Identificação, Isolamento e Caracterização de Progenitores Fibro-Adipogênicos (FAPs) e Progenitores Miogênicos (MPs) em Músculo Esquelético no Rato

Summary

Este protocolo descreve um método para isolar progenitores fibro-adipogênicos (FAPs) e progenitores miogênicos (MPs) do músculo esquelético de rato. A utilização do rato em modelos de lesão muscular proporciona maior disponibilidade tecidual do músculo atroférico para a análise e um repertório maior de métodos validados para avaliar a força muscular e a marcha em animais em movimento livre.

Abstract

Progenitores fibro-adipogênicos (FAPs) são células intersticiciais residentes no músculo esquelético que, juntamente com progenitores miogênicos (MPs), desempenham um papel fundamental na homeostase muscular, lesão e reparo. Os protocolos atuais para identificação e isolamento de FAPs utilizam citometria/fluorescência ativada de triagem celular (FACS) e estudos que avaliam sua função in vivo até o momento foram realizados exclusivamente em camundongos. O maior tamanho inerente do rato permite uma análise mais abrangente das FAPs em modelos de lesão muscular esquelética, especialmente em músculos severamente atroféricos ou quando os pesquisadores requerem massa tecidual substancial para realizar múltiplos ensaios a jusante. O rato também fornece uma seleção maior de ensaios funcionais musculares que não requerem sedação ou sacrifício animal, minimizando assim a morbidade e o uso animal, permitindo avaliações seriais. Os protocolos de citometria/FACS de fluxo otimizados para camundongos são espécies específicas, notadamente restritas pelas características dos anticorpos disponíveis comercialmente. Eles não foram otimizados para separar FAPs de músculos ratos ou altamente fibrosos. Desenvolveu-se um protocolo de citometria/FACS de fluxo para identificação e isolamento de FAPs e MPs de músculo esquelético de rato saudável e denervado, contando com a expressão diferencial dos marcadores de superfície CD31, CD45, Sca-1 e VCAM-1. Como os anticorpos primários específicos do fluxo, validados pela citometria de fluxo, são severamente limitados, a conjugação interna do anticorpo que tem como alvo o Sca-1 foi realizada. Por meio deste protocolo, foi confirmada a conjugação Sca-1 bem sucedida, e a identificação citométrica de fluxo de FAPs e MPs foi validada pela cultura celular e imunossaturação de FAPs e MPs isolados pelo FACS. Finalmente, relatamos um novo curso de tempo faps em um modelo prolongado (14 semanas) de denervação de ratos. Este método fornece aos pesquisadores a capacidade de estudar FAPs em um novo modelo animal.

Introduction

As células progenitoras fibro-adipogênicas (FAPs) são uma população de células progenitoras multipotentes residentes no músculo esquelético que desempenham um papel crítico na homeostase muscular, reparação e regeneração, e, por outro lado, também mediam respostas patológicas à lesão muscular. Como o nome sugere, as FAPs foram originalmente identificadas como uma população progenitora com potencial para diferenciar-se em fibroblastos e adipócitos¹ e foram supostamente os principais mediadores da infiltração fibro-gordurosa do músculo esquelético em lesões crônicas e doenças. Estudo suplementar revelou que as FAPs são adicionalmente capazes de osteogênese e condrogênese^2,3,4. Assim, são mais amplamente notados na literatura como progenitores mesenquimais ou estrogonais^3,5,6,7,8. Em lesão muscular esquelética aguda, os FAPs ajudam indiretamente na miogênese regenerativa, proliferando transitoriamente para fornecer um ambiente favorável para células de satélite musculares ativadas e seus progenitores miogênicos a jusante (MPs)^{contrapartes 1,9,10}. Paralelamente à regeneração bem sucedida, os FAPs passam por apoptose, devolvendo seus números aos níveis de linha de base^1,9,10,11. Em contraste, na lesão muscular crônica, as FAPs substituem sinais pró-apoptóticos, o que resulta em sua persistência^9,10,11 e reparação muscular anormal.

Estudos in vivo que avaliam os mecanismos celulares e moleculares pelos quais as FAPs mediam as respostas musculares utilizaram modelos de animais murinos até o momento^{1,7,9,10,11,12,13,14}. Embora camundongos geneticamente modificados sejam ferramentas poderosas para uso nessas análises, o pequeno tamanho do animal limita a disponibilidade de tecidos para estudo em modelos localizados de lesão a longo prazo onde a atrofia muscular pode ser profunda, como a denervação traumática. Além disso, a medição da força muscular e da função física requer medidas ex vivo ou in situ que requerem a terminação do camundongo, ou métodos in vivo que requerem cirurgia e/ou um anestésico geral para permitir a avaliação do desempenho contratil muscular^{15,16,17,18,19,20} . Em ratos, existem análises funcionais musculares bem validadas e utilizadas globalmente, além de análises para comportamentos motores mais complexos, como análise de marcha (por exemplo, Índice de Função Ciática, Análise de CatWalk) e são realizadas em animais acordados e em movimentos espontaneamente^21,22,23,24 . Isso otimiza, ainda, os princípios de morbidade mínima na experimentação animal e o número de animais de pesquisa utilizados. O rato fornece ao pesquisador das FAPs a flexibilidade adicional de maior volume muscular ferido para análises proteicas e celulares e a capacidade de realizar avaliações seriais de atividades e comportamentos funcionais complexos musculares e dinâmicos, no animal de alerta.

As FAPs foram principalmente identificadas e isoladas de amostras musculares inteiras usando citometria de fluxo e triagem celular ativada por Fluorescência (FACS), respectivamente. Estes são ensaios baseados em laser que são capazes de identificar múltiplas populações celulares específicas com base em características características como tamanho, granularidade e uma combinação específica de superfície celular ou marcadores intracelulares²⁵. Isso é altamente vantajoso no estudo de um sistema de órgãos como o músculo esquelético, pois a homeostase e a regeneração são processos complexos e multifatoriais coordenados por uma infinidade de tipos celulares. Estudo seminal identificou FAPs, bem como MPs, utilizando métodos citométricos de fluxo no músculo esquelético do camundongo¹. Eles demonstraram que os FAPs são mesenquimais na natureza, por falta de antígenos superficiais específicos para células de origens endoteliais (CD31), hematopoiéticas (CD45), ou miogênicas (Integrin-α7 [ITGA7]), mas expressaram o marcador de células-tronco mesenquimal Sca-1 (antígeno de células-tronco 1)¹ e diferenciado em células fibrogênicas e adipogênicas na cultura. Outros estudos demonstraram o isolamento bem-sucedido de progenitores mesenquimais em músculos com base na expressão de um marcador de células-tronco alternativo, o receptor de fator de crescimento alfa derivado de plaquetas (PDGFRα)^2,7,8 e análises posteriores revelaram que estes provavelmente são a mesma população celular que as FAPs³. Os FAPs são agora comumente identificados na citometria de fluxo usando sca-1 ou PDGFRα como um marcador de seleção positivo^{1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31} . O uso de PDGFRα é preferencial para o tecido humano, no entanto, como um homólogo humano direto do Murine Sca-1 ainda não foi identificado³². Além disso, outras proteínas de superfície celular têm sido relatadas como marcadores de MPs (por exemplo, VCAM-1), fornecendo uma alternativa potencial ao ITGA7 como um indicador de células de linhagem miogênica durante o isolamento^{faps 33}.

Enquanto a citometria de fluxo/FACS é uma metodologia poderosa para estudar o papel e o potencial patogênico das FAPs no músculo esquelético^{1,9,10,11,13,29}, é limitada tecnicamente pela especificidade e otimização de seus reagentes necessários. Uma vez que a identificação citométrica do fluxo e o isolamento das FAPs tem sido desenvolvido e conduzido nos modelos de animais de camundongos^1,9,10,11,29, isso coloca desafios para os pesquisadores que desejam estudar FAPs em outros organismos modelo. Muitos fatores - como o tamanho ideal do tecido a ser processado, bem como a especificidade e disponibilidade de reagentes e/ou anticorpos - diferem dependendo das espécies utilizadas.

Além das barreiras técnicas para estudar FAPs em um novo modelo animal, eles têm sido em grande parte estudados em um ambiente agudo e tóxico - geralmente através de injeção química intramuscular ou cardiotoxina. A avaliação da dinâmica de longo prazo dos FAPs limita-se principalmente à avaliação na distrofia muscular de Duchenne, utilizando o modelo de camundongo mdx^9,10,11, e modelos de lesão muscular combinada, como ruptura maciça do manguito rotador, onde a transposição e denervação do tendão simultâneo é realizada na musculatura do ombro^26,27,28 . A resposta dos FAPs ao único insulto da denervação traumática crônica, ocorrência comum em acidentes de trabalho na indústria pesada, agricultura e em traumas de nascimento (lesão por plexo braquial)^34,35,36,37 com morbidade significativa, não tem sido tão bem caracterizada, muitas vezes limitada a um período de curto prazo^11,38.

Descrevemos um método para identificar e isolar FAPs e MPs de músculo esquelético severamente atroférico e fibroso no rato. Primeiro, a identificação de MPs CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs e CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ utilizando um protocolo de coloração de digestão e citometria de fluxo de tecido é demonstrada e a validação subsequente de nossos achados é realizada através da cultura e coloração imunocitológica de células isoladas do FACS. Usando este método, também relatamos um novo curso de tempo faps em um modelo de lesão de denervação isolada de longo prazo no rato.

Protocol

Os investigadores que conduzem este protocolo devem receber permissão de seu conselho local de ética animal/comitê de cuidados. Todo o trabalho animal foi aprovado pelo St. Michael's Hospital Unity Toronto Animal Care Committee (ACC #918) e foi conduzido de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais (CCAC). Um esquema do protocolo de citometria de fluxo é mostrado na Figura 1. Se a aplicação a jusante for FACS e cultura celular subsequente, todas as etapas devem ser completadas com técnica asséptica adequada.

