Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Identifiering, isolering och karakterisering av fibroadiogena stamceller (FAPs) och myogena stamceller (MPs) i skelettmuskulaturen i råttan

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/61750
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Keenan Research Center for Biomedical Science, St Michaels Hospital, Unity Health Toronto, 2Department of Medicine and Interdepartmental Division of Critical Care Medicine, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll skisserar en metod för att isolera Fibro-adipogenic stamceller (FAPs) och myogena stamceller (MPs) från råtta skelettmuskulaturen. Användning av råttan i muskelskada modeller ger ökad vävnad tillgänglighet från bestod muskel för analysen och en större repertoar av validerade metoder för att bedöma muskelstyrka och gång i fria djur.

Abstract

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) är bosatta interstitiella celler i skelettmuskulaturen som, tillsammans med myogena stamceller (MPs), spelar en nyckelroll i muskel homeostas, skada och reparation. Nuvarande protokoll för FAPs identifiering och isolering använder flöde cytometri/fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och studier som utvärderar deras funktion in vivo hittills har genomförts uteslutande på möss. Råttans större inneboende storlek möjliggör en mer omfattande analys av FAPs i skelettmuskelskada modeller, särskilt i allvarligt bestod muskel eller när utredare kräver betydande vävnad massa att genomföra flera nedströms analyser. Råttan ger dessutom ett större urval av muskelfunktionella analyser som inte kräver djursedering eller uppoffring, vilket minimerar sjuklighet och djuranvändning genom att möjliggöra seriella bedömningar. Flödescytometrin/FACS-protokollen optimerade för möss är artspecifika, särskilt begränsade av egenskaperna hos kommersiellt tillgängliga antikroppar. De har inte optimerats för att separera FAPs från råtta eller mycket fibrotic muskel. Ett flöde cytometry/FACS protokoll för identifiering och isolering av FAPs och MPs från både friska och denervated råtta skelettet muskel utvecklades, förlita sig på differentiell uttryck av ytan markörer CD31, CD45, Sca-1 och VCAM-1. Eftersom råttspecifikt flöde cytometri-validerade primära antikroppar är allvarligt begränsade, utfördes intern konjugation av antikroppen som riktade sig mot Sca-1. Med hjälp av detta protokoll bekräftades framgångsrik Sca-1 konjugation, och flöde cytometrisk identifiering av FAPs och parlamentsledamöter validerades av cell kultur och immunstaining av FACS-isolerade FAPs och parlamentsledamöter. Slutligen rapporterar vi en ny FAPs tidskurs i en långvarig (14 veckor) råtta denervation modell. Denna metod ger utredarna möjlighet att studera FAPs i en ny djurmodell.

Introduction

Fibro-adipogenic stamceller (FAPs) är en population av bosatta multipotent stamceller i skelettmuskulaturen som spelar en kritisk roll i muskel homeostas, reparation och regenerering, och omvänt också medla patologiskt svar på muskel skada. Som namnet antyder identifierades FAPs ursprungligen som en stampopulation med potential att differentiera sig till fibroblaster och adipocyter1 och påstods vara de viktigaste medlarna för fibro-fet infiltration av skelettmuskulaturen i kronisk skada och sjukdom. Ytterligare studie visade att FAPs dessutom är kapabla till osteogenes och kondrogenes2,3,4. Således noteras de mer allmänt i litteraturen som mesenkymala eller stromala föregångare3,5,6,7,8. Vid akut skelettmuskelskada hjälper FAPs indirekt till regenerativ myogenes genom att tillfälligt föröka sig för att ge en gynnsam miljö för aktiverade muskelsatellitceller och deras nedströms myogena stamceller (MPs) motsvarigheter1,9,10. Parallellt med framgångsrik regenerering genomgår FAPs apoptos och återgår till baslinjenivåerna1,9,10,11. Däremot, i kronisk muskelskada, FAPs åsidosätta pro-apoptotic signaler, vilket resulterar i deras persistens9,10,11 och onormal muskelreparation.

In vivo-studier som utvärderar de cellulära och molekylära mekanismer genom vilka FAPs förmedlar muskelsvar har använt murindjurmodeller hittills1,7,9,10,11,12,13,14. Medan genetiskt konstruerade möss är kraftfulla verktyg för användning i dessa analyser, begränsar djurets lilla storlek vävnadstillgängligheten för studier i långsiktiga lokaliserade skademodeller där muskelatrofi kan vara djupgående, såsom traumatisk denervation. Dessutom kräver mätning av muskelstyrka och fysisk funktion ex vivo- eller in situ-mätningar som kräver att musen avslutas, eller in vivo-metoder som kräver operation och/eller narkos för att möjliggöra utvärdering av muskelkontraktilprestanda15,16,17,18,19,20 . Hos råttor finns väl validerade och globalt använda muskelfunktionella analyser, förutom analyser för mer komplexa motoriska beteenden som gånganalys (t.ex. ischiasfunktionsindex, CatWalk-analys) och utförs i vakna och spontant rörliga djur21,22,23,24 . Detta optimerar dessutom principerna om minimal sjuklighet i djurförsök och antalet forskningsdjur som används. Råttan ger därmed FAPs utredare den extra flexibiliteten av större skadad muskelvolym för protein- och cellulära analyser och förmågan att genomföra seriella bedömningar av muskelkomplex statisk och dynamisk funktionell aktivitet och beteenden, i varningsdjuret.

FAPs har främst identifierats och isolerats från hela muskelprover med hjälp av flödescytometri respektive fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Dessa är laserbaserade analyser som kan identifiera flera specifika cellpopulationer baserat på karakteristiska egenskaper som storlek, granularitet och en specifik kombination av cellyta eller intracellulära markörer25. Detta är mycket fördelaktigt i studien av ett organsystem som skelettmuskulatur, eftersom homeostas och regenerering är komplexa, multifaktoriella processer samordnade av en mängd celltyper. En viktig studie identifierade FAPs, liksom parlamentsledamöter, med hjälp av flöde cytometriska metoder i mus skelettmuskel1. De visade att FAPs är mesenkymal till sin natur, eftersom de saknade ytan antigener specifika för celler från endotel (CD31), hematopoietic (CD45), eller myogena (Integrin-α7 [ITGA7]) ursprung, men uttryckte den mesenkymala stamcellsmarkör sca-1 (stamcell antigen 1)1 och differentieras till fibrogenic och adipogenic celler i kultur. Andra studier visade framgångsrik isolering av mesenkymala stamceller i muskler baserat på uttrycket av en alternativ stamcellsmarkör, trombocyt-härledd tillväxtfaktorreceptor alfa (PDGFRα)2,7,8 och ytterligare analys visade att dessa sannolikt är samma cellpopulation som FAPs3. Faps identifieras nu ofta i flödescytometri med antingen Sca-1 eller PDGFRα som en positiv urvalsmarkör1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Användningen av PDGFRα är dock företräde för mänsklig vävnad, eftersom en direkt mänsklig homolog av murin Sca-1 ännu inte har identifierats32. Dessutom har andra cellytans proteiner rapporterats som markörer för parlamentsledamöter (t.ex. VCAM-1), vilket ger ett potentiellt alternativ till ITGA7 som en indikator på celler av myogen härstamning under FAPs isolering33.

Medan flöde cytometri / FACS är en kraftfull metod för att studera rollen och patogen potential av FAPs i skelettmuskeln1,9,10,11,13,29, det begränsas tekniskt av specificiteten och optimeringen av dess nödvändiga reagenser. Eftersom flödescytometrisk identifiering och isolering av FAPs har utvecklats och utförts i musdjursmodeller1,9,10,11,29, innebär detta utmaningar för forskare som vill studera FAPs i andra modellorganismer. Många faktorer - såsom optimal vävnadsstorlek som ska bearbetas, liksom reagens och/eller antikroppsitalitet och tillgänglighet - varierar beroende på vilken art som används.

Förutom de tekniska hindren för att studera FAPs i en ny djurmodell har de till stor del studerats i en akut, giftig miljö - vanligtvis via intramuskulär kemisk injektion eller kardiotoxin. Utvärdering av den långsiktiga dynamiken hos FAPs är främst begränsad till bedömning i Duchennes muskeldystrofi, med hjälp av mdxmusmodell9,10,11, och modeller av kombination muskelskada såsom massiv rotator manschett tår där samtidig sena transection och denervation utförs på axel muskulatur26,27,28 . Faps svar på den enda förolämpningen av kronisk traumatisk denervation, en vanlig förekomst i arbetsplatsolyckor i tung industri, jordbruk och i födelsetrauma (brachial plexusskada)34,35,36,37 med betydande sjuklighet, har inte karakteriserats lika väl, ofta begränsat till en kortvarig tidsram11,38.

Vi beskriver en metod för att identifiera och isolera FAPs och parlamentsledamöter från friska samt allvarligt atrofiska och fibrotic skelettmuskulaturen i råttan. För det första, identifiering av CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs och CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ MPs med hjälp av en vävnad matsmältning och flöde cytometri färgning protokoll visas och efterföljande validering av våra resultat utförs genom kultur och immunocytochemical färgning av FACS-isolerade celler. Med den här metoden rapporterar vi också en ny FAPs tidskurs i en långsiktig isolerad denervation skada modell i råttan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Utredare som genomför detta protokoll måste få tillstånd från sin lokala djuretiska styrelse/vårdkommitté. Allt djurarbete godkändes av St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Animal Care Committee (ACC #918) och genomfördes i enlighet med riktlinjerna från Canadian Council on Animal Care (CCAC). Ett schema för flödescytometriprotokollet visas i figur 1. Om nedströmsapplikationen är FACS och efterföljande cellkultur bör alla steg slutföras med rätt aseptisk teknik.

1. Muskelskörd

  1. Bedöva råttor med lämplig bedövningsmedel och offer enligt lokala riktlinjer för vivarium och djuriska styrelsen. Detta protokoll skördar gastrocnemiusmuskeln från vuxna lewisråttor (200-250 g), som ett exempel. Råttor bedövades med 2-3% Isofluran och offrades genom intrakarbiac injektion av T61.
  2. När djuret har offrats, raka hela baklimben för att underlätta muskelns placering och minimera pälsförorening av den skördade vävnaden.
  3. Använd en steril skalpell, gör två snitt i huden: den första runt omkretsen av fotleden och den andra upp mittlinjen i den mediala aspekten av baklimben från fotleden till höften.
  4. Skala tillbaka huden och ytliga muskellager för att avslöja den underliggande gastrocnemius, som har sitt ursprung vid lårbenets mediala och laterala kondyles och skär vid Achilles Tendon.
  5. Använd trubbig dissekering för att separera gastrocnemius från den omgivande vävnaden, hantera muskeln endast genom senan för att undvika krossskada.
  6. Separera gastrocnemius från dess införande genom att transecting Achilles Tendon så distally som möjligt med skarpa saxar. När du har skurit, ta tag i hälsenan med tång och skala försiktigt gastrocnemiusen från underläggningsbenet. Fortfarande hålla muskeln med tång i ena handen, lokalisera gastrocnemius två ursprung och skära vid mediala och laterala femorala condyles.
  7. Fläcka den strukna gastrocnemius försiktigt mot en steril bit gasväv för att ta bort så mycket blod som möjligt. Trimma muskeln på en steril yta och ta bort eventuellt överskott av bindväv samt hälsenan.
  8. Placera musklerna i en vägbåt och väg med precisionsskala. Detta protokoll är optimerat för att smälta muskler med en våt vikt som sträcker sig från 200-600 mg. Aktörerna får om så önskas dela upp överskott av skördad vävnad för andra analyser nedströms.
  9. Dela försiktigt ytterligare skördade muskler som ska användas för flödescytometri i 3-4 mindre bitar (ca 1-2 cm3) och nedsänk i iskall 1x PBS. Håll dig kall på is tills alla prover har skördats.

