脂肪沈着と一致した。筋組織学的断面のSca-1免疫染色は、健康筋における筋線維間におけるベースライン発現に加えて、14週筋電化筋肉(図5G)における線維脂肪変化の領域に対するSca-1発現細胞の局在化を確認した。Sca-1 シグナルの強い増加によって特徴付けられる経時脱変の間に FAPs 集団に細胞の明確なサブセットが出現した (Sca-1 高;図6A、赤いボックス)フローサイトメトリック分析で、FAPsの基底Sca-1式(Sca-1 Med/Low)と比較した。図6A、緑のボックス)。これらの亜集団の定量化は、時間の経過とともに微分動を明らかにした。Sca-1 高い FAP は、12 週および 14 週の脱毛後(図 6B)で有意に増加し、総 FAPS のおよそ半分を含む (図 6C)。対照的に、Sca-1 Med/Low FAPsは、2週および5週間の脱毛後(図6C)で優勢な亜集団であり、脱毛後のレベルの一時的な増加のみを示した(図6B)。
長期的な脱ネル化筋におけるFAPの持続的存在とは対照的に、MPは脱ネルに対する予想される二相応答を実証した。当初、MPはコントロール四肢に見られる以上のデンエル化筋で増加したが、脱変後5週間で人口が減少し始めた(図6D)。長期脱熱筋47における筋肉衛星細胞集団のよく知られた疲労に合わせて、12週までにMPは脛骨神経切除後のベースラインレベルまたはベースラインレベル以下であった。
また、Lin-/Sca-1+/VCAM-1+個の母集団のダイナミクスを分析しました(補助図 3D-E)。リン-集団に対する二重陽性細胞の頻度は時間の経過とともにデンバー化された筋肉で徐々に減少したが、絶対細胞数が筋肉のグラム当たりに決定された場合、二重陽性集団の一時的な増加が観察された。
図1: MP と MP の識別、分離、および文化のグラフィカルな概略図: ラット胃腸からの MP と MP の識別を示すグラフィカルな概略図サンプルは、2つの逐次酵素消化を受ける前に収穫され、機械的にみじん切りにされる。次いで、組織製剤を処理し、単一の細胞懸濁液を生成するために濾過する。蛍光結合抗体のカクテルを各サンプルに追加し、フローサイトメーターまたは細胞選別機を介してそれぞれMPとMPを識別または分離 します。
図2:Sca-1::APC自己共役抗体の検証と滴定 Sca-1::APC抗体結合の検査は、商業的補償ビーズ(A)および健康ラット胃腸筋(B)から発生する単一細胞懸濁液に単染色による。Sca-1標識ビーズとセルの両方の明確な集団が明らかである(ブラックボックス)。抗体滴定は、Sca-1:APCの5つの異なる濃度を単一細胞懸濁液(C)で試験することによって行われた。最適濃度は、最小限のバックグラウンド染色で最大蛍光強度に基づいて選択され、バッチ依存であることが判明した。代表的な滴定は、赤いボックスで示されるバッチ固有の最適濃度で示される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ラット胃腸管炎におけるPPsとMPのフローサイトメトリー同定(A-F)FAPsとMPのフローサイトメトリック分析のためのゲーティング戦略(A)サンプルは、まず破片(ブラックボックス)を除外し、ビーズ(赤いボックス)をカウントするためのゲートにゲートされています。次に、セルは、フロントスキャッタ(FSC)(B)およびサイドスキャッタ(SSC)特性(C)の両方によって二重化を除外するためにゲートされます。得られた単一細胞の生存率は、SYTOXブルー(D)による染色によって評価される。SYTOXブルーネガティブ(ライブ)シングルは、CD31およびCD45(リネージュ;リネージュ;)を識別するFITC信号について評価される。Lin)は、Lin+画分をさらなる分析から除外するため(ブラックボックスのLin-cells)(E)。Lin-母集団は、Sca-1:::APC 対 VCAM-1::P E シグナル (F) について評価されます。MP は Lin-/Sca-1+/VCAM-1- (F; 赤いボックス) として識別され、MP は Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ イベント (F; ブルー ボックス) として識別されます。Lin-/Sca-1+/VCAM-1+倍正母集団も明らかである(右上の象限)。(G)CD31:::FITC および CD45::FITC の FMO (蛍光マイナス 1) コントロールは、リン細胞に対する適切な補正と適合性を示す。