1. Colheita muscular

1. Anestesize ratos usando um anestésico apropriado e sacrifício de acordo com as diretrizes locais do conselho de ética animal e vivarium. Este protocolo colhe o músculo gastrocnemius de ratos adultos de Lewis (200-250 g), como exemplo. Os ratos foram anestesiados usando isoflurane de 2-3% e foram sacrificados por injeção intracardiac de T61.
2. Uma vez que o animal tenha sido sacrificado, raspe toda a mepinte para facilitar a localização do músculo e minimizar a contaminação do tecido colhido.
3. Usando um bisturi estéril, faça duas incisões na pele: a primeira em torno da circunferência da articulação do tornozelo e a segunda até a linha média do aspecto medial da linha traseira do tornozelo ao quadril.
4. Retire a pele e as camadas musculares superficiais para revelar o gastrocnemius subjacente, que se origina nas condílais medial e lateral do fêmur e insere no Tendão de Aquiles.
5. Use dissecção contundente para separar o gastrocnemius do tecido circundante, manuseando o músculo apenas pelo tendão para evitar lesões por esmagamento.
6. Separe o gastrocnemius de sua inserção transcessão do Tendão de Aquiles o mais distally possível com uma tesoura afiada. Uma vez cortado, segure o tendão de Aquiles com fórceps e retire suavemente o gastrocnemius do osso subjacente. Ainda segurando o músculo com fórceps em uma mão, localize as duas origens do gastrocnemius e corte nos condyles femorais medial e lateral.
7. Borriize o gastrocnemius excisado suavemente contra um pedaço estéril de gaze para remover o máximo de sangue possível. Corte o músculo em uma superfície estéril e remova qualquer excesso de tecido conjuntivo, bem como o Tendão de Aquiles.
8. Coloque o músculo em um barco de pesagem e pese usando uma balança de precisão. Este protocolo é otimizado para digerir músculo com um peso úmido variando de 200-600 mgs. Os operadores podem subdividir o excesso de tecido colhido para outros ensaios a jusante, se desejar.
9. Divida suavemente ainda mais o músculo colhido para ser usado para citometria de fluxo em 3-4 pedaços menores (aproximadamente 1-2 cm³) e submerse em 1x PBS gelado. Mantenha frio no gelo até que todas as amostras tenham sido colhidas.

2. Digestão muscular

1. Remova o músculo da PBS e coloque em um prato de cultura celular estéril de 10 cm. Tecido suavemente rasgado e picado com fórces até que os pedaços sejam aproximadamente 3-4 mm³, removendo o máximo de tecido conjuntivo possível. Uma vez completamente picado, transfira para um tubo cônico estéril de 50 mL contendo 6 mL DMEM + 1% penicilina/estreptomicina (P/S).
2. Adicione 10 μL de solução cacl₂ de 300 mM a 365 μL de solução Collagenase II (concentração de estoque 4800 U/mL) para ativar a enzima colagenase. Adicione a solução de colagemnase II ativada ao tubo cônico de 50 mL contendo o chorume tecidual. A concentração final de Colagenase II é de 250 U/mL.
3. Incubar tubos em um agitador por 1 h a 37 °C, 240 x g,certificando-se de girar manualmente a cada 15 minutos para desalojar qualquer tecido que tenha aderido ao lado do tubo.
4. Após 1h, remova os tubos do agitador e adicione o seguinte por amostra: 100 μL de Colagenase II (4.800 U/mL) e 50 μL de Dispase (4,8 U/mL).
5. Amostras de pipeta utilizando uma pipeta sorológica 15-20 vezes até que a solução seja homogênea. Se processar várias amostras, use uma pipeta estéril separada para cada amostra para evitar a contaminação cruzada da amostra.
6. Incubar novamente em um shaker por 30 min a 37 °C e 240 x g. Após 15 minutos, agite amostras à mão para desalojar tecido aderente do lado do tubo.

3. Geração de suspensão de célula única

1. Lentamente, as amostras de cisalhamento através de uma seringa de 10 mL com uma agulha de 20 G para 10 ciclos.
   NOTA: Um ciclo envolve a entrada de solução muscular na seringa e a injeção de volta no tubo. Certifique-se de minimizar quaisquer bolhas completando o esarquihamento lentamente, pois espuma excessiva pode causar morte celular adicional³⁹.
2. Coloque um coador de células de 40 μm em um tubo cônico estéril de 50 mL e molhe-o por tubos de 5 mL DMEM + 10% FBS & 1% P/S.
3. Pipeta 1 mL da amostra de cada vez através do coador celular.
4. Lave o coador de células por pipetação de DMEM com 10% de FBS e 1% P/S através do coador para levar o volume total do tubo para 25 mL.
5. Divida 25 mL da amostra igualmente em dois tubos cônicos de 15 mL e centrífuga a 15 °C, 400 x g por 15 min.
   NOTA: Dividir a solução muscular em dois tubos cônicos de 15 mL garante uma melhor recuperação celular após a centrifugação em comparação com um único tubo.
6. Aspire o supernatante e suspenda a pelota em 1 mL 1x RBC Lysis buffer (ver Arquivo Suplementar) em temperatura ambiente por 7 minutos para eliminar eritrócitos.
7. Leve o volume para 10 mL com 9 mL de tampão de lavagem (ver Arquivo Suplementar) e tubos de spin a 400 x g, 15 °C por 15 min.
8. Aspire as pelotas supernascidas e recombinas, re suspendindo em tampão de lavagem de 1 mL.
9. Transfira um volume apropriado de células para um tubo de microcentrifutura separado de 1,5 mL e misture com corante azul trypan. Conte células vivas em um microscópio leve usando um hemótmetro.

4. Coloração de anticorpos para citometria de fluxo

NOTA: O anticorpo Sca-1 deve ser conjugado à APC antes de experimentos de citometria/FACS de fluxo, de acordo com as instruções do fabricante. O desempenho deve ser validado para cada lote de conjugados(Figura 2). As conjugações finais podem ser armazenadas em 20 μL a -20 °C e estão estáveis por três semanas. Consulte o Arquivo Suplementar para o protocolo de conjugação completo.

1. Para citometria de fluxo, transfira 1-2 x 10⁶ células por amostra experimental para um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL estéril. Leve o volume até 1 mL com tampão de lavagem e coloque no gelo.
2. Para cada experimento, configure os seguintes controles necessários: i) controles de viabilidade não manchados e ii) para selecionar com precisão para a população de células vivas; iii) controles de fluorescência menos um (FMO) em suspensões de célula única para definir portões precisos para frações CD31-/CD45, FAPs e MPs; e iv) contas de compensação de uma única mancha para corrigir a fluorescência entre os canais.
   1. Para todos os controles celulares, alíquota 5 x 10⁵ - 1 x 10⁶ células em 1 mL de tampão de lavagem em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e coloque no gelo.
   2. Para controles de contas, adicione 1 gota de contas de compensação positivas (~1,5 x 10⁵ contas por gota) a cada tubo de microcentrifuuge rotulado de 1,5 mL. O complemento completo dos controles está listado na Tabela 1.
      NOTA: Se o experimento estiver sendo realizado pela primeira vez, execute controles de uma única mancha para cada anticorpo conjugado em suspensões de células únicas (além de contas de compensação não manchadas, viabilidade, compensação de uma única mancha e controles de FMO) para avaliar a população manchada positiva em células e validar a coloração observada em contas de compensação. Validar cada preparação recém-conjugada de Sca-1::APC realizando coloração única em contas de compensação e suspensões de células únicas. Consulte a Tabela 1 para obter uma lista completa de controles de coloração.
3. Para preparar o controle de viabilidade, transfira metade do volume de células do tubo de "viabilidade" para um novo tubo de microcentrifuge de 1,5 mL. Rotule este tubo de "Morto".
4. Incubar tubo "morto" a 65 °C por 2-3 minutos para matar as células, em seguida, coloque no gelo. Após 2-3 min, ree combinar células mortas com células vivas permanecendo no tubo de controle de viabilidade. Essa população de células será usada para definir valores de compensação (se necessário) e definir adequadamente os portões para o corante de viabilidade.
5. Centrifugar as suspensões de células únicas (amostras e controles experimentais) a 500 x g, 4 °C por 5 min.
6. Aspire as cápsulas de células supernascidas e re-suspender em 100 μL tampão de lavagem.
7. Adicione anticorpos, dependendo da amostra experimental ou controle. Consulte a matriz de coloração(Tabela 2)para obter informações sobre combinações e quantidades de anticorpos.
8. Mova suavemente cada amostra para garantir a mistura completa e incubar no gelo no escuro por 15 minutos. Para contas de compensação, incubar à temperatura ambiente no escuro por 15 minutos.
9. Para amostras experimentais e de controle de suspensão celular única, eleve o volume para 1 mL adicionando 900 μL de tampão de lavagem. Para controles de contas de compensação, eleça o volume para 1 mL com 900 μL de 1x PBS.
10. Centrifugar amostras de suspensão de célula única a 500 x g,4 °C por 5 min. Cento de compensação controles de contas a 300 x g, 4 °C por 5 min.
11. Para todas as amostras de suspensão de células únicas, aspirar e descartar supernasce e suspender de re-suspensão a pelota celular em 300 μL tampão de lavagem. Para controles de contas de compensação, aspire e descarte o supernasce, suspenda novamente a pelota em 300 μL de 1x PBS e adicione 1 gota (~1,5 x 10⁵) de contas de compensação negativa.
12. Mantenha todas as amostras de suspensão de células únicas no gelo sob papel alumínio e prossiga para a aquisição citométrica de fluxo. Os controles de contas de compensação também devem ser protegidos contra a luz, mas podem ser mantidos à temperatura ambiente.
    NOTA: Se o ponto final experimental for a identificação de FAPs por citometria de fluxo, siga as etapas 5.1.1-5.1.11. Se o ponto final for o isolamento celular via FACS para cultura e coloração, siga as etapas 5.2.1-5.2.9 e as seções 6-7.