2. Muskel matsmältning

  1. Ta bort musklerna från PBS och placera i en steril 10 cm cellodlingsfat. Riv försiktigt och färsvävnad med tång tills bitarna är cirka 3-4 mm3, ta bort så mycket bindväv som möjligt. När det är ordentligt malet, överför till ett sterilt 50 ml koniskt rör som innehåller 6 ml DMEM + 1% penicillin/streptomycin (P/S).
  2. Tillsätt 10 μL cacl2-lösning på 365 μL Collagenase II-lösning (lagerkoncentration 4800 U/ml) för att aktivera kollagenasenzymet. Tillsätt den aktiverade collagenas II-lösningen till det koniska röret på 50 ml som innehåller vävnadsslammet. Den slutliga Collagenase II-koncentrationen är 250 U/ml.
  3. Inkubera rör i en shaker i 1 h vid 37 °C, 240 x g, se till att manuellt virvla runt var 15: e minut för att lossa all vävnad som har klibbat fast vid sidan av röret.
  4. Efter 1 h, ta bort rör från skakapparaten och tillsätt följande per prov: 100 μL Kollagenas II (4 800 U/ml) och 50 μL dispase (4,8 U/ml).
  5. Pipettprover med en serologisk pipett 15-20 gånger tills lösningen är homogen. Vid bearbetning av flera prover, använd en separat steril pipett för varje prov för att undvika korskontaminering av prov.
  6. Inkubera igen i en shaker i 30 min vid 37 °C och 240 x g. Skaka efter 15 minuter, skaka prover för hand för att lossa vidhäftande vävnad från sidan av röret.

3. Generering av encellsfjädring

  1. Skjuvprover långsamt genom en 10 ml spruta med en 20 G nål i 10 cykler.
    OBS: En cykel innebär att ta upp muskellösning i sprutan och injicera den tillbaka i röret. Se till att minimera eventuella bubblor genom att slutföra skjuvning långsamt, eftersom överdriven skumning kan orsaka ytterligare celldöd39.
  2. Placera en 40 μm cellsil på ett sterilt koniskt rör på 50 ml och fukta det genom pipettering 5 ml DMEM + 10% FBS & 1% P/S.
  3. Pipettering 1 ml av provet i taget genom cellsilen.
  4. Tvätta cellsilen genom att leda DMEM med 10% FBS och 1% P/S genom silen för att få den totala volymen i röret till 25 ml.
  5. Dela 25 ml av provet jämnt i två koniska rör på 15 ml och centrifugera vid 15 °C, 400 x g i 15 minuter.
    OBS: Att dela upp muskellösningen i två koniska rör på 15 ml säkerställer bättre cellåtervinning efter centrifugering jämfört med ett enda rör.
  6. Aspirera på supernatanten och suspendera pelleten i 1 mL 1x RBC Lysis buffert (se Kompletterande fil)vid rumstemperatur i 7 minuter för att eliminera erytrocyter.
  7. Ta upp volymen till 10 ml med 9 ml tvättbuffert (se Kompletterande fil)och spinnrör vid 400 x g, 15 °C i 15 min.
  8. Aspirera supernatant och rekombin pellets genom att suspendera i 1 mL tvättbuffert.
  9. Överför en lämplig volym celler till ett separat 1,5 ml mikrocentrifugerör och blanda med trypanblå färgämne. Räkna levande celler på ett ljusmikroskop med hjälp av en hemocytometer.

4. Antikroppsfärgning för flödescytometri

OBS: Sca-1-antikroppen måste konjugeras till APC före flödescytometri/FACS-experiment, enligt tillverkarens instruktioner. Prestanda måste valideras för varje sats konjugat(figur 2). Slutliga konjugationer kan förvaras i 20 μL alikvoter vid -20 °C och är stabila i tre veckor. Se tilläggsfilen för fullständigt konjugationsprotokoll.

  1. För flödescytometri, överför 1-2 x 106 celler per experimentellt prov till ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerör. Ta upp volymen upp till 1 ml med tvättbuffert och lägg på is.
  2. För varje experiment ställer du in följande nödvändiga kontroller: i) oupplösta och ii) bärkraftskontroller för att korrekt välja för den levande cellpopulationen. iii) Fluorescens minus en (FMO) kontroller på encellsupphängningar för att ställa in exakta grindar för CD31-/CD45-fraktioner, FAPs och parlamentsledamöter; och iv) enfärgade kompensationspärlor för att korrigera för fluorescensspill mellan kanalerna.
    1. För alla cellkontroller, alikvot 5 x 105 - 1 x 106 celler i 1 ml tvättbuffert i ett 1,5 ml mikrocentrifugerör och placera på is.
    2. För pärlkontroller, tillsätt 1 droppe positiva kompensationspärlor (~ 1,5 x 105 pärlor per droppe) till varje märkt 1,5 ml mikrocentrifugerör. Det fullständiga komplementet av kontrollerna visas i tabell 1.
      OBS: Om experimentet utförs för första gången, kör enfärgade kontroller för varje konjugerad antikropp på encelliga suspensioner (förutom oförseglade, livskraft, enfärgade kompensationspärlor och FMO-kontroller) för att bedöma den positiva färgade populationen i celler och validera färgning som observerats på kompensationspärlor. Validera varje nykonjugerad Sca-1::APC-förberedelse genom att utföra enfärgning på kompensationspärlor och encellsupphängningar. Se tabell 1 för en fullständig lista över färgningskontroller.
  3. För att förbereda bärkraftskontrollen, överför hälften av volymen av celler från "livskraftsröret" till ett nytt 1,5 mL mikrocentrifugerör. Märk det här röret som "Död".
  4. Inkubera "Dead" rör vid 65 °C i 2-3 min för att döda cellerna och placera sedan på is. Efter 2-3 min, kombinera döda celler med levande celler kvar i livskraft kontroll röret. Denna population av celler kommer att användas för att sätta kompensationsvärden (om det behövs) och korrekt sätta grindar för livskraftsfärgen.
  5. Centrifugera encellsupphängningarna (experimentella prover och kontroller) vid 500 x g,4 °C i 5 minuter.
  6. Aspirera på supernatanten och suspendera cellpellets i 100 μL tvättbuffert.
  7. Tillsätt antikroppar, beroende på det experimentella provet eller kontrollen. Se färgningsmatrisen (tabell 2) för information om antikroppskombinationer och mängder.
  8. Snärta försiktigt varje prov för att säkerställa fullständig blandning och inkubera på is i mörkret i 15 minuter. För kompensationspärlor, inkubera vid rumstemperatur i mörkret i 15 min.
  9. För experimentella prover och kontrollprover med en cellupphängning ska volymen öka till 1 ml genom att tillsätta 900 μL tvättbuffert. För kompensationspärla kontroller, öka volymen till 1 ml med 900 μL 1x PBS.
  10. Centrifugera encellsfjädringsprover vid 500 x g, 4 °C i 5 min. Centrifugkompensationspärla kontroller vid 300 x g, 4 °C i 5 min.
  11. För alla encelliga upphängningsprover, aspirera och kassera supernatant och suspendera cellpelleten i 300 μL tvättbuffert. För kompensationspärlor, aspirera och kassera supernatanten, suspendera pelleten i 300 μL 1x PBS och tillsätt sedan 1 droppe (~ 1,5 x 105) av negativa kompensationspärlor.
  12. Förvara alla encelliga upphängningsprover på is under aluminiumfolie och fortsätt att flöda cytometriskt förvärv. Kompensationspärla kontroller bör också skyddas mot ljus men kan hållas i rumstemperatur.
    OBS: Om experimentell endpoint är FAPs identifiering efter flödescytometri, följ steg 5.1.1-5.1.11. Om slutpunkten är cellisolering via FACS för odling och färgning, följ steg 5.2.1-5.2.9 och avsnitten 6-7.