(H-I)Sca-1::APC 対 VCAM-1::P FMO 制御のプロットは、FAPs(Sca-1 FMO)および MP(VCAM-1 FMO)に対する適切な補償と格子を示しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:並べ替えられたFAPsおよびMP細胞培養および免疫染色 (A) PDGFRα (緑色) と Pax7 (赤) の、新たにソートされた FAPs (上段) と MP (下段) の共同免疫染色。核染色ブルーとDAPI。PPはPDGFRαとPax7陽性細胞を単独で発現させることは明らかであり、MPはPDGFRα陽性細胞汚染のないPax7を独占的に発現し、両方の選別された集団の純度を示す。(B) 12日目の脂肪芽細胞分化培地(AD)の染色陽性の線維芽細胞特異的タンパク質1(FSP-1;緑)およびペリリピン-1(Plin-1;green)をそれぞれ、分化線維芽細胞および脂肪細胞をそれぞれ実証する。核はDAPI(青)で染色されます。オイルレッドO(ORO)染色(赤)は、12日目までに成熟脂肪細胞から生じる中性トリグリセリドおよび脂質の存在を示す。線維形成性分化培地(FD)を施したFAPsは、FAPs由来コラーゲン型1(Col1a1;緑色)の発現を示す。腺系または線維性のいずれの培地で培養されたFAPsは、ミオシン重鎖(MHC、赤色)に対する共免疫染色剤を有せず、ミオサイトを汚染していないことを示す。(C) 12日目に筋形成分化培地(MD)で成長したMPは、成熟した筋細胞と融合した多核筋管の存在を示すMHC陽性(赤)染色を表示する。核はDAPI(青)で染色されます。MP培養物は、FSP-1(緑色)、プリン-1(緑色)およびORO染色に対する共免疫染色の欠如によって示されるように線維芽細胞およびアディポサイト汚染を明らかにした。Co1a1免疫染色に対応するためにラミニン上で成長させたMPは、コラーゲンに発生する12日目までに同程度の筋管融合を示さない。Col1a1(緑)はMP文化から欠けています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:長期脱熱筋の萎縮、線維症、脂肪浸潤(A)代表は、脱化後4つの連続したタイムポイントで胃頭筋を収穫した。胃腸はCONTRAと表記され、2週間の脱退動物からの代表的な対側肢サンプルである。(B) 脱化後筋脱化後の筋萎縮の定量化は、逆側(CONTRA)肢のそれとの内性(DEN)胃腸の湿重量の比率として表される。(C)ピクロシリウスレッド(PSR)は、2または14週後に収穫した胃頭間症の組織学的断面を染色し、進行性線維症を示す。筋肉の汚れは黄色、コラーゲンは赤に染み付きます。(D)線維症は、全組織面積に対してPSR陽性組織の面積を決定することによって定量化される。(E)オイルレッドO(ORO)は、ヘマトキシリンで反染色された2週間または14週後に収穫された胃頭腸の断面を染色した。脂質は赤く染まります。(F)全組織面積に対してORO染色組織の面積を決定することによって定量化された脂肪の浸潤。(G)胃内膜組織学的断面は、2週または14週後に脱毛後、ラミニン(緑色)およびSca-1(赤)に対して免疫染色された。ラミニンは、個々のミオファイバーを取り囲む基底層層を積極的に染色します。Sca-1は複数の前駆細胞タイプを識別する。核はDAPI(青)で染色されます。インセットは、健康な筋肉の基底層層外のSca-1+細胞の局在を示しています。黄色の矢印は、線維領域内のSca-1+細胞の存在を示す。(データは平均 +/- S.D; n =3 (2 週間および 14 週のタイムポイント) です。一方向の分散分析によって分析されたパネルB内のデータ、パネルDおよびFのデータは、双方向のANOVAによって分析される。ポストホックシダックのテストは、複数の比較を修正するために実行されました。* = コントラとデンの間の P<0.05;# = P<0.05 サンプル間)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:長期脱熱ラット胃腸におけるFAPとMPのダイナミクス (A) 代表 Sca-1::APC 対 VCAM-1::P E リンのパネル -(CD31-/CD45-) 筋のサンプルから 2-, 5-, 12-, または 14 週後の脱毛後に収穫された筋肉のサンプルから.上の行は脱電(DEN)胃腸からのプロットを示し、下の行は反側、未操作(CONTRA)胃腸からのプロットを示しています。Lin-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs(合計)はSca-1ハイ(赤いボックス)とSca-1メド/ロー(緑のボックス)の分数に細分され、Lin-/Sca-1-/VCAM-1+MPは青いボックスに表示されます。(B)各時点から脱毛後の各時点におけるFAPs(Total,Sca-1 High,Sca-1 Med/Low)の定量化は、リン細胞の頻度(上列)およびグラム筋あたりの細胞数(下列)が逆側制御胃塞流に正規化された頻度(%)として報告される。