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Identification, isolement et caractérisation des progéniteurs fibro-adipogéniques (PAF) et des progéniteurs myogéniques (MP) dans le muscle squelettique chez le rat

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/61750
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Keenan Research Center for Biomedical Science, St Michaels Hospital, Unity Health Toronto, 2Department of Medicine and Interdepartmental Division of Critical Care Medicine, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole décrit une méthode pour isoler les progéniteurs fibro-adipogènes (PAF) et les progéniteurs myogéniques (MP) du muscle squelettique du rat. L’utilisation du rat dans les modèles de lésions musculaires offre une disponibilité accrue des tissus du muscle atrophique pour l’analyse et un plus grand répertoire de méthodes validées pour évaluer la force musculaire et la démarche chez les animaux en mouvement libre.

Abstract

Les progéniteurs fibro-adipogènes (PAP) sont des cellules interstitielles résidentes dans le muscle squelettique qui, avec les progéniteurs myogéniques (MP), jouent un rôle clé dans l’homéostasie musculaire, les blessures et la réparation. Les protocoles actuels d’identification et d’isolement des PAF utilisent la cytométrie en flux / tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et des études évaluant leur fonction in vivo à ce jour ont été entreprises exclusivement chez la souris. La plus grande taille inhérente du rat permet une analyse plus complète des PAF dans les modèles de lésions musculaires squelettiques, en particulier dans les muscles gravement atrophiques ou lorsque les chercheurs ont besoin d’une masse tissulaire importante pour effectuer plusieurs essais en aval. Le rat fournit en outre une plus grande sélection de tests fonctionnels musculaires qui ne nécessitent pas de sédation ou de sacrifice animal, minimisant ainsi la morbidité et l’utilisation des animaux en permettant des évaluations en série. Les protocoles de cytométrie en flux/FACS optimisés pour les souris sont spécifiques à l’espèce, notamment limités par les caractéristiques des anticorps disponibles dans le commerce. Ils n’ont pas été optimisés pour séparer les PAF des muscles rat ou hautement fibrotiques. Un protocole de cytométrie en flux / FACS pour l’identification et l’isolement des PAF et des MP du muscle squelettique de rat sain et dénervé a été développé, en s’appuyant sur l’expression différentielle des marqueurs de surface CD31, CD45, Sca-1 et VCAM-1. Comme les anticorps primaires spécifiques au rat et validés par cytométrie en flux sont sévèrement limités, une conjugaison interne de l’anticorps ciblant Sca-1 a été effectuée. À l’aide de ce protocole, la conjugaison Sca-1 réussie a été confirmée et l’identification cytométrique en flux des PAP et des MP a été validée par culture cellulaire et immunocoloration des PAP et des MSP isolés du FACS. Enfin, nous rapportons un nouveau cours temporel des PAF dans un modèle de dénervation prolongée (14 semaines) du rat. Cette méthode permet aux chercheurs d’étudier les PAF dans un nouveau modèle animal.

Introduction

Les cellules progénitrices fibro-adipogènes (MAP) sont une population de cellules progénitrices multipotentes résidentes dans le muscle squelettique qui jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie, la réparation et la régénération musculaires et, inversement, interviennent également dans les réponses pathologiques aux lésions musculaires. Comme leur nom l’indique, les PAF ont été identifiés à l’origine comme une population progénitrice ayant le potentiel de se différencier en fibroblastes et adipocytes1 et étaient censés être les principaux médiateurs de l’infiltration fibro-graisseuse du muscle squelettique dans les blessures et les maladies chroniques. Une étude plus approfondie a révélé que les PAF sont en outre capables d’ostéogenèse et de chondrogenèse2,3,4. Ainsi, ils sont plus largement notés dans la littérature comme des progéniteurs mésenchymateux oustromaux 3,5,6,7,8. Dans les lésions musculaires squelettiques aiguës, les PAF aident indirectement à la myogenèse régénérative en proliférant transitoirement pour fournir un environnement favorable aux cellules satellites musculaires activées et à leurs homologues progéniteurs myogéniques (MP) en aval1,9,10. Parallèlement à une régénération réussie, les PAF subissent une apoptose, ramenant leur nombre aux niveaux de base1,9,10,11. En revanche, dans les lésions musculaires chroniques, les FAP remplacent les signaux pro-apoptotiques, ce qui entraîne leur persistance9,10,11 et une réparation musculaire anormale.

Des études in vivo évaluant les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels les PAF interviennent dans les réponses musculaires ont utilisé des modèles animaux murins à ce jour1,7,9,10, 11,12,13,14. Bien que les souris génétiquement modifiées soient des outils puissants à utiliser dans ces analyses, la petite taille de l’animal limite la disponibilité des tissus pour l’étude dans des modèles de lésions localisées à long terme où l’atrophie musculaire peut être profonde, comme la dénervation traumatique. En outre, la mesure de la force musculaire et de la fonction physique nécessite des mesures ex vivo ou in situ qui nécessitent l’arrêt de la souris, ou des méthodes in vivo qui nécessitent une intervention chirurgicale et / ou une anesthésie générale pour permettre l’évaluation de la performance contractile musculaire15,16,17,18,19,20 . Chez le rat, il existe des analyses fonctionnelles musculaires bien validées et utilisées à l’échelle mondiale, en plus des analyses de comportements moteurs plus complexes tels que l’analyse de la démarche (par exemple, indice de la fonction sciatique, analyse CatWalk) et sont effectuées chez des animaux éveillés et en mouvement spontané21,22,23,24 . Cela optimise en outre les principes de morbidité minimale dans l’expérimentation animale et le nombre d’animaux de recherche utilisés. Le rat offre ainsi à l’investigateur des PAF la flexibilité supplémentaire d’un plus grand volume musculaire blessé pour les analyses protéiques et cellulaires et la capacité d’entreprendre des évaluations en série de l’activité et des comportements fonctionnels statiques et dynamiques complexes musculaires chez l’animal alerte.

Les PAF ont principalement été identifiés et isolés à partir d’échantillons de muscles entiers à l’aide de la cytométrie en flux et du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) respectivement. Il s’agit de tests laser capables d’identifier plusieurs populations cellulaires spécifiques en fonction de caractéristiques telles que la taille, la granularité et une combinaison spécifique de marqueurs de surface cellulaire ou intracellulaires25. Ceci est très avantageux dans l’étude d’un système d’organes tel que le muscle squelettique, car l’homéostasie et la régénération sont des processus complexes et multifactoriels coordonnés par une pléthore de types de cellules. Une étude séminale a identifié des PAF, ainsi que des MP, en utilisant des méthodes de cytométrie en flux dans le muscle squelettique de souris1. Ils ont démontré que les PAF sont de nature mésenchymateuse, car ils manquaient d’antigènes de surface spécifiques aux cellules d’origine endothéliale (CD31), hématopoïétique (CD45) ou myogénique (Intégrine-α7 [ITGA7]), mais ont exprimé le marqueur de cellules souches mésenchymateuses Sca-1 (antigène de cellules souches 1)1 et différenciés en cellules fibrogéniques et adipogéniques en culture. D’autres études ont démontré l’isolement réussi des progéniteurs mésenchymateux dans les muscles sur la base de l’expression d’un marqueur alternatif de cellules souches, le récepteur alpha du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRα)2,7,8 et une analyse plus approfondie a révélé qu’il s’agissait probablement de la même population cellulaire que les FAPs3. Les PAF sont maintenant couramment identifiés en cytométrie en flux en utilisant Sca-1 ou PDGFRα comme marqueur de sélection positif1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . L’utilisation de PDGFRα est préférentielle pour les tissus humains cependant, car un homologue humain direct de Sca-1 murin n’a pas encore été identifié32. En outre, d’autres protéines de surface cellulaire ont été rapportées comme marqueurs des MP (par exemple, VCAM-1), offrant une alternative potentielle à ITGA7 comme indicateur des cellules de lignée myogénique pendant l’isolement des PAF33.

Alors que la cytométrie en flux / FACS est une méthodologie puissante pour étudier le rôle et le potentiel pathogène des FAP dans le muscle squelettique1,9,10,11,13,29, elle est limitée techniquement par la spécificité et l’optimisation de ses réactifs requis. Étant donné que l’identification cytométrique en flux et l’isolement des PAP ont été développés et menés dans des modèles animaux murins1,9, 10,11,29, cela pose des défis aux chercheurs qui souhaitent étudier les PAE dans d’autres organismes modèles. De nombreux facteurs - tels que la taille optimale des tissus à traiter, ainsi que la spécificité et la disponibilité des réactifs et / ou des anticorps - diffèrent selon les espèces utilisées.

En plus des obstacles techniques à l’étude des PAP dans un nouveau modèle animal, ils ont été largement étudiés dans un contexte aigu et toxique - généralement par injection chimique intramusculaire ou cardiotoxine. L’évaluation de la dynamique à long terme des PAF se limite principalement à l’évaluation de la dystrophie musculaire de Duchenne, à l’aide du modèle de souris mdx9,10,11, et de modèles de lésions musculaires combinées telles que la déchirure massive de la coiffe des rotateurs où la transsection et la dénervation simultanées du tendon sont effectuées sur la musculature del’épaule26,27,28 . La réponse des PAF à la seule insulte de dénervation traumatique chronique, un phénomène fréquent dans les accidents du travail dans l’industrie lourde, l’agriculture et dans les traumatismes à la naissance (lésion du plexus brachial)34,35,36,37 avec une morbidité significative, n’a pas été aussi bien caractérisée, souvent limitée à une période de courte durée11,38.

Nous décrivons une méthode pour identifier et isoler les PAP et les MP des muscles squelettiques sains, sévèrement atrophiques et fibrotiques chez le rat. Tout d’abord, l’identification des MAP CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- et des MP CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ à l’aide d’un protocole de digestion tissulaire et de coloration par cytométrie en flux est démontrée et la validation ultérieure de nos résultats est effectuée par culture et coloration immunocytochimique de cellules isolées du FACS. En utilisant cette méthode, nous rapportons également un nouveau cours temporel des PAF dans un modèle de lésion de dénervation isolée à long terme chez le rat.

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Protocol

Les enquêteurs qui appliquent ce protocole doivent obtenir la permission de leur comité local d’éthique et de soins des animaux. Tous les travaux sur les animaux ont été approuvés par le Comité des soins aux animaux de Toronto unity de l’Hôpital St. Michael’s (ACC no 918) et ont été effectués conformément aux lignes directrices établies par le Conseil canadien des soins aux animaux (CCPA). Un schéma du protocole de cytométrie en flux est illustré à la figure 1. Si l’application en aval est FACS et la culture cellulaire ultérieure, toutes les étapes doivent être complétées avec une technique aseptique appropriée.