5. Flödescytometri och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)

  1. Flödescytometri
    OBS: Detta protokoll använder en bänkflödescytometer utrustad med 405 nm, 488 nm och 640 nm lasrar som samtidigt kan skilja 10 olika färger. Bandpassfilter och tillhörande fluorokromer som används i detta protokoll är följande: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) och 670/30 (APC). Spänningar för varje detektor är följande: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SytOX Blå 360; APC 570. Se till att du är utbildad i korrekt drift av flödescytometern eller cellsorteraren före användning.
    1. Se till att cytometern har slagits på i 10-20 min före användning och har primets genom att rengöra sekventiellt med rena, skölj- och mantvätskalösningar i 30-45 s vardera. Avsluta med en sköljning med dH2O. Se till att en tillräcklig volym mantlade vätska har tillsatts i förvaringsbehållaren för att upprätthålla korrekt provflöde under hela förvärvet.
    2. Ställ in gatingstrategin för att identifiera allmänpraktiserande läkare och parlamentsledamöter enligt figur 3.
      OBS: FAPs och parlamentsledamöter identifieras genom följande hierarkiska gatingstrategi: i) SSC-A vs FSC-A (sidocellsspridningsområde kontra spridningsområde för främre celler till separata celler vs skräp), ii) FSC-W vs FSC-H (framåt cellspridningsbredd jämfört med främre cellspridningshöjd för att diskriminera singlets från dubbletter i FSC-parametern), iii) SSC-W vs SSC-H (sidocellsspridningsbredd kontra sidocellsspridningshöjd för att diskriminera singlets från dubbletter i FSC-parametern), iii) SSC-W vs SSC-H (sidocellsspridningsbredd kontra sidocellsspridningshöjd för att diskriminera singlets från dubbletter i FSC-parametern), iii) SSC-W vs SSC-H (sidocellsspridningsbredd kontra sidocellsspridningshöjd för att diskriminera singlets från dubbletter i FSC-parametern), iii) SSC-W vs SSC-H (sidocellsspridningsbredd kontra sidocellsspridningshöjd för att diskriminera singlets från dubbletter i FSC-parametern), iii) SSC-W vs SSC-H (sidocellsspridningsbredd kontra sidocellsspridningshöjd för att diskriminera singlets från dubbletter i FSC-parametern), iii) SSC-W vs SSC-H (sidocellsspridningsbredd kontra sidocellsspridningshöjd för att diskriminera singlets från dubbletter i FSC-parametern), iii) SSC-W vs SSC-H (sidocell iv) SSC-A vs SYTOX Blue (för att skilja levande kontra döda singlar), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (för att utesluta CD31+ och CD45+ celler från ytterligare analys), och vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E från CD31-/CD45- (Härstamning; Lin-) population (identifiering av FAPs och parlamentsledamöter). Faps identifieras som CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-händelser och parlamentsledamöter identifieras som CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+-händelser.
    3. Kör först varje enfärgad kompensationspärla kontroll genom cytometern på låg hastighet för att generera kompensationsvärden som används för att korrigera för eventuell fluorescensspill över kanaler. Utvärdera kompensationen genom att jämföra fluorescerande signal från varje kontroll i sin egen detektor (t.ex. SSC-A vs APC för Sca-1::APC enfärgade pärlor) samt alla andra detektorer. Det bör finnas två distinkta populationer (en med negativ och en med positiv signal) i lämplig detektor och endast en negativ population i alla andra detektorer. Ställ in stoppporten på 10 000 kompensationspärla händelser och registrera data.
      OBS: Mellan förvärvet av varje prov, se till att köra dH2O genom cytometern i 10-20 sek för att undvika prov-till-prov-förorening.
    4. Nästa process de ouppnuppnliga och livsdugliga kontrollproverna för att korrekt gate på levande enskilda celler. Ställ in stoppporten på 10 000 singlet-händelser och registrera data.
      OBS: Tillsätt 1 μL SYTOX Blått bärkraftsfärg (300 μM arbetskoncentration utspädd från 1 mM stamlösning) till varje prov och snärta försiktigt för att blanda (slutlig koncentration 1 μM).
    5. Skaffa sedan de återstående proverna för kontroll av encellsupphängning. Bedöma varje FMO-kontroll med lämpligt område i gatingstrategin(figur 3). Utvärdera till exempel FITC-signalen för CD31+CD45 FMO för att säkerställa en korrekt CD31-/CD45-gate. Ett optimalt exempel visas i figur 3G. Om protokollet utförs för första gången bör enfärgade kontroller av celler köras före förvärvet av FMO-kontroller.
    6. Utvärdera fluorescerande signalen från varje enfläckat cellprov i dess lämpliga detektor samt i alla andra detektorer för att validera korrekt kompensation. Ställ in stoppporten på 10 000 live-singlet-händelser och spela in på programvaran.
    7. När alla kontroller (encelliga suspensioner och pärlor) har bearbetats, förbered alla experimentella prover genom att först mäta och registrera volymen på varje prov. Dessa mätningar kommer att användas för att exakt kvantifiera faps och parlamentsledamöter, enligt beskrivningen i steg 5.1.11. Tillsätt sedan 50 μL precisionsräkningspärlor och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner 2-3 gånger.
    8. Kör kortfattat det första experimentella provet för att validera identifieringen av populationen av räknepärla. Denna population visas som ett litet distinkt kluster separat från den allmänna cellpopulationen på FSC-A vs SSC-A-området (figur 3A, röd ruta). Skapa en grind runt den räknande pärlpopulationen. Inhämta sedan data för varje experimentellt prov genom att bearbeta genom cytometern med låg hastighet. Ställ in stoppporten på 10 000 räkna pärlhändelser och rekord.
      OBS: Utredare kan alternativt identifiera räknepärlor genom att sätta upp en ytterligare plot bedömning av SSC-A jämfört med någon av detektorerna, eftersom räknepärlorna är fluorescerande i alla detektorer.
    9. När alla prover har bearbetats rengör du cytometern med hjälp av lämpliga protokoll. Exportera alla data för analys.
    10. Öppna alla datafiler på en lämplig programvara för flödescytometrianalys. Ställ in gitterstrategin som används för datainsamling enligt beskrivningen i steg 5.1.2. Undersök kontroller i samma ordning som vid datainsamling (t.ex. oförstörd, livskraft, en enda fläck, sedan FMO-kontroller) för att validera gatingstrategin igen. När exakta grindar har ställts in med hjälp av FMO-kontroller, applicera portarna på alla experimentella prover. Exportera rådata som ett kalkylblad för kvantifiering.
    11. Beräkna antalet faps och parlamentsledamöter i varje experimentellt prov med hjälp av räknepärlorna:
      Equation 1
      där antalet registrerade händelser av relevant cellpopulation (t.ex. Förvärvat pärlantal är antalet registrerade händelser för att räkna pärlor på förvärvsprogrammet; Counting Beads Volume är volymen av räkna pärla lösning som läggs till i steg 5.1.7; Provvolym är volymen för varje färgat försöksprov före tillsats av räknepärlor. Pärlkoncentration är antalet pärlor per μL-lösning. Det här värdet finns i produktdatabladet.
  2. FACS - sortering för cellkultur
    OBS: Detta protokoll utför FACS på en cellsorterare utrustad med 4 lasrar (UV, Violet, Blue, Red) som samtidigt kan skilja 11-14 färger. Följ det experimentella provfärgningsprotokollet (avsnitt 4) och flödescytometriprotokollet, med undantag för steg 1 till 3 avgränsade nedan, för att optimera FACS-arbetsflödet:
    1. Öka koncentrationen av celler i de experimentella proverna som ska sorteras till 7 x 106 celler/ml för att generera robusta utbyten av FAPs och parlamentsledamöter.
    2. För att ta hänsyn till denna betydande ökning av cellkoncentrationen fördubblar du alla antikroppskoncentrationer i de försöksprover som ska sorteras.
    3. Bearbeta de slutliga färgade cellproverna genom ett 40 μM cellsiltak fäst på ett 5 ml polystyrenrör omedelbart före sortering för att minska cellklumpningen och öka sortutbytet.
    4. Samla enstaka, levande råtta FAPs och parlamentsledamöter direkt från cellsorteraren i ett 5 ml polypropylen insamlingsrör som innehåller 1 ml sterilt, 100% fetalt bovinserum (FBS). Håll cellerna på is tills sorteringen är klar.
      OBS: Om du utför FACS på en plats utanför anläggningen, överför alla sorterade celler på is och i en säker, täckt behållare.
    5. Arbeta i ett sterilt biosäkerhetsskåp (BSC), ta med volymen sorterade celler upp till 7 ml med lämpligt tillväxtmedium (t.ex. FAP growth media (FAP GM) för sorterade FAPs och MP-tillväxtmedier (MP GM) för sorterade parlamentsledamöter; se Kompletterande fil för recept) och centrifugera vid 500 x g, 4 °C för 7 min för att ta bort så mycket resttvättbuffert som möjligt.
    6. Återanvänd pellets i 1 ml lämpligt tillväxtmedium och platta till en 12-välplatta som innehåller en steril, kollagenbelagd 12 mm glasöverdragsslip/brunn för efterföljande immunstaining (se avsnitt 6).
      OBS: Om immunocytokemi färgar för kollagen, platta sorterade celler i en 12 brunnsplatta som innehåller en steril, lamininbelagd 12 mm glasöverdrag/brunn, istället för kollagenbelagd. Om immunocytokemiexperiment av omedelbart isolerade stamceller krävs, så frö FAPs och parlamentsledamöter med en densitet av 15 000 celler per cm2 och fortsätt direkt till steg 6,1. För långsiktiga kulturer för att inducera stamdifferentiering, frö-FAPs med en densitet av 5 000 celler per cm2och parlamentsledamöter med en densitet på 7 500 celler per cm2.
    7. Inkubera celler vid 37 °C och 5% CO2 i en cellodlingsinkubator. Efter 72 timmar i kulturen, byt hälften av media. Byt media helt var 2-4 d efter.
    8. För att inducera myocytutveckling, byt MPs kulturer till MP differentiering (MD) medium på dag 9 av kultur. För att inducera adipocyter, byt FAPs kulturer till FAP adipogenic differentiering (AD) medium på dag 10 av kulturen.
    9. För att inducera fibrogenes kan FAPs byta till fibrogen differentiering (FD) media vid varierande tidpunkter under kultur, eller alternativt, kan sås direkt till FD-medier efter isolering (steg 5.2.6) (se kompletterande fil för alla medierecept).

6. Immunocytokemi hos odlade FAPs och parlamentsledamöter

  1. För att validera cellsortering och påvisa renhet hos FAPs och MPs kulturer, immunstain med celltyp specifika markörer inklusive PDGFRα (FAPs markör), Pax-7 (muskelstam [satellit] cellmarkör), Fibroblast-specifika protein (FSP-1, fibroblast markör), Perilipin-1 (Plin-1, adipocyte markör), kollagen typ 1 (Col1a1, indikator på fibros), Myosin Heavy Chain ( MHC).
    1. För immunstaining av nysorterade celler, centrifugera 12-brunnsplattan vid 200 x g i 3 min vid rumstemperatur för att underlätta vidhäftningen av celler till täckslipet/brunnen. Detta steg är inte nödvändigt för långsiktiga kulturer. Ta bort kulturmedier.
    2. För immunstaining med FSP-1, fixera celler med 1 ml 100% metanol (MeOH) i 2 min vid 4 °C. Om immunstaining för PDGFRα, Plin-1, Pax7 eller Col1a1, fixera cellkulturer med 1 ml 4% PFA i 1x PBS i 15 minuter vid rumstemperatur. MHC immunostaining tolererar antingen fixativ.
      OBS: För metanol-fasta celler hoppar du över steg 6.2 och fortsätter till steg 6.3.
  2. Aspirera 4% PFA och tvätta snabbt cellkulturer 3-4 gånger med 1x PBS. Tillsätt 1 ml 100 mM Glycin i 1x PBS och inkubera i 10 min vid rumstemperatur för att inaktivera rest PFA. Aspirera och tvätta 1-2 gånger med 1x PBS.
    OBS: Cellerna kan lämnas i detta skede i 2 ml 1x PBS, insvept i plastfolie och lagras vid 4 °C i högst 7-10 dagar.
  3. Efter tvätt, tillsätt 1 ml 0,1% Triton-X i 1x PBS och inkubera i 20 min för att permeabilisera cellmembran.
  4. Tvätta brunnar 2-3 gånger med 1-2 ml 1x PBS och blockera sedan celler med 1 ml 1x PBS + 3% BSA per brunn i 1 h vid rumstemperatur.
  5. Pipette 80 μL primär antikropp utspädd i 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 neat, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/mL) på en bit parafilmed på en mobil behållare. Använd sterila fina tångar, lyft försiktigt ut täcksläckat ur brunnen och vänd på droppen av antikroppslösning. Inkubera täckslip med två våta pappershanddukar och täckbehållare i plastfilm för att undvika avdunstning av antikroppslösningen. Inkubera över natten vid 4 °C.
    OBS: Färgning av täcken ur brunnen använder mindre antikropp (~ 80 μL) än färgning inuti brunnen (500 μL minimum).
  6. På dag 2, lämna täckslipar vid rumstemperatur i 30 min för att värma. Använd tång försiktigt rätt och överföra täcken tillbaka till sina respektive brunnar (celler vända uppåt) och tvätta 2-3 gånger med 1-2 ml 1x PBS i 2 min vardera för att ta bort så mycket primär antikropp som möjligt.
  7. Med samma färgningsteknik som vid primär antikroppsfärgning, fläckceller med get antikanin Alexa Fluor 488 sekundär antikropp (1:400) för att upptäcka FSP-1, Plin-1, Col1a1 eller PDGFRα och get antimus Alexa Fluor 555 sekundär antikropp (1:300) för att upptäcka MHC eller Pax-7. Inkubera celler i 1 h vid rumstemperatur och håll cellerna skyddade mot ljus.
  8. Återför celler till brunnen och inkubera celler med Hoechst (1:10 000) i 2-4 min vid rumstemperatur. Tvätta cellerna ytterligare 2-3 gånger med 1x PBS i 2 min vardera för att ta bort överskott av Hoechst.
  9. Montera täcken på glasrutschbanor med hjälp av ett anti-fade fluorescerande monteringsmedium och låt rutschkanorna torka över natten i mörkret vid rumstemperatur. Förvara monterade täcken vid 4 °C i mörker.