(C) 総FAPsのSca-1高およびSca-1メド/低個母集団の相対的比率。(D)リン細胞の周波数(左グラフ)と1グラム筋当たりの細胞数(右グラフ)として報告された各時点の経時脱用時のMPの定量化は、対照的に正規化された。(データは平均 +/- S.D; n =4 は 2 週間のタイム ポイントと 12 週のタイム ポイント、n=5 は 5 週間のタイム ポイント、n=2 は 14 週のタイムポイントです。一方向の分散分析によって分析されたデータ。複数の比較を修正するためのポストホックシダックのテスト。# = P<0.05. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1: 抗体の検証と滴定 CD31:::FITC(A-C)、CD45::FITC(D-F)、VCAM-1::P E(G-I)の補償ビーズ(A,D,G)および健康ラット胃腸筋(B,E,H)からの単細胞懸濁液に対する商業的共役抗体の検証。各抗体は、5つの異なる濃度(C,F,I)で滴定した。最適濃度は、最小限のバックグラウンド染色(赤いボックス)で最大蛍光強度に基づいて選択されました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補助図2: 逆分化培養条件での並べ替えのFAおよびMP(A)FSP-1(緑色)、プリン-1(緑)またはCol1a1(緑色)およびMHC(赤)に対する12日目の筋形成分化培地(MD)で培養されたFAPsは、筋細胞汚染を示さない。陽性FSP-1、およびCol1a1染色は、線維芽細胞に対するFAP分化を明らかにする。O染色(赤)は、Plin-1陽性脂肪細胞が容易に見えないが脂質産生を明らかにする。DAPIで染色された核(青色)。(B) 薄方性分化培地を受けた MP が死亡した。FAP成長培地(FAP GM)で12日間培養されたMPは、FSP-1(緑色)またはプリン-1(緑色)およびMHC(赤)に対して共免疫染色され、FSP-1またはプリン1陽性細胞を有しない分化された筋細胞およびミオチューブを示す。ORO染色の欠如は、培養中の有数化細胞の欠如をさらに確認する。Col1a1およびMHCに対して増殖した免疫反応培地(FD)および共免疫化されたMPは、成熟した筋細胞およびCol1a1陽性細胞の存在を示す。Col1a1免疫染色を収容するためにラミニン上で成長させたMPは、コラーゲンに発生するのと同じ程度の培養でミオチューブに対して同程度の融合を示さない。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:Lin-/Sca-1+/VCAM-1+細胞は、FAPとMPの混合集団である。(A)単離したばかりの Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ 細胞の PDGFRα と Pax7 の共同免疫染色は、それぞれ、PDGFRα 単一陽性 (白矢印) と Pax7 単一陽性 (黄色矢印) 細胞の混合集団を示す。(B) 筋原性分化培地(MD)で増殖した12日目のLin-/Sca-1+/VCAM-1+培養物は、それぞれ線維芽細胞および筋細胞/チューブを同定するFSP-1単一陽性(緑色)およびMHC単一陽性(赤)細胞の両方を含む。Plin-1(緑色)とORO(赤)染色の欠如は、成熟したアディポサイトの不在を示す。Col1a1(緑色)およびMHC(赤色)の共同免疫染色は、成熟した筋細胞および線維芽細胞を示す。(C)腺異分化培地(AD)で増殖した12日目のLin-/Sca-1+/VCAM-1+細胞は、同様にFSP-1(緑色)単一陽性細胞とMHC(赤)単一陽性細胞の混合を示すが、Plin-1(緑色)単一陽性細胞およびORO染色が存在し、線維芽細胞、筋細胞およびaapocycyの分化を確認する。線維原性分化培地(FD)で増殖した培養物は、成熟した筋細胞およびCol1a1単一陽性細胞(線維芽細胞)を示す。(D) 代表 Sca-1::APC 対 VCAM-1::P E Lin-(CD31-/CD45-) デン化筋サンプルからの人口 2-、5-、12-、または14週間の脱毛後の 14 週間の収穫されたLin-/Sca-1+/VCAM-1+の人口は紫色の箱に示されています。(E)リン細胞の定量化は、脱化後の4つの連続したタイムポイントにわたって、Lin-細胞(左グラフ)および1グラム筋あたりの細胞数(右グラフ)が対側胃内膜に正規化されたと報告される。(データは平均 +/- S.D; n =4 は 2 週間のタイム ポイントと 12 週のタイム ポイント、n=5 は 5 週間のタイム ポイント、n=2 は 14 週のタイムポイントです。