1. Récolte musculaire

  1. Anesthésier les rats à l’aide d’un anesthésique approprié et les sacrifier selon les directives locales du vivarium et du comité d’éthique animale. Ce protocole récolte le muscle gastrocnémien de rats Lewis femelles adultes (200-250 g), à titre d’exemple. Les rats ont été anesthésiés à l’aide de 2-3% d’isoflurane et ont été sacrifiés par injection intracardiaque de T61.
  2. Une fois que l’animal a été sacrifié, rasez tout le membre postérieur pour faciliter la localisation du muscle et minimiser la contamination de la fourrure du tissu récolté.
  3. À l’aide d’un scalpel stérile, faites deux incisions dans la peau: la première autour de la circonférence de l’articulation de la cheville et la seconde vers le haut de la ligne médiane de l’aspect médian du membre postérieur de la cheville à la hanche.
  4. Pelez la peau et les couches musculaires superficielles pour révéler le gastrocnémien sous-jacent, qui prend naissance aux condyles médiaux et latéraux du fémur et s’insère au tendon d’Achille.
  5. Utilisez une dissection contondante pour séparer le gastrocnémien du tissu environnant, en manipulant le muscle uniquement par le tendon pour éviter les blessures par écrasement.
  6. Séparez le gastrocnémien de son insertion en transectant le tendon d’Achille aussi distalement que possible avec des ciseaux tranchants. Une fois coupé, saisissez le tendon d’Achille avec une pince et pelez doucement le gastrocnémien de l’os sous-jacent. Toujours en tenant le muscle avec une pince dans une main, localisez les deux origines du gastrocnémien et coupez les condyles fémoraux médiaux et latéraux.
  7. Épongez doucement le gastrocnémien excisé contre un morceau de gaze stérile pour enlever autant de sang que possible. Coupez le muscle sur une surface stérile et enlevez tout excès de tissu conjonctif ainsi que le tendon d’Achille.
  8. Placez le muscle dans un bateau de pesage et pesez à l’aide d’une balance de précision. Ce protocole est optimisé pour digérer les muscles avec un poids humide allant de 200 à 600 mg. Les opérateurs peuvent subdiviser les tissus récoltés en excès pour d’autres essais en aval, s’ils le souhaitent.
  9. Divisez doucement le muscle récolté pour l’utiliser pour la cytométrie en flux en 3-4 petits morceaux (environ 1-2 cm3)et immergez-le dans 1x PBS glacé. Garder froid sur la glace jusqu’à ce que tous les échantillons aient été récoltés.

2. Digestion musculaire

  1. Retirer le muscle du PBS et le placer dans un plat stérile de culture cellulaire de 10 cm. Déchirez doucement et hachez le tissu avec une pince jusqu’à ce que les morceaux mesurent environ 3-4 mm 3 , en enlevantautantde tissu conjonctif que possible. Une fois bien haché, transférer dans un tube conique stérile de 50 mL contenant 6 mL de DMEM + 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S).
  2. Ajouter 10 μL de solution de CaCl2 de 300 mM à 365 μL de solution de collagénase II (concentration en stock de 4800 U/mL) pour activer l’enzyme collagénase. Ajouter la solution de collagénase II activée au tube conique de 50 mL contenant la boue tissulaire. La concentration finale de collagénase II est de 250 U/mL.
  3. Incuber les tubes dans un agitateur pendant 1 h à 37 °C, 240 x g, en veillant à tourbillonner manuellement toutes les 15 minutes pour déloger tout tissu qui a adhéré sur le côté du tube.
  4. Après 1 h, retirer les tubes de l’agitateur et ajouter ce qui suit par échantillon : 100 μL de collagénase II (4 800 U/mL) et 50 μL de Dispase (4,8 U/mL).
  5. Échantillons de pipette à l’aide d’une pipette sérologique 15 à 20 fois jusqu’à ce que la solution soit homogène. Si vous traitez plusieurs échantillons, utilisez une pipette stérile distincte pour chaque échantillon afin d’éviter la contamination croisée de l’échantillon.
  6. Incuber à nouveau dans un agitateur pendant 30 min à 37 °C et 240 x g. Après 15 min, secouez les échantillons à la main pour déloger le tissu adhérent du côté du tube.

3. Génération d’une suspension monocellulaire

  1. Cisaillez lentement les échantillons à travers une seringue de 10 mL avec une aiguille de 20 G pendant 10 cycles.
    REMARQUE: Un cycle consiste à prendre une solution musculaire dans une seringue et à la réinjecter dans un tube. Assurez-vous de minimiser les bulles en terminant le cisaillement lentement, car une mousse excessive peut entraîner une mort cellulaire supplémentaire39.
  2. Placez une passoire cellulaire de 40 μm sur un tube conique stérile de 50 mL et mouillez-la en pipetant 5 mL de DMEM + 10% FBS et 1% P / S.
  3. Pipette 1 mL de l’échantillon à la fois à travers la passoire cellulaire.
  4. Lavez la crépine à cellules en pipetant le DMEM avec 10% de FBS et 1% de P / S à travers la crépine pour porter le volume total dans le tube à 25 mL.
  5. Diviser 25 mL de l’échantillon également en deux tubes coniques de 15 mL et centrifuger à 15 °C, 400 x g pendant 15 min.
    REMARQUE: La division de la solution musculaire en deux tubes coniques de 15 mL assure une meilleure récupération cellulaire après centrifugation par rapport à un seul tube.
  6. Aspirer le surnageant et suspendre à nouveau la pastille dans 1 mL 1x tampon de lyse RBC (voir Fichier supplémentaire)à température ambiante pendant 7 min pour éliminer les érythrocytes.
  7. Porter le volume à 10 mL avec 9 mL de tampon de lavage (voir Fichier supplémentaire)et des tubes d’essorage à 400 x g,15 °C pendant 15 min.
  8. Aspirer le surnageant et recombiner les granulés en les remettant en suspension dans un tampon de lavage de 1 mL.
  9. Transférer un volume approprié de cellules dans un tube de microcentrifugation séparé de 1,5 mL et mélanger avec un colorant bleu trypan. Comptez les cellules vivantes au microscope optique à l’aide d’un hémocytomètre.

4. Coloration des anticorps pour la cytométrie en flux

REMARQUE: L’anticorps Sca-1 doit être conjugué à APC avant les expériences de cytométrie en flux / FACS, conformément aux instructions du fabricant. Les performances doivent être validées pour chaque lot de conjugués (Figure 2). Les conjugaisons finales peuvent être conservées dans des aliquotes de 20 μL à -20 °C et sont stables pendant trois semaines. Reportez-vous au dossier supplémentaire pour connaître le protocole de conjugaison complet.

  1. Pour la cytométrie en flux, transférer 1-2 x 106 cellules par échantillon expérimental dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL. Porter le volume jusqu’à 1 mL avec un tampon de lavage et placer sur de la glace.
  2. Pour chaque expérience, mettre en place les contrôles requis suivants : i) non colorés et ii) contrôles de viabilité pour sélectionner avec précision la population de cellules vivantes; iii) contrôles de fluorescence moins un (FMO) sur les suspensions à cellule unique afin de définir des portes précises pour les fractions CD31-/CD45-, les PAP et les MP; et iv) des billes de compensation à coloration unique pour corriger les débordements de fluorescence entre les canaux.
    1. Pour tous les contrôles cellulaires, aliquote 5 x 105 - 1 x 106 cellules dans 1 mL de tampon de lavage dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et placer sur la glace.
    2. Pour les témoins de perles, ajoutez 1 goutte de perles de compensation positive (~1,5 x 105 perles par goutte) à chaque tube de microcentrifugation de 1,5 mL étiqueté. L’ensemble des contrôles est répertorié dans le tableau 1.
      REMARQUE: Si l’expérience est réalisée pour la première fois, exécutez des témoins à coloration unique pour chaque anticorps conjugué sur des suspensions unicellulaires (en plus des témoins non colorés, viables, de compensation à coloration unique et FMO) afin d’évaluer la population colorée positive dans les cellules et de valider la coloration observée sur les perles de compensation. Validez chaque préparation Sca-1::APC fraîchement conjuguée en effectuant une coloration unique sur les billes de compensation et les suspensions à cellule unique. Reportez-vous au tableau 1 pour obtenir la liste complète des contrôles de coloration.
  3. Pour préparer le contrôle de viabilité, transférer la moitié du volume de cellules du tube de « viabilité » vers un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Étiquetez ce tube « Mort ».
  4. Incuber le tube « mort » à 65 °C pendant 2-3 min pour tuer les cellules, puis placer sur la glace. Après 2-3 min, re-combiner les cellules mortes avec les cellules vivantes restant dans le tube de contrôle de la viabilité. Cette population de cellules sera utilisée pour fixer des valeurs de compensation (si nécessaire) et définir correctement les portes du colorant de viabilité.
  5. Centrifuger les suspensions monocellulaires (échantillons expérimentaux et témoins) à 500 x g,4 °C pendant 5 min.
  6. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans un tampon de lavage de 100 μL.
  7. Ajouter des anticorps, selon l’échantillon expérimental ou le contrôle. Reportez-vous à la matrice de coloration (Tableau 2) pour obtenir des renseignements sur les combinaisons et les quantités d’anticorps.
  8. Faire glisser doucement chaque échantillon pour assurer un mélange complet et incuber sur de la glace dans l’obscurité pendant 15 min. Pour les perles de compensation, incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 15 min.
  9. Pour les échantillons expérimentaux et témoins de suspension à cellule unique, porter le volume à 1 mL en ajoutant un tampon de lavage de 900 μL. Pour les contrôles de billes de compensation, porter le volume à 1 mL avec 900 μL de 1x PBS.
  10. Centrifuger des échantillons de suspension monocellulaire à 500 x g,4 °C pendant 5 min. Le cordon de compensation de la centrifugeuse contrôle à 300 x g,4 °C pendant 5 min.
  11. Pour tous les échantillons de suspension à cellule unique, aspirer et jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans un tampon de lavage de 300 μL. Pour les contrôles de perles de compensation, aspirer et jeter le surnageant, suspendre à nouveau la pastille dans 300 μL de 1x PBS, puis ajouter 1 goutte (~1,5 x 105) de perles de compensation négative.
  12. Conservez tous les échantillons de suspension monocellulaire sur de la glace sous du papier d’aluminium et procédez à l’acquisition cytométrique en flux. Les commandes de perles de compensation doivent également être protégées de la lumière, mais peuvent être maintenues à température ambiante.
    REMARQUE : Si le critère d’évaluation expérimental est l’identification des PAP par cytométrie en flux, veuillez suivre les étapes 5.1.1 à 5.1.11. Si le point final est l’isolement cellulaire via FACS pour la culture et la coloration, veuillez suivre les étapes 5.2.1 à 5.2.9 et les sections 6 à 7.