5. Citometria de fluxo e classificação celular ativada por fluorescência (FACS)

1. Citometria de fluxo
   NOTA: Este protocolo emprega um citômetro de fluxo de bancada equipado com lasers de 405 nm, 488 nm e 640 nm capazes de distinguir simultaneamente 10 cores diferentes. Os filtros bandpass e seus fluorochromes associados utilizados neste protocolo são os seguintes: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) e 670/30 (APC). As tensões para cada detector são as seguintes: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX Azul 360; APC 570. Certifique-se de que você é treinado sobre o funcionamento adequado do citômetro de fluxo ou classificador celular antes de usar.
   1. Certifique-se de que o cítmetro foi ligado por 10-20 minutos antes do uso e foi preparado pela limpeza sequencial com soluções limpas, enxaguadas e fluidos de baia para 30-45 s cada. Finalize com uma lavagem com dH₂O. Certifique-se de que um volume adequado de fluido de baia foi adicionado ao recipiente de armazenamento para manter o fluxo adequado da amostra durante toda a aquisição.
   2. Configure a estratégia de gating para identificar FAPs e MPs conforme delineado na Figura 3.
      NOTA: Os FAPs e os MPs são identificados pela seguinte estratégia hierárquica: i) SSC-A vs FSC-A (área de dispersão de células laterais versus área de dispersão de células dianteiras para células separadas vs detritos), ii) FSC-W vs FSC-H (largura de dispersão de células dianteiras versus altura de dispersão da célula dianteira para discriminar singlets de doublets no parâmetro FSC), iii) SSC-W vs SSC-H (largura de dispersão de células laterais versus altura de dispersão de células laterais para discriminar singlets de doublets no parâmetro SSC), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (para distinguir singlets vivos versus mortos), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (para excluir células CD31+ e CD45+ de análises posteriores) e vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E do CD31-/CD45- (Linhagem; Lin-) população (identificação de FAPs e PMs). Os FAPs são identificados como eventos CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- e os MPs são identificados como eventos CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+.
   3. Primeiro execute cada controle de contas de compensação de uma única mancha através do citômetro em baixa velocidade para gerar valores de compensação usados para corrigir qualquer derramamento de fluorescência entre os canais. Avalie a compensação comparando o sinal fluorescente de cada controle em seu próprio detector (por exemplo, SSC-A vs APC para Sca-1::APC contas de uma única mancha) bem como todos os outros detectores. Deve haver duas populações distintas (uma com negativo e outra com sinal positivo) no detector apropriado e apenas uma população negativa em todos os outros detectores. Estabeleça o portão de parada para 10.000 eventos de contas de compensação e regise os dados.
      NOTA: Entre a aquisição de cada amostra, certifique-se de executar dH₂O através do cítômetro por 10-20 seg para evitar a contaminação amostral..
   4. Em seguida, processe as amostras de controle de viabilidade não manchadas para portar adequadamente em células individuais vivas. Defina o portão de parada para 10.000 eventos de singlet e grave dados.
      NOTA: Aproximadamente 5 minutos antes da aquisição de cada amostra de suspensão celular única, com exceção da amostra não manchada, adicione 1 μL de corante de viabilidade azul SYTOX (concentração de trabalho de 300 μM diluída a partir de 1 mM solução de estoque) a cada amostra e gire suavemente para misturar (concentração final 1 μM).
   5. Em seguida, adquira as amostras restantes de controle de suspensão de célula única. Avalie cada controle de FMO com seu enredo apropriado na estratégia de gating(Figura 3). Por exemplo, avalie o sinal FITC do FMO CD31+CD45 para garantir um portão CD31-/CD45 preciso. Um exemplo ideal é mostrado na Figura 3G. Se o protocolo estiver sendo executado pela primeira vez, os controles de uma única mancha nas células devem ser executados antes da aquisição dos controles FMO.
   6. Avalie o sinal fluorescente de cada amostra celular manchada em seu detector apropriado, bem como em todos os outros detectores para validar a compensação adequada. Defina o portão de parada para 10.000 eventos singlet ao vivo e grave no software.
   7. Uma vez processados todos os controles (suspensões e contas de células únicas), prepare todas as amostras experimentais medindo e registrando primeiro o volume de cada amostra. Essas medidas serão utilizadas para quantificar com precisão os FAPs e os PMs, conforme descrito na etapa 5.1.11. Em seguida, adicione 50 μL de contas de contagem de precisão e misture suavemente por pipetar para cima e para baixo 2-3 vezes.
   8. Execute brevemente a primeira amostra experimental para validar a identificação da população de contas de contagem. Esta população aparece como um pequeno aglomerado distinto separado da população geral de células na trama FSC-A vs SSC-A(Figura 3A, caixa vermelha). Crie um portão em torno da população de contas de contagem. Em seguida, adquira dados para cada amostra experimental processando através do citômetro em baixa velocidade. Defina o portão de parada para 10.000 eventos de contas e recorde.
      NOTA: Os investigadores podem identificar alternativamente a contagem de contas, configurando um gráfico adicional avaliando o SSC-A versus qualquer um dos detectores, já que as contas de contagem são fluorescentes em todos os detectores.
   9. Depois de todas as amostras terem sido processadas, limpe o citómetro usando os protocolos apropriados. Exportar todos os dados para análise.
   10. Abra todos os arquivos de dados em um software apropriado de análise de citometria de fluxo. Defina a estratégia de gating como usada para aquisição de dados conforme descrito na etapa 5.1.2. Examine os controles na mesma ordem da aquisição de dados (por exemplo, não manchados, viabilidade, única mancha, depois controles FMO) para validar novamente a estratégia de gating. Uma vez que portões precisos tenham sido definidos usando controles FMO, aplique os portões em todas as amostras experimentais. Exportar dados brutos como uma planilha para quantificação.
   11. Calcule o número de FAPs e MPs em cada amostra experimental usando as contas de contagem:
       
       onde, Contagem de Células Adquiridas é o número de eventos registrados de população celular pertinente (por exemplo, FAPs ou MPs) no software de aquisição; O Bead Count adquirido é o número de eventos registrados de contas de contagem no software de aquisição; Contando o Volume de Contas é o volume de solução de contas de contagem adicionada na etapa 5.1.7; Volume amostral é o volume de cada amostra experimental manchada antes da adição de contas de contagem.; Concentração de contas é o número de contas por solução μL; este valor é encontrado na folha de dados do produto.
2. FACS - classificação para cultura celular
   NOTA: Este protocolo executa FACS em um classificador de células equipado com 4 lasers (UV, Violet, Azul, Vermelho) que é capaz de distinguir simultaneamente cores de 11-14. Siga a coloração experimental da amostra (seção 4) e o protocolo de citometria de fluxo, com exceções das etapas 1 a 3 delineadas abaixo, para otimizar o fluxo de trabalho FACS:
   1. Aumente a concentração de células nas amostras experimentais a serem classificadas para 7 x 10⁶ células/mL para gerar rendimentos robustos de FAPs e MPs.
   2. Para explicar esse aumento significativo na concentração celular, dobre todas as concentrações de anticorpos nas amostras experimentais a serem classificadas.
   3. Processe as amostras de células manchadas finais através de uma tampa de coador de células de 40 μM afixada em um tubo de poliestireno de 5 mL imediatamente antes da triagem para reduzir a aglomeração celular e aumentar os rendimentos de classificação.
   4. Recolher FAPs e MPs de ratos únicos e vivos diretamente do classificador celular em um tubo de coleta de polipropileno de 5 mL contendo 1 mL de estéril, 100% de bovino fetal (FBS). Mantenha as células no gelo até que a classificação esteja completa.
      NOTA: Se estiver conduzindo o FACS em um local fora do local, transfira todas as células classificadas no gelo e em um recipiente protegido e coberto.
   5. Trabalhando em um gabinete de biossegurança estéril (BSC), traga volume de células classificadas até 7 mL com mídia de crescimento apropriada (por exemplo, mídia de crescimento FAP (FAP GM) para FAPs classificados e mídia de crescimento mp (MP GM) para MPs classificados; ver Arquivo Suplementar para receitas) e centrífuga a 500 x g, 4 °C por 7 min para remover o máximo de tampão de lavagem residual possível.
   6. Resuspend pelotas em 1 mL de mídia de crescimento apropriada e placa em uma placa de 12 poços contendo uma tampa de vidro estéril, revestida de colágeno 12 mm/poço para imunostaining subsequente (ver seção 6).
      NOTA: Se a imunocitoquímica colorir para colágeno, as células classificadas em uma placa de 12 poços contendo uma tampa de vidro estéril, revestida de laminina de 12 mm/bem, em vez de revestida de colágeno. Se forem necessários experimentos imunocittoquímicos de progenitores imediatamente isolados, sejam necessários FAPs e MPs de sementes a uma densidade de 15.000 células por cm² e procedem diretamente à etapa 6.1. Para culturas de longo prazo induzirem a diferenciação progenitora, as FAPs de sementes a uma densidade de 5.000 células por cm², e MPs a uma densidade de 7.500 células por cm².
   7. Incubar células a 37 °C e 5% de CO₂ em uma incubadora de cultura celular. Depois de 72 h na cultura, mude metade da mídia. Mude a mídia totalmente a cada 2-4 d depois.
   8. Para induzir o desenvolvimento do miócito, mude as culturas dos MPs para o meio de diferenciação de MP (MD) no dia 9 da cultura. Para induzir adipócitos, mude as culturas faps para o meio de diferenciação adipogênica (AD) fap no dia 10 da cultura.
   9. Para induzir a fibrogênese, os FAPs podem ser trocados para a mídia de diferenciação fibrogênica (FD) em momentos variáveis durante a cultura, ou, alternativamente, podem ser semeados diretamente na mídia FD após o isolamento (etapa 5.2.6) (Ver Arquivo Suplementar para todas as receitas de mídia).