データは一方向の分散分析によって分析された。複数の比較を修正するためのポストホックシダックのテスト。# = P<0.05.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補助図4:ラット骨格筋のフローサイトメトリーにおける筋細胞細胞のマーカーとしてのITGA7。 ITGA7の検証::P E-Cy7抗体結合法は、商業的補償ビーズ(A)および健康ラット胃腸筋(B)から発生する単一細胞懸濁液に単染色することにより行われる。ITGA7標識ビーズおよび細胞の両方の集団が明らか(ブラックボックス)(C)抗体滴定は、単一細胞懸濁液に対する5つの異なる濃度を試験することによって行った。赤いボックスは理想的な濃度を示します。(D)蛍光マイナス1(FMO)コントロールのプロットは、抗体コンジュゲート全体にわたる蛍光波波及び蛍光の欠如を示すが、細胞懸濁液の完全な染色は、Sca-1:::APCとITGA7::P E-Cy7(緑のボックス)の間の非特異的な相互作用を明らかにする。ゲーティング (E) Lin-/Sca-1+/ITGA7-細胞(「FAPs」と称される)と Lin-Sca-1-/IGTA7+ 細胞(「MP」と称される) を分離する。(F)ペリリピン-1(緑色)およびMHC(赤色)とめっき後12日目におけるFACS並べ替え細胞培養の共同免疫染色は、ほとんど筋細胞が存在しない脂肪細胞に主に成熟した細胞の両方の群を示す。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
| 1. 汚れない |
| 2. 生存率制御 |
| 3. CD31 + CD45 FMO |
| 4. スカ-1 FMO |
| 5. VCAM-1 FMO |
| 6. CD31 + CD45 シングルステイン (ビーズ) |
| 7. CD31 + CD45 単染色(セル) |
| 8. スカ-1 シングルステイン(ビーズ) |
| 9. スカ-1 単染色 (セル) |
| 10. VCAM-1 シングルステイン(ビーズ) |
| 11. VCAM-1 単染色(細胞) |
表1:フローサイトメトリー抗体染色制御 抗体染色制御の完全な補体。実験が初めて実行される場合は、報酬ビーズと単一細胞懸濁液の両方で、単一の染色されたコントロールを実行する必要があります。以降のすべての実験では、単一の染色されたコントロールを補正ビードで実行するだけで済みます。
| CD31::フィット(μg) | CD45::フィット(μg) | スカ-1::APC(μg)* | VCAM-1::P E (μg) | シトークス ブルー (μM;最終濃度) |
|
| 未染色制御 | |||||
| -- | -- | -- | -- | -- | |
| シングルステインコントロール | |||||
| SYTOXブルー(生存率制御) | -- | -- | -- | -- | 1 |
| CD31とCD45 | 0.5 | 0.25 | -- | -- | 1 |
| スカ-1 | -- | -- | 0.25 | -- | 1 |
| VCAM-1 | -- | -- | -- | 0.25 | 1 |
| 蛍光マイナス1(FMO) | |||||
| CD31とCD45 | -- | -- | 0.25 | 0.25 | 1 |
| スカ-1 | 0.5 | 0.25 | -- | 0.25 | 1 |
| VCAM-1 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | -- | 1 |
| 実験サンプル | |||||
| フルステイン | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 1 |
表2:フローサイトメトリー抗体染色マトリックス フローサイトメトリー用の実験試料および対照試料の染色に対する抗体量が示されている。すべての染色は、100 μLの洗浄バッファーの全容量で行われます。*自己共役Sca-1::APC抗体の最適量は、使用するバッチによって異なる場合があります。すべての新しく共役したSca-1::APCバッチは、補償ビーズと単一細胞懸濁液の両方を単染色することによって最初に検証する必要があります。