5. Cytométrie en flux et tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

  1. Cytométrie en flux
    REMARQUE: Ce protocole utilise un cytomètre de flux de paillasse équipé de lasers de 405 nm, 488 nm et 640 nm capables de distinguer simultanément 10 couleurs différentes. Les filtres passe-bande et leurs fluorochromes associés utilisés dans ce protocole sont les suivants : 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) et 670/30 (APC). Les tensions pour chaque détecteur sont les suivantes: FSC 700; SPC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX Bleu 360; APC 570. Assurez-vous d’être formé au bon fonctionnement du cytomètre en flux ou du trieur de cellules avant utilisation.
    1. Assurez-vous que le cytomètre a été allumé pendant 10 à 20 minutes avant utilisation et qu’il a été amorcé en nettoyant séquentiellement avec des solutions de liquide propre, rinçage et gaine pendant 30 à 45 s chacune. Terminer par un rinçage avec dH2O. S’assurer qu’un volume adéquat de liquide de gaine a été ajouté au récipient de stockage pour maintenir un débit d’échantillon approprié tout au long de l’acquisition.
    2. Mettre en place la stratégie de contrôle pour identifier les PAP et les MP comme indiqué à la figure 3.
      REMARQUE : Les PAF et les MP sont identifiés par la stratégie de contrôle hiérarchique suivante : i) SSC-A vs FSC-A (zone de dispersion des cellules latérales par rapport à la zone de dispersion des cellules avant pour séparer les cellules par rapport aux débris), ii) FSC-W vs FSC-H (largeur de diffusion des cellules avant par rapport à la hauteur de dispersion des cellules avant pour distinguer les singlets des doublets dans le paramètre FSC), iii) SSC-W vs SSC-H (largeur de diffusion des cellules latérales par rapport à la hauteur de dispersion des cellules latérales pour distinguer les singlets des doublets dans le paramètre SSC), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (pour distinguer les singlets vivants des singlets morts), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (pour exclure les cellules CD31+ et CD45+ d’une analyse plus approfondie), et vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E du CD31-/CD45- (Lignée; Lin-) population (identification des PAF et des députés). Les PAP sont identifiés comme des événements CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- et les MP sont identifiés comme des événements CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+.
    3. Exécutez d’abord chaque contrôle de bille de compensation à simple coloration à travers le cytomètre à basse vitesse pour générer des valeurs de compensation utilisées pour corriger tout débordement de fluorescence entre les canaux. Évaluez la compensation en comparant le signal fluorescent de chaque contrôle dans son propre détecteur (par exemple, SSC-A vs APC pour les billes à coloration unique Sca-1::APC) ainsi que tous les autres détecteurs. Il devrait y avoir deux populations distinctes (une avec un signal négatif et une avec un signal positif) dans le détecteur approprié et seulement une population négative dans tous les autres détecteurs. Réglez la porte d’arrêt sur 10 000 événements de perles de compensation et enregistrez les données.
      REMARQUE: Entre l’acquisition de chaque échantillon, assurez-vous de faire passer dH2O à travers le cytomètre pendant 10 à 20 secondes pour éviter toute contamination d’échantillon à échantillon.
    4. Ensuite, traitez les échantillons de contrôle non colorés et de viabilité pour qu’ils s’appuient correctement sur des cellules individuelles vivantes. Définissez la porte d’arrêt sur 10 000 événements singlet et enregistrez les données.
      REMARQUE : Environ 5 minutes avant l’acquisition de chaque échantillon de suspension à cellule unique, à l’exception de l’échantillon non coloré, ajouter 1 μL de colorant de viabilité SYTOX Blue (concentration de travail de 300 μM diluée à partir de 1 mM de solution mère) à chaque échantillon et faire glisser doucement pour mélanger (concentration finale de 1 μM).
    5. Ensuite, acquérez les échantillons de contrôle de suspension à cellule unique restants. Évaluer chaque contrôle FMO avec son tracé approprié dans la stratégie de contrôle (Figure 3). Par exemple, évaluez le signal FITC du FMO CD31+CD45 pour vous assurer d’une grille CD31-/CD45- précise. Un exemple optimal est illustré à la figure 3G. Si le protocole est exécuté pour la première fois, des contrôles à coloration unique sur les cellules doivent être exécutés avant l’acquisition des contrôles FMO.
    6. Évaluer le signal fluorescent de chaque échantillon de cellule colorée dans son détecteur approprié ainsi que dans tous les autres détecteurs pour valider la compensation appropriée. Réglez la porte d’arrêt sur 10 000 événements singlet en direct et enregistrez-les sur le logiciel.
    7. Une fois que tous les témoins (suspensions à cellule unique et billes) ont été traités, préparez tous les échantillons expérimentaux en mesurant et en enregistrant d’abord le volume de chaque échantillon. Ces mesures seront utilisées pour quantifier avec précision les PAF et les MP, comme décrit à l’étape 5.1.11. Ensuite, ajoutez 50 μL de billes de comptage de précision et mélangez doucement en pipetant de haut en bas 2-3 fois.
    8. Exécutez brièvement le premier échantillon expérimental pour valider l’identification de la population de billes de comptage. Cette population apparaît comme un petit groupe distinct distinct de la population cellulaire générale sur le diagramme FSC-A vs SSC-A(Figure 3A,encadré rouge). Créez une porte autour de la population de perles de comptage. Ensuite, acquérez des données pour chaque échantillon expérimental en les traitant à travers le cytomètre à basse vitesse. Réglez la porte d’arrêt sur 10 000 événements de perles de comptage et enregistrez.
      REMARQUE : Les enquêteurs peuvent également identifier les billes de comptage en mettant en place une placette supplémentaire évaluant la SSC-A par rapport à l’un des détecteurs, car les perles de comptage sont fluorescentes dans tous les détecteurs.
    9. Une fois que tous les échantillons ont été traités, nettoyez le cytomètre en utilisant les protocoles appropriés. Exportez toutes les données à des fins d’analyse.
    10. Ouvrez tous les fichiers de données sur un logiciel d’analyse de cytométrie en flux approprié. Définissez la stratégie de contrôle utilisée pour l’acquisition de données, comme décrit à l’étape 5.1.2. Examinez les contrôles dans le même ordre que dans l’acquisition de données (p. ex., non taché, viabilité, tache unique, puis contrôles FMO) pour revalider la stratégie de contrôle. Une fois que des portes précises ont été définies à l’aide de commandes FMO, appliquez les portes à tous les échantillons expérimentaux. Exportez les données brutes sous forme de feuille de calcul à des fins de quantification.
    11. Calculer le nombre de PAF et de MSP dans chaque échantillon expérimental à l’aide des perles de comptage :
      Equation 1
      où le nombre de cellules acquises est le nombre d’événements enregistrés de la population cellulaire pertinente (p. ex. PAF ou MP) sur le logiciel d’acquisition; Le nombre de perles acquises est le nombre d’événements enregistrés de comptage des perles sur le logiciel d’acquisition; Le volume de perles de comptage est le volume de solution de billes de comptage ajouté à l’étape 5.1.7; Le volume de l’échantillon est le volume de chaque échantillon expérimental coloré avant l’ajout de perles de comptage. La concentration de billes est le nombre de billes par solution μL; cette valeur se trouve sur la fiche technique du produit.
  2. FACS - tri pour la culture cellulaire
    REMARQUE: Ce protocole effectue FACS sur un trieur de cellules équipé de 4 lasers (UV, Violet, Bleu, Rouge) capable de distinguer simultanément 11-14 couleurs. Suivez le protocole expérimental de coloration de l’échantillon (section 4) et de cytométrie en flux, à l’exception des étapes 1 à 3 décrites ci-dessous, pour optimiser le flux de travail FACS :
    1. Augmenter la concentration de cellules dans les échantillons expérimentaux à trier à 7 x 106 cellules/mL pour générer des rendements robustes de PAE et de MSP.
    2. Pour tenir compte de cette augmentation significative de la concentration cellulaire, doubler toutes les concentrations d’anticorps dans les échantillons expérimentaux à trier.
    3. Traiter les échantillons finaux de cellules colorées à travers un bouchon de crépine cellulaire de 40 μM fixé à un tube de polystyrène de 5 mL immédiatement avant le tri afin de réduire l’agglutination des cellules et d’augmenter les rendements de tri.
    4. Collectez les PAP et les MP de rats vivants directement à partir du trieur de cellules dans un tube de collecte de polypropylène de 5 mL contenant 1 mL de sérum bovin stérile à 100 % fœtal (FBS). Gardez les cellules sur la glace jusqu’à ce que le tri soit terminé.
      REMARQUE : Si vous effectuez un FACS à un endroit hors site, transférez toutes les cellules triées sur de la glace et dans un conteneur sécurisé et couvert.
    5. En travaillant dans une armoire de biosécurité stérile (ESB), porter le volume de cellules triées jusqu’à 7 mL avec des milieux de croissance appropriés (p. ex., milieux de croissance FAP (FAP GM) pour les PAP triés et milieux de croissance MP (MP GM) pour les MP triés; voir Fichier supplémentaire pour les recettes) et centrifuger à 500 x g, 4 °C pendant 7 min pour éliminer autant de tampon de lavage résiduel que possible.
    6. Remettre en suspension les granulés dans 1 mL de milieu de croissance et de plaque appropriés dans une plaque de 12 puits contenant un couvercle/puits en verre stérile recouvert de collagène de 12 mm pour une immunocoloration ultérieure (voir rubrique 6).
      REMARQUE: Si la coloration immunocytochimique pour le collagène, plaque trier les cellules dans une plaque de 12 puits contenant un couvercle / puits stérile en verre recouvert de laminine de 12 mm, au lieu d’un revêtement en collagène. Si des expériences d’immunocytochimie de progéniteurs immédiatement isolés sont nécessaires, ensemencez les PAP et les MSP à une densité de 15 000 cellules par cm2 et passez directement à l’étape 6.1. Pour les cultures à long terme induisant la différenciation des progéniteurs, semer des FAP à une densité de 5 000 cellules par cm2,et des MPs à une densité de 7 500 cellules par cm2.
    7. Incuber des cellules à 37 °C et 5 % deCO2 dans un incubateur de culture cellulaire. Après 72 h dans la culture, changez la moitié des médias. Changez complètement le média tous les 2-4 j après.
    8. Pour induire le développement des myocytes, passez les cultures de MP au milieu de différenciation MP (MD) au jour 9 de la culture. Pour induire des adipocytes, passez les cultures de FAP à un milieu de différenciation adipogénique (MA) FAP au jour 10 de la culture.
    9. Pour induire la fibrogenèse, les PAP peuvent être basculés vers des milieux de différenciation fibrogénique (FD) à des moments variables pendant la culture, ou bien, peuvent être ensemencés directement dans des milieux FD après isolement (étape 5.2.6) (Voir fichier supplémentaire pour toutes les recettes de milieux).