6. Imunocytoquímica de FAPs e PMs cultos

1. Para validar a classificação celular e demonstrar pureza das culturas faps e MPs, imunostain com marcadores específicos do tipo celular, incluindo PDGFRα (marcador FAPs), Pax-7 (marcador de células de tronco muscular [satélite]), proteína específica do fibroblasto (FSP-1, marcador fibroblasto), Perilipin-1 (Plin-1, marcador de adipocito), colágeno tipo 1 (Col1a1, indicador de fibrose), Myosin Heavy Chain (MHC, marcador de miec.
   1. Para a imunossuagem de células recém-classificadas, centrifugar a placa de 12 poços a 200 x g por 3 min à temperatura ambiente para facilitar a adesão das células ao deslizamento/poço. Este passo não é necessário para culturas de longo prazo. Remova a mídia cultural.
   2. Para imunostaining com FSP-1, fixar células com 1 mL 100% metanol (MeOH) por 2 min a 4 °C. Se imunostaining para PDGFRα, Plin-1, Pax7 ou Col1a1, fixar culturas celulares com 1 mL 4% PFA em 1x PBS por 15 minutos à temperatura ambiente. A imunossuagem do MHC tolera qualquer fixação.
      NOTA: Para células fixas de metanol, pule a etapa 6.2 e prossiga para a etapa 6.3.
2. Aspirar 4% PFA e lavar rapidamente as culturas celulares 3-4 vezes com 1x PBS. Adicione 1 mL de 100 mM Glycine em 1x PBS e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente para inativar PFA residual. Aspire e lave 1-2 vezes com 1x PBS.
   NOTA: As células podem ser deixadas nesta fase em 2 mL de 1x PBS, enroladas em filme agarrado e armazenadas a 4 °C por 7-10 dias no máximo.
3. Após a lavagem, adicione 1 mL de 0,1% Triton-X em 1x PBS e incuba por 20 minutos para permeabilize membranas celulares.
4. Lave os poços 2-3 vezes com 1-2 mL de 1x PBS e bloqueie as células com 1 mL de 1x PBS + 3% BSA por poço por 1h à temperatura ambiente.
5. Pipeta 80 μL de anticorpo primário diluído em 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 puro, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/mL) em um pedaço de parafilme colado em um recipiente móvel. Usando fórceps finos estéreis, levante cuidadosamente o deslizamento de tampas para fora do poço e inverta na gota da solução de anticorpos. Incubar tampas com dois pedaços molhados de papel toalha e recipiente de cobertura em filme plástico para evitar a evaporação da solução de anticorpos. Incubar durante a noite a 4 °C.
   NOTA: As manchas saem do poço utiliza menos anticorpos (~80 μL) do que a coloração dentro do poço (mínimo de 500 μL).
6. No dia 2, deixe as coberturas em temperatura ambiente por 30 minutos para aquecer. Usando fórceps cuidadosamente corretamente e transferir tampas de volta para seus respectivos poços (células voltadas para cima) e lavar 2-3 vezes com 1-2 mL de 1x PBS por 2 min cada para remover o máximo de anticorpos primários possível.
7. Usando a mesma técnica de coloração como com a coloração primária de anticorpos, colorições com anticorpos secundários Alexa Fluor 488 (1:400) para detectar FSP-1, Plin-1, Col1a1 ou PDGFRα e anti-rato de cabra Alexa Fluor 555 anticorpo secundário (1:300) para detectar MHC ou Pax-7. Incubar células por 1h à temperatura ambiente e manter as células protegidas da luz.
8. Retornar células ao poço e incubar células com Hoechst (1:10.000) por 2-4 min em temperatura ambiente. Lave as células mais 2-3 vezes com 1x PBS por 2 min cada para remover o excesso de Hoechst.
9. Montagem desliza em lâminas de vidro usando um meio de montagem fluorescente anti-fade e deixa slides para secar durante a noite no escuro à temperatura ambiente. Armazene as tampas montadas a 4 °C no escuro.

7. Mancha de O Vermelho-Óleo (ORO) de FAPs e MPs cultos

1. Realizar a coloração de ORO em células não permeabilizadas, pois a permeabilização da membrana celular pode resultar em coloração não específica/indesejada de tipos de células não adipogênicas. Antes de iniciar a coloração, prepare um estoque de trabalho oro (Ver Arquivo Suplementar para a receita) e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos.
2. Após 20 min, filtre a solução usando um filtro de 0,2 μm para remover quaisquer agregados não resolvidos.
3. Aspirar mídia de bem e adicionar 1 mL de Formalina Tamponada Neutra de 10% (10% NBF). Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
   NOTA: A confluência celular pode resultar na elevação do poço/deslizamento de tampas. Tome cuidado ao aspirar/adicionar soluções.
4. Aspire e adicione 1 mL de 10% de NBF fresco e incubar por pelo menos 1h em temperatura ambiente.
   NOTA: O protocolo pode ser interrompido neste momento, pois as células podem ser deixadas em 10% NBF durante a noite.
5. Lave rapidamente os poços uma vez com 1 mL de isopropanol de 60%, depois aspire e deixe os poços secarem completamente (aproximadamente 2 min).
6. Adicione 400 μL Óleo Vermelho O de trabalho por poço e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente, certificando-se de evitar a tubulação de qualquer ORO nas paredes da placa.
7. Remova todo o Óleo Vermelho O e lave rapidamente o poço 4 vezes com dH₂O.
   NOTA: Se os poços manchados conterem tampas, monte usando a mesma técnica descrita na etapa 6.9.
8. A imagem ou tampas montadas ou o poço manchado usando um microscópio brightfield.

8. Coloração tecidual de seções gastrocnemius de ratos contralaterais e denervadas

1. Vermelho Picrosirius (PSR)
   1. Realize a coloração de PSR em seções histológicas de rato de 5 μm de espessura e fixas (FFPE), como descrito anteriormente⁴⁰.
2. Óleo vermelho o (ORO)
   1. Fixar 5 μm de espessura isopentane-congelado de rato gastrocnemius seções histológicas em 4% PFA por 10 min, incubar em 60% álcool isopropílico por 1 min.
   2. Mancha com estoque de trabalho ORO por 12 min. Incubar em 60% de álcool isopropílico por 1 min, lave por 10 min em dH₂O. Monte em tampas usando uma mídia de montagem solúvel em água.
3. Imunohistoquímica fluorescente de tecido sca-1 e laminina (IHC)
   1. Realize o IHC fluorescente em seções histológicas de ratos congelados de isopentane de 5 μm de espessura.
   2. Hidrate amostras em 1x PBS por 5 min, fixe em 4% PFA por 10 minutos e incuba amostras na solução de bloqueio if de tecido (ver Arquivo Suplementar) por 90 minutos.
   3. Incubar com anticorpo primário anti-Sca-1 (1:500) diluído em 1x PBS + 0,05% Tween a 4 °C durante a noite.
   4. No dia 2, lave três vezes em 1x PBS + 0,05% Tween por 5 min cada, depois incubar em anti-coelho de cabra Alexa Fluor 555 (1:500) por 1 h.
   5. Lave novamente (como antes), incubar com solução de bloqueio por 1h e, em seguida, adicione anticorpo primário anti-laminina (1:500) diluído em 1x PBS + 0,05% Tween por 1 h.
   6. Lave novamente (como antes), depois incubar em anti-coelho de cabra Alexa Fluor 488 (1:500) por 1 h (para laminina).
   7. Lave novamente (como antes) e incuba em DAPI (1:10.000) por 4 min. Lave e monte em tampas usando meio de montagem anti-fade.

Representative Results

Identificação de FAPs e MPs via citometria de fluxo usando um novo painel de anticorpos, incluindo Sca-1 e VCAM-1
A estratégia de gating para identificar FAPs no músculo de rato baseia-se nos protocolos de citometria de fluxo no mouse²⁹, que portão em células positivas CD31 (endotelial) e CD45 (hematopoiética) (denominada linhagem [Lin]) e examina o perfil fluorescente do marcador FAPs Sca-1 e MPs marcador ITGA7 da população linage-negativa (Lin-) Na ausência de anticorpos validados por fluoroforeiro e citometria de fluxo para o rato Sca-1 e ITGA7, auto-conjugamos um anticorpo Sca-1::APC de rato e empreendemos uma estratégia alternativa para identificar os PMs. Como o VCAM-1 mostrou-se recentemente um eficiente marcador de seleção positivo único para o isolamento dos MPs³³ de ratos e um anticorpo validado por citometria de fluxo, específico para ratos, com destino ao VCAM-1, utilizamos o VCAM-1 para identificar MPs, em oposição ao ITGA7.

Confirmamos a conjugação e o desempenho bem-sucedidos do anticorpo Sca-1:APC com coloração única de contas de compensação e suspensões celulares geradas a partir de gastrocnemius de rato saudável (Figura 2A, B). Uma titulação de cinco pontos de Sca-1::APC (Figura 2C) foi realizada, além de todos os outros anticorpos (CD31::FITC, CD45::FITC, VCAM-1:PE) utilizado no protocolo (Figura Suplementar 1), para identificar as concentrações ideais. Usando este novo design de painel, FAPs putativos e MPs foram simultaneamente identificados a partir de gastrocnemius saudável(Figura 3), pelo qual foram designadas células positivas para Sca-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) e células positivas para VCAM-1 (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) foram designadas MPs (caixa azul). Também identificamos uma população de células o dobro de positivo para Sca-1 e VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) (Figura 3F; quadrante superior direito).

Validação da identificação de FAPs e MPs pela FACS e cultura celular
Para validar o protocolo apresentado para identificação citométrica de fluxo de FAPs e PMs em músculo esquelético de ratos, buscou-se isolar células vivas para cultura in vitro. Utilizando FACS, os FAPs viáveis e os PMs foram isolados utilizando a mesma estratégia de gating da análise citométrica de fluxo. Aproximadamente 20.000-40.000 FAPs e 30.000-50.000 PMs foram coletados para cultura celular de um único músculo gastrocnemius de um rato de 230 g.