補足ファイル:試薬のレシピ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ラットの筋肉のための最適化された、検証されたFAPs分離プロトコルは、生物学的または技術的な理由のためにマウスで実現不可能な傷害モデルを研究したい研究者にとって不可欠です。例えば、マウスは、慢性局所的、または長期脱退などの神経変性傷害を研究するための最適な動物モデルではない。生物学的には、マウスの短い寿命と急速な老化は、老化の交絡因子からの脱用による筋肉のイコナを正確に引き出すことを困難にする。技術的な観点から、重度の萎縮による筋肉量の大幅な減少は、効果的なフローサイトメトリック分析には不十分であろう。実際、マウスの FAPs 分離プロトコルは、正常な筋肉をグループ化して、並べ替えられた FAPs29の収率を上げることを提案しています。これは、分析のための十分な筋肉組織を得るための技術的な障壁を解決しながら, それは同時に筋肉固有のレベルでFAPsを評価することから研究者を制限します..特定の筋肉群は繊維型組成、血管化の程度、およびミトコンドリアの数47に本質的に異なるため、例えばフローサイトメトリック解析のために複数の異なる筋肉を組み合わせることで、筋肉特異的なFAの特徴付けが妨げられます。これに対し、健康で長期の脱用、萎縮性および線維性ラット胃腸炎は、効果的なフローサイトメトリーに対して十分な量の出発物質を提供することを示す。さらに、健康なサンプルでは、筋肉の余剰は、複数の下流アッセイのためにさらに細分化することができ、研究者は同じ組織の細胞、分子、および組織学的特徴を付随的に分析することができます。最後に、治療を伴う傷害モデルにおけるFAPsを操作する実験では、21、22、23、24の身体機能と歩行の十分に検証された分析が利用可能であり、動物の終了を必要とせずに筋肉機能の連続評価を可能にする。
ラットの最適化されたFA絶縁プロトコルを作成する際の重要な障害は、抗体の可用性でした。私たちの最初のアプローチは、マウス1、7、8、9、10、11、12、13、14で広く採用されている抗体パネルと格言戦略プロトコルをコピーしようとしました。市販されている間、共役、フローサイトメトリー試験、およびラットを認識する検証された抗体は、系統マーカーCD31およびCD45に利用可能であったが、陽性のFA識別マーカーSca-1またはPDGFRα、ならびに負選択マーカーITGA7には存在しなかった。非共役、これらのマーカーに特異的な一次抗体が利用可能であったが、PPsマーカーSca-1およびPDGFRαのうち、ラット細胞48のフローサイトメトリック分析において公表された文献においてSca-1抗体のみが検証された。したがって、我々は、FAPsの正の選択マーカーとしてSca-1を選択しました。Sca-1およびITGA7マーカーを線引するために二次抗体を使用する見通しは、いくつかの理由で実現可能ではなかったが、主にSca-1およびITGA7に対して唯一のラット特異的抗体が同じ宿主種で生成された。したがって、残りの選択肢は、市販のキットを用いた両方の抗体の自己結合であった。
抗体結合のための最適なキットを選択するプロセスは、多くのキットが一次抗体に存在する様々な緩衝希釈剤(例えば、グリシン、グリセロール、BSA、アジドナトリウム)に対して完全または部分的に不耐性であるとして、広範囲に及んだ。さらに、提供されるフルオロフォアは、調査員が利用できるフローサイトメーター/細胞選別機内に装備されているレーザーと互換性があり、サンプル内の他の細胞タイプを識別するために使用される他のフルオロフォアと同様の波長で放出されてはならない。ラット特異的PDGFRα一次抗体中の希釈剤成分の存在は、共役キットとの適合性が低く、このプロトコルにおける陽性のFAPs選択マーカーとしてSca-1を選択する際に追加的な検討事項であった。これらの結果は、Sca-1::APCとITGA7::P E-Cy7コンジュゲーションの両方が補償ビーズと細胞の両方で明確な陽性染色された集団の同定をもたらしたことを示しているが、前者は製造業者によって宣伝されたよりも早く蛍光の崩壊を示すことが判明した。研究者は、メーカーの指示に従ってSca-1::APCを結合し、堅牢なシグナルを確保するために最初の使用の直前(例えば実験の前日)、それに応じて抗体の単一バッチの有効性の窓内で使用できるように実験を計画し、単一の染色補償ビードと単一細胞で単一の懸濁液によって各バッチを検証することを強くお勧めします。しかし、さらに重要なことは、Sca-1::APCとITGA7::P E-Cy7の間に指摘された重要な相互作用は、MPに対するFAPsの集団の正確な線引きを妨げ、代替戦略を採用する必要があります。
ボスコロ・セシロらは最近、CD31、CD45およびCD11b陰性細胞における単一の陽性選択マーカー33としてVCAM-1を用いたラット筋幹細胞のフロー細胞量分離に成功したことを実証した。VCAM-1をMP選択マーカーとして、新しい抗体パネルを利用してFAPs(Lin-/Sca-1+/VCAM-1-)とMP(Lin-/Sca-1-/VCAM-1+)を同定し、健康な胃食道筋からFACS選別細胞の インビトロ培養で アプローチを検証しました。分離された新しいFAPsおよびMPは、それぞれの代替マーカーPDGFRαおよびPax7に対してのみ免疫染色された。培養されたFAPは、成熟した線維芽細胞および腺細胞の集団に分化し、MPを成熟した筋細胞/筋管に分化した。文化内のISPとMPの相互汚染は発生しなかった。組織学的断面の免疫染色は、Sca-1陽性細胞を有するデンエル化筋における線維脂肪分解の領域の浸潤を確認した。