6. Immunocytochimie des PAP et des MP en culture

  1. Pour valider le tri cellulaire et démontrer la pureté des cultures de FAPs et de MPs, l’immunocoloration avec des marqueurs spécifiques au type cellulaire, y compris PDGFRα (marqueur FAPs), Pax-7 (marqueur cellulaire souche musculaire [satellite]), Protéine spécifique des fibroblastes (FSP-1, marqueur fibroblastique), Perilipin-1 (Plin-1, marqueur adipocytaire), Collagène de type 1 (Col1a1, indicateur de fibrose), Chaîne lourde de myosine (CMH, marqueur myocytaire mature).
    1. Pour l’immunocoloration des cellules fraîchement triées, centrifuger la plaque de 12 puits à 200 x g pendant 3 min à température ambiante pour faciliter l’adhérence des cellules au couvercle/puits. Cette étape n’est pas nécessaire pour les cultures à long terme. Supprimer les milieux de culture.
    2. Pour l’immunocoloration avec FSP-1, fixez les cellules avec 1 mL de méthanol à 100 % (MeOH) pendant 2 min à 4 °C. En cas d’immunocoloration pour PDGFRα, Plin-1, Pax7 ou Col1a1, fixer des cultures cellulaires avec 1 mL 4% PFA dans 1x PBS pendant 15 min à température ambiante. L’immunocoloration du CMH tolère l’un ou l’autre fixateur.
      REMARQUE: Pour les cellules fixées au méthanol, sautez l’étape 6.2 et passez à l’étape 6.3.
  2. Aspirer 4% de PFA et laver rapidement les cultures cellulaires 3-4 fois avec 1x PBS. Ajouter 1 mL de glycine 100 mM dans 1x PBS et incuber pendant 10 min à température ambiante pour inactiver le PFA résiduel. Aspirer et laver 1-2 fois avec 1x PBS.
    REMARQUE: Les cellules peuvent être laissées à ce stade dans 2 mL de 1x PBS, enveloppées dans un film alimentaire et stockées à 4 ° C pendant 7 à 10 jours maximum.
  3. Après le lavage, ajouter 1 mL de Triton-X à 0,1 % dans 1x PBS et incuber pendant 20 min pour perméabiliser les membranes cellulaires.
  4. Lavez les puits 2-3 fois avec 1-2 mL de 1x PBS puis bloquez les cellules avec 1 mL de 1x PBS + 3% BSA par puits pendant 1 h à température ambiante.
  5. Pipette 80 μL d’anticorps primaire dilué dans 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 neat, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/mL) sur un morceau de parafilm scotché à un récipient mobile. À l’aide de pinces fines stériles, soulevez soigneusement le couvercle hors du puits et inversez la goutte de solution d’anticorps. Incuber le couvercle avec deux morceaux humides d’essuie-tout et de couvrir le récipient dans un film plastique pour éviter l’évaporation de la solution d’anticorps. Incuber toute la nuit à 4 °C.
    REMARQUE: La coloration des couvertures à l’extérieur du puits utilise moins d’anticorps (~ 80 μL) que la coloration à l’intérieur du puits (500 μL minimum).
  6. Le jour 2, laissez les couvercles à température ambiante pendant 30 minutes pour les réchauffer. En utilisant soigneusement les pinces à droite et transférer les couvercles vers leurs puits respectifs (cellules tournées vers le haut) et laver 2-3 fois avec 1-2 mL de 1x PBS pendant 2 min chacun pour enlever autant d’anticorps primaires que possible.
  7. En utilisant la même technique de coloration qu’avec la coloration des anticorps primaires, les cellules de coloration avec l’anticorps secondaire Alexa Fluor 488 anti-lapin de chèvre (1:400) pour détecter FSP-1, Plin-1, Col1a1 ou PDGFRα et l’anticorps secondaire alexa Fluor 555 anti-souris de chèvre (1:300) pour détecter le CMH ou Pax-7. Incuber les cellules pendant 1 h à température ambiante et protéger les cellules de la lumière.
  8. Renvoyer les cellules au puits et incuber les cellules avec Hoechst (1:10 000) pendant 2 à 4 minutes à température ambiante. Lavez les cellules encore 2-3 fois avec 1x PBS pendant 2 minutes chacune pour éliminer l’excès de Hoechst.
  9. Montez les couvercles sur des lames de verre à l’aide d’un support de montage fluorescent anti-décoloration et laissez les glissières sécher pendant la nuit dans l’obscurité à température ambiante. Rangez les couvercles montés à 4 °C dans l’obscurité.

7. Coloration à l’huile rouge O (ORO) des PAP et des MP cultivés

  1. Effectuer une coloration ORO sur des cellules non perméabilisées, car la perméabilisation de la membrane cellulaire peut entraîner une coloration non spécifique / indésirable des types de cellules non adipogènes. Avant de commencer la coloration, préparez un stock de travail ORO (voir le dossier supplémentaire pour la recette) et incubez à température ambiante pendant 20 min.
  2. Après 20 min, filtrer la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 μm afin d’éliminer les agrégats non dissous.
  3. Aspirer le milieu du puits et ajouter 1 mL de formol tamponné neutre à 10 % (FBN à 10 %). Incuber pendant 5 min à température ambiante.
    REMARQUE: La confluence des cellules peut entraîner une levée du puits / couvercle. Faites attention lorsque vous aspirez/ajoutez des solutions.
  4. Aspirer et ajouter 1 mL de FBN frais à 10 % et incuber pendant au moins 1 h à température ambiante.
    REMARQUE: Le protocole peut être arrêté à ce stade, car les cellules peuvent être laissées dans 10% NBF pendant la nuit.
  5. Lavez rapidement les puits une fois avec 1 mL d’isopropanol à 60%, puis aspirez et laissez les puits sécher complètement (environ 2 min).
  6. Ajouter 400 μL de stock de travail Oil Red O par puits et incuber pendant 10 min à température ambiante, en veillant à éviter de pipeter tout ORO sur les parois de la plaque.
  7. Retirez tout le Oil Red O et lavez rapidement le puits 4 fois avec dH2O.
    REMARQUE: Si les puits colorés contiennent des couvercles, montez en utilisant la même technique que celle décrite à l’étape 6.9.
  8. Image soit monté sur des couvercles, soit le puits taché à l’aide d’un microscope à fond clair.

8. Coloration tissulaire des sections gastrocnémiennes controlatérales et dénervées du rat

  1. Picrosirius Rouge (PSR)
    1. Effectuer la coloration PSR sur des sections histologiques de rat gastrocnémien de 5 μm d’épaisseur, fixées au formol et incorporées dans la paraffine fixée au formol (FFPE), comme décrit précédemment40.
  2. Huile Rouge O (ORO)
    1. Fixer des coupes histologiques gastrocnémiennes de rat congelées à l’isopentane de 5 μm d’épaisseur dans du PFA à 4 % pendant 10 min, incuber dans de l’alcool isopropylique à 60 % pendant 1 min.
    2. Tache avec stock de travail ORO pendant 12 min. Incuber dans de l’alcool isopropylique à 60% pendant 1 min, laver pendant 10 min en dH2O. Monter sur des couvercles à l’aide d’un support de montage soluble dans l’eau.
  3. Sca-1 et immunohistochimie fluorescente des tissus de laminine (IHC)
    1. Effectuer un IHC fluorescent sur des coupes histologiques gastrocnémiennes congelées à l’isopentane de 5 μm d’épaisseur.
    2. Hydrater les échantillons dans 1x PBS pendant 5 min, fixer dans 4% PFA pendant 10 min puis incuber les échantillons dans une solution de blocage IF tissulaire (voir Fichier supplémentaire)pendant 90 min.
    3. Incuber avec un anticorps primaire anti-Sca-1 (1:500) dilué dans 1x PBS + 0,05% Tween à 4 °C pendant la nuit.
    4. Le jour 2, laver trois fois dans 1x PBS + 0,05% Tween pendant 5 min chacun, puis incuber dans l’anti-lapin de chèvre Alexa Fluor 555 (1:500) pendant 1 h.
    5. Laver à nouveau (comme précédemment), incuber avec une solution bloquante pendant 1 h, puis ajouter l’anticorps primaire anti-laminine (1:500) dilué dans 1x PBS + 0,05% Tween pendant 1 h.
    6. Laver à nouveau (comme précédemment), puis incuber dans de la chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488 (1:500) pendant 1 h (pour la laminine).
    7. Laver à nouveau (comme précédemment) puis incuber dans DAPI (1:10 000) pendant 4 min. Lavez et montez sur les couvercles à l’aide d’un support de montage anti-décoloration.

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Representative Results

Identification des PAP et des MP par cytométrie en flux à l’aide d’un nouveau panel d’anticorps comprenant Sca-1 et VCAM-1
La stratégie de contrôle pour identifier les PAF dans le muscle du rat est basée sur les protocoles de cytométrie en flux chez la souris29, qui portent sur les cellules positives CD31 (endothéliales) et CD45 (hématopoïétiques) (appelées lignée [Lin]) et examine le profil fluorescent du marqueur FAPs Sca-1 et du marqueur MPs ITGA7 de la population linage-négative (Lin-). En l’absence d’anticorps disponibles dans le commerce, conjugués au fluorophore et validés par cytométrie en flux pour le rat Sca-1 et l’ITGA7, nous avons auto-conjugué un anticorps Sca-1::APC de rat et entrepris une stratégie alternative pour identifier les députés. Comme VCAM-1 s’est récemment avéré être un marqueur de sélection positif unique efficace pour l’isolement des MPs33 de rat et qu’un anticorps spécifique au rat, conjugué et validé par cytométrie en flux ciblant VCAM-1 est disponible, nous avons utilisé VCAM-1 pour identifier les MP, par opposition à ITGA7.

Nous avons confirmé la conjugaison et la performance réussies de l’anticorps Sca-1:APC avec coloration unique des billes de compensation et des suspensions cellulaires générées par le gastrocnémien de rat en bonne santé (Figure 2A, B). Un titrage en cinq points de Sca-1::APC (Figure 2C) a été effectué en plus de tous les autres anticorps (CD31::FITC, CD45::FITC, VCAM-1:PE) utilisés dans le protocole (Figure supplémentaire 1),afin d’identifier les concentrations optimales. À l’aide de cette nouvelle conception de panel, des PAP et des MP putatifs ont été identifiés simultanément à partir de gastrocnémiens sains(Figure 3),les cellules uni-positives pour Sca-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) ont été désignées FAP (boîte rouge) et les cellules uni-positives pour VCAM-1 (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) ont été désignées DÉPUTÉS (boîte bleue). Nous avons également identifié une population de cellules doublement positives pour Sca-1 et VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) (Figure 3F; quadrant supérieur droit).