7. Olja Röd O (ORO) färgning av odlade FAPs och parlamentsledamöter

  1. Utför ORO-färgning på icke-permeabiliserade celler, eftersom permeabilisering av cellmembranet kan resultera i icke-specifik/oönskad färgning av icke-adipogenic celltyper. Innan färgning börjar, förbered ett ORO-arbetslager (se kompletterande fil för receptet) och inkubera vid rumstemperatur i 20 min.
  2. Efter 20 minuter filtrerar du lösningen med ett 0,2 μm-filter för att ta bort eventuella oupplösta aggregat.
  3. Aspirera media från väl och tillsätt 1 ml 10% neutral buffrad formalin (10% NBF). Inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
    OBS: Cellkonfluens kan leda till lyft från brunnen/täckslipet. Var försiktig när du aspirera/lägga till lösningar.
  4. Aspirera och tillsätt 1 ml färsk 10% NBF och inkubera i minst 1 h vid rumstemperatur.
    OBS: Protokollet kan stoppas vid denna punkt, eftersom celler kan lämnas i 10% NBF över natten.
  5. Tvätta snabbt brunnarna en gång med 1 ml 60% isopropanol, aspirera sedan och låt brunnarna torka helt (ca 2 min).
  6. Tillsätt 400 μL Oil Red O arbetslager per brunn och inkubera i 10 min vid rumstemperatur, se till att undvika pipettering av oro på plattans väggar.
  7. Ta bort all oljeröd O och tvätta snabbt brunnen 4 gånger med dH2O.
    OBS: Om färgade brunnar innehåller täcken, montera med samma teknik som beskrivs i steg 6.9.
  8. Bild antingen monterade täcken eller den färgade brunnen med hjälp av ett brightfield mikroskop.

8. Vävnadsfärgning av kontralaterala och denervated råtta gastrocnemius sektioner

  1. Picrosirius Röd (PSR)
    1. Utför PSR-färgning på 5 μm tjocka, formalin-fixerade paraffin inbäddade (FFPE) råtta gastrocnemius histologic sektioner som tidigare beskrivits40.
  2. Olja Röd O (ORO)
    1. Fix 5 μm-tjock isopentanfryst råtta gastrocnemius histologic sektioner i 4% PFA i 10 min, inkubera i 60% isopropylalkohol i 1 min.
    2. Fläck med ORO arbetslager i 12 min. Inkubera i 60% isopropylalkohol i 1 min, tvätta i 10 min i dH2O. Montera på täcken med hjälp av ett vattenlösligt monteringsmedium.
  3. Sca-1 och laminin vävnad fluorescerande immunohistochemistry (IHC)
    1. Utför fluorescerande IHC på 5 μm-tjock isopentan-fryst råtta gastrocnemius histologic sektioner.
    2. Hydrera prover i 1x PBS i 5 min, fixera i 4% PFA i 10 min och inkubera sedan prover i vävnad IF-blockeringslösning (se Kompletterande fil)i 90 min.
    3. Inkubera med anti-Sca-1 primär antikropp (1:500) utspädd i 1x PBS + 0,05% Interpolering vid 4 °C över natten.
    4. På dag 2, tvätta tre gånger i 1x PBS + 0,05% Interpolering i 5 min vardera och inkubera sedan i get antikanin Alexa Fluor 555 (1:500) i 1 h.
    5. Tvätta igen (som tidigare), inkubera med blockerande lösning i 1 h och tillsätt sedan anti-laminin primär antikropp (1:500) utspädd i 1x PBS + 0,05% Interpolering i 1 h.
    6. Tvätta igen (som tidigare), inkubera sedan i get anti-kanin Alexa Fluor 488 (1:500) i 1 h (för laminin).
    7. Tvätta igen (som tidigare) och inkubera sedan i DAPI (1:10 000) i 4 min. Tvätta och montera på täckslipar med hjälp av anti-fade monteringsmedium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Identifiera FAPs och parlamentsledamöter via flödescytometri med hjälp av en ny antikroppspanel inklusive Sca-1 och VCAM-1
Gating-strategin för att identifiera FAPs i råttmuskeln är baserad på flödescytometriprotokoll i musen29, som grind på CD31 (endotel) och CD45 (hematopoetiska) positiva celler (kallas härstamningen [Lin]) och undersöker fluorescerande profilen av FAPs markör Sca-1 och parlamentsledamöter markerar ITGA7 från linage-negativa (Lin-) populationen. I avsaknad av kommersiellt tillgängliga, fluoroforkonjugerade och flöde cytometri-validerade antikroppar för råtta Sca-1 och ITGA7, vi självkonjugerade en råtta Sca-1::APC antikropp, och genomförde en alternativ strategi för att identifiera parlamentsledamöter. Eftersom VCAM-1 nyligen visade sig vara en effektiv enda positiv urvalsmarkör för isolering av råtta MPs33 och en råtta-specifik, konjugerad, flöde cytometry-validerad antikropp riktad mot VCAM-1 är tillgänglig, använde vi VCAM-1 för att identifiera parlamentsledamöter, i motsats till ITGA7.

Vi bekräftade framgångsrik konjugation och prestanda av Sca-1:APC antikroppen med en enda färgning av kompensationspärlor och cell suspensioner som genereras från friska råtta gastrocnemius (figur 2A,B). En fempunktstitrering av Sca-1::APC (figur 2C) utfördes utöver alla andra antikroppar (CD31::FITC, CD45::FITC, VCAM-1:PE) som används i protokollet(kompletterande figur 1), för att identifiera de optimala koncentrationerna. Med hjälp av denna nya paneldesign identifierades förmodade FAPs och parlamentsledamöter samtidigt från friska gastrocnemius (figur 3), varigenom celler som var enkelpositiva för Sca-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) betecknades FAPs (röd låda) och celler enkelpositiva för VCAM-1 (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) utsågs till parlamentsledamöter (blå låda). Vi identifierade också en population av celler dubbelt positiva för Sca-1 och VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+)(figur 3F;övre högra kvadrant).

Validering av FACS och cellkulturs identifiering av allmänpraktiserande läkare och parlamentsledamöter
För att validera protokollet som presenteras för flöde cytometrisk identifiering av FAPs och parlamentsledamöter i råtta skelettmuskulatur, försökte vi isolera levande celler för kultur in vitro. Med hjälp av FACS isolerades livskraftiga FAPs och parlamentsledamöter med samma gating-strategi som i flödescytometrisk analys. Cirka 20 000-40 000 FAPs och 30 000-50 000 parlamentsledamöter samlades in för cellkultur från en enda gastrocnemiusmuskel från en 230 g råtta.

För att bekräfta renheten hos varje population, vi co-immunostained nysorterade FAPs och parlamentsledamöter för PDGFRα och Pax7. PDGFRα är den andra mesenkymala stamfadermarkören, förutom Sca-1, som vanligtvis används för att identifiera FAPs2,7,8. Pax-7 är en välkänd och allmänt använd markör för muskelsatellitceller (stamceller)41. Den sorterade populationen av FAPs visade positiv färgning för PDGFRα utan förorening av Pax7 positiva celler(figur 4A, översta raden). Omvänt färgades den sorterade populationen av parlamentsledamöter positivt för Pax7 med avsaknad av PDGFRα-positiva celler (figur 4A, nedre raden), vilket validerar förmågan hos Lin-/Sca-1+/VCAM-1- och Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ cellytans antigenprofiler att isolera rena populationer av FAPs respektive parlamentsledamöter.

Vi nästa odlade sorterade FAPs och parlamentsledamöter under en tidsförlopp av 10-12 dagar under förhållanden för att inducera adipogenic, fibrogenic och myogen differentiering. Dag 12 innehöll FAPs kulturer som utsattes för adipogenic villkor celler med antingen en fibroblastliknande morfologi eller en multilokal morfologi som liknar den för vita pre-adipocyter med fettdroppar (data visas inte). Immunostaining för fibroblastspecifikt protein-1 (FSP-1) bekräftade fibroblastdifferentiering, medan färgning för Plin-1 (Perilipin-1; en adipocytmarkör)42 och oljerött O bekräftade differentiering av adipocyter respektive förekomsten av neutrala triglycerider och lipider (figur 4B). Avsaknaden av kontaminerande celler från en myogen härstamning i FAPs kulturer bekräftades av co-immunostaining för myosin tunga kedjan (MHC), en markör för differentierade myocyter. FAPs kulturer som utsätts för fibrogen differentiering (FD) bedömdes för kollagen typ 1 (Col1a1) uttryck, en av de viktigaste FAPs-härledda kollagenerna8. Co-immunostaining för Col1a1 och MHC på dag 11 visade robust kollagen typ 1 uttryck utan förorenande MHC positiva celler (figur 4B). Slutlig bekräftelse av renheten hos FAPs befolkningen genomfördes genom odling av FAPs i myogena medier, för att uppmuntra utväxten av alla förorenande parlamentsledamöter. Inga MHC-positiva celler observerades(kompletterande figur 2A).