重度の萎縮性、線維性および脂肪浸潤筋におけるプロトコルを検証するために長期のデンエル化筋肉のフローサイトメトリック分析を行ったが、我々はつながら、ベースラインSca-1発現(Sca-1 Med/Lowと比較して)Sca-1シグナル(Sca-1 Highと表記)の増加を伴うFAPs亜集団の出現を観察した。Sca-1高いFAPは後デナーブ(12週間プラス)が大幅に遅れて増加し、Sca-1 Med/Low FAPはベースラインレベルに戻る前に5週間で早期にピークに達しました。フェープ表現型における異質性は10,30と報告されている。より高いSca−1発現を有するFAPsは、より容易にアディポサイトに分化することが示され、線維化刺激にさらされるとCol1a130,49の発現が増加した。ここで観察されるFAPs亜集団のダイナミクスは、変性誘発後遺および筋肉の再生能力47の時間経過と一致しているように見えるため、異なる細胞プログラムを有するFAPs亜集団を特徴付ける可能性がある。Sca-1高いFAPsは、線維/脂肪浸潤および再生ポテンシャルの低下に伴う後期の時点でアップレギュレートされ、Sca-1 Med/Low FAPsは筋肉の再生期間中にアップレギュレートされ、効果的な再生筋形成に役立つ可能性があります。ここで示すFAPs絶縁プロトコルは、研究者が将来の研究のためにこれらの様々な集団を特定し、隔離する能力を提供します。
我々は、Sca-1とVCAM-1(Lin-/Sca-1+/VCAM-1+)の両方に陽性染色する細胞の集団を同定し、この二重陽性集団がFAPとMPの混合物であることを確認した。Malecovaたちは、健康な筋肉にほぼ存在しないFAPsを発現するVCAM-1のサブ集団を報告し、急性炎症とともに一過性増加し、mdxマウス(筋ジストロフィーのモデル)における持続性は慢性筋炎症および線維症10と関連していた。対照的に、純粋なFAP集団ではないが、Lin-/Sca-1+/VCAM-1+集団は、脱毛後12週間および14週間で慢性筋線維症のベースラインレベル以下に減少したことがわかった。脱熱は、mdxマウスが経験する同じ炎症反応およびサイクリング再生の試みを誘発せず、我々の結果の違いを説明する可能性がある。Lin-/Sca-1+/VCAM-1+細胞集団におけるMPの同定は、健康な筋肉における非常に小さな割合のMPに関するSca-1発現の報告と一致しており、筋芽細胞増殖および細胞周期45からのその後の離脱時の傷害後の一過性増加である。したがって、当社の抗体標識とFACS格子戦略は、研究のためにFAPsとMPの純粋な集団を分離することに成功しましたが、これらの集団のフローサイトメトリーベースの定量化を必要とする実験は、Sca-1とVCAM-1を共同発現する両方の前駆細胞ラインの細胞の割合が小さいため、その数をわずかに過小評価する可能性があります。いずれにせよ、現在のプロトコルは、長期的な脱ネルバチ筋肉における人口の短期的なアップレギュレーションとその後の枯渇を伴う、脱過性傷害に対するMPの古典的な二相応答を明確に示している。同様に、単離された短時間脱用傷害で報告されたFAPsの増加は、ここで再現され、長期脛骨神経切除モデルを用いてさらに持続することが示される。
要約すると、このプロトコルは、これまで未踏の動物、フローサイトメトリック法を使用してFAPsとMPを同時に研究するラットを提供します。全体として、ラットのFAPs研究は、急性および慢性筋肉および末梢神経外傷および疾患におけるこの主要な前駆物質集団の新しい役割を発見し、その後細胞特異的療法を発症する可能性を高める可能性がある。
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Disclosures
著者らは開示する矛盾はない。
Acknowledgments
オタワ大学のフローサイトメトリーコア施設と、セントマイケルズ病院ユニティヘルストロントのセントマイケルズ病院ユニティヘルストロントのフローサイトメトリーコア施設に、この原稿に記載されているフローサイトメトリー/FACSプロトコルの最適化に関する専門知識とガイダンスに感謝します。この作品は、デザインによる医学による新しいアイデア2018ファンド(MbDNI-2018-01)からJBに資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 10 cm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3902 | |
| 12-well cell culture plate | ThermoFisher | 130185 | |
| 12 mm glass coverslips, No.2 | VWR | 89015-724 | |
| 10 mL Syringe | Beckton Dickenson | 302995 | |
| 15 mL centrifuge tubes | FroggaBio | 91014 | |
| 20 gauge needle | Beckton Dickenson | 305176 | |
| 25mL Serological pipette | Sarstedt | 86.1685.001 | |
| 40µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50mL centrifuge tubes | FroggaBio | TB50 | |
| AbC Total Antibody Compensation Beads | ThermoFisher | A10497 | |
| Ammonium Chloride, Reagent Grade | Bioshop | AMC303.500 | |
| APC Conjugation Kit, 50-100µg | Biotium | 92307 | |
| Aquatex Aqueous Mounting Medium | Merck | 108562 | |
| Biolaminin 411 LN | Biolamina | LN411 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Bioshop | ALB001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop | CCL444.500 | |
| Collagenase Type II | Gibco | 17101015 | |
| CountBright Plus Absolute Counting Beads | ThermoFisher | C36995 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 17105041 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | (+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L Sodium Pyruvate |
| EDTA | FisherScientific | S311 | |
| FACSClean Solution | Beckton Dickenson | 340345 | |
| FACSDiva Software | Beckton Dickenson | -- | |
| FACSRinse Solution | Beckton Dickenson | 340346 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | |
| Flow Cytometry Sheath Fluid | Beckton Dickenson | 342003 | |
| FlowJo Software | Beckton Dickenson | -- | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S302380-2 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21424 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | |
| Ham's F10 Media | ThermoFisher | 11550043 | (+) Phenol Red (+) L-Glutamine (-) HEPES |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) | Multicell | 311-513-CL | |
| Heat Inactivated Horse Serum | Gibco | 26050-088 | |
| Hemocytometer | Reichert | N/A | |
| HEPES, minimum 99.5% titration | Sigma | H3375 | |
| Horse Serum | ThermoFisher | 16050130 | |
| Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) | Cell Signaling | 8915LF | |
| Humulin R | Lilly | HI0210 | |
| IBMX | Millipore Sigma | I5879 | Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | Also known as 2-propanol |
| Lewis Rat, Female | Charles River Kingston | 004 (Strain Code) | 200-250 grams used |
| LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer | Beckton Dickenson | -- | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP-5417R | |
| MoFlo XDP Cell Sorter | Beckman Coulter | -- | |
| Mouse Anti-CD31::FITC Antibody | Abcam | ab33858 | Clone TLD-3A12 |
| Mouse Anti-CD45::FITC Antibody | Biolegend | 202205 | Clone OX-1 |
| Mouse Anti-CD106::PE Antibody | Biolegend | 200403 | Also known as VCAM-1 |
| Mouse Anti-MHC Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | Also known as MF20 |
| Mouse Anti-Pax7 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | |
| Neutral Buffered Formalin, 10 % | Sigma | HT501128 | |
| Oil Red O | Millipore Sigma | O0625 | |
| PE-Cy7 Conjugation Kit | Abcam | ab102903 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | (-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride |
| Potassium Bicarbonate, Reagent Grade | Bioshop | PBC401.250 | |
| Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody | Invitrogen | MA5-32347 | FSP-1 also known as S100A4 |
| Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody | Abcam | ab203254 | |
| Rabbit Anti-Laminin Antibody | Sigma | L9393 | |
| Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody | Abcam | ab3526 | |
| Rabbit Anti-Sca-1 Antibody | Millipore Sigma | AB4336 | |
| Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody | Abcam | ab260043 | Also known as Col1a1 |
| Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody | Abcam | ab203491 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Gibco | PHG0266 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Troglitazone | Millipore Sigma | T2573 | |
| Tween-20 | Bioshop | TWN510 |
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