Validation de l’identification des PAP et des MP par FACS et culture cellulaire
Pour valider le protocole présenté pour l’identification cytométrique en flux des PAA et des MP dans le muscle squelettique du rat, nous avons cherché à isoler des cellules vivantes pour la culture in vitro. À l’aide du FACS, les PAP et les MP viables ont été isolés à l’aide de la même stratégie de contrôle que dans l’analyse cytométrique en flux. Environ 20 000 à 40 000 PAP et 30 000 à 50 000 députés ont été prélevés pour la culture cellulaire d’un seul muscle gastrocnémien d’un rat de 230 g.

Pour confirmer la pureté de chaque population, nous avons co-immuno-immunodéfié les FAP et les MSP fraîchement triés pour PDGFRα et Pax7. PDGFRα est le deuxième marqueur progéniteur mésenchymateux, après Sca-1, couramment utilisé pour identifier les FAP2,7,8. Pax-7 est un marqueur bien connu et largement utilisé des cellules satellites musculaires (souches)41. La population triée de PAP a montré une coloration positive pour PDGFRα sans contamination par des cellules Pax7 positives (Figure 4A; rangée du haut). Inversement, la population triée de MP s’est maintenue positive pour Pax7 avec une absence de cellules PDGFRα positives(Figure 4A; rangée du bas), validant la capacité des profils d’antigènes de surface cellulaire Lin-/Sca-1+/VCAM-1- et Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ à isoler des populations pures de FAP et de MP respectivement.

Nous avons ensuite cultivé des PAP et des DÉPUTÉS triés sur une période de 10 à 12 jours dans des conditions permettant d’induire une différenciation adipogène, fibrogénique et myogénique. Au jour 12, les cultures de PAF soumises à des conditions adipogéniques contenaient des cellules ayant une morphologie semblable à celle des fibroblastes ou une morphologie multiloculaire similaire à celle des pré-adipocytes blancs avec des gouttelettes de graisse (données non montrées). La coloration immunologique de la protéine 1 spécifique des fibroblastes (FSP-1) a confirmé la différenciation des fibroblastes, tandis que la coloration du plin-1 (perilipine-1; un marqueur adipocytaire)42 et du rouge d’huile O a confirmé la différenciation des adipocytes et la présence de triglycérides et de lipides neutres, respectivement(Figure 4B). L’absence de cellules contaminantes d’une lignée myogénique dans les cultures de PAF a été confirmée par co-immunocoloration de la chaîne lourde de myosine (CMH), un marqueur des myocytes différenciés. Les cultures de FAPs soumises à la différenciation fibrogénique (FD) ont été évaluées pour l’expression du collagène de type 1 (Col1a1), l’un des principaux collagènes dérivés des FAP8. La co-immunocoloration pour Col1a1 et le CMH au jour 11 a révélé une expression robuste du collagène de type 1 sans cellules positives contaminantes du CMH(Figure 4B). La confirmation finale de la pureté de la population de PAF a été entreprise en cultivant des PAP dans des milieux myogéniques, afin d’encourager la croissance de tout député contaminant. Aucune cellule positive au CMH n’a été observée (Figure supplémentaire 2A).

Les cultures MP soumises à des conditions myogéniques ont démontré des myocytes matures exprimant le CMH et des myotubes multinucléés 12 jours après le placage(Figure 4C). La co-immunocoloration des cultures MP avec FSP-1 et Plin-1 a démontré l’absence de fibroblastes ou d’adipocytes contaminants, respectivement. De même, la coloration ORO n’a pas démontré de contamination lipidique (Fig. 4C). Col1a1, qui est fortement exprimé par les fibroblastes, a également été rapporté comme étant produit dans une moindre mesure par les précurseurs myogéniques et les myoblastes, bien qu’il existe des données contradictoires dans la littérature à cet égard8,43,44. Bien que la co-immunocoloration des MP avec Col1a1 et MHC ait révélé une différenciation myocytaire de notre culture MP, aucune preuve d’immunopositivité à Col1a1 n’a été trouvée(Figure 4C). Pour confirmer davantage la pureté de la population, les cultures MP ont été soumises à des conditions adipogéniques ou fibrogéniques pour favoriser la croissance des adipocytes et des fibroblastes (Figure supplémentaire 2B). Aucune cellule contaminante de la lignée des PAF n’a été observée.

Alors que nous avions démontré la capacité d’identifier et de trier les populations pures de FAP et de MPs à partir du muscle rat, nous avons ensuite cherché à déterminer l’identité des cellules Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ (double positif). Étant donné que l’expression de Sca-1 a été rapportée sur une très faible proportion de MP (environ 3%) dans les muscles sains45 et que de même peu de FAP (environ 4%) ont été signalés pour exprimer VCAM-1 dans les muscles sains10, une immunocoloration des cellules Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ fraîchement triées a été réalisée pour PDGFRα et Pax7 ainsi que leur culture dans des cellules myogènes, adipogéniques, et des conditions fibrogéniques pour induire respectivement la myogenèse, l’adipogenèse et la fibrogenèse. Il a été constaté que les cellules doublement positives étaient une population mixte de MP et de FAP, avec des cellules fraîchement triées immunocolorant positives pour PDGFRα ou Pax7(Figure supplémentaire 3A)et des cellules cultivées se différenciant en myocytes matures, adipocytes ou fibroblastes ( Figuresupplémentaire 3B, C).

ITGA7 vs VCAM-1 pour identifier les MP lors de l’identification des MAP cytométriques en flux
Bien qu’un protocole efficace pour l’identification cytométrique en flux des PAP et des MP de rats utilisant respectivement Sca-1 et VCAM-1 ait été établi, nous avons cherché à déterminer si un anticorps ITGA7 auto-conjugué pouvait également être utilisé pour identifier les MP au lieu de VCAM-1, comme c’est la norme chez la souris. Un anticorps ITGA7 spécifique au rat a été conjugué à PE-Cy7 (voir dossier supplémentaire) et la performance de l’anticorps a été validée sur des billes de compensation commerciales et des suspensions unicellulaires générées à partir de gastrocnémiens de rat(figure supplémentaire 4A-C). L’anticorps ITGA7::P E-Cy7 a obtenu des résultats adéquats lors d’expériences de coloration unique et de FMO(figure supplémentaire 4D). Cependant, lors de la coloration complète des suspensions de cellules gastrocnémiennes avec CD31::FITC, CD45::FITC, Sca-1::APC et ITGA7::P E-Cy7, une interaction est devenue évidente entre les anticorps Sca-1::APC et ITGA7::P E-Cy-7. La culture ultérieure des cellules Lin-/Sca-1+/ITGA7- triées par FACS (prétendument FAP) et des cellules Lin-/Sca-1-/IGTA7+ (supposées MP)(Figure supplémentaire 4E)a donné principalement des PAP et avec peu de MP (Figure supplémentaire 4F),indiquant que l’interaction entre les anticorps Sca-1::APC et ITGA7::P E-Cy-7 a eu un impact négatif sur la spécificité de l’identification cellulaire.

Un nouveau cours temporel des PAF dans le muscle squelettique dénervé à long terme
Comme la dynamique des PAF a été évaluée dans le contexte de la dénervation traumatique à court terme, dans les modèlesmurins 11,38, nous avons cherché à valider la performance de notre méthode pour l’isolement des PAP du muscle fibrotique sain et gravement atrophique. Les rats ont été soumis à une lésion traumatique de dénervation à long terme à l’aide du modèle de transsection unilatérale du nerf tibial46 bien validé avec un muscle gastrocnémien récolté à quatre moments en série sur 14 semaines après la dénervation du membre dénervé et du membre innervé controlatéral (pour servir de contrôle interne). Comme cela a été rapporté précédemment, le muscle dénervé a présenté une atrophie progressive (Figure 5A, B), avec une augmentation de la fibrose et des dépôts de graisse ( Figure5C-F) au fil du temps47.

Notre protocole a généré un nombre adéquat de cellules pour l’analyse cytométrique en flux, même si les gastrocnémiens dénervés de 12 et 14 semaines pesaient environ 0,2 à 0,3 g (15 à 20 % du muscle témoin controlaltaire respectif)(Figure 5B). Nous avons observé une régulation à la hausse des PAF dans le muscle gastrocnémien dénervé par rapport au muscle témoin controlal controlal innervé, maintenu pendant la durée de 14 semaines de l’expérience(Figure 6A,B),concordant avec la fibrose musculaire progressive et le dépôt de graisse. L’immunocoloration Sca-1 des coupes histologiques musculaires a confirmé la localisation des cellules exprimant Sca-1 dans les zones de changement fibro-gras dans les muscles dénervés pendant 14 semaines (Figure 5G), en plus de l’expression de base dans l’interstitium entre les myofibres dans les muscles sains. Un sous-ensemble distinct de cellules est apparu dans la population des PAF au fil du temps après la dénervation, caractérisé par une forte augmentation du signal Sca-1 (Sca-1 élevé; Figure 6A,encadré rouge) sur l’analyse cytométrique en flux, comparée à l’expression basale de Sca-1 des FAP (Sca-1 Med/Low; Figure 6A, encadré vert). La quantification de ces sous-populations a révélé une dynamique différentielle au fil du temps; Les PAP élevés Sca-1 ont augmenté de manière significative à 12 et 14 semaines après la dénervation (Figure 6B), représentant environ la moitié de la population totale de PAAF (Figure 6C). En revanche, sca-1 Med/LOW FAPs était la sous-population dominante à 2 et 5 semaines après la dénervation (Figure 6C) et n’a montré qu’une augmentation transitoire des niveaux au début de la post-dénervation (Figure 6B).

Contrairement à la présence soutenue de PAF dans les muscles dénervés à long terme, les députés ont démontré une réponse biphasique attendue à la dénervation. Initialement, les députés ont augmenté dans le muscle dénervé au-dessus de celui observé dans le membre témoin, mais à 5 semaines après la dénervation, la population a commencé à décliner (Figure 6D). Conformément à l’épuisement bien connu de la population de cellules satellites musculaires dans les muscles dénervés à long terme47, à 12 semaines, les députés étaient soit égaux ou inférieurs aux niveaux de base après la transsection du nerf tibial.