MP kulturer utsätts för myogena villkor visat MHC-uttrycka mogna myocyter och multi-nukleated myotubes 12 dagar efter plätering(figur 4C). Co-immunostaining av MP kulturer med FSP-1 och Plin-1 visat avsaknaden av förorenande fibroblaster eller adipocyter, respektive. Oro-färgning visade inte heller lipidkontaminering (Fig. 4C). Col1a1, som uttrycks högt av fibroblaster, har också rapporterats vara producerad i mindre utsträckning av myogena prekursorer och myoblaster, även om det finns motstridiga uppgifter i litteraturen i detta avseende8,43,44. Medan samtidig immunstaining av parlamentsledamöter med Col1a1 och MHC visade myocyt differentiering av vår MP-kultur, hittades inga bevis på Col1a1 immunopositivity (figur 4C). För att ytterligare bekräfta befolkningens renhet utsattes MP-kulturer för adipogenic eller fibrogena tillstånd för att uppmuntra tillväxten av adipocyter och fibroblaster(kompletterande figur 2B). Inga förorenande celler från FAPs härstamning observerades.

Medan vi hade visat förmågan att identifiera och sortera rena populationer av FAPs och parlamentsledamöter från råtta muskler, försökte vi sedan bestämma identiteten på Lin-/Sca-1 +/VCAM-1 + (dubbelpositiv) celler. Eftersom Sca-1 uttryck har rapporterats på en mycket liten andel av MPs (cirka 3%) i friska muskler45 och på samma sätt har få FAPs (ca 4%) rapporterats att uttrycka VCAM-1 i friska muskler10,immunstaining av nysorterade Lin-/Sca-1+/VCAM-1 + celler utfördes för PDGFRα och Pax7 tillsammans med odling av dem i myogena, adipogenic, fibrogena tillstånd för att inducera myogenes, adipogenes respektive fibrogenes. Det konstaterades att de dubbelpositiva cellerna var en blandad population av parlamentsledamöter och FAPs, med nysorterade celler immunostaining positiva för antingen PDGFRα eller Pax7(kompletterande figur 3A) och odlade celler som differentieras till mogna myocyter, adipocyter eller fibroblaster(kompletterande figur 3B,C).

ITGA7 vs VCAM-1 för att identifiera parlamentsledamöter under flödescytometrisk FAPs-identifiering
Medan ett framgångsrikt protokoll för flöde cytometrisk identifiering av råtta FAPs och parlamentsledamöter med Sca-1 respektive VCAM-1 inrättades, försökte vi avgöra om en självkonjugerad ITGA7 antikropp på samma sätt kunde användas för att identifiera parlamentsledamöter istället för VCAM-1, som är standard i musen. En råttspecifik ITGA7-antikropp konjugerades till PE-Cy7 (se Kompletterande fil)och antikroppens prestanda validerades på kommersiella kompensationspärlor och encellsavstängningar som genererades av råtta gastrocnemius(kompletterande figur 4A-C). Antikroppen ITGA7::P E-Cy7 utfördes på ett tillfredsställande sätt på enstaka färgnings- och FMO-experiment(kompletterande figur 4D). Men när full färgning gastrocnemius cell suspensioner med CD31::FITC, CD45::FITC, Sca-1::APC och ITGA7::P E-Cy7, en interaktion blev uppenbar mellan Sca-1::APC och ITGA7::P E-Cy-7 antikroppar. Efterföljande kultur av både FACS sorterade Lin-/Sca-1+/ITGA7-celler (påstådda FAPs) och Lin-/Sca-1-/IGTA7+ celler (påstådda parlamentsledamöter) (kompletterande figur 4E) gav främst FAPs och med få parlamentsledamöter(kompletterande figur 4F), vilket indikerar interaktionen mellan Sca-1::APC och ITGA7::P E-Cy-7 antikroppar påverkade specifikheten.

En ny FAPs tidskurs i långsiktig denervated skelettmuskulatur
Eftersom FAPs dynamik har bedömts i samband med kortsiktig traumatisk denervation, i murin modeller11,38, försökte vi validera prestandan hos vår metod för FAPs isolering från både friska och allvarligt atrofiska, fibrotiska muskler. Råttor utsattes för traumatiska långsiktiga denervation skada med hjälp av väl validerade ensidiga tibial nerv transection modell46 med gastrocnemius muskel skördas vid fyra seriella tidpunkter under 14 veckor post-denervation från den denervated lem och contralateral innervated lem (att fungera som en intern kontroll). Som tidigare rapporterats visade denervated muskel progressiv atrofi (figur 5A, B), med ökande fibros och fettdeposition ( figur5C-F) över tiden47.

Vårt protokoll genererade ett tillräckligt antal celler för flödescytometrisk analys, även om 12 och 14 veckors denervated gastrocnemius vägde cirka 0,2-0,3 g (15-20% av respektive kontralateral kontrollmuskel) (figur 5B). Vi observerade uppreglering av FAPs i den denervated gastrocnemius muskeln jämfört med innervated kontralateral kontroll muskel, upprätthålls under 14 veckor varaktigheten av experimentet (figur 6A, B), överensstämmelse med progressiva muskel fibros och fett nedfall. Sca-1 immunostaining av muskel histologic tvärsnitt bekräftade lokalisering av Sca-1 uttrycker celler till områden av fibro-fett förändring i 14 veckor-denervated muskeln (figur 5G), förutom baslinjen uttryck i interstitium mellan myofibrer i friska muskeln. En distinkt delmängd av celler uppstod i FAPs population över tiden post-denervation kännetecknas av en robust ökning av Sca-1 signal (Sca-1 hög; Figur 6A, röd låda) på flödescytometrisk analys, jämfört med FAPs basala Sca-1-uttryck (Sca-1 Med/Low; Bild 6A, grön ruta). Kvantifiering av dessa subpopulationer visade differentiell dynamik över tid; Sca-1 High FAPs ökade betydligt vid 12- och 14 veckors efterförnekning(figur 6B), som utgjorde ungefär hälften av den totala FAPs-befolkningen(figur 6C). Däremot var Sca-1 Med/Low FAPs den dominerande subpopulationen vid 2- och 5 veckors efterdeervation (figur 6C) och visade endast en övergående ökning av nivåerna tidigt efter denervation(figur 6B).

I motsats till den ihållande förekomsten av FAPs i långsiktiga denervated muskeln, visade parlamentsledamöter en förväntad bifasisk svar på denervation. Inledningsvis ökade parlamentsledamöterna i denervated muskel över det som ses i kontrollbenet, men vid 5 veckor efter denervation började befolkningen minska (figur 6D). I linje med den välkända utmattningen av muskelsatellitcellpopulationen i långtidsförsvagning muskel47, med 12 veckor var parlamentsledamöter antingen på eller under baslinjen nivåer efter tibial nervtransection.

Vi analyserade också dynamiken i Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ populationen(Kompletterande figur 3D-E). Medan frekvensen av dubbla positiva celler i förhållande till Lin- populationen gradvis minskade i denervated muskel över tiden, när det absoluta cellantalet bestämdes per gram muskel observerades en tillfällig ökning av den dubbla positiva populationen, innan den föll till eller under baslinjen nivåer med 14 veckor efter denervation.