Para confirmar a pureza de cada população, nós co-imunostivemos FAPs e MPs recém-classificados para PDGFRα e Pax7. PDGFRα é o segundo marcador progenitor mesenquimal, além do Sca-1, comumente usado para identificar FAPs^2,7,8. Pax-7 é um marcador bem reconhecido e amplamente utilizado de células de satélite muscular (tronco)⁴¹. A população classificada de FAPs apresentou coloração positiva para PDGFRα sem contaminação por células positivas Pax7(Figura 4A; linha superior). Por outro lado, a população classificada de PMs manchou positivamente para Pax7 com ausência de células positivas PDGFRα(Figura 4A; linha inferior), validando a capacidade de Lin-/Sca-1+/VCAM-1- e Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ perfis de antígenos de superfície celular para isolar populações puras de FAPs e MPs, respectivamente.

Em seguida, nós, os FAPs e os PMs ordenados ao longo de um período de 10-12 dias em condições para induzir diferenciação adipogênica, fibrogênica e miogênica. Até o dia 12, as culturas faps submetidas a condições adipogênicas continham células com uma morfologia semelhante ao fibroblasto ou uma morfologia multilocular semelhante à dos pré-adipócitos brancos com gotículas de gordura (dados não mostrados). A imunostaining para fibroblasto específico proteína-1 (FSP-1) confirmou a diferenciação do fibroblasto, enquanto a coloração para Plin-1 (Perilipin-1; um marcador de adipócito)⁴² e óleo vermelho O confirmou a diferenciação de adipócitos e a presença de triglicérides e lipídios neutros,respectivamente (Figura 4B). A ausência de células contaminantes de uma linhagem miogênica nas culturas faps foi confirmada pela co-imunostaining para a cadeia pesada de miosina (MHC), um marcador de miócitos diferenciados. As culturas faps submetidas à diferenciação fibrogênica (DF) foram avaliadas para a expressão Colágeno tipo 1 (Col1a1), uma das principais collagens derivadas de FAPs⁸. A co-imunossuagem para Col1a1 e MHC no dia 11 revelou uma expressão robusta de colágeno tipo 1 com células positivas de MHC contaminantes(Figura 4B). A confirmação final da pureza da população das FAPs foi realizada por meio da cultura de FAPs na mídia miogênica, para incentivar o crescimento de qualquer PM contaminante. Não foram observadas células positivas de MHC(Figura Suplementar 2A).

Culturas mp submetidas a condições miogênicas demonstraram miócitos maduros expressos em MHC e miótubos multinucleados 12 dias após o revestimento(Figura 4C). A co-imunossucultura das culturas mp com fsp-1, e Plin-1 demonstraram a ausência de fibroblastos ou adipócitos contaminantes, respectivamente. Da mesma forma, a coloração oro não demonstrou contaminação lipídica (Fig. 4C). O Col1a1, que é altamente expresso pelos fibroblastos, também foi relatado como produzido em menor medida por precursores miogênicos e myoblasts, embora existam dados contraditórios na literatura a este respeito^8,43,44. Enquanto a co-imunossuagem de PMs com Col1a1 e MHC revelou diferenciação miófica da nossa cultura mp, não foram encontradas evidências de imunopositividade Col1a1(Figura 4C). Para confirmar ainda mais a pureza da população, as culturas mp foram submetidas a condições adipogênicas ou fibrogênicas para incentivar o crescimento de adipócitos e fibroblastos(Figura Suplementar 2B). Não foram observadas células contaminantes da linhagem FAPs.

Embora tivéssemos demonstrado a capacidade de identificar e classificar populações puras de FAPs e MPs de músculos de ratos, em seguida, procuramos determinar a identidade das células Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ (duplo positivo). Desde a expressão Sca-1 tem sido relatada em uma proporção muito pequena de PMs (aproximadamente 3%) em músculo saudável⁴⁵ e, da mesma forma, poucos FAPs (aprox. 4%) foram relatados para expressar VCAM-1 em músculo saudável¹⁰, imunostaining de células lin-/sca-1+/VCAM-1+ recém-classificadas foi realizada para PDGFRα e Pax7, juntamente com culturando-as em células miogênicas, adipogênicas, e condições fibrogênicas para induzir miogênese, adipogênese e fibrogênese, respectivamente. Verificou-se que as células duplamente positivas eram uma população mista de PMs e FAPs, com células recém-classificadas imunostaining positivas para PDGFRα ou Pax7(Figura Suplementar 3A) e células cultivadas diferenciando-se em miócitos maduros, adipócitos ou fibroblastos(Figura Suplementar 3B,C).

ITGA7 vs VCAM-1 para identificar MPs durante a identificação de FAPs citométricos de fluxo
Embora tenha sido estabelecido um protocolo bem-sucedido para identificação citométrica de fluxo de FAPs e MPs de ratos usando Sca-1 e VCAM-1, respectivamente, procuramos determinar se um anticorpo ITGA7 autoconcolicido poderia ser usado da mesma forma para identificar MPs em vez de VCAM-1, como é padrão no mouse. Um anticorpo ITGA7 específico para ratos foi conjugado ao PE-Cy7 (ver Arquivo Suplementar) e o desempenho do anticorpo foi validado em contas de compensação comercial e suspensões de células únicas geradas a partir de gastrocnemius de ratos (Figura Suplementar 4A-C). O anticorpo ITGA7::P E-Cy7 realizado adequadamente em experimentos de coloração única e FMO(Figura Suplementar 4D). No entanto, quando as suspensões de células gastrocnemius de coloração completa com CD31::FITC, CD45::FITC, Sca-1::APC e ITGA7::P E-Cy7, uma interação tornou-se evidente entre os anticorpos Sca-1::APC e ITGA7::P E-Cy-7. Cultura subsequente das células FACS classificadas Lin-/Sca-1+/ITGA7 (supostos FAPs) e lin-/Sca-1-/IGTA7+ (supostos MPs) (Figura Suplementar 4E) rendeu predominantemente FAPs e com poucos MPs (Figura Suplementar 4F),indicando a interação entre Sca-1::APC e ITGA7::P E-Cy-7 anticorpos impactaram negativamente a especificidade da identificação celular.

Um novo curso de tempo faps em músculo esquelético de longo prazo denervado
Como a dinâmica das FAPs tem sido avaliada no contexto da denervação traumática de curto prazo, nos modelos murinos^11,38, buscamos validar o desempenho do nosso método de isolamento faps de músculos fibrosos saudáveis e severamente atroféricos. Os ratos foram submetidos a uma lesão traumática de longo prazo usando o bem validado modelo de transeção do nervo tibial⁴⁶ com músculo gastrocnemius colhido em quatro pontos de tempo seriais ao longo de 14 semanas após a denervação do membro denervado e membro inervado contralateral (para servir como um controle interno). Como foi relatado anteriormente, o músculo denervado demonstrou atrofia progressiva(Figura 5A,B),com aumento da fibrose e da deposição de gordura(Figura 5C-F) ao longo do tempo⁴⁷.

Nosso protocolo gerou um número adequado de células para análise citométrica de fluxo, embora o gastrocnemius de 12 e 14 semanas tenha pesado aproximadamente 0,2-0,3 g (15-20% do respectivo músculo de controle contralateral)(Figura 5B). Observou-se aumento da regulação das FAPs no músculo gastrocnemius denervado em comparação com o músculo de controle contralateral inervado, mantido durante a duração de 14 semanas do experimento(Figura 6A,B),concordante com a fibrose muscular progressiva e deposição de gordura. A imunostenção sca-1 de seções transversais histológicas musculares confirmou a localização de células expressas de Sca-1 para áreas de alteração fibro-gordurosa em músculos denervados de 14 semanas(Figura 5G),além da expressão de linha de base no interstício entre miofibers em músculo saudável. Um subconjunto distinto de células emergiu na população de FAPs ao longo do tempo após a denervação caracterizada por um aumento robusto no sinal Sca-1 (Sca-1 alto; Figura 6A, caixa vermelha) na análise citométrica de fluxo, em comparação com a expressão basal Sca-1 das FAPs (Sca-1 Med/Low; Figura 6A, caixa verde). A quantificação dessas subpopulações revelou dinâmica diferencial ao longo do tempo; As FAPs altas do Sca-1 aumentaram significativamente em 12 e 14 semanas após a denervação(Figura 6B),compreendendo aproximadamente metade da população total de FAPs(Figura 6C). Em contraste, as FAPs Sca-1 Med/Low foram a subpopulação dominante em 2 e 5 semanas após a denervação(Figura 6C) e mostraram apenas um aumento transitório nos níveis pós-denervação(Figura 6B).

Em contraste com a presença sustentada de FAPs em músculos denervados de longo prazo, os PMs demonstraram uma resposta bifásica esperada à denervação. Inicialmente, os PMs aumentaram em músculos denervados acima do observado no membro de controle, mas em 5 semanas após a denervação a população começou a declinar(Figura 6D). De acordo com o conhecido esgotamento da população de células de satélite musculares em músculos denervados de longo prazo⁴⁷, por 12 semanas os PMs estavam em níveis de linha de base pós-transeção do nervo tibial.

Também foram analisadas a dinâmica da população Lin-/Sca-1+/VCAM-1+(Figura Suplementar 3D-E). Enquanto a frequência de células duplas positivas em relação à população de Lin diminuiu progressivamente em músculos denervados ao longo do tempo, quando a contagem absoluta de células foi determinada por grama de músculo um aumento temporário na população dupla positiva foi observado, antes de cair para ou abaixo dos níveis de linha de base por 14 semanas após a denervação.

Figura 1: Esquema gráfico para identificação, isolamento e cultura de FAPs e MPs: esquema gráfico representando FAPs e Identificação de MPs de gastrocnemius de ratos. As amostras são colhidas e picadas mecanicamente antes de serem submetidas a duas digestões enzimáticas sequenciais. As preparações teciduais são então processadas e filtradas para gerar uma única suspensão celular. Um coquetel de anticorpos fluorescentes conjugados é adicionado a cada amostra que é então executado através de um citômetro de fluxo ou classificador celular para respectivamente identificar ou isolar FAPs e MPs. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Sca-1::APC validação e titulação de anticorpos autoconjugados. Validação de Sca-1::Conjugação de anticorpos APC por coloração única em contas de compensação comercial (A) e suspensões de células únicas geradas a partir de músculo gastrocnemius de rato saudável(B). Populações distintas de contas e células rotuladas Sca-1 são evidentes (caixas pretas). A titulação de anticorpos foi realizada testando cinco concentrações diferentes de Sca-1::APC em suspensões de célula única(C); a concentração ideal foi escolhida com base na maior intensidade de fluorescência com coloração mínima de fundo e considerada dependente de lotes. Uma titulação representativa é mostrada com a concentração ideal específica do lote indicada pela caixa vermelha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Identificação de citometria de fluxo de FAPs e PMs em gastrocnemius de rato. (A-F) Estratégia de gating para análise citométrica de fluxo de FAPs e MPs. (A) As amostras são primeiro fechadas para excluir detritos (caixa preta) bem como para portão para contagem de contas (caixa vermelha). As células são então fechadas para excluir doublets tanto por características de dispersão frontal(FSC) (B) quanto de dispersão lateral (SSC). A viabilidade das células únicas resultantes é avaliada pela coloração com SYTOX Blue(D). Os singlets negativos (ao vivo) SYTOX Blue são então avaliados para o sinal FITC que identifica CD31 e CD45 (Linhagem; Lin) a fim de excluir frações lin+ de análise suplementar (caixa preta Lin-cells) (E). A população de Lin é então avaliada para Sca-1::APC versus VCAM-1::P E sinal(F). Os FAPs são identificados como eventos Lin-/Sca-1+/VCAM-1- (F; caixa vermelha) enquanto os MPs são identificados como eventos Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ (F; caixa azul). Uma população Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ dupla positiva também é evidente (quadrante superior direito). (G) Os controles FMO (Fluorescence Minus One) para CD31::FITC e CD45::FITC demonstram compensação e gating adequadas para células Lin. (H-I) Sca-1::APC versus VCAM-1::P E parcelas de controles FMO demonstram compensação e gating adequadas para FAPs (Sca-1 FMO) e MPs (VCAM-1 FMO). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Cultura celular e imunostaining de FAPs e MPs classificadas. (A) Co-imunostaining para PDGFRα (verde) e Pax7 (vermelho) em FAPs recém-classificados (linha superior) e MPs (linha inferior). Núcleos mancham azul com DAPI. As FAPs expressam exclusivamente PDGFRα e nenhuma célula positiva Pax7 são evidentes, enquanto os MPs expressam exclusivamente Pax7 sem contaminação celular positiva PDGFRα, demonstrando a pureza de ambas as populações classificadas. (B) FAPs no dia 12 em mídia de diferenciação adipogênica (AD) mancha positiva para proteína específica do fibroblasto 1 (FSP-1; verde) e Perilipin-1 (Plin-1; verde), demonstrando fibroblastos e adipócitos diferenciados, respectivamente. Os núcleos estão manchados com DAPI (azul). A coloração de Óleo Vermelho O (ORO) (vermelho) indica a presença de triglicérides neutros e lipídios decorrentes de adipócitos maduros até o dia 12. As FAPs submetidas a mídias de diferenciação fibrogênica (FD) demonstram expressão do Colágeno derivado de FAPs tipo 1 (Col1a1; verde). Os FAPs cultivados em mídia adipogênica ou fibrogênica não co-imunossuria para a cadeia pesada de miosina (MHC, vermelho), indicando a ausência de miócitos contaminantes. (C) Os PMs cultivados em mídia de diferenciação miogênica (MD) no dia 12 exibem manchas MHC positivas (vermelhas) demonstrando a presença de miócitos maduros e miostubos multinucleados fundidos. Os núcleos estão manchados com DAPI (azul). As culturas mp foram claras de contaminação por fibroblasto e adipócito, como indicado pela ausência de co-imunossundo para manchas de FSP-1 (verde), Plin-1 (verde) e ORO. Os PMs cultivados em laminina para acomodar imunostaining Co1a1 não exibem o mesmo grau de fusão do miotube até o dia 12, como ocorre no colágeno. Col1a1 (verde) está ausente das culturas mp. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Atrofia, fibrose e infiltração gordurosa de músculo denervado a longo prazo. (A) Representante colheu músculos gastrocnemius em quatro momentos seriais pós-denervação. Gastrocnemius denotado CONTRA é uma amostra representativa de membros contralaterais de um animal de duas semanas. (B) Quantificação da atrofia muscular pós-denervação expressa como a razão de gastrocnemius gastrocnemius denervado (DEN) peso úmido para o do membro contralateral (CONTRA). (C) Picrosirius Red (PSR) manchado seções histológicas de gastrocnemius colhidas 2 ou 14 semanas pós-denervação demonstram fibrose progressiva. Manchas musculares amarelas, manchas de colágeno vermelhas. (D) Fibrose quantificada pela determinação da área do tecido positivo de RSE em relação à área total do tecido. (E) O O vermelho-óleo (ORO) manchas transversais de gastrocnemius colhidas 2 ou 14 semanas pós-denervação, contra-manchadas com hematoxilina. Lipídios mancham vermelho. (F) Infiltração gordurosa quantificada pela determinação da área de tecido manchado de ORO em relação à área total do tecido. (G) As seções transversais histológicas gastrocnemius colheram 2 ou 14 semanas pós-denervação, imunostidas para laminina (verde) e Sca-1 (vermelho). Laminin mancha positivamente a lamina basal que envolve miofibers individuais. O Sca-1 identifica vários tipos de células progenitoras. Os núcleos estão manchados com DAPI (azul). Inset mostra localização de células Sca-1+ fora da lamina basal em músculo saudável; setas amarelas denotam presença de células Sca-1+ dentro de áreas fibrosas. (Os dados são médios +/- S.D; n=3 para pontos de tempo de 2 e 14 semanas. Dados no painel B analisados pela ANOVA unidirecional, dados nos painéis D e F analisados pela ANOVA bidirecional. O teste pós-hoc de Sidak foi realizado para corrigir para múltiplas comparações. * = P<0,05 entre CONTRA e DEN; # = P<0,05 entre as amostras) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Dinâmica de FAPs e MPs em gastrocnemius de rato denervado a longo prazo. (A) Representante Sca-1::APC versus VCAM-1::P E painéis da população Lin-(CD31-/CD45-) a partir de amostras musculares colhidas 2-, 5-, 12 ou 14 semanas após a denervação. A linha superior mostra parcelas do gastrocnemius denervado (DEN), enquanto a linha inferior mostra aqueles do gastrocnemius contralateral, não operado (CONTRA). As frações Lin-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs (Total) são subdivididas em frações Sca-1 High (caixa vermelha) e Sca-1 Med/Low (caixa verde), enquanto os MPs Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ são mostrados na caixa azul. (B) Quantificação de FAPs (Total, Sca-1 High, Sca-1 Med/Low) em cada ponto de tempo pós-denervação, relatada como a frequência (%) das células Lin (linha superior) e o número de células por grama muscular (linha inferior) normalizadas para o gastrocnemius de controle contralateral. (C) Proporções relativas de Sca-1 Alta e Sca-1 Med/Baixa população da população total de FAPs. (D) Quantificação de PMs em cada ponto de tempo pós-denervação relatado como a frequência (%) das células lin (gráfico esquerdo) e como o número de células por grama muscular (gráfico direito) normalizado para o controle contralateral. (Os dados são médios +/- S.D; n=4 para pontos de tempo de 2 e 12 semanas; n=5 para ponto de tempo de 5 semanas; n=2 para o ponto de tempo de 14 semanas. Dados analisados pela ANOVA unidirecional; Teste pós-hoc Sidak para corrigir para múltiplas comparações. # = P<0,05.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Validação e titulação de anticorpos. Validação de CD31::FITC (A-C), CD45::FITC (D-F) e VCAM-1::P E (G-I) anticorpos comercialmente conjugados em contas de compensação (A,D,G) e suspensões unicelulares de músculo gastrocnemius de rato saudável (B,E,H). Cada anticorpo foi titulado em 5 concentrações diferentes (C,F,I). A concentração ideal foi escolhida com base na maior intensidade de fluorescência com coloração mínima de fundo (caixas vermelhas). Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 2: FaPs e MPs classificados em condições de cultura de diferenciação reversa. (A) FAPs cultivados em mídia de diferenciação miogênica (MD) no dia 12 co-imunossumado para FSP-1 (verde), Plin-1 (verde) ou Col1a1 (verde) e MHC (vermelho) não demonstram contaminação do miócito. As manchas positivas FSP-1 e Col1a1 revelam diferenciação de FAPs aos fibroblastos. A coloração de ORO (vermelha) revela a produção lipídica, embora os adipócitos positivos Plin-1 não sejam facilmente visíveis. Núcleos manchados com DAPI (azul). (B) Morreram os PMs submetidos à mídia de diferenciação adipogênica. MPs cultivados em FAP Growth Media (FAP GM) por 12 dias e co-imunossuídos para FSP-1 (verde) ou Plin-1 (verde) e MHC (vermelho) demonstram miócitos e miotubes diferenciados com ausência de células positivas FSP-1 ou Plin-1. A ausência de coloração oro confirma ainda mais a falta de células adipogênicas na cultura. Os PMs cultivados em mídia de diferenciação fibrogênica (DF) e co-imunossuídos para Col1a1 e MHC mostram miócitos maduros e ausência de células positivas Col1a1. Os PMs cultivados em laminina para acomodar a imunostaining Col1a1 não exibem o mesmo grau de fusão aos miotubes aos 12 dias de cultura, como ocorre no colágeno. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar 3: Lin-/Sca-1+/VCAM-1+células são uma população mista de FAPs e MPs. (A) PDGFRα e Pax7 co-imunostaining de células lin-/sca-1+/VCAM-1+ recém-isoladas mostram uma população mista de células PDGFRα single positive (setas brancas) e Pax7 single positive (seta amarela) identificando FAPs e MPs, respectivamente. (B) As culturas Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ no dia 12 cultivadas em mídia de diferenciação miogênica (MD) contêm células fsp-1 single positive (verde) e MHC single positive (vermelho) que identificam fibroblastos e miócitos/tubos, respectivamente. A ausência de manchas Plin-1 (verde) e ORO (vermelho) indicam a ausência de adipócitos maduros. Co-imunostaining para Col1a1 (verde) e MHC (vermelho) mostram miócitos maduros e fibroblastos. (C) As células Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ no dia 12 cultivadas em mídia de diferenciação adipogênica (AD) também mostram uma mistura de células positivas simples FSP-1 (verde) e MHC (vermelho), mas também com células positivas únicas Plin-1 (verde) e manchas oro presentes, confirmando a diferenciação de fibrosos, miótos e adipóstos. Culturas cultivadas em mídia de diferenciação fibrogênica (DF) mostram miócitos maduros e células positivas únicas Col1a1 (fibroblastos). (D) Representante Sca-1::APC versus VCAM-1::P E painéis da população Lin- (CD31-/CD45-) a partir de amostras musculares deserdadas colhidas 2-, 5-, 12 ou 14 semanas após a denervação; A população lin-/Sca-1+/VCAM-1+ está indicada na caixa roxa. (E) Quantificação das células Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ em quatro pontos de tempo seriais pós-denervação, relatada como a frequência de lin-células (gráfico esquerdo) e células por grama muscular (gráfico direito) normalizadas para o gastrocnemius contralateral. (Os dados são médios +/- S.D; n=4 para pontos de tempo de 2 e 12 semanas; n=5 para ponto de tempo de 5 semanas; n=2 para o ponto de tempo de 14 semanas. Os dados foram analisados pela ANOVA unidirecional; teste pós-hoc Sidak para corrigir para múltiplas comparações; # = P<0,05.) Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 4: ITGA7 como marcador de células miogênicas na citometria de fluxo do músculo esquelético de rato. Validação da conjugação de anticorpos ITGA7::P E-Cy7 por coloração única em contas de compensação comercial (A) e suspensões de células únicas geradas a partir de músculo gastrocnemius de rato saudável(B). Populações de contas e células rotuladas itga7 são evidentes (caixas pretas) (C) A titulação de anticorpos foi realizada testando cinco concentrações diferentes em suspensões de células únicas. Caixa vermelha indica concentração ideal. (D) Os controles de Fluorescência Minus One (FMO) demonstram a ausência de fluorescência nos conjugados de anticorpos, mas a mancha completa das suspensões celulares revela uma interação não específica entre Sca-1::APC e ITGA7::P E-Cy7 (caixa verde). Gating(E)para separar células Lin-/Sca-1+/ITGA7 (supostos "FAPs") e lin-/Sca-1-/IGTA7+ (supostos "MPs"). (F) A co-imunossucultura de culturas celulares classificadas pelo FACS em 12 dias pós-revestimento com Perilipin-1 (verde) e MHC (vermelho) demonstra que ambos os grupos de células classificadas amadureceram predominantemente em adipócitos com poucos miócitos presentes. Clique aqui para baixar este Arquivo.

1. Não manchado

2. Controle de Viabilidade

3. CD31 + CD45 FMO

4. Sca-1 FMO

5. VCAM-1 FMO

6. CD31 + CD45 Única Mancha (Contas)

7. CD31 + CD45 Única Mancha (Células)

8. Mancha única Sca-1 (contas)

9. Mancha única Sca-1 (Células)

10. VCAM-1 Única Mancha (Contas)

11. VCAM-1 Única Mancha (Células)

Tabela 1: Controles de coloração de anticorpos de citometria de fluxo. Complemento completo de controles de coloração de anticorpos. Se o experimento estiver sendo realizado pela primeira vez, controles únicos manchados devem ser executados tanto em contas de compensação quanto em suspensões de células únicas. Para todos os experimentos subsequentes, os controles únicos manchados só precisam ser executados em contas de compensação.

	CD31::FITC (μg)	CD45::FITC (μg)	Sca-1::APC (μg)*	VCAM-1::P E (μg)	Azul SyTOX (μM; Concentração Final)
Controle não detido
	--	--	--	--	--
Controles de uma única mancha
SYTOX Blue (Controle de Viabilidade)	--	--	--	--	1
CD31 & CD45	0.5	0.25	--	--	1
Sca-1	--	--	0.25	--	1
VCAM-1	--	--	--	0.25	1
Fluorescência Menos Um (FMO)
CD31 & CD45	--	--	0.25	0.25	1
Sca-1	0.5	0.25	--	0.25	1
VCAM-1	0.5	0.25	0.25	--	1
Amostras Experimentais
Mancha completa	0.5	0.25	0.25	0.25	1

Tabela 2: Matriz de coloração de anticorpos de citometria de fluxo. A quantidade de anticorpos para coloração de amostras experimentais e de controle para citometria de fluxo é mostrada. Toda a coloração é realizada em um volume total de 100 μL de tampão de lavagem. *A quantidade ideal de Sca-1 autoconco conjugado pode variar dependendo do lote utilizado. Todos os lotes Sca-1::APC recém-conjugados devem ser validados primeiro por uma única mancha tanto por contas de compensação quanto por suspensões de células únicas.

Arquivo complementar: Receitas de reagente. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussion

Um protocolo de isolamento otimizado e validado de FAPs para músculos de ratos é essencial para pesquisadores que desejam estudar modelos de lesões que não são viáveis no camundongo por razões biológicas ou técnicas. Por exemplo, os camundongos não são um modelo animal ideal para estudar lesões crônicas locais ou neurodegenerativas, como a denervação a longo prazo. Biologicamente, a vida útil curta e o envelhecimento rápido dos camundongos dificultam o delineamento preciso do músculo sequalae devido à denervação do fator de confusão do envelhecimento. Do ponto de vista técnico, a redução drástica da massa muscular devido à atrofia grave seria insuficiente para uma análise citométrica de fluxo eficaz. De fato, os protocolos de isolamento dos FAPs do rato sugerem agrupar músculos saudáveis para aumentar melhor o rendimento das FAPs²⁹classificadas . Embora isso resolva a barreira técnica da obtenção de tecido muscular adequado para análise, limita simultaneamente os pesquisadores de avaliar as FAPs em um nível específico dos músculos. Uma vez que grupos musculares específicos variam inerentemente em sua composição tipo de fibra, grau de vascularização e números mitocondriais^47, por exemplo, a combinação de múltiplos músculos diferentes para análise citométrica de fluxo previne a caracterização de FAPs específicas musculares. Em contraste, mostramos que tanto gastrocnemius de rato saudável quanto de longo prazo fornecem uma quantidade adequada de material inicial para citometria de fluxo eficaz. Além disso, em amostras saudáveis, o excedente de músculos pode ser subdividido para múltiplos ensaios a jusante, permitindo que os pesquisadores analisem concomitantemente as características celulares, moleculares e histológicas do mesmo tecido. Por fim, para experimentos que manipulam FAPs em modelos de lesões com terapêutica, análises bem validadas da função física e marcha em alerta e ratos ativos estão disponíveis^21,22,23,24, permitindo avaliação serial da função muscular sem a necessidade de término do animal.

Um obstáculo fundamental na criação de um protocolo de isolamento otimizado das FAPs para o rato foi a disponibilidade de anticorpos. Nossa abordagem inicial buscou copiar o painel de anticorpos e protocolos de estratégia de gating amplamente empregados no mouse^{1,7,8,9,10,11,12,13,14}. Embora comercialmente disponíveis, conjugados, testados em citometria de fluxo e anticorpos validados que reconheçam ratos estavam disponíveis para os marcadores de linhagem CD31 e CD45, nenhum existia para FAPs positivos identificando marcadores Sca-1 ou PDGFRα, bem como para o marcador de seleção negativo ITGA7. Anticorpos primários não julgados específicos desses marcadores e que supostamente eram eficazes na citometria de fluxo estavam disponíveis, mas dos marcadores FAPs Sca-1 e PDGFRα, apenas o anticorpo Sca-1 havia sido validado na literatura publicada na análise citométrica de fluxo das células de ratos⁴⁸. Nós, portanto, selecionamos o Sca-1 como o marcador de seleção positivo para FAPs. A perspectiva de usar anticorpos secundários para delinear marcadores Sca-1 e ITGA7 não era viável por várias razões, mas principalmente porque os únicos anticorpos específicos para ratos para Sca-1 e ITGA7 validados para citometria de fluxo foram gerados nas mesmas espécies hospedeiras. Portanto, a opção restante foi a autocojudação de ambos os anticorpos utilizando kits disponíveis comercialmente.