Nous avons également analysé la dynamique de la population Lin-/Sca-1+/VCAM-1+(Figure supplémentaire 3D-E). Alors que la fréquence des cellules doubles positives par rapport à la population Lin- a progressivement diminué dans le muscle dénervé au fil du temps, lorsque le nombre absolu de cellules a été déterminé par gramme de muscle, une augmentation temporaire de la population double positive a été observée, avant de tomber aux niveaux de base ou en dessous de 14 semaines après la dénervation.

Figure 1
Figure 1: Schéma graphique pour l’identification, l’isolement et la culture des PAP et des DÉPUTÉS : Schéma graphique illustrant l’identification des PAP et des DÉPUTÉS à partir de gastrocnémiens de rat. Les échantillons sont récoltés et hachés mécaniquement avant de subir deux digestions enzymatiques séquentielles. Les préparations tissulaires sont ensuite traitées et filtrées pour générer une suspension à cellule unique. Un cocktail d’anticorps conjugués par fluorescence est ajouté à chaque échantillon, qui est ensuite passé à travers un cytomètre en flux ou un trieur de cellules pour identifier ou isoler respectivement les PAF et les MSP. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Sca-1::Apc auto-conjuguée validation et titrage des anticorps. Validation de la conjugaison des anticorps Sca-1::APC par coloration unique sur des billes de compensation commerciale (A) et des suspensions unicellulaires générées à partir de muscle gastrocnémien de rat sain (B). Des populations distinctes de perles et de cellules marquées Sca-1 sont évidentes (boîtes noires). Le titrage des anticorps a été effectué en testant cinq concentrations différentes de Sca-1::APC sur des suspensions unicellulaires (C); la concentration optimale a été choisie en fonction de la plus grande intensité de fluorescence avec une coloration de fond minimale et s’est avérée dépendre du lot. Un titrage représentatif est indiqué avec la concentration optimale spécifique au lot indiquée par la case rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Identification par cytométrie en flux des PAP et des MP chez les gastrocnémiens de rat. (A-F) Stratégie de contrôle pour l’analyse cytométrique en flux des PAF et des MP. (A) Les échantillons sont d’abord fermés pour exclure les débris (boîte noire) ainsi que pour le contrôle des perles (boîte rouge). Les cellules sont ensuite fermées pour exclure les doublets à la fois par les caractéristiques de diffusion frontale (FSC)(B)et de dispersion latérale (SSC)(C). La viabilité des cellules individuelles résultantes est évaluée par coloration avec SYTOX Blue (D). Les singlets négatifs (en direct) SYTOX Blue sont ensuite évalués pour le signal FITC identifiant CD31 et CD45 (Lineage; Lin) afin d’exclure les fractions Lin+ d’une analyse ultérieure (cellules Lin de la boîte noire) (E). La population Lin- est ensuite évaluée pour le signal Sca-1::APC par rapport au signal VCAM-1::P E (F). Les PAF sont identifiés comme des événements Lin-/Sca-1+/VCAM-1- (F; boîte rouge) tandis que les MP sont identifiés comme des événements Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ (F; boîte bleue). Une population double positive Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ est également évidente (quadrant supérieur droit). (G) Les contrôles FMO (Fluorescence Minus One) pour CD31::FITC et CD45::FITC démontrent une compensation et un contrôle appropriés pour les cellules Lin. (H-I) Les diagrammes Sca-1::APC versus VCAM-1::P E des contrôles FMO démontrent une rémunération et un contrôle appropriés pour les FAP (Sca-1 FMO) et les MP (VCAM-1 FMO). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Tri des PAF et des MSP culture cellulaire et immunocoloration. (A) Co-immunocoloration pour PDGFRα (vert) et Pax7 (rouge) sur les FAP fraîchement triés (rangée du haut) et les MP (rangée du bas). Les noyaux tachent en bleu avec DAPI. Les PAP expriment uniquement PDGFRα et aucune cellule Pax7 positive n’est évidente, tandis que les MP expriment exclusivement Pax7 sans contamination cellulaire PDGFRα positive, démontrant la pureté des deux populations triées. (B) Les PAF au jour 12 dans les milieux de différenciation adipogénique (MA) sont positifs pour la protéine 1 spécifique des fibroblastes (FSP-1; vert) et la perilipine-1 (plin-1; vert), démontrant respectivement des fibroblastes et des adipocytes différenciés. Les noyaux sont colorés avec du DAPI (bleu). La coloration à l’huile Rouge O (ORO) (rouge) indique la présence de triglycérides neutres et de lipides provenant d’adipocytes matures au jour 12. Les PAP soumis à des milieux de différenciation fibrogénique (FD) démontrent l’expression du collagène de type 1 dérivé des FAPs (Col1a1; vert). Les PAF cultivés dans des milieux adipogènes ou fibrogéniques ne co-immunospécifiques pour la chaîne lourde de la myosine (CMH, rouge), ce qui indique une absence de contamination des myocytes. (C) Les MP cultivés dans des milieux de différenciation myogénique (DM) au jour 12 présentent une coloration (rouge) positive au CMH démontrant la présence de myocytes matures et de myotubes multinucléés fusionnés. Les noyaux sont colorés avec du DAPI (bleu). Les cultures MP étaient exemptes de contamination par les fibroblastes et les adipocytes, comme l’indique l’absence de co-immunocoloration pour les colorations FSP-1 (vert), Plin-1 (vert) et ORO. Les députés cultivés sur la laminine pour accommoder l’immunocoloration du Co1a1 ne présentent pas le même degré de fusion des myotubes au jour 12 que sur le collagène. Col1a1 (vert) est absent des cultures MP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Atrophie, fibrose et infiltration graisseuse du muscle dénervé à long terme. (A) Les muscles gastrocnémiens récoltés représentatifs à quatre moments en série après la dénervation. Gastrocnemius noté CONTRA est un échantillon représentatif du membre controlatéral d’un animal dénervé de deux semaines. (B) Quantification de l’atrophie musculaire post-dénervation exprimée comme le rapport entre le poids humide gastrocnémien dénervé (DEN) et celui du membre controlatéral (CONTRA). (C) Picrosirius Red (PSR) taché de coupes histologiques de gastrocnémies récoltées 2 ou 14 semaines après la dénervation démontrent une fibrose progressive. Les taches musculaires jaunes, les taches de collagène rouges. (D) Fibrose quantifiée en déterminant la zone du tissu positif PSR par rapport à la surface tissulaire totale. (E) Sections transversales colorées en huile d’O rouge (ORO) de gastrocnémies récoltées 2 ou 14 semaines après la dénervation, contre-colorées avec de l’hématoxyline. Les lipides tachent en rouge. (F) Infiltration graisseuse quantifiée en déterminant la surface du tissu coloré ORO par rapport à la surface totale du tissu. (G) Coupes histologiques gastrocnémiennes récoltées 2 ou 14 semaines après la dénervation, immunocolorées pour la laminine (vert) et Sca-1 (rouge). La laminine tache positivement la lame basale qui entoure les myofibres individuels. Sca-1 identifie plusieurs types de cellules progénitrices. Les noyaux sont colorés avec du DAPI (bleu). L’encadré montre la localisation des cellules Sca-1+ à l’extérieur de la lame basale dans les muscles sains; les flèches jaunes indiquent la présence de cellules Sca-1+ dans les zones fibrotiques. (Les données sont la moyenne +/- S.D; n = 3 pour les points de temps de 2 et 14 semaines. Données du panneau B analysées par ANOVA unidirectionnelle, données des panneaux D et F analysées par ANOVA bidirectionnelle. Test de Sidak post-hoc effectué pour corriger plusieurs comparaisons. * = P<0,05 entre CONTRA et DEN; # = P<0,05 entre les échantillons) Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Dynamique des PAP et des MP chez les gastrocnémiens de rat dénervés à long terme. (A) Représentatif Sca-1::APC versus VCAM-1::P E panels de la population Lin- (CD31-/CD45-) à partir d’échantillons musculaires prélevés 2, 5, 12 ou 14 semaines après la dénervation. La rangée du haut montre les tracés du gastrocnémien dénervé (DEN), tandis que la rangée du bas montre celles du gastrocnémien controlatéral non opéré (CONTRA). Les FAP Lin-/Sca-1+/VCAM-1( Total) sont subdivisés en fractions Sca-1 High (boîte rouge) et Sca-1 Med/Low (boîte verte), tandis que les MPs Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ sont indiqués dans la boîte bleue. (B) Quantification des PAF (Total, Sca-1 High, Sca-1 Med/Low) à chaque point temporel après la dénervation, rapportée comme la fréquence (%) des cellules Lin (rangée du haut) et le nombre de cellules par muscle gramme (rangée du bas) normalisées au contrôle controle controlique gastrocnémien. (C) Proportions relatives des sous-populations Sca-1 High et Sca-1 Med/Low de la population totale des PAF. (D) Quantification des MP à chaque point temporel post-dénervation rapportée comme la fréquence (%) des cellules Lin (graphique de gauche) et comme le nombre de cellules par muscle gramme (graphique de droite) normalisé au contrôle control controlatéral. (Les données sont la moyenne +/- S.D; n = 4 pour les points de temps de 2 et 12 semaines; n = 5 pour le point de temps de 5 semaines; n = 2 pour le point de temps de 14 semaines. Données analysées par ANOVA unidirectionnelle; Test de Sidak post-hoc à corriger pour plusieurs comparaisons. # = P<0,05.) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1: Validation et titrage des anticorps. Validation des anticorps CD31::FITC (A-C), CD45::FITC (D-F) et VCAM-1::P E (G-I) conjugués commercialement sur des billes de compensation (A,D,G) et des suspensions unicellulaires provenant du muscle gastrocnémien sain du rat (B,E,H). Chaque anticorps a été titré à 5 concentrations différentes (C, F, I). La concentration optimale a été choisie en fonction de la plus grande intensité de fluorescence avec une coloration de fond minimale (boîtes rouges). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2: PAF et MP triés dans des conditions de culture de différenciation inverse. (A) Les PAF cultivés dans des milieux de différenciation myogénique (DM) au jour 12 co-immunodéfinis pour FSP-1 (vert), Plin-1 (vert) ou Col1a1 (vert) et MHC (rouge) ne démontrent pas de contamination myocytaire. La coloration positive FSP-1 et Col1a1 révèlent la différenciation des FAP en fibroblastes. La coloration ORO (rouge) révèle une production de lipides bien que les adipocytes positifs à la Plin-1 ne soient pas facilement visibles. Noyaux colorés avec DAPI (bleu). (B) Des députés soumis à des médias de différenciation adipogénique sont morts. Les MP cultivés dans des milieux de croissance FAP (FAP GM) pendant 12 jours et co-immunodéfinis pour FSP-1 (vert) ou Plin-1 (vert) et MHC (rouge) présentent des myocytes et des myotubes différenciés avec une absence de cellules FSP-1 ou Plin-1 positives. L’absence de coloration ORO confirme en outre le manque de cellules adipogéniques en culture. Les MP cultivés dans des milieux de différenciation fibrogénique (FD) et co-immunodéfinis pour Col1a1 et MHC montrent des myocytes matures et une absence de cellules Positives à Col1a1. Les DÉPUTÉs cultivés sur la laminine pour accommoder l’immunocoloration de Col1a1 ne présentent pas le même degré de fusion aux myotubes à 12 jours en culture que sur le collagène. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3: Les cellulesLin-/Sca-1+/VCAM-1+sont une population mixtede PAF et de MSP. (A) La co-immunocoloration PDGFRα et Pax7 de cellules Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ fraîchement isolées montre une population mixte de cellules PDGFRα mono-positives (flèches blanches) et Pax7 uniques positives (flèche jaune) identifiant respectivement les FAP et les MSP. (B) Les cultures Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ au jour 12 cultivées dans des milieux de différenciation myogénique (DM) contiennent à la fois des cellules FSP-1 simples positives (vertes) et des cellules FSP-1 uniques positives (rouges) identifiant respectivement les fibroblastes et les myocytes/tubes. Une absence de coloration Plin-1 (vert) et ORO (rouge) indique l’absence d’adipocytes matures. Les co-immunocolorations pour Col1a1 (vert) et MHC (rouge) montrent des myocytes et des fibroblastes matures. (C) Les cellules Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ au jour 12 cultivées dans des milieux de différenciation adipogène (MA) présentent de manière similaire un mélange de cellules FSP-1 (vert) simples positives et de cellules MHC (rouge) uniques positives, mais aussi avec des cellules Plin-1 (vertes) uniques positives et une coloration ORO présente, confirmant la différenciation des fibroblastes, des myocytes et des adipocytes. Les cultures cultivées dans des milieux de différenciation fibrogénique (FD) montrent des myocytes matures et des cellules positives uniques Col1a1 (fibroblastes). (D) Représentatif Sca-1::APC versus VCAM-1::P E panels de la population Lin- (CD31-/CD45-) à partir d’échantillons de muscles dénervés prélevés 2, 5, 12 ou 14 semaines après la dénervation; La population Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ est indiquée dans la case violette. (E) Quantification des cellules Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ sur quatre points temporels série après la dénervation, rapportée comme la fréquence des cellules Lin (graphique de gauche) et des cellules par muscle gramme (graphique de droite) normalisée au gastrocnémien controlatéral. (Les données sont la moyenne +/- S.D; n = 4 pour les points de temps de 2 et 12 semaines; n = 5 pour le point de temps de 5 semaines; n = 2 pour le point de temps de 14 semaines. Les données ont été analysées par ANOVA unidirectionnelle; test de Sidak post-hoc pour corriger les comparaisons multiples; # = P<0,05.) Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4: ITGA7 comme marqueur des cellules myogéniques dans la cytométrie en flux du muscle squelettique du rat. Validation de la conjugaison des anticorps ITGA7::P E-Cy7 par coloration unique sur des billes de compensation commerciale (A) et des suspensions unicellulaires générées à partir de muscle gastrocnémien de rat sain (B). Les populations de billes et de cellules marquées ITGA7 sont évidentes (boîtes noires) (C) Le titrage des anticorps a été effectué en testant cinq concentrations différentes sur des suspensions unicellulaires. La case rouge indique la concentration idéale. (D) Les diagrammes de contrôle de fluorescence moins un (FMO) démontrent l’absence de débordement de fluorescence sur les conjugués d’anticorps, mais la coloration complète des suspensions cellulaires révèle une interaction non spécifique entre Sca-1::APC et ITGA7::P E-Cy7 (boîte verte). Gating (E) pour séparer les cellules Lin-/Sca-1+/ITGA7- (prétendument « FAP ») et les cellules Lin-/Sca-1-/IGTA7+ (prétendues « MPs »). (F) La co-immunocoloration de cultures cellulaires triées par FACS 12 jours après le placage avec la perilipine-1 (vert) et le CMH (rouge) montre que les deux groupes de cellules triées ont mûri principalement en adipocytes avec peu de myocytes présents. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

1. Non taché
2. Contrôle de la viabilité
3. CD31 + CD45 FMO
4. Sca-1 FMO
5. VCAM-1 FMO
6. CD31 + CD45 Single Stain (perles)
7. CD31 + CD45 Single Stain (cellules)
8. Sca-1 Single Stain (perles)
9. Sca-1 Single Stain (Cellules)
10. VCAM-1 Simple Tache (perles)
11. VCAM-1 Single Stain (cellules)

Tableau 1: Témoins de coloration des anticorps par cytométrie en flux. Complément complet de contrôles de coloration des anticorps. Si l’expérience est réalisée pour la première fois, des commandes à simple coloration doivent être exécutées à la fois sur des billes de compensation et sur des suspensions à cellule unique. Pour toutes les expériences ultérieures, les contrôles à coloration unique ne doivent être exécutés que sur des perles de compensation.

CD31::FITC (μg) CD45::FITC (μg) Sca-1::APC (μg)* VCAM-1::P E (μg) SYTOX Bleu
(μM; Concentration finale)
Contrôle non taché
-- -- -- -- --
Contrôles à coloration unique
SYTOX Blue (Contrôle de viabilité) -- -- -- -- 1
CD31 et CD45 0.5 0.25 -- -- 1
Sca-1 -- -- 0.25 -- 1
VCAM-1 -- -- -- 0.25 1
Fluorescence moins un (FMO)
CD31 et CD45 -- -- 0.25 0.25 1
Sca-1 0.5 0.25 -- 0.25 1
VCAM-1 0.5 0.25 0.25 -- 1
Échantillons expérimentaux
Tache complète 0.5 0.25 0.25 0.25 1

Tableau 2: Matrice de coloration des anticorps de cytométrie en flux. La quantité d’anticorps pour la coloration des échantillons expérimentaux et témoins pour la cytométrie en flux est indiquée. Toute la coloration est effectuée dans un volume total de 100 μL de tampon de lavage. *La quantité optimale d’anticorps Auto-conjugué Sca-1::APC peut varier en fonction du lot utilisé. Tous les lots Sca-1::APC fraîchement conjugués doivent d’abord être validés par une seule coloration des billes de compensation et des suspensions à cellule unique.

Fichier supplémentaire : Recettes de réactifs. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Un protocole d’isolement des PAP optimisé et validé pour le muscle du rat est essentiel pour les chercheurs qui souhaitent étudier des modèles de blessures qui ne sont pas réalisables chez la souris pour des raisons biologiques ou techniques. Par exemple, les souris ne sont pas un modèle animal optimal pour étudier les lésions chroniques locales ou neurodégénératives telles que la dénervation à long terme. Biologiquement, la courte durée de vie et le vieillissement rapide des souris rendent difficile la délimitation précise des séqualaes musculaires en raison de la dénervation du facteur de confusion du vieillissement. D’un point de vue technique, la réduction drastique de la masse musculaire due à une atrophie sévère serait insuffisante pour une analyse cytométrique en flux efficace. En fait, les protocoles d’isolement des PAF de souris suggèrent de regrouper les muscles sains pour mieux augmenter le rendement des PAP triés29. Bien que cela résolve la barrière technique de l’obtention d’un tissu musculaire adéquat pour l’analyse, cela limite simultanément les chercheurs à évaluer les PAF à un niveau spécifique au muscle. Étant donné que des groupes musculaires spécifiques varient intrinsèquement dans leur composition de type de fibre, leur degré de vascularisation et leur nombre mitochondrial47 par exemple, la combinaison de plusieurs muscles différents pour l’analyse cytométrique en flux empêche la caractérisation des PAF spécifiques aux muscles. En revanche, nous montrons que les gastrocnémies de rats dénervés sains et à long terme, atrophiques et fibrotiques fournissent une quantité adéquate de matière première pour une cytométrie en flux efficace. De plus, dans des échantillons sains, le surplus de muscle peut être subdivisé pour plusieurs tests en aval, ce qui permet aux chercheurs d’analyser simultanément les caractéristiques cellulaires, moléculaires et histologiques du même tissu. Enfin, pour les expériences manipulant les PAP dans des modèles de blessures avec des thérapeutiques, des analyses bien validées de la fonction physique et de la démarche chez les rats alertes et actifs sont disponibles21,22,23,24, permettant une évaluation en série de la fonction musculaire sans qu’il soit nécessaire d’arrêter l’animal.

Un obstacle clé à la création d’un protocole d’isolement optimisé des PAF pour le rat était la disponibilité des anticorps. Notre approche initiale visait à copier le panel d’anticorps et les protocoles de stratégie de contrôle largement utilisés chez la souris1,7,8,9,10,11,12,13,14. Bien que des anticorps disponibles dans le commerce, conjugués, testés par cytométrie en flux et validés qui reconnaissent le rat étaient disponibles pour les marqueurs de lignée CD31 et CD45, aucun n’existait pour les PAF positifs identifiant les marqueurs Sca-1 ou PDGFRα, ainsi que pour le marqueur de sélection négatif ITGA7. Des anticorps primaires non conjugués spécifiques à ces marqueurs et censés être efficaces en cytométrie en flux étaient disponibles, mais parmi les marqueurs FAPs Sca-1 et PDGFRα, seul l’anticorps Sca-1 avait été validé dans la littérature publiée en analyse cytométrique en flux de cellules de rat48. Nous avons donc choisi Sca-1 comme marqueur de sélection positif pour les PAF. La perspective d’utiliser des anticorps secondaires pour délimiter les marqueurs Sca-1 et ITGA7 n’était pas réalisable pour plusieurs raisons, mais principalement parce que les seuls anticorps spécifiques au rat pour Sca-1 et ITGA7 validés pour la cytométrie en flux ont été générés dans la même espèce hôte. Par conséquent, l’option restante était l’auto-conjugaison des deux anticorps à l’aide de kits disponibles dans le commerce.

Le processus de choix d’un kit optimal pour la conjugaison des anticorps a été vaste, car de nombreux kits sont complètement ou partiellement intolérants à divers diluants tampons (par exemple, glycine, glycérol, BSA, azoture de sodium) présents dans les anticorps primaires. De plus, le fluorophore fourni doit être compatible avec les lasers équipés dans le cytomètre en flux/trieur de cellules à la disposition de l’investigateur, et ne pas émettre à une longueur d’onde similaire à celle des autres fluorophores utilisés pour identifier d’autres types de cellules dans l’échantillon. La présence de composants diluants dans les anticorps primaires PDGFRα spécifiques au rat qui étaient mal compatibles avec les kits de conjugaison était une considération supplémentaire dans le choix de Sca-1 comme marqueur de sélection des FAP positifs dans ce protocole. Bien que ces résultats démontrent que les conjugaisons Sca-1::APC et ITGA7::P E-Cy7 ont permis d’identifier des populations distinctes colorées positivement sur les perles et les cellules de compensation, les premières se sont révélées se désintégrer en fluorescence plus tôt que ce qui était annoncé par le fabricant. Il est fortement recommandé que les chercheurs conjuguent Sca-1::APC conformément aux instructions du fabricant, immédiatement avant la première utilisation (par exemple, la veille de l’expérience) pour assurer un signal robuste, planifient les expériences en conséquence de sorte qu’un seul lot d’anticorps conjugués puisse être utilisé dans la fenêtre d’efficacité de l’anticorps, et valident chaque lot en perles de compensation à coloration unique et en titrant sur des suspensions unicellulaires. Plus important encore, cependant, l’interaction critique notée entre Sca-1::APC et ITGA7::P E-Cy7 a empêché la délimitation précise des populations de PAF par rapport aux DÉPUTÉS, ce qui a nécessité l’utilisation d’une stratégie alternative.

Boscolo Sesillo et al. ont récemment démontré l’isolement cytométrique en flux réussi des cellules souches musculaires de rat en utilisant VCAM-1 comme marqueur de sélection positif unique33 dans les cellules CD31, CD45 et CD11b négatives. Avec VCAM-1 comme marqueur de sélection MP, nous avons utilisé un nouveau panel d’anticorps pour identifier les PAF (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) et les MPs (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) et validé l’approche avec la culture in vitro de cellules triées FACS à partir de muscles gastrocnémiens sains. Les PAP et les MSP fraîchement isolés sont immunocolorés uniquement pour leurs marqueurs alternatifs respectifs PDGFRα et Pax7. Les PAP cultivés se différencient en populations de fibroblastes et d’adipocytes matures, et les MP en myocytes/myotubes matures. Il n’y a pas eu de contamination croisée des PAP et des députés au sein des cultures. La coloration immunologique des coupes transversales histologiques a confirmé l’infiltration de zones de dégradation fibro-graisseuse dans les muscles dénervés avec des cellules Sca-1 positives.

Alors que nous avons entrepris une analyse cytométrique en flux du muscle dénervé à long terme pour valider notre protocole dans les muscles sévèrement atrophiques, fibrotiques et infiltrés dans la graisse, nous avons observé incidemment l’émergence d’une sous-population de FAPs avec un signal Sca-1 accru (noté Sca-1 High) par rapport à l’expression de base sca-1 (noté Sca-1 Med / Low) au fil du temps. Les PAP Sca-1 High ont augmenté significativement tard après la dénervation (12 semaines et plus), tandis que les PAP Sca-1 Med / Low ont culminé tôt à 5 semaines avant de retomber aux niveaux de base. L’hétérogénéité du phénotype des PAF a été rapportée10,30. Il a été démontré que les FAP avec une expression plus élevée de Sca-1 se différencient plus facilement en adipocytes et, lorsqu’ils sont exposés à une stimulation fibrogénique, augmentent l’expression de Col1a130,49. La dynamique des sous-populations de PAF observées ici semble être conforme à l’évolution temporelle des séquelles induites par la dénervation et à la capacité de régénération des muscles47 et peut donc caractériser les sous-populations de PAF avec des programmes cellulaires différents. Les PAF Sca-1 High deviennent régulés à la hausse à des moments tardifs concomitants à une infiltration fibro/graisseuse et à une diminution du potentiel de régénération, tandis que les PAP Sca-1 Med/Low deviennent régulés à la hausse pendant la fenêtre de régénération du muscle et peuvent aider à une myogenèse régénérative efficace. Le protocole d’isolement des PAF présenté ici permet aux chercheurs d’identifier et d’isoler ces diverses populations en vue d’études futures.

Nous avons identifié une population de cellules colorant positives pour Sca-1 et VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) et déterminé que cette double population positive était un mélange de PAF et de MSP. La séparation de cette population à l’aide d’un troisième marqueur - ITGA7 - n’a pas été possible en raison de l’interaction entre les anticorps primaires Sca-1 et ITGA7. Malecova et ses collègues ont signalé une sous-population de VCAM-1 exprimant des PAF qui est presque absente dans les muscles sains, a augmenté transitoirement avec une inflammation aiguë, et leur persistance chez les souris mdx (modèle de dystrophie musculaire) était associée à une inflammation musculaire chronique et à une fibrose10. En revanche, et bien qu’il ne s’agisse pas d’une population de PAF pure, nous avons constaté que la population de Lin/Sca-1+/VCAM-1+ diminuait à des niveaux de base ou en dessous des niveaux de fibrose musculaire chronique à 12 et 14 semaines après la dénervation. La dénervation n’induit pas la même réaction inflammatoire et les mêmes tentatives de régénération cyclique que celles vécues par les souris mdx, ce qui peut expliquer les différences dans nos résultats. Notre identification des MP dans la population cellulaire Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ est conforme au rapport d’expression de Sca-1 sur une très faible proportion de MP dans les muscles sains, avec une augmentation transitoire suite à une blessure lors de la prolifération des myoblastes et du retrait ultérieur du cycle cellulaire45. Ainsi, alors que notre stratégie de marquage des anticorps et de contrôle des FACS isole avec succès des populations pures de PAF et de MSP pour étude, les expériences nécessitant une quantification basée sur la cytométrie en flux de ces populations peuvent légèrement sous-estimer leur nombre en raison du faible pourcentage de cellules dans les deux lignées progénitrices qui co-expriment Sca-1 et VCAM-1. Quoi qu’il en soit, le protocole actuel démontre clairement la réponse biphasique classique des députés aux lésions de dénervation, avec une régulation à la hausse à court terme et un épuisement ultérieur de la population dans les muscles dénervés à long terme. De même, l’augmentation des PAF rapportée dans les lésions de dénervation isolées à court terme est récapitulée ici et s’est avérée plus soutenue à l’aide du modèle de transsection du nerf tibial à long terme.

En résumé, ce protocole fournit aux chercheurs un animal jusque-là inexploré, le rat, dans lequel utiliser des méthodes cytométriques en flux pour étudier simultanément les PAP et les MP. Des expériences chez des souris limitées par la quantité de muscle squelettique et la nécessité fréquente d’entreprendre des expériences terminales pour évaluer la force et la fonction musculaires peuvent être facilement menées chez le plus grand rat et avec une gamme plus étendue de méthodes d’évaluation fonctionnelle et de force non létale. Dans l’ensemble, les études sur les PAF chez le rat pourraient révéler de nouveaux rôles de cette population progénitrice clé dans les traumatismes et les maladies musculaires et nerveuses périphériques aigus et chroniques, augmentant ainsi le potentiel de développement de thérapies cellulaires spécifiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier les installations de base de cytométrie en flux de l’Université d’Ottawa et le Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC) de l’Hôpital St Michaels Unity Health Toronto pour leur expertise et leurs conseils en matière d’optimisation du protocole de cytométrie en flux/FACS présenté dans ce manuscrit. Ce travail a été financé par Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) à JB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap Falcon 352235
10 cm cell culture dishes Sarstedt 83.3902
12-well cell culture plate ThermoFisher 130185
12 mm glass coverslips, No.2 VWR 89015-724
10 mL Syringe Beckton Dickenson 302995
15 mL centrifuge tubes FroggaBio 91014
20 gauge needle Beckton Dickenson 305176
25mL Serological pipette Sarstedt 86.1685.001
40µm cell strainer Fisher Scientific 22363547
50mL centrifuge tubes FroggaBio TB50
AbC Total Antibody Compensation Beads  ThermoFisher A10497
Ammonium Chloride, Reagent Grade Bioshop AMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µg Biotium 92307
Aquatex Aqueous Mounting Medium Merck 108562
Biolaminin 411 LN Biolamina LN411
Bovine Serum Albumin (BSA) Bioshop ALB001
Calcium Chloride Bioshop CCL444.500
Collagenase Type II Gibco 17101015
CountBright Plus Absolute Counting Beads ThermoFisher C36995
Dexamethasone Millipore Sigma D4902
Dispase Gibco 17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Gibco 11995-065 (+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTA FisherScientific S311
FACSClean Solution Beckton Dickenson 340345
FACSDiva Software Beckton Dickenson --
FACSRinse Solution Beckton Dickenson 340346
Fetal Bovine Serum Sigma F1051
Flow Cytometry Sheath Fluid Beckton Dickenson 342003
FlowJo Software Beckton Dickenson --
Fluorescent Mounting Medium Dako S302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody Invitrogen A11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21429
Goat Serum Gibco 16210-064
Ham's F10 Media ThermoFisher  11550043 (+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) Multicell 311-513-CL
Heat Inactivated Horse Serum Gibco 26050-088
Hemocytometer Reichert N/A
HEPES, minimum 99.5% titration Sigma H3375
Horse Serum ThermoFisher 16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) Cell Signaling 8915LF
Humulin R Lilly HI0210
IBMX Millipore Sigma I5879 Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
Isopropanol Sigma I9516 Also known as 2-propanol
Lewis Rat, Female Charles River Kingston 004 (Strain Code) 200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer Beckton Dickenson --
Microcentrifuge Eppendorf EP-5417R
MoFlo XDP Cell Sorter Beckman Coulter --
Mouse Anti-CD31::FITC Antibody Abcam ab33858 Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC Antibody Biolegend 202205 Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE Antibody Biolegend 200403 Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A Also known as MF20
Mouse Anti-Pax7 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 % Sigma HT501128
Oil Red O Millipore Sigma O0625
PE-Cy7 Conjugation Kit Abcam ab102903
Penicillin-Streptomycin Sigma  P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 (-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent Grade Bioshop PBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody Invitrogen MA5-32347 FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody Abcam ab203254
Rabbit Anti-Laminin Antibody Sigma L9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody Abcam ab3526
Rabbit Anti-Sca-1 Antibody Millipore Sigma AB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody Abcam ab260043 Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody Abcam ab203491
Recombinant Human FGF-basic Gibco PHG0266
Sodium Azide Sigma S2002
Triton-X-100 Fisher Scientific BP151
Troglitazone Millipore Sigma T2573
Tween-20 Bioshop TWN510

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References

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Biologie numéro 172 progéniteurs mésenchymateux progéniteurs fibro-adipogéniques progéniteurs myogéniques cytométrie en flux tri cellulaire activé par fluorescence FACS muscle squelettique dénervation traumatique chronique rat atrophie musculaire fibrose
Identification, isolement et caractérisation des progéniteurs fibro-adipogéniques (PAF) et des progéniteurs myogéniques (MP) dans le muscle squelettique chez le rat
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Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat. J. Vis. Exp. (172), e61750, doi:10.3791/61750 (2021).

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