Figure 1
Bild 1: Grafiskt schema för FAPs och parlamentsledamöter identifiering, isolering och kultur: Grafiskt schema som visar FAPs och parlamentsledamöter identifiering från råtta gastrocnemius. Prover skördas och mekaniskt malets innan de genomgår två sekventiella enzymatiska matsmältningar. Vävnadspreparat bearbetas och filtreras sedan för att generera en enda cellfjädring. En cocktail av fluorescerande konjugerade antikroppar tillsätts till varje prov som sedan körs genom en flödescytometer eller cellsorterare för att identifiera eller isolera FAPs och parlamentsledamöter. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Sca-1::APC självkonjugerad antikroppsvalidering och titrering. Validering av Sca-1::APC antikroppskonjugation genom enfärgning på kommersiella kompensationspärlor(A) och encelliga suspensioner som genereras från friska råtta gastrocnemius muskel (B). Distinkta populationer av både Sca-1 märkta pärlor och celler är uppenbara (svarta lådor). Antikroppstitrering utfördes genom att testa fem olika koncentrationer av Sca-1::APC på encellsupphängningar (C); den optimala koncentrationen valdes baserat på största fluorescensintensitet med minimal bakgrundsfärgning och befanns vara batchberoende. En representativ titrering visas med den batchspecifika optimala koncentrationen som indikeras av den röda rutan. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Identifiering av flödescytometri av FAPs och parlamentsledamöter i råtta gastrocnemius. (A-F) Gating-strategi för flödescytometrisk analys av FAPs och parlamentsledamöter. (A) Prover är först gated för att utesluta skräp (svart låda) samt för att gate för att räkna pärlor (röd låda). Cellerna portas sedan för att utesluta dubbletter både genom front scatter (FSC) (B) och sidospridning (SSC) egenskaper (C). Livskraften hos resulterande enstaka celler bedöms genom färgning med SYTOX Blue (D). SYTOX Blå negativa (levande) singlar bedöms sedan för FITC-signal som identifierar CD31 och CD45 (Härstamning; Lin) för att utesluta Lin+ fraktioner från ytterligare analys (svart låda Lin- celler) (E). Linpopulationen bedöms sedan för Sca-1::APC kontra VCAM-1::P E-signal (F). FAPs identifieras som Lin-/Sca-1+/VCAM-1- (F; röd låda) medan parlamentsledamöter identifieras som Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ händelser (F; blå låda). En Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ dubbelpositiv population är också uppenbar (övre högra kvadranten). G)FMO-kontroller (Fluorescence Minus One) för CD31::FITC och CD45::FITC visar korrekt kompensation och gating för Lin-celler. (H-I) Sca-1::APC jämfört med VCAM-1::P E-tomter med FMO-kontroller visar korrekt kompensation och gating för FAPs (Sca-1 FMO) och parlamentsledamöter (VCAM-1 FMO). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Sorterade FAPs och parlamentsledamöter cellkultur och immunstaining. ( A) Co-immunostaining för PDGFRα (grön) och Pax7 (röd) på nysorterade FAPs (översta raden) och parlamentsledamöter (nedre raden). Nuklei fläck blå med DAPI. FAPs uttrycker endast PDGFRα och inga Pax7 positiva celler är uppenbara, medan parlamentsledamöter uteslutande uttrycker Pax7 utan PDGFRα positiv cellförorening, vilket visar renheten hos båda sorterade populationer. b)FAPs på dag 12 i adipogenic differentieringsmedieringsmedier (AD) färgar positivt för Fibroblast-specifika protein 1 (FSP-1; grön) och Perilipin-1 (Plin-1; grön), vilket visar differentierade fibroblaster respektive adipocyter. Kärnor är färgade med DAPI (blå). Olja Röd O (ORO) färgning (röd) indikerar förekomsten av neutrala triglycerider och lipider som härrör från mogna adipocyter vid dag 12. FAPs utsätts för fibrogenic differentiering media (FD) visar uttryck för FAPs-härledda kollagen typ 1 (Col1a1; grön). FAPs odlas i antingen adipogenic eller fibrogenic media inte co-immunostain för myosin tunga kedjan (MHC, röd), vilket indikerar en avsaknad av förorenande myocyter. (C) Parlamentsledamöter som odlas i myogena differentieringsmedieringsmedier (MD) på dag 12 visar MHC-positiv (röd) färgning som visar närvaron av mogna myocyter och smälta multinukleära myotuber. Kärnor är färgade med DAPI (blå). MP kulturer var fria från fibroblast och adipocyte kontaminering som anges av avsaknaden av co-immunostaining för FSP-1 (grön), Plin-1 (grön) och ORO färgning. Parlamentsledamöter som odlas på laminin för att rymma Co1a1 immunstaining visar inte samma grad av myotube fusion vid dag 12 som förekommer på kollagen. Col1a1 (grön) är frånvarande från MP-kulturer. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Atrofi, fibros och fet infiltration av långsiktiga denervated muskel. ( A) Representativ skördade gastrocnemiusmuskler vid fyra seriella tidpunkter efter denervation. Gastrocnemius betecknas CONTRA är ett representativt kontralateralt benprov från ett två veckors denervated djur. b)Kvantifiering av muskelatrofi efter denervation uttryckt som förhållandet mellan denervated (DEN) gastrocnemius våtvikt och förhållandet mellan den kontralaterala (CONTRA) delen. c)Picrosirius Red (PSR) färgade histologic tvärsnitt av gastrocnemius skördas 2 eller 14 veckor efter denervation visa progressiv fibros. Muskelfläckar gula, kollagen fläckar röda. (D) Fibros kvantifieras genom att bestämma området psr-positiv vävnad i förhållande till den totala vävnadsarealen. e)Olja Röd O (ORO) färgade tvärsnitt av gastrocnemius skördas 2- eller 14 veckors eftertäthet, motbetsade med hematoxylin. Lipider fläck röd. (F) Fettinfiltration kvantifierad genom bestämning av området av ORO-färgad vävnad i förhållande till den totala vävnadsarealen. G)Gastrocnemius histologic tvärsnitt skördade 2- eller 14 veckors postdenervation, immunstained för laminin (grön) och Sca-1 (röd). Laminin fläckar positivt den basala lamina som omger enskilda myofibrer. Sca-1 identifierar flera stamcellstyper. Kärnor är färgade med DAPI (blå). Infälld visar lokalisering av Sca-1 + celler utanför basal lamina i friska muskler; gula pilar betecknar förekomst av Sca-1+ celler inom fibrotiska områden. (Data är medelvärde +/- S.D; n=3 för 2 och 14 veckors tidsperioder. Data i panel B analyseras av enkelriktadE ANOVA, data i panelerna D och F analyserade av tvåvägs ANOVA. Post-hoc Sidaks test utfördes för att korrigera för flera jämförelser. * = P<0,05 mellan CONTRA och DEN; # = P<0.05 mellan proverna) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: FAPs och parlamentsledamöter dynamik i långsiktiga denervated råtta gastrocnemius. (A) Representativ Sca-1::APC jämfört med VCAM-1::P E paneler av Lin- (CD31-/CD45-) populationen från muskelprover skördade 2-, 5-, 12- eller 14-veckors efteravskräckning. Översta raden visar tomter från den denervated (DEN) gastrocnemius, medan den nedre raden visar de från den kontralaterala, oanvändbara (CONTRA) gastrocnemius. Lin-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs (Totalt) är indelade i Sca-1 High (röd låda) och Sca-1 Med/Low (grön låda) fraktioner, medan Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ MPs visas i den blå rutan. (B) Kvantifiering av FAPs (Totalt, Sca-1 Hög, Sca-1 Med/Low) vid varje tidpunkt efter denervation, rapporterad som frekvensen (%) av Lin- celler (översta raden) och antalet celler per gram muskel (nedre raden) normaliseras till kontralateral kontroll gastrocnemius. c)Relativa proportioner av Sca-1 High och Sca-1 Med/Low subpopulationer av den totala FAPs befolkningen. (D) Kvantifiering av parlamentsledamöter vid varje tidpunkt efter denervation rapporteras som frekvensen (%) av Lin- celler (vänster graf) och som antalet celler per gram muskel (höger graf) normaliseras till kontralateral kontroll. (Data är medelvärdet +/- S.D; n=4 för 2 och 12 veckors tidsperioder; n=5 för 5 veckors tidspunkt; n=2 för 14 veckors tidsperiod. Data analyserade av enkelriktadE ANOVA; Post-hoc Sidaks test för att korrigera för flera jämförelser. # = P<0.05.) Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Kompletterande figur 1: Antikroppsvalidering och titrering. Validering av CD31::FITC (A-C), CD45::FITC (D-F) och VCAM-1::P E (G-I) kommersiellt konjugerade antikroppar på kompensationspärlor (A,D,G) och encelliga suspensioner från friska råtta gastrocnemius muskel (B,E,H). Varje antikropp titrerades vid 5 olika koncentrationer (C, F, I). Den optimala koncentrationen valdes baserat på största fluorescensintensitet med minimal bakgrundsfärgning (röda lådor). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Sorterade FAPs och parlamentsledamöter i omvända differentieringskulturförhållanden. (A) FAPs odlade i myogena differentieringsmedieringsmedier (MD) vid dag 12 medimmunstained för FSP-1 (grön), Plin-1 (grön) eller Col1a1 (grön) och MHC (röd) visar inte myocytförorening. Positiva FSP-1 och Col1a1 färgning avslöjar FAPs differentiering till fibroblaster. ORO färgning (röd) avslöjar lipidproduktion även om Plin-1 positiva adipocyter inte är lätt synliga. Kärnor färgade med DAPI (blå). b)Parlamentsledamöter som utsatts för adipogenic differentieringsmedieringsmedier har avlidit. Parlamentsledamöter odlade i FAP Growth Media (FAP GM) i 12 dagar och co-immunostained för FSP-1 (grön) eller Plin-1 (grön) och MHC (röd) visar differentierade myocyter och myotubes med avsaknad av FSP-1 eller Plin-1 positiva celler. Avsaknaden av ORO färgning bekräftar ytterligare bristen på adipogenic celler i kultur. Parlamentsledamöter odlade i fibrogenic differentiering media (FD) och co-immunostained för Col1a1 och MHC visar mogna myocyter och en avsaknad av Col1a1 positiva celler. Parlamentsledamöter som odlas på laminin för att rymma Col1a1 immunstaining visar inte samma grad av fusion till myotuber vid 12 dagar i kultur som förekommer på kollagen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ celler är en blandad population avFAPs och parlamentsledamöter. (A)PDGFRα och Pax7 co-immunostaining av nyisolerade Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ celler visar en blandad population av PDGFRα enstaka positiva (vita pilar) och Pax7 enstaka positiva (gula pil) celler som identifierar FAPs respektive parlamentsledamöter. (B) Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ kulturer på dag 12 som odlas i myogena differentieringsmedieringsmedier (MD) innehåller både FSP-1 enstaka positiva (gröna) och MHC-enpositiva (röda) celler som identifierar fibroblaster respektive myocyter/rör. Frånvaro av Plin-1 (grön) och ORO (röd) färgning indikerar frånvaron av mogna adipocyter. Co-immunostaining för Col1a1 (grön) och MHC (röd) visar mogna myocyter och fibroblaster. (C) Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ celler på dag 12 odlade i adipogenic differentieringsmedieringsmedier (AD) visar på samma sätt en blandning av FSP-1 (grön) enstaka positiva och MHC (röda) enstaka positiva celler, men också med Plin-1 (grön) enstaka positiva celler och ORO-färgning närvarande, vilket bekräftar differentiering av fibroblaster, myocyter och adipocyter. Kulturer som odlas i fibrogenic differentieringsmedieringsmedia (FD) visar mogna myocyter och Col1a1 enda positiva celler (fibroblaster). (D) Representativ Sca-1::APC jämfört med VCAM-1::P E paneler av Lin- (CD31-/CD45-) populationen från denervated muskelprover skördade 2-, 5-, 12- eller 14-veckors efteravskräckning; Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ population anges i den lila rutan. (E) Kvantifiering av Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ celler över fyra seriella tidpunkter efter denervation, rapporterad som frekvensen av Lin- celler (vänster graf) och celler per gram muskel (höger graf) normaliseras till kontralateral gastrocnemius. (Data är medelvärdet +/- S.D; n=4 för 2 och 12 veckors tidsperioder; n=5 för 5 veckors tidspunkt; n=2 för 14 veckors tidsperiod. Data analyserades av enkelriktadE ANOVA; post-hoc Sidaks test för att korrigera för flera jämförelser; # = P<0.05.) Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 4: ITGA7 som markör för myogena celler i flödescytometri av råttskeletalmuskel. Validering av ITGA7::P E-Cy7 antikroppskonjugation genom enfärgning på kommersiella kompensationspärlor (A) och encelliga suspensioner som genereras från friska råtta gastrocnemius muskel (B). Populationer av både ITGA7 märkta pärlor och celler är uppenbara (svarta lådor) (C) Antikropp titrering utfördes genom att testa fem olika koncentrationer på encelliga suspensioner. Röd låda indikerar idealisk koncentration. (D) Diagram av Fluorescence Minus One (FMO) kontroller visar frånvaron av fluorescensspill över antikroppskonjugaterna, men full fläck av cellupphängningar avslöjar en icke-specifik interaktion mellan Sca-1::APC och ITGA7::P E-Cy7 (grön låda). Gating (E) för att separera Lin-/Sca-1+/ITGA7-celler (påstådda "FAPs") och Lin-/Sca-1-/IGTA7+-celler (påstådda "MPs"). (F)Co-immunostaining av FACS-sorterade cellkulturer vid 12 dagar efter plätering med Perilipin-1 (grön) och MHC (röd) visar båda grupperna av sorterade celler mognat främst till adipocyter med få myocyter närvarande. Klicka här för att ladda ner den här filen.

1. Obefläckad
2. Kontroll av livskraften
3. CD31 + CD45 FMO
4. Sca-1 FMO
5. VCAM-1 FMO
6. CD31 + CD45 Single Stain (Pärlor)
7. CD31 + CD45 Single Stain (Celler)
8. Sca-1 Enda fläck (pärlor)
9. Sca-1 Enkel fläck (celler)
10. VCAM-1 Enda fläck (pärlor)
11. VCAM-1 Enstaka fläckar (celler)

Tabell 1: Flödescytometriantikroppsfärgningskontroller. Komplett komplement av antikroppsfärgningskontroller. Om experimentet utförs för första gången bör enfärgade kontroller köras på både kompensationspärlor och encelliga suspensioner. För alla efterföljande experiment behöver enfärgade kontroller bara köras på kompensationspärlor.