O processo de escolha de um kit ideal para conjugação de anticorpos foi extenso, pois muitos kits são completamente ou parcialmente intolerantes a vários diluentes tampão (por exemplo, Glicecina, Glicerol, BSA, Azide de Sódio) presentes em anticorpos primários. Além disso, o fluorforeiro fornecido deve ser compatível com os lasers equipados dentro do classificador de fluxo/célula disponível para o pesquisador, e não emitir em um comprimento de onda semelhante a outros fluoroforos usados para identificar outros tipos de células na amostra. A presença de componentes diluídos nos anticorpos primários PDGFRα específicos para ratos que eram pouco compatíveis com os kits de conjugação, foi uma consideração adicional na escolha do Sca-1 como o marcador positivo de seleção de FAPs neste protocolo. Embora esses resultados demonstrem que tanto as conjugações Sca-1::APC e ITGA7::P E-Cy7 resultaram na identificação de populações distintas manchadas de positivo em contas de compensação e células, as primeiras apresentaram decadência na fluorescência mais cedo do que foi anunciada pelo fabricante. É altamente recomendável que os pesquisadores conjugam Sca-1::APC de acordo com as instruções do fabricante, imediatamente antes do uso pela primeira vez (por exemplo, no dia anterior ao experimento) para garantir um sinal robusto, planejar experimentos de acordo com o caso de que um único lote de anticorpo conjugado possa ser usado dentro da janela de eficácia do anticorpo, e validar cada lote por contas de compensação de uma única mancha e titulação de uma única célula. Mais importante, porém, a interação crítica observada entre Sca-1::APC e ITGA7::P E-Cy7 impediu o delineamento preciso das populações de FAPs versus MPs, necessitando de uma estratégia alternativa.

Boscolo Sesillo et al. recentemente demonstraram o sucesso do isolamento citométrico do fluxo das células-tronco musculares de rato usando VCAM-1 como um único marcador de seleção positivo³³ em células negativas CD31, CD45 e CD11b. Com o VCAM-1 como marcador de seleção mp, utilizamos um novo painel de anticorpos para identificar FAPs (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) e MPs (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) e validamos a abordagem com cultura in vitro de células classificadas facs de músculo gastrocnemius saudável. FaPs e PMs recém-isolados imunossumão apenas para seus respectivos marcadores alternativos PDGFRα e Pax7. FaPs cultivados diferenciados em populações de fibroblastos maduros e adipócitos, e PMs em miócitos maduros/miotubes. Não ocorreu contaminação cruzada de FAPs e PMs dentro das culturas. A imunossuagem de seções transversais histológicas confirmou a infiltração de áreas de degradação fibro-gordurosa em músculos denervados com células positivas Sca-1.

Enquanto realizamos a análise citométrica de fluxo de músculo denervado de longo prazo para validar nosso protocolo em músculo severamente atroférico, fibroso e infiltrado por gordura, observamos incidentalmente o surgimento de uma sub-população faps com aumento do sinal Sca-1 (denotado Sca-1 High) em comparação com a expressão Sca-1 da linha de base (denotada Sca-1 Med/Low) ao longo do tempo. Os FAPs altos Sca-1 aumentaram significativamente após a denervação (mais de 12 semanas), enquanto os FAPs Sca-1 Med/Low atingiram o pico mais cedo de 5 semanas antes de declinarem para os níveis de linha de base. A heterogeneidade no fenótipo das FAPs foi relatada^10,30. FaPs com maior expressão Sca-1 mostraram-se diferenciando mais facilmente em adipócitos, e quando expostos à estimulação fibrogênica aumentaram a expressão de Col1a1^30,49. A dinâmica das subsu populações faps observada aqui parece estar em consonância com o curso de tempo de sequelas induzidas por denervação e capacidade regenerativa muscular⁴⁷ e, portanto, pode caracterizar sub-populações faps com diferentes programas celulares. Os FaPs altos Sca-1 tornam-se regulados em pontos de tempo tardio concomitantes com infiltração fibro/gordurosa e um declínio no potencial regenerativo, enquanto as FAPs Sca-1 Med/Low tornam-se reguladas durante a janela regenerativa do músculo e podem ajudar na miogênese regenerativa eficaz. O protocolo de isolamento das FAPs aqui apresentado fornece aos investigadores a capacidade de identificar e isolar essas várias populações para estudos futuros.

Identificamos uma população de células manchando positivamente tanto para sca-1 quanto VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) e verificamos que essa população dupla positiva era uma mistura de FAPs e PMs. A separação dessa população usando um terceiro marcador - ITGA7 - não foi possível devido à interação entre os anticorpos primários Sca-1 e ITGA7. Malecova e colegas relataram uma subsu população de VCAM-1 expressando FAPs que está quase ausente em músculos saudáveis, aumentou transitoriamente com inflamação aguda, e sua persistência em camundongos mdx (modelo de distrofia muscular) foi associada à inflamação muscular crônica e fibrose¹⁰. Em contraste, e embora não seja uma população pura de FAPs, descobrimos que a população Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ diminuiu para ou abaixo dos níveis de linha de base com fibrose muscular crônica em 12 e 14 semanas após a denervação. A denervação não induz a mesma reação inflamatória e tentativas de regeneração de ciclismo experimentadas por camundongos mdx, o que pode explicar as diferenças em nossos resultados. Nossa identificação de PMs na população celular Lin-/Sca-1+/ VCAM-1+ está de acordo com o relato da expressão Sca-1 em uma proporção muito pequena de PMs em músculo saudável, com aumento transitório após lesão durante a proliferação do míbio e posterior retirada do ciclo celular⁴⁵. Assim, enquanto nossa rotulagem de anticorpos e estratégia de gating FACS isola com sucesso populações puras de FAPs e MPs para estudo, experimentos que requerem quantificação baseada em citometria de fluxo dessas populações podem subestimar ligeiramente seus números devido à pequena porcentagem de células em ambas as linhas progenitoras que co-expressam Sca-1 e VCAM-1. Independentemente disso, o protocolo atual demonstra claramente a clássica resposta bifásica dos PMs à lesão de denervação, com regulação de curto prazo e posterior esgotamento da população em músculos denervados a longo prazo. Da mesma forma, o aumento das FAPs relatadas em lesões isoladas de denervação a curto prazo é recapitulado aqui, e mostrou-se ainda mais sustentado usando o modelo de transssecção do nervo tibial de longo prazo.

Em resumo, este protocolo fornece aos pesquisadores um animal anteriormente inexplorado, o rato, no qual usar métodos citométricos de fluxo para estudar simultaneamente FAPs e MPs. Experimentos em camundongos limitados pela quantidade de músculo esquelético, e a necessidade frequente de realizar experimentos terminais para avaliar a força e a função muscular, podem ser prontamente conduzidos no rato maior e com uma gama mais extensa de força não letal e métodos de avaliação funcional. No geral, os estudos faps no rato podem descobrir novos papéis desta população progenitora chave em traumas e doenças musculares agudas e crônicas e periféricos, aumentando posteriormente o potencial para o desenvolvimento de terapias específicas para células.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	Falcon	352235
10 cm cell culture dishes	Sarstedt	83.3902
12-well cell culture plate	ThermoFisher	130185
12 mm glass coverslips, No.2	VWR	89015-724
10 mL Syringe	Beckton Dickenson	302995
15 mL centrifuge tubes	FroggaBio	91014
20 gauge needle	Beckton Dickenson	305176
25mL Serological pipette	Sarstedt	86.1685.001
40µm cell strainer	Fisher Scientific	22363547
50mL centrifuge tubes	FroggaBio	TB50
AbC Total Antibody Compensation Beads	ThermoFisher	A10497
Ammonium Chloride, Reagent Grade	Bioshop	AMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µg	Biotium	92307
Aquatex Aqueous Mounting Medium	Merck	108562
Biolaminin 411 LN	Biolamina	LN411
Bovine Serum Albumin (BSA)	Bioshop	ALB001
Calcium Chloride	Bioshop	CCL444.500
Collagenase Type II	Gibco	17101015
CountBright Plus Absolute Counting Beads	ThermoFisher	C36995
Dexamethasone	Millipore Sigma	D4902
Dispase	Gibco	17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)	Gibco	11995-065	(+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTA	FisherScientific	S311
FACSClean Solution	Beckton Dickenson	340345
FACSDiva Software	Beckton Dickenson	--
FACSRinse Solution	Beckton Dickenson	340346
Fetal Bovine Serum	Sigma	F1051
Flow Cytometry Sheath Fluid	Beckton Dickenson	342003
FlowJo Software	Beckton Dickenson	--
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody	Invitrogen	A21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody	Invitrogen	A21429
Goat Serum	Gibco	16210-064
Ham's F10 Media	ThermoFisher	11550043	(+) Phenol Red (+) L-Glutamine (-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)	Multicell	311-513-CL
Heat Inactivated Horse Serum	Gibco	26050-088
Hemocytometer	Reichert	N/A
HEPES, minimum 99.5% titration	Sigma	H3375
Horse Serum	ThermoFisher	16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1)	Cell Signaling	8915LF
Humulin R	Lilly	HI0210
IBMX	Millipore Sigma	I5879	Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
Isopropanol	Sigma	I9516	Also known as 2-propanol
Lewis Rat, Female	Charles River Kingston	004 (Strain Code)	200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer	Beckton Dickenson	--
Microcentrifuge	Eppendorf	EP-5417R
MoFlo XDP Cell Sorter	Beckman Coulter	--
Mouse Anti-CD31::FITC Antibody	Abcam	ab33858	Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC Antibody	Biolegend	202205	Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE Antibody	Biolegend	200403	Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	N/A	Also known as MF20
Mouse Anti-Pax7 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %	Sigma	HT501128
Oil Red O	Millipore Sigma	O0625
PE-Cy7 Conjugation Kit	Abcam	ab102903
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)	Gibco	10010-023	(-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent Grade	Bioshop	PBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody	Invitrogen	MA5-32347	FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody	Abcam	ab203254
Rabbit Anti-Laminin Antibody	Sigma	L9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody	Abcam	ab3526
Rabbit Anti-Sca-1 Antibody	Millipore Sigma	AB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody	Abcam	ab260043	Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody	Abcam	ab203491
Recombinant Human FGF-basic	Gibco	PHG0266
Sodium Azide	Sigma	S2002
Triton-X-100	Fisher Scientific	BP151
Troglitazone	Millipore Sigma	T2573
Tween-20	Bioshop	TWN510