CD31::FITC (μg) CD45::FITC (μg) Sca-1::APC (μg)* VCAM-1::P E (μg) SYTOX Blå
(μM; Slutlig koncentration)
Oförstörd kontroll
-- -- -- -- --
Enkelfärgade kontroller
SytOX Blå (Bärkraftskontroll) -- -- -- -- 1
CD31 och CD45 0.5 0.25 -- -- 1
Sca-1 -- -- 0.25 -- 1
VCAM-1 -- -- -- 0.25 1
Fluorescens minus en (FMO)
CD31 och CD45 -- -- 0.25 0.25 1
Sca-1 0.5 0.25 -- 0.25 1
VCAM-1 0.5 0.25 0.25 -- 1
Experimentella prover
Full fläck 0.5 0.25 0.25 0.25 1

Tabell 2: Flödescytometri antikroppsfärgningsmatris. Antikroppsmängden för färgning av experimentella prover och kontrollprover för flödescytometri visas. All färgning utförs i en total volym av 100 μL tvättbuffert. *Den optimala mängden självkonjugerad Sca-1::APC-antikropp kan variera beroende på vilken sats som används. Alla nykonjugerade Sca-1::APC-partier bör först valideras genom enfärgning av både kompensationspärlor och encellsupphängningar.

Kompletterande fil: Reagens recept. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ett optimerat, validerat FAPs isoleringsprotokoll för råttmuskel är viktigt för forskare som vill studera skademodeller som inte är genomförbara i musen av biologiska eller tekniska skäl. Till exempel är möss inte en optimal djurmodell för att studera kroniska lokala eller neurodegenerativa skador som långsiktig denervation. Biologiskt gör mössens korta livslängd och snabba åldrande det svårt att noggrant avgränsa muskelsequalae på grund av denervation från den förvirrande faktorn åldrande. Ur teknisk synvinkel skulle den drastiskt minskade muskelmassan på grund av att svår atrofi vara otillräcklig för effektiv flöde cytometrisk analys. Faktum är att mus-FAPs isoleringsprotokoll föreslår att gruppera friska muskler tillsammans för att bättre öka avkastningen av sorterade FAPs29. Medan detta löser den tekniska barriären för att få tillräcklig muskelvävnad för analys, begränsar det samtidigt forskare från att bedöma FAPs på en muskelspecifik nivå. Eftersom specifika muskelgrupper varierar naturligt i sin fiber typ sammansättning, graden av vaskulärisering och mitokondriellt nummer47 till exempel, kombinera flera olika muskler för flöde cytometrisk analys förhindrar muskel-specifika FAPs karakterisering. Däremot visar vi att både friska och långsiktiga denervated, bestod och fibrotic råtta gastrocnemius ger en tillräcklig mängd startmaterial för effektivt flöde cytometry. Dessutom, i friska prover, överskottet av muskler kan ytterligare delas upp för flera nedströms analyser, så att forskare samtidigt analysera cellulära, molekylära och histologiska funktioner i samma vävnad. Slutligen, för experiment som manipulerar FAPs i skademodeller med terapeutiska, finns väl validerade analyser av fysisk funktion och gång i alerta och aktiva råttor tillgängliga21,22,23,24, vilket möjliggör seriell bedömning av muskelfunktionen utan behov av djurets abort.

Ett viktigt hinder för att skapa ett optimerat FAPs isoleringsprotokoll för råttan var antikroppstillgänglighet. Vårt första tillvägagångssätt syftade till att kopiera antikroppspanelen och gatingstrategiprotokollen som används i stor utsträckning i musen1,7,8,9,10,11,12,13,14. Medan kommersiellt tillgängliga, konjugerade, flöde cytometry-testade och validerade antikroppar som känner igen råtta var tillgängliga för härstamningsmarkörerna CD31 och CD45, fanns ingen för positiva FAPs identifiera markörer Sca-1 eller PDGFRα, liksom för den negativa urvalsmarkören ITGA7. Icke-konjugerade, primära antikroppar som är specifika för dessa markörer och påstods vara effektiva i flödescytometri fanns tillgängliga, men av FAPs markörer Sca-1 och PDGFRα hade endast Sca-1-antikroppen validerats i den publicerade litteraturen i flödescytometrisk analys av råttceller48. Vi valde därför Sca-1 som den positiva urvalsmarkören för FAPs. Möjligheten att använda sekundära antikroppar för att avgränsa Sca-1- och ITGA7-markörer var inte möjlig av flera skäl, utan främst för att de enda råttspecifika antikropparna för Sca-1 och ITGA7 som validerats för flödescytometri genererades i samma värdart. Det återstående alternativet var därför självkonjugation av båda antikropparna med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit.

Processen att välja ett optimalt kit för antikroppskonjugation var omfattande, eftersom många kit är helt eller delvis intoleranta mot olika buffertdluenter (t.ex. Glycin, Glycerol, BSA, Natriumazid) som finns i primära antikroppar. Dessutom skall den fluorofor som tillhandahålls vara kompatibel med de lasrar som är utrustade inom den flödescytometer/cellsorterare som prövaren har tillgång till och inte vid en liknande våglängd avge andra fluoroforer som används för att identifiera andra celltyper i provet. Förekomsten av spädningskomponenter i de råttspecifika PDGFRα primära antikropparna som var dåligt kompatibla med konjugationssatserna, var ytterligare en övervägande i valet av Sca-1 som den positiva FAPs urvalsmarkören i detta protokoll. Medan dessa resultat visar att både Sca-1::APC och ITGA7::P E-Cy7 konjugationer resulterade i identifiering av distinkta positiv-färgade populationer på både kompensation pärlor och celler, den förra befanns uppvisa förfall i fluorescens tidigare än vad som annonserades av tillverkaren. Det rekommenderas starkt att forskare konjugerar Sca-1::APC enligt tillverkarens instruktioner, omedelbart före första gången användning (t.ex. dagen före experimentet) för att säkerställa robust signal, planera experiment i enlighet därmed så att ett enda parti konjugerad antikropp kan användas inom antikroppens effektivitetsfönster och validera varje parti genom enfärgning av kompensationspärlor och titrering på encellsupphängningar. Ännu viktigare är dock att den kritiska interaktionen som noterades mellan Sca-1::APC och ITGA7::P E-Cy7 förhindrade korrekt avgränsning av populationer av FAPs vs MPs, vilket krävde en alternativ strategi.

visade nyligen framgångsrika flöde cytometrisk isolering av råtta muskel stamceller med VCAM-1 som en enda positiv urvalsmarkör33 i CD31, CD45 och CD11b negativa celler. Med VCAM-1 som MP-urvalsmarkör använde vi en ny antikroppspanel för att identifiera FAPs (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) och MPs (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) och validerade tillvägagångssättet med in vitro-kultur av FACS-sorterade celler från friska gastrocnemiusmuskeln. Nyligen isolerade FAPs och parlamentsledamöter immunstained endast för sina respektive alternativa markörer PDGFRα och Pax7. Odlade FAPs differentierade i populationer av mogna fibroblaster och adipocyter, och parlamentsledamöter i mogna myocyter / myotubes. Ingen korskontaminering av FAPs och parlamentsledamöter inom kulturerna inträffade. Immunostaining av histologic tvärsnitt bekräftade infiltration av områden av fibro-fett nedbrytning i denervated muskeln med Sca-1 positiva celler.

Medan vi genomförde flöde cytometrisk analys av långsiktiga denervated muskeln att validera vårt protokoll i allvarligt bestod, fibrotic och fett-infiltrerade muskel, observerade vi för övrigt uppkomsten av en FAPs sub-population med ökad Sca-1 signal (betecknad Sca-1 Hög) jämfört med baslinjen Sca-1 uttryck (betecknas Sca-1 Med/Low) över tiden. Sca-1 High FAPs ökade betydligt sent efter denervation (12 veckor plus), medan Sca-1 Med / Low FAPs toppade tidigt på 5 veckor innan de sjönk tillbaka till baslinjenivåer. Heterogenitet i FAPs fenotyp har rapporterats10,30. FAPs med högre Sca-1 uttryck visade sig skilja lättare i adipocyter, och när de utsätts för fibrogen stimulering ökade uttrycket av Col1a130,49. Dynamiken i FAPs-underpopulationerna som observeras här verkar vara i linje med tidsförloppet för denervation-inducerade och sviter och muskelns regenerativa kapacitet47 och kan därmed karakterisera FAPs-underpopulationer med olika cellulära program. Sca-1 High FAPs blir up-regulated vid sena tidpunkter samtidiga med fibro / fet infiltration och en minskning av regenerativ potential, medan Sca-1 Med / Low FAPs blir uppreglerade under muskelns regenerativa fönster och kan bidra till effektiv regenerativ myogenes. FAPs isoleringsprotokoll som presenteras här ger utredarna möjlighet att identifiera och isolera dessa olika populationer för framtida studier.

Vi identifierade en population av celler som färgar positivt för både Sca-1 och VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) och konstaterade denna dubbla positiva population att vara en blandning av FAPs och parlamentsledamöter. Malecova och kollegor rapporterade en underpopulation av VCAM-1 som uttrycker FAPs som är nästan frånvarande i friska muskler, tillfälligt ökad med akut inflammation, och deras persistens hos mdx möss (modell av muskeldystrofi) var associerad med kronisk muskelinflammation och fibros10. Däremot, och även om det inte är en ren FAPs population, fann vi att Lin-/Sca-1+/VCAM-1 + befolkningen minskade till eller under baslinjen nivåer med kronisk muskelfibros vid 12- och 14-veckors post-denervation. Denervation inducerar inte samma inflammatoriska reaktion och cykling regenereringsförsök som upplevs av mdx möss, vilket kan förklara skillnaderna i våra resultat. Vår identifiering av parlamentsledamöter i Cellen Lin-/Sca-1+/ VCAM-1+ är i linje med rapporten från Sca-1-uttryck på en mycket liten andel parlamentsledamöter i friska muskler, med en övergående ökning efter skada under myoblast spridning och efterföljande tillbakadragande från cellcykeln45. Således, medan vår antikropp märkning och FACS gating strategi framgångsrikt isolerar rena populationer av FAPs och MPs för studie, experiment som kräver flöde cytometry-baserade kvantifiering av dessa populationer kan något underskatta deras antal på grund av den lilla andelen celler i båda stamceller som co-express Sca-1 och VCAM-1. Oavsett visar det nuvarande protokollet tydligt det klassiska bifasiska svaret från parlamentsledamöter på denervation skada, med kortsiktig uppreglering och efterföljande utarmning av befolkningen i långsiktiga denervated muskeln. På samma sätt är ökningen av FAPs rapporteras i isolerade kortsiktiga denervation skada rekapituleras här, och visat sig vara ytterligare lidit med hjälp av den långsiktiga tibial nerv transection modellen.

Sammanfattningsvis ger detta protokoll forskare ett tidigare outforskat djur, råttan, där man kan använda flödescytometriska metoder för att samtidigt studera FAPs och parlamentsledamöter. Experiment på möss begränsade av mängden skelettmuskulatur, och det frekventa behovet av att utföra terminala experiment för att bedöma muskelstyrka och funktion, kan lätt utföras i den större råttan och med ett mer omfattande utbud av icke-dödliga styrka och funktionella bedömningsmetoder. Sammantaget kan FAPs studier i råtta avslöja nya roller av denna viktiga stampopulation i akut och kronisk muskel och perifera nerv trauma och sjukdom, därefter öka potentialen för att utveckla cellspecifika terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konflikter att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Flow cytometri Core Facilities vid University of Ottawa och Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto för deras expertis och vägledning i optimering av flödescytometri/ FACS-protokollet som presenteras i detta manuskript. Detta arbete finansierades av Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) till JB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap Falcon 352235
10 cm cell culture dishes Sarstedt 83.3902
12-well cell culture plate ThermoFisher 130185
12 mm glass coverslips, No.2 VWR 89015-724
10 mL Syringe Beckton Dickenson 302995
15 mL centrifuge tubes FroggaBio 91014
20 gauge needle Beckton Dickenson 305176
25mL Serological pipette Sarstedt 86.1685.001
40µm cell strainer Fisher Scientific 22363547
50mL centrifuge tubes FroggaBio TB50
AbC Total Antibody Compensation Beads  ThermoFisher A10497
Ammonium Chloride, Reagent Grade Bioshop AMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µg Biotium 92307
Aquatex Aqueous Mounting Medium Merck 108562
Biolaminin 411 LN Biolamina LN411
Bovine Serum Albumin (BSA) Bioshop ALB001
Calcium Chloride Bioshop CCL444.500
Collagenase Type II Gibco 17101015
CountBright Plus Absolute Counting Beads ThermoFisher C36995
Dexamethasone Millipore Sigma D4902
Dispase Gibco 17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Gibco 11995-065 (+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTA FisherScientific S311
FACSClean Solution Beckton Dickenson 340345
FACSDiva Software Beckton Dickenson --
FACSRinse Solution Beckton Dickenson 340346
Fetal Bovine Serum Sigma F1051
Flow Cytometry Sheath Fluid Beckton Dickenson 342003
FlowJo Software Beckton Dickenson --
Fluorescent Mounting Medium Dako S302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody Invitrogen A11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21429
Goat Serum Gibco 16210-064
Ham's F10 Media ThermoFisher  11550043 (+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) Multicell 311-513-CL
Heat Inactivated Horse Serum Gibco 26050-088
Hemocytometer Reichert N/A
HEPES, minimum 99.5% titration Sigma H3375
Horse Serum ThermoFisher 16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) Cell Signaling 8915LF
Humulin R Lilly HI0210
IBMX Millipore Sigma I5879 Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
Isopropanol Sigma I9516 Also known as 2-propanol
Lewis Rat, Female Charles River Kingston 004 (Strain Code) 200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer Beckton Dickenson --
Microcentrifuge Eppendorf EP-5417R
MoFlo XDP Cell Sorter Beckman Coulter --
Mouse Anti-CD31::FITC Antibody Abcam ab33858 Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC Antibody Biolegend 202205 Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE Antibody Biolegend 200403 Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A Also known as MF20
Mouse Anti-Pax7 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 % Sigma HT501128
Oil Red O Millipore Sigma O0625
PE-Cy7 Conjugation Kit Abcam ab102903
Penicillin-Streptomycin Sigma  P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 (-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent Grade Bioshop PBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody Invitrogen MA5-32347 FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody Abcam ab203254
Rabbit Anti-Laminin Antibody Sigma L9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody Abcam ab3526
Rabbit Anti-Sca-1 Antibody Millipore Sigma AB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody Abcam ab260043 Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody Abcam ab203491
Recombinant Human FGF-basic Gibco PHG0266
Sodium Azide Sigma S2002
Triton-X-100 Fisher Scientific BP151
Troglitazone Millipore Sigma T2573
Tween-20 Bioshop TWN510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12, 153-163 (2010).
  2. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  3. Uezumi, A., Ikemoto-Uezumi, M., Tsuchida, K. Roles of nonmyogenic mesenchymal progenitors in pathogenesis and regeneration of skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 5, 1-11 (2014).
  4. Biswas, A. A., Goldhamer, D. J. FACS fractionation and differentiation of skeletal-muscle resident multipotent Tie2+ progenitors. Methods in Molecular Biology. 1460, 255-267 (2016).
  5. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1-10 (2019).
  6. Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46 (2), 135-143 (2018).
  7. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  8. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124 (21), 3654-3664 (2011).
  9. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  10. Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  11. Madaro, L., et al. Denervation-activated STAT3-IL-6 signalling in fibro-adipogenic progenitors promotes myofibres atrophy and fibrosis. Nature Cell Biology. 20 (8), 917-927 (2018).
  12. Heredia, J. E., et al. Type 2 innate signals stimulate fibro/adipogenic progenitors to facilitate muscle regeneration. Cell. 153 (2), 376-388 (2013).
  13. Fiore, D., et al. Pharmacological blockage of fibro/adipogenic progenitor expansion and suppression of regenerative fibrogenesis is associated with impaired skeletal muscle regeneration. Stem Cell Research. 17 (1), 161-169 (2016).
  14. Kang, X., et al. Interleukin-15 facilitates muscle regeneration through modulation of fibro/adipogenic progenitors. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 1-11 (2018).
  15. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., Mcmillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782 (2011).
  16. Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernández-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In vivo assessment of muscle contractility in animal studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
  17. Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
  18. Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183 (2013).
  19. Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
  20. Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
  21. Iohom, G., et al. Long-term evaluation of motor function following intraneural injection of ropivacaine using walking track analysis in rats. British Journal of Anaesthesia. 94 (4), 524-529 (2005).
  22. Brown, C. J., et al. Self-evaluation of walking-track measurement using a sciatic function index. Microsurgery. 10 (3), 226-235 (1989).
  23. Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
  24. Deumens, R., Jaken, R. J. P., Marcus, M. A. E., Joosten, E. A. J. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
  25. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 2018, 1-11 (2018).
  26. Jensen, A. R., et al. Neer Award 2018: Platelet-derived growth factor receptor α co-expression typifies a subset of platelet-derived growth factor receptor β-positive progenitor cells that contribute to fatty degeneration and fibrosis of the murine rotator cuff. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27 (7), 1149-1161 (2018).
  27. Mosich, G. M., et al. Non-fibro-adipogenic pericytes from human embryonic stem cells attenuate degeneration of the chronically injured mouse muscle. JCI Insight. 4 (24), (2019).
  28. Lee, D., et al. HMGB2 is a novel adipogenic factor that regulates ectopic fat infiltration in skeletal muscles. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  29. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/Adipogenic Progenitors (FAPs): Isolation by FACS and Culture. Muscle Stem Cells: Methods and Protocols. , 179-189 (2017).
  30. Giuliani, G., et al. SCA-1 micro-heterogeneity in the fate decision of dystrophic fibro/adipogenic progenitors. Cell Death and Disease. 12 (1), 1-24 (2021).
  31. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  32. Upadhyay, G. Emerging role of lymphocyte antigen-6 family of genes in cancer and immune cells. Frontiers in Immunology. 10, 819 (2019).
  33. Boscolo Sesillo, F., Wong, M., Cortez, A., Alperin, M. Isolation of muscle stem cells from rat skeletal muscles. Stem Cell Research. 43, 101684 (2020).
  34. Ciaramitaro, P., et al. Traumatic peripheral nerve injuries: Epidemiological findings, neuropathic pain and quality of life in 158 patients. Journal of the Peripheral Nervous System. 15 (2), 120-127 (2010).
  35. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of upper and lower extremity peripheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45 (1), (1998).
  36. Malik, S. Traumatic peripheral neuropraxias in neonates: A case series. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (10), 10-12 (2014).
  37. Smith, B. W., Daunter, A. K., Yang, L. J. S., Wilson, T. J. An update on the management of neonatal brachial plexus palsy-replacing old paradigms a review. JAMA Pediatrics. 172 (6), 585-591 (2018).
  38. Rebolledo, D. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle fibrosis is mediated by CTGF/CCN2 independently of TGF-β. Matrix Biology. 82, 20-37 (2019).
  39. Walls, P. L. L., McRae, O., Natarajan, V., Johnson, C., Antoniou, C., Bird, J. C. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  40. Yuen, D. A., et al. Culture-modified bone marrow cells attenuate cardiac and renal injury in a chronic kidney disease rat model via a novel antifibrotic mechanism. PLOS One. 5 (3), 9543 (2010).
  41. Fukada, S. I. The roles of muscle stem cells in muscle injury, atrophy and hypertrophy. Journal of Biochemistry. 163 (5), 353-358 (2018).
  42. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 1-11 (2017).
  43. Chapman, M. A., Mukund, K., Subramaniam, S., Brenner, D., Lieber, R. L. Three distinct cell populations express extracellular matrix proteins and increase in number during skeletal muscle fibrosis. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 312 (2), 131-143 (2016).
  44. Hillege, M., Galli Caro, R., Offringa, C., de Wit, G., Jaspers, R., Hoogaars, W. TGF-β regulates Collagen Type I expression in myoblasts and myotubes via transient Ctgf and Fgf-2 Expression. Cells. 9 (2), 375 (2020).
  45. Kafadar, K. A., Yi, L., Ahmad, Y., So, L., Rossi, F., Pavlath, G. K. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
  46. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
  47. Carlson, B. M. The biology of long-term denervated skeletal muscle. European Journal of Translational Myology. 24 (1), (2014).
  48. Kennedy, E., et al. Embryonic rat vascular smooth muscle cells revisited - A model for neonatal, neointimal SMC or differentiated vascular stem cells. Vascular Cell. 6 (1), 1-13 (2014).
  49. Pannérec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development (Cambridge). 140 (14), 2879-2891 (2013).

Tags

Biologi nummer 172 mesenkymala stamceller fibroadipogenic stamceller myogena stamceller flödescytometri fluorescensaktiverad cellsortering FACS skelettmuskulatur kronisk traumatisk denervation råtta muskelatrofi fibros
Identifiering, isolering och karakterisering av fibroadiogena stamceller (FAPs) och myogena stamceller (MPs) i skelettmuskulaturen i råttan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Te, L. J. I., Doherty, C., Correa,… More

Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat. J. Vis. Exp. (172), e61750, doi:10.3791/61750 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter