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Neuroscience

माउस मस्तिष्क के क्षैतिज हिप्पोकैम्पल स्लाइस

Published: September 22, 2020 doi: 10.3791/61753
Automatic Translation
1,2, 2, 2, *1, *1,2
1Laboratory of Endometrium, Endometriosis and Reproductive Medicine, Department of Development and Regeneration, KU Leuven, 2Laboratory of Ion Channel Research, VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, Leuven, Belgium and Department of Molecular Medicine, KU Leuven
* These authors contributed equally

Summary

इस लेख का उद्देश्य चूहों में क्षैतिज हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क स्लाइस प्राप्त करने के लिए एक व्यवस्थित प्रोटोकॉल का वर्णन करना है। इस पद्धति का उद्देश्य हिप्पोकैम्पस फाइबर रास्तों की अखंडता को संरक्षित करना है, जैसे कि छिद्रपूर्ण पथ और काई फाइबर ट्रैक्ट डेंटेट जाइरस संबंधित न्यूरोलॉजिकल प्रक्रियाओं का आकलन करने के लिए।

Abstract

हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क में एक अत्यधिक संगठित संरचना है जो लिम्बिक प्रणाली का एक हिस्सा है और स्मृति गठन और समेकन के साथ-साथ अल्जाइमर रोग और मिर्गी सहित गंभीर मस्तिष्क विकारों की अभिव्यक्ति में शामिल है। हिप्पोकैम्पस को उच्च स्तर की अंतर-और अंतर-कनेक्टिविटी प्राप्त होती है, जो आंतरिक और बाहरी मस्तिष्क संरचनाओं के साथ उचित संचार हासिल करती है। यह कनेक्टिविटी फाइबर रास्तों के रूप में विभिन्न सूचनात्मक प्रवाहों के माध्यम से पूरी की जाती है। हिप्पोकैम्पस के न्यूरोफिजियोलॉजिकल कार्यों की खोज करते समय मस्तिष्क स्लाइस अक्सर उपयोग की जाने वाली पद्धति होती है। हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग कई अलग-अलग अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग, हल्के सूक्ष्म माप के साथ-साथ कई आणविक जैविक और हिस्टोकेमिकल तकनीक शामिल हैं। इसलिए, मस्तिष्क स्लाइस प्रोटीन कार्यों का आकलन करने के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं, न्यूरोलॉजिकल विकारों में शामिल रोगविज्ञानी प्रक्रियाओं के साथ-साथ दवा खोज उद्देश्यों के लिए जांच करने के लिए।

स्लाइस तैयारी के कई अलग-अलग तरीके मौजूद हैं। वाइब्रेकोम के साथ मस्तिष्क स्लाइस तैयारी ऊतक संरचना के बेहतर संरक्षण की अनुमति देती है और टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान पर्याप्त ऑक्सीजन आपूर्ति की गारंटी देती है, जो ऊतक हेलिकॉप्टर के पारंपरिक उपयोग पर फायदे पेश करती है। इसके अलावा, वाइब्रेटम ब्रेन स्लाइस तैयारियों के लिए विभिन्न कटिंग प्लेन लगाए जा सकते हैं। यहां, माउस दिमाग के वाइब्रेटोम-कट क्षैतिज हिप्पोकैम्पस स्लाइस की सफल तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। अन्य स्लाइस तैयारी के विपरीत, क्षैतिज टुकड़ा एक टुकड़ा के भीतर पूरी तरह से बरकरार स्थिति में हिप्पोकैम्पल इनपुट पथ (छिद्रपूर्ण पथ) के फाइबर रखने की अनुमति देता है, जो एंटोराइनल-हिप्पोकैम्पल इंटरैक्शन की जांच की सुविधा प्रदान करता है। यहां, हम मुरीन मस्तिष्क के विच्छेदन, निष्कर्षण और तीव्र क्षैतिज टुकड़ा करने की क्रिया के लिए एक पूरी तरह से प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, और इस तकनीक की चुनौतियों और संभावित नुकसान पर चर्चा करते हैं। अंत में, हम आगे के अनुप्रयोगों में मस्तिष्क स्लाइस के उपयोग के लिए कुछ उदाहरण दिखाएंगे।

Introduction

हिप्पोकैम्पस की व्यापक खोज तब शुरू हुई जब स्कोविल और मिलनर ने गंभीर मिर्गी1के उपचार के रूप में हिप्पोकैम्पस और पास के लौकिक पालि संरचनाओं के सर्जिकल हटाने के बाद नई, घोषणात्मक स्मृति बनाने के लिए एक रोगी (एच.M.) की असमर्थता की सूचना दी। उस क्षण से, हिप्पोकैम्पस का बड़े पैमाने पर सामान्य न्यूरोनल गुणों से शुरू किया गया है और मिर्गी और अल्जाइमर रोग2, 3,4,5जैसे गंभीर मस्तिष्क विकारों के विकास तक कार्य करता है। हिप्पोकैम्पस लिम्बिक सिस्टम का हिस्सा है, जिसमें संबंधित मस्तिष्क संरचनाओं का एक समूह शामिल है जो भावना और स्मृति निर्माण6,7में शामिल है। कई फाइबर रास्तों का एक घना नेटवर्क आंतरिक और बाहरी मस्तिष्क संरचनाओं के लिए एक तंग हिप्पोकैम्पस कनेक्टिविटी को पूरा करता है। इन रास्तों में मध्यवर्ती और पार्श्व परफारॅ्मेट पाथ (एंटोराइनल कॉर्टेक्स टू डेंटेट जाइरस, सीए3 - सीए1 और सबिकुलम)8,मॉसी फाइबर पाथ (डेंटेट जायरस से सीए 3)9 और शेफर कोलैटरल/एसोसिएशनल कॉमिसरल पाथवे (सीए 3 से सीए1)10 (चित्रा 1)शामिल हैं। हिप्पोकैम्पस न्यूरोनल लेयर गठन के अत्यधिक संरक्षित लैमिनार संगठन के कारण अब तक सबसे मोटे तौर पर खोजे गए मस्तिष्क क्षेत्रों में से एक प्रस्तुत करता है, और सापेक्ष आसानी से महत्वपूर्ण न्यूरोनल संस्कृतियों और मस्तिष्क स्लाइस प्राप्त करने की संभावना5।

Figure 1
चित्रा 1: विभिन्न हिप्पोकैम्पस क्षेत्रों और मुख्य फाइबर रास्तों को दर्शाते कार्टून। विभिन्न हिप्पोकैम्पस क्षेत्रों को ठोस रंगीन रेखाओं द्वारा इंगित किया जाता है: एंटोराइनल कॉर्टेक्स (ईसी; ब्लैक), डेंटेट जाइरस (डीजी; नारंगी), कॉर्नू अमोनिस (सीए) 3 (सियान), 2 (पीला), और 1 (मैजेंटा), और उपमूर्ति (हरा)। फाइबर रास्ते एक रंगीन बिंदीदार रेखा के साथ दिखाए जाते हैं: मध्यशास्त्री (एमपीपी, लाल) और पार्श्व छिद्र पथ (एलपीपी, नीला) (एंटोराइनल कॉर्टेक्स से डेंटेट जायरस, सीए 3, सीए 1, और सबिकुलम तक), मॉसी फाइबर पाथवे (एमएफ, वायलेट) (डेंटेट जाइरस से सीए 3 तक) और शेफर कोलैटरल (एससी, ब्राउन) (CA3 से CA1) /एसोसिएशनल कॉमिसुरल पाथवे (एसी, लाइट ग्रीन) (सीए 3 से सीए1 तक कॉन्ट्रालेट) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ब्रेन स्लाइस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप अक्सर अधिक दूर के मस्तिष्क क्षेत्रों से ब्याज के क्षेत्र में कनेक्शन की हानि होती है5. इसके अलावा, केशिकाएं अब कार्यात्मक नहीं हैं5 और रक्त परिसंचरण11से वंचित है । इन सीमाओं के बावजूद, मस्तिष्क स्लाइस अभी भी मुख्य रूप से कई फायदों के कारण हिप्पोकैम्पस के न्यूरोफिजियोलॉजिकल कार्यों की जांच के लिए उपयोग किए जाते हैं। सबसे पहले, हिप्पोकैम्पस का निष्कर्षण तेजी से12 है और कई सामग्रियों की आवश्यकता नहीं है। केवल आवश्यक उपकरणों में एक विच्छेदन किट, एक प्रयोगशाला जल स्नान, कार्बोजन तक पहुंच और एक कंपन माइक्रोटोम (वाइब्रेटोम)13शामिल हैं। मस्तिष्क की स्लाइस तकनीक की अन्य संपत्तियां रक्त-मस्तिष्क-बाधा (बीबीबी) और प्रयोग5की शुरुआत से पहले अंतर्जात रूप से जारी अणुओं के धोने से दरकिनार हैं, जिससे अपेक्षाकृत सटीक खुराक नियंत्रण14के साथ दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करना संभव हो जाता है। इसके अलावा, मस्तिष्क के स्लाइस हिप्पोकैम्पस15, 16के भीतर साइटो-आर्किटेक्चर और सिनैप्टिक सर्किटको संरक्षितकरते हैं, जहां न्यूरोएनाटॉमी और न्यूरोनल कनेक्टिविटी और जटिल न्यूरॉन-ग्लिया इंटरैक्शन के साथ स्थानीय वातावरण4,11,17 संरक्षितहैं। इसके अतिरिक्त, हिप्पोकैम्पल फाइबर कनेक्शन मुख्य रूप से एकदिशात्मक और हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स में एक उच्च सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी होती है, जो न्यूरोलॉजिकल प्रक्रियाओं को समझने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के संग्रह और व्याख्या को काफी सरल बनाता है18,19। महत्वपूर्ण बात यह है कि मस्तिष्क के स्लाइस विभिन्न वैज्ञानिक तकनीकों की एक विस्तृत श्रृंखला में लागू एक मूल्यवान संपत्ति प्रस्तुत करते हैं, जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकलमापन12, 20, 21, 22,23,24,25, 26तक इमेजिंग रिकॉर्डिंग पर आणविक जैविक तकनीकों से फैलेहोतेहैं।

जैसा कि ऊपर उल्लिखित है, हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस सिनैप्टिक कनेक्टिविटी की संरचनात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक उपकरण प्रस्तुत करते हैं। यह न्यूरोनल उत्तेजना और प्लास्टिसिटीपररसायनों या उत्परिवर्तनों के प्रभावों का आकलन करने का अवसर प्रदान करता है ।

तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी एक अपेक्षाकृत संवेदनशील तकनीक पेश कर रहे हैं और इष्टतम टुकड़ा गुणवत्ता आदर्श प्रायोगिक स्थितियों पर अत्यधिक निर्भर है, जिसमें पशु की आयु, इच्छामृत्यु की विधि, विच्छेदन और टुकड़ा करने की क्रिया की गति, टुकड़ा करने की क्रिया समाधान और पैरामीटर (जैसे, टुकड़ा करने की गति) के साथ-साथ स्लाइस रिकवरी4के लिए शर्तें शामिल हैं। इसलिए, एक अच्छी तरह से डिजाइन प्रोटोकॉल का सबसे अधिक महत्व है और विभिन्न अनुसंधान इकाइयों में प्रजनन क्षमता को सुरक्षित करता है13।

यहां, हम तीव्र क्षैतिज हिप्पोकैम्पस स्लाइस तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जिसका उद्देश्य हिप्पोकैम्पल पार्श्व और मध्यकालीन छिद्रण पथ और काई फाइबर मार्ग की अखंडता को संरक्षित करना है, जिससे डेंटेट जाइरस संबंधित प्रक्रियाओं की जांच की अनुमति9। हम विस्तार से विच्छेदन, निकालने, और क्षैतिज मुरीन मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए महत्वपूर्ण कदम का वर्णन करेंगे, कैल्शियम के प्रतिनिधि परिणामों के बाद-microfluorimetric रिकॉर्डिंग और क्षेत्र उत्तेजक पोस्टसिनैप्टिक संभावित रिकॉर्डिंग (fEPSPs) आधारभूत परिस्थितियों के तहत और जंगली प्रकार C57BL/6J चूहों के मस्तिष्क स्लाइस में LTP प्रेरण प्रोटोकॉल के दौरान ।

Protocol

इस अध्ययन के लिए सभी पशु प्रयोगों को केयू लेवेन (बेल्जियम) (P021/2012) की नैतिक समीक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. उच्च सुक्रोज स्लाइस समाधान और कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ (ACSF) की तैयारी

  1. प्रायोगिक दिन से पहले
    1. प्रयोगशाला ग्रेड टाइप 1 पानी युक्त (एमएम में): 25 केसीएल, 20 सीएसीएल 2, 10 एमजीएसओ4,12.5केएच2 पीओ4 (टेबल 1)के साथ 10x स्लाइस प्री-सॉल्यूशन तैयार करें। कैल्शियम फॉस्फेट वर्षा को रोकने के लिए, धीरे-धीरे एक बीकर में रसायनों को 800 एमएल एच 2 ओ से भरेहुएमिलाएं, जबकि लगातार चुंबकीय उभारने वाले के साथ सरगर्मी करते हैं। समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान (आरटी) पर स्टोर करें।
  2. प्रायोगिक दिवस पर
    1. प्रयोगशाला ग्रेड टाइप 1 पानी युक्त (एमएमएम में): 125 एनएसीएल, 2.5 केसीएल, 2 सीएसीएल 2,1एमजीओ 4, 1.25 एनएएच2पीओ4,26 एनएएचसीओ3,25 ग्लूकोज(टेबल 2)के साथ 1x एसीएसएफ के 1 एल तैयार करें। 305-315 mOsm (पीएच ~ 7.55-7.6) के बीच ऑस्मोलारिटी को मान्य करने के लिए वाष्प दबाव ऑस्मोमीटर का उपयोग करें।
      नोट: कैल्शियम फॉस्फेट वर्षा को रोकने के लिए, धीरे-धीरे सभी ठोस रसायनों को एच2ओ के 800 एमएल से भरे बीकर में मिलाएं, जबकि लगातार चुंबकीय उभारक के साथ सरगर्मी करते हैं। बहुत अंत में MgSO4 और CaCl2 जोड़ें, धीरे से 1 एम स्टॉक समाधान से आवश्यक राशि में टपकाव ।
    2. 7.3-7.4 के बीच पीएच सेट करने के लिए कार्बोजन के साथ आरटी में लगातार बुलबुला 1x ACSF समाधान।
      नोट: यदि पीएच थोड़ा बहुत अधिक या बहुत कम है, तो कार्बोजेनेशन ताकत में छोटे समायोजन पर्याप्त होंगे। यदि पीएच कार्बोजेनेशन के साथ 7.45 से अधिक है, तो इसे 1 एम एनएएच 2 पीओ4 समाधान की कुछबूंदोंको जोड़कर समायोजित करें।
    3. 10x स्लाइस प्री-सॉल्यूशन के 25 एमएल वाले बीकर में 1x हाई-सुक्रोज स्लाइस सॉल्यूशन के 250 एमएल (प्रति ब्रेन) तैयार करें और (एमएमएम में): 252 सुक्रोज, 26 नाएचसीओ3और 10 ग्लूकोज(टेबल 3)। सत्यापित करें कि ऑस्मोलारिटी 320-325 एमओएम (पीएच ~ 7.55-7.6 के बीच है)।
    4. 7.3-7.4 के बीच पीएच को नियंत्रित करने के लिए कार्बोजन के साथ 10-15 मिनट के लिए उच्च सुक्रोज स्लाइस समाधान बुलबुला।
      नोट: यदि पीएच कार्बोजेनेशन के साथ 7.45 से अधिक है, तो इसे 1 एम केएच 2 पीओ4 समाधान की कुछबूंदोंको जोड़कर समायोजित करें।
    5. अल्ट्रा फ्रीजर (-80 डिग्री सेल्सियस) में 20-30 मिनट के लिए उच्च सुक्रोज स्लाइस समाधान स्टोर करें जब तक कि यह आंशिक रूप से जमे हुए न हो जाए।

2. मस्तिष्क विच्छेदन के लिए कार्यक्षेत्र की तैयारी

  1. उच्च सुक्रोज स्लाइस समाधान के शांत-डाउन के दौरान, निम्नलिखित तैयार करें।
    1. पानी स्नान को 32 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    2. रिकवरी चैंबर(चित्रा 2 ए)को कार्बोजेनेटेड ACSF समाधान के साथ भरें और चैंबर को पानी के स्नान में रखें। रिकवरी चैंबर में मुख्य एसीएसएफ बोतल और एसीएसएफ में लगातार कार्बोजेन लगाएं।
    3. प्रायोगिक कमरे में जानवर प्रवेश।
      नोट: जानवर की उम्र, लिंग और तनाव को व्यक्तिगत प्रयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए और यह विशिष्ट अध्ययन प्रश्न पर निर्भर है। हालांकि, विभिन्न प्रयोगात्मक दिनों के बीच तुलनीयता की गारंटी देने के लिए जानवर के मापदंडों को एक अध्ययन के भीतर स्थिर रहना चाहिए। यह प्रोटोकॉल 2-6 सप्ताह की उम्र में C57BL/6J पुरुष चूहों के उपयोग के लिए डिजाइन किया गया था । यदि पुराने जानवरों का उपयोग किया जाएगा, तो तीव्र स्लाइस के मस्तिष्क स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए स्लाइस और रिकवरी समाधानों को तदनुसार4,27 (उदाहरण के लिए, एनएमडीजी+-आधारितसमाधान23,28)के रूप में अनुकूलित किया जा सकता है।
    4. संज्ञाहरण कक्ष तैयार करें।
    5. ऊतक कागज, व्यापक उद्घाटन के साथ प्लास्टिक पाश्चर पिपेट (खुला कट), बर्फ से भरा 90 मिमी संस्कृति पकवान, ठंडा संस्कृति पकवान के शीर्ष पर फिल्टर पेपर का एक वर्ग, डेपुटेशन के लिए मजबूत कैंची, विच्छेदन कैंची, घुमावदार संदंश, स्पैटुला, 35 मिमी संस्कृति पकवान, ठीक ब्रश, ब्लेड, नमूना प्लेट (वाइब्रेकोम के साथ आता है), सुपर गोंद, पिपेट टिप, फिल्टर पेपर की चार पट्टियां (~ 2 सेमी x 0.5 सेमी)(चित्रा 2A)।
    6. वाइब्रेटम सेट करें: सबसे पहले, सही सेटिंग्स के लिए वाइब्रेटम प्रोग्राम करें (ब्लेड यात्रा की गति: 0.08 मिमी/ इसके बाद, स्लाइस चैंबर को धारक में रखें, स्लाइस चैंबर के आसपास के धारक को बर्फ से भरें और कंपन के लिए सब कुछ संलग्न करें। अंत में, रेजर ब्लेड को वाइब्रेटम ब्लेड धारक(चित्रा 2B)में रखें।
  2. उच्च सुक्रोज समाधान की ठंड के बाद निम्नलिखित चरणों का पालन करें।
    1. 20-30 मिनट के बाद, हाई-सुक्रोज स्लाइस समाधान को -80 डिग्री सेल्सियस अल्ट्रा-फ्रीजर से बाहर निकालें और बीकर को बर्फ पर रखें।
    2. अपनी बेंच पर वाइब्रेटम के बगल में उच्च सुक्रोज समाधान रखें, एक अच्छा कीचड़ पाने के लिए आंशिक रूप से जमे हुए समाधान को एक स्पैटुला के साथ मिलाएं और कार्बोजन के साथ बुदबुदाना शुरू करें।
    3. ठंडा 90 मिमी संस्कृति पकवान के शीर्ष पर चुकता फिल्टर पेपर सोख करने के लिए प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ कुछ उच्च सुक्रोज स्लाइस समाधान लें।
    4. 35 मिमी संस्कृति पकवान (या किसी भी समकक्ष छोटे कंटेनर जो पूरे मस्तिष्क को स्टोर करने के लिए उपयुक्त है) को उच्च-सुक्रोज स्लाइस समाधान (पूरे मस्तिष्क को कवर करने के लिए पर्याप्त) के साथ 75% तक भरें और बाकी समाधान के साथ बीकर के बगल में रखी बर्फ पर संस्कृति पकवान को ठंडा करें। 35 मिमी कल्चर डिश में घोल को कार्बोजनेट करें।

3. विच्छेदन और मुरीन मस्तिष्क की स्थिति

  1. 5% आइसोफ्लुन के साथ जानवर को एनेस्थेटाइज करें। पंजा पिंच करके संज्ञाहरण की उचित गहराई निर्धारित करें। कोई पंजा वापसी पलटा नहीं होना चाहिए।
  2. ऊतक कागज पर जानवर को स्थानांतरित करें और इसे मजबूत कैंची या एक छोटे जानवर गिलोटिन के साथ काटना।
  3. खोपड़ी को खोलने के लिए विच्छेदन कैंची का उपयोग करें।
  4. सगित्तल सीवन के साथ कैल्वरिया को खोलें और घुमावदार संदंश की मदद से इसे हटा दें जब तक कि घ्राण बल्ब सहित पूरा मस्तिष्क दिखाई न दे।
    नोट: कैल्वरिया या संदंश के तेज किनारों के साथ मस्तिष्क को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधान रहें।
  5. ध्यान से मस्तिष्क को स्कूप करने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग करें (घ्राण बल्ब जुड़े रहना चाहिए)।
  6. ठंडा 35 मिमी संस्कृति पकवान में मस्तिष्क स्थानांतरित करें और एक ACSF से भरे पाश्चुर पिपेट के साथ मस्तिष्क को धीरे से धोकर ऊतक से सभी बालों या रक्त कणों को हटा दें (रक्त मस्तिष्क के ऊतकों पर साइटोटॉक्सिक प्रभाव पड़ता है29)।
  7. ठंडा 90 मिमी संस्कृति पकवान(चित्रा 2A)के शीर्ष पर भीगे हुए फिल्टर पेपर पर स्पैटुला की मदद से मस्तिष्क को स्थानांतरित करें।
  8. मस्तिष्क को आधे में काटने के लिए एक ब्लेड का उपयोग करें, दो गोलार्द्धों को अलग करें, और दोनों गोलार्द्धों को हौसले से काटे गए मध्यान की ओर रखें।
  9. पृष्ठीय भाग को हटाने के लिए एक ब्लेड का उपयोग करें (5%-10%) पृष्ठीय शीर्ष(चित्रा 2C)30 के लिए एक समानांतर कटौती के साथ प्रत्येक गोलार्द्ध से मस्तिष्क की और मस्तिष्क के वेंट्रल भाग के साथ हौसले से कट साइड पर दोनों गोलार्द्धों को ऊपर की ओर सामना करना पड़ रहा है ।
  10. नमूना प्लेट पर सुपर गोंद की एक बूंद की स्थिति और दोनों गोलार्द्धों को समायोजित करने के लिए एक पिपेट टिप के साथ ठीक से फैल गया।
  11. फिल्टर पेपर स्ट्रैप के साथ वेंट्रल साइड को छूकर केशिका बलों के साथ एक गोलार्द्ध लेने के लिए फिल्टर पेपर स्ट्रैप का उपयोग करें, जिससे ऊतक को नुकसान न पहुंचे।
  12. नमूना प्लेट पर गोंद के शीर्ष पर पृष्ठीय पक्ष के साथ गोलार्ध को स्थिति से पहले मस्तिष्क के पृष्ठीय पक्ष को ध्यान से अर्ध-शुष्क करने के लिए एक और फिल्टर पेपर स्ट्रैप का उपयोग करें। दूसरे गोलार्द्ध के साथ एक ही प्रक्रिया दोहराएं।
    नोट: गोलार्द्धों को कंपन प्लेट पर एक प्रतिबिंबित फैशन में क्षैतिज संरेखण में तैनात किया जाना चाहिए, जिसमें रोस्ट्रल पक्ष बाहर की ओर इशारा करते हैं और बीच में एक-दूसरे को छूते हुए कौडल पक्षों का सामना करना पड़ रहा है (लेकिन छू नहीं) । दोनों गोलार्द्धों के मध्यीय पक्षों को वाइब्रेटम ब्लेड और प्रयोगकर्ता(चित्रा 2डी)की ओर पार्श्व पक्षों की ओर इशारा करना चाहिए।
  13. नमूना प्लेट को स्लाइसिंग कक्ष में और जल्दी से रखें, लेकिन ध्यान से, इसे बर्फ-ठंडे उच्च-सुक्रोज स्लाइस समाधान कीचड़ से ढक दें। जैसे ही समाधान गोंद को छूता है, यह गोलार्द्धों को नमूना प्लेट में जमना और ठीक से गोंद करेगा।
  14. आश्वस्त करें कि गोलार्द्धों को उच्च-सुक्रोज स्लाइस समाधान के साथ ठीक से कवर किया जाता है और पुष्टि करते हैं कि समाधान कार्बोजन के साथ बुलबुला है।
    नोट: पूरी विच्छेदन प्रक्रिया जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए। कृपया सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क बहुत लंबे समय तक ऑक्सीजन की आपूर्ति के बिना नहीं रहता है। यह उच्च सुक्रोज स्लाइस समाधान कीचड़ में मस्तिष्क पनडुब्बी के लिए डेपुटेशन से केवल 1-1.5 मिनट के आसपास ले जाना चाहिए । स्लाइस की उच्च गुणवत्ता वारंट करने के लिए तीव्र मस्तिष्क स्लाइस तैयारी के लिए यह सबसे महत्वपूर्ण आवश्यकता है।

4. मस्तिष्क की क्षैतिज टुकड़ा करने की क्रिया

  1. गोलार्द्धों के मध्यान्तर पक्ष के सामने वाइब्रेटम ब्लेड की स्थिति और गोलार्द्धों के वेंट्रल पक्षों के समान ऊंचाई तक इसे कम करें जो अब ऊपर की ओर सामना कर रहे हैं। कंपन नियंत्रण की मदद से ब्लेड को पृष्ठीय दिशा में 600 माइक्रोन तक कम करें और टुकड़ा करने की क्रिया शुरू करें। ब्लेड ऊतक मारा जाना चाहिए (यदि नहीं, ब्लेड रिवर्स और यह थोड़ा और अधिक कम) । स्लाइस जब तक पहले दो स्लाइस पूरी तरह से दो गोलार्द्धों से अलग हो रहे हैं ।
  2. ब्लेड रिवर्स और एक और 300 μm कम और फिर से टुकड़ा।
  3. जब हिप्पोकैम्पस दिखाई देता है (मदद के लिए माउस31 मस्तिष्क एटलस का उपयोग करें, यदि आवश्यक हो)(चित्रा 2E)चौड़ा प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ स्लाइस इकट्ठा करें। स्लाइस तब तक ले लीजिए जब तक कि कॉडेट पुटामेन हिप्पोकैम्पस के बगल में दिखाई न दे। आमतौर पर, माउस मस्तिष्क के लिए 300 माइक्रोन (4-6 प्रति गोलार्द्ध) के 8-12 स्लाइस के बीच एकत्र किया जा सकता है।
  4. स्लाइस इकट्ठा करने के लिए प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें और उन्हें पानी के स्नान(चित्रा 2F)में रिकवरी चैंबर में स्थानांतरित करें (स्लाइस कक्ष में चारों ओर तैरने से रोकने के लिए स्लाइस स्लाइस के प्रत्येक दौर के बाद स्लाइस एकत्र करें)।
    नोट: जितनी जल्दी हो सके काम करें और यह सुनिश्चित करें कि उच्च सुक्रोज स्लाइस समाधान पूरी प्रक्रिया के दौरान बर्फ-ठंडा और कारबोजेनेटेड है। यदि आवश्यक हो, तो स्लाइस कक्ष के आसपास की बर्फ को फिर से भरें।

5. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए मस्तिष्क स्लाइस की वसूली

  1. 1 घंटे के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में ACSF से भरे रिकवरी चैंबर में स्लाइस छोड़ दें।
    नोट: वसूली कक्षों भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ।
  2. रिकवरी चैंबर को पानी के स्नान से बाहर निकालें।
  3. किसी भी आगे आवेदन शुरू करने से पहले वसूली के लिए कम से कम एक और 30 मिनट के लिए आरटी पर स्लाइस रखें।

6. हिप्पोकैम्पस के मध्यकालीन perforant पथ (MPP) में fEPSP रिकॉर्डिंग

  1. एक क्षैतिज पिपेट पुलर के साथ बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं से रिकॉर्डिंग पिपेट खींचें ~ 2 एमΩ के आकार के पिपेट प्राप्त करने के लिए जब ACSF समाधान से भरा और ACSF से भरे रिकॉर्डिंग कक्ष में डूबे।
  2. एक गुरुत्वाकर्षण नियंत्रित बहु बैरल परफ्यूजन प्रणाली है कि रिकॉर्डिंग चैंबर से जुड़ा हुआ है में उपयुक्त रसायनों (जैसे, Bicuculline) युक्त ACSF स्नान समाधान और ACSF समाधान भरें । लगातार सभी समाधानों को कार्बोजेनेट करें।
  3. एक पेरिस्टाल्टिक या वैक्यूम पंप चालू करें जो एक सक्शन ट्यूबिंग से जुड़ा हुआ है जो रिकॉर्डिंग कक्ष में पर्फ्यूजन लाइन के विपरीत समाप्त होता है। ACSF से भरे बैरल खोलें और एक सतत प्रवाह (प्रति सेकंड 1-2 बूंदें) स्थापित करने के लिए शुरू करते हैं । सत्यापित करें कि संदर्भ इलेक्ट्रोड ACSF समाधान में डूबे हुए है।
  4. सेटअप कंप्यूटर, एम्पलीफायर, माइक्रोमैनीपुलेटर, उत्तेजक, माइक्रोस्कोप लाइट (एस), कैमरा और मॉनिटर (यदि लागू हो) पर स्विच करें।
  5. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर खोलें (इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल उपकरण के लिए कई अलग-अलग हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर प्रदाता मौजूद हैं)।
  6. रिकवरी चैंबर से एक मस्तिष्क स्लाइस गोलार्द्ध को स्लाइस सेटअप के रिकॉर्डिंग कक्ष में स्थानांतरित करें और इसे डेंटेट जाइरस ग्रेन्यूल सेल परत और दृश्य के क्षेत्र में आणविक परत के साथ सही अभिविन्यास में स्थिति में रखें। सुनिश्चित करें कि उत्तेजना इलेक्ट्रोड एंटोराइनल कॉर्टेक्स की दिशा से स्लाइस में एमपीपी तक पहुंच सकता है और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड में CA3 की दिशा से सटीक विपरीत दिशा से एमपीपी तक पहुंच है।
  7. एक पेपर क्लिप(चित्रा 3A)या एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मस्तिष्क टुकड़ा ग्रिड के साथ रिकॉर्डिंग कक्ष में स्लाइस को स्थिर करें।
    नोट: स्लाइस ट्रांसफर और पोजिशनिंग के दौरान परफ्यूजन को बंद करना मददगार हो सकता है। हालांकि, मस्तिष्क के टुकड़े की गुणवत्ता की गारंटी देने के लिए इसमें बहुत अधिक समय नहीं लगना चाहिए।
  8. लगभग 100-150 माइक्रोन की दूरी पर एक दूसरे का सामना कर रहे कणिका कोशिका परत(चित्रा 3 B)के करीब आणविक परत के निचले तीसरे हिस्से में एमपीपी में रिकॉर्डिंग और उत्तेजना इलेक्ट्रोड को कम और स्थिति में रखें। उत्तेजना इलेक्ट्रोड को सतह से न्यूनतम संपर्क करना चाहिए, जबकि रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को ऊपरी स्लाइस परत में थोड़ी घुसपैठ करनी चाहिए।
  9. fEPSP संकेत प्राप्त करने के लिए मस्तिष्क के स्लाइस में कम तीव्रता उत्तेजना (0.1 एमएस के लिए 30-50 μA) लागू करें। यदि आवश्यक हो तो इलेक्ट्रोड की स्थिति को अनुकूलित करें (उदाहरण के लिए, कम या असामान्य आकार के fEPSP संकेत)।
  10. इनपुट-आउटपुट घटता रिकॉर्डिंग शुरू करें: 30 एस के अंतराल में मस्तिष्क के स्लाइस पर बढ़ती उत्तेजना तीव्रता लागू करें।
  11. अधिकतम fEPSP प्रतिक्रिया के 50% करने के लिए उत्तेजना तीव्रता सेट और मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए 30 s अंतराल में 20-40 मिनट के लिए 50% उत्तेजना तीव्रता लागू बेसलाइन fEPSP रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं।
  12. यदि आधार रेखा स्थिर प्रतीत होती है, तो अतिरिक्त रिकॉर्डिंग (जैसे, एलटीपी/लिमिटेड प्रोटोकॉल और/या ड्रग अनुप्रयोगों) के साथ आगे बढ़ें । (एमपीपी में एलटीपी इंडक्शन के लिए यहां 5 मिनट के अंतराल में लागू चार गुणा 1 एस 100 हर्ट्ज दालों से मिलकर एक प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया गया। कंडीशनिंग चरण से पहले और दौरान 10 मिनट से पहले बिक्यूकुलिन लागू किया गया था।
    नोट: सभी रिकॉर्डिंग को वर्तमान क्लैंप मोड में उचित कम-पास फ़िल्टरिंग (एंड एलटी;5 किलोहर्ट्ज) और नमूना दरों (>10 kHz) के साथ किया जाना चाहिए।
  13. डेटा को एक उपयुक्त फ़ाइल प्रारूप में निकालें और फाइबर वॉली, एफपीएसपी आयाम और एफपीएसपी ढलान जैसे एफईपीएसपी मापदंडों का विश्लेषण करें।

7. कैल्शियम इमेजिंग मस्तिष्क स्लाइस की रिकॉर्डिंग

  1. एक मस्तिष्क टुकड़ा गोलार्द्ध को 12-अच्छी तरह से कक्ष में स्थानांतरित करें और इसे उपयुक्त कैल्शियम डाई के साथ 30 मिनट से 1 घंटे तक लोड करें। लगातार 12-वेल प्लेट के ढक्कन में एक सेल्फ-मेड होल (गर्म 18G सुई के साथ) के माध्यम से एक कार्बोजेनेशन ट्यूब डालकर लोडिंग समाधान को कार्बोजोजेनेट करें।
    नोट: यह कदम आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों से मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी के मामले में आवश्यक नहीं है जो असाधारण रूप से GCaMP जैसे फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को व्यक्त करते हैं।
  2. चरण 6.2-6.5 में वर्णित रिकॉर्डिंग सेटअप तैयार करें।
    नोट: माइक्रोफ्लोरिमेट्रिक इमेजिंग प्रयोगों के लिए कोई एम्पलीफायर या माइक्रोमैनीपुलेटर आवश्यक नहीं है। एक उत्तेजक का उपयोग प्रयोग निर्भर है। फ्लोरेसेंस इमेजिंग प्रयोगों के लिए विशिष्ट सॉफ्टवेयर आवश्यक है।
  3. सॉफ्टवेयर को सही इमेजिंग सेटिंग्स में समायोजित करें: इसमें कैमरा एम्पलीफायर और बिनिंग सेटिंग, तरंगदैर्ध्य की स्थापना, एक्सपोजर समय और समय प्रोटोकॉल शामिल हैं। सटीक प्रयोगों के आधार पर सेटिंग अलग-अलग हो सकती है. (उदाहरण के लिए निशान, 1 x 1 बिनिंग, 2.4x प्री-एम्पलीफायर लाभ, 300 ईएम कैमरा गेन, प्रयोग की अवधि के लिए हर 500 मिलियन में 50 एमएस का एक्सपोजर दोहराया गया था।
  4. कैल्शियम डाई के साथ लोड होने के बाद, मस्तिष्क स्लाइस गोलार्द्ध को 12-वेल से रिकॉर्डिंग कक्ष में स्थानांतरित करें और इसे माइक्रोस्कोप चरण पर रखें।
  5. एक पेपर क्लिप(चित्रा 3A)या एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मस्तिष्क टुकड़ा ग्रिड के साथ रिकॉर्डिंग कक्ष में टुकड़ा स्थिर कदम 6.7 में वर्णित एक के समान।
  6. विश्वास दिलाता हूं कि ब्याज का क्षेत्र सही सूक्ष्म क्षेत्र में है और ध्यान में है ।
  7. अपने स्लाइस पर ब्याज (आरओआई) के कई क्षेत्रों का चयन करने के लिए फ्लोरेसेंस इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    नोट: फोटोब्लैचिंग के कारण चमक में सामान्य उतार-चढ़ाव का पालन करने के लिए पूरे क्षेत्र को देखने का चयन करना उपयोगी हो सकता है।
  8. रिकॉर्डिंग शुरू करें और चुने हुए समय बिंदुओं पर प्रायोगिक परीक्षण-दवाओं को लागू करें।
    नोट: कोशिकाओं के न्यूरोनल चरित्र और स्लाइस गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए प्रत्येक प्रयोग के अंत में एक उच्च K+ समाधान लागू करने की सलाह दी जाती है।
  9. डेटा को एक उपयुक्त फ़ाइल प्रारूप में निकालें और पूरे माप पर आरओआई में होने वाले फ्लोरेसेंस सिग्नल परिवर्तनों का विश्लेषण करें। आरओआई को ऑफ लाइन विश्लेषण के दौरान भी अनुकूलित किया जा सकता है।
    नोट: मस्तिष्क के स्लाइस में एफईपीएसपी रिकॉर्डिंग और कैल्शियम माइक्रोफ्लोरिमेट्री का वर्णन करने वाले अन्य प्रोटोकॉल साहित्य में उपलब्ध हैं24,32,33, 34,35.

Representative Results

प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक उपकरणों और महत्वपूर्ण कदमों का सामान्य अवलोकन
चित्रा 2 इस प्रोटोकॉल में वर्णित क्षैतिज तीव्र हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी के लिए सभी आवश्यक उपकरण और महत्वपूर्ण कदम प्रस्तुत करता है। आम तौर पर, कुछ विच्छेदन उपकरण और एक स्लाइस रिकवरी चैंबर(चित्रा 2 ए),एक प्रयोगशाला जल स्नान, और एक कंपन(चित्रा 2B)सहित सीमित संख्या में प्रमुख उपकरणों की आवश्यकता होती है। चित्रा 2सी-ई स्लाइस तैयारी प्रोटोकॉल के दौरान मस्तिष्क और गोलार्द्धों के महत्वपूर्ण चरणों और झुकाव की कल्पना करें। चित्रा 2F क्षैतिज मस्तिष्क स्लाइस के अपेक्षित परिणाम का एक उदाहरण है।

मध्यकालीन छिद्र पथ में fEPSP रिकॉर्डिंग
वसूली अवधि के बाद, मस्तिष्क स्लाइस fEPSPs की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहां, हमने एक मल्टी-चैनल गुरुत्वाकर्षण-नियंत्रित परफ्यूजन सिस्टम(चित्रा 3 ए और चित्रा 3B)से लैस एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग किया। एक ग्लास माइक्रोपिपेट (~ 2 एमΩ) ACSF समाधान से भरा हुआ था और क्लोराइड-लेपित चांदी इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर जुड़ा हुआ था जो क्लोरीनेटेड बाथ इलेक्ट्रोड के साथ सर्किट में एक परिचालन एम्पलीफायर के लिए रखा जाता है। मस्तिष्क के टुकड़े की ऊपरी परत में हिप्पोकैम्पस के एमपीपी में ग्लास माइक्रोपिपेट डालकर एक एम्पलीफायर और उपयुक्त रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के साथ एफईपीएस को रिकॉर्ड और कल्पना की गई थी। एफईपीएस को 2-संपर्क क्लस्टर माइक्रोइलेक्ट्रोड के साथ उत्तेजना से प्रेरित किया गया था, जो रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के एमपीपी अपस्ट्रीम में विभिन्न वर्तमान तीव्रता को लागू करता था। ध्यान दें कि इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एमपीपी रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के तरीके को समझाना नहीं है, लेकिन यहां वर्णित स्लाइस तैयारी प्रोटोकॉल की सफलता को प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में एमपीपी में रिकॉर्डिंग का उपयोग करता है। यदि कोई एमपीपी रिकॉर्डिंग करने का प्रयास करता है, तो उचित रिकॉर्डिंग साइट सुनिश्चित करने और एमपीपी को एलपीपी कोएलपीपी 8,36, 37से अलग करने के लिए कुछ नियंत्रण (उदाहरण के लिए, बनती हुईपल्सरिकॉर्डिंग) आवश्यक होसकतेहैं।

चित्रा 3C एक नकारात्मक (बाएं पैनल, कम गुणवत्ता टुकड़ा) और सकारात्मक (सही पैनल, उच्च गुणवत्ता टुकड़ा) एक fEPSP रिकॉर्डिंग का उदाहरण दिखाता है । नकारात्मक उदाहरण ट्रेस एक बड़ी फाइबर वॉली (एफवी) आयाम दिखाता है जो वास्तविक एफपीएसपी आयाम (≈0.5 एमवी) से भी अधिक है। इसके विपरीत, उच्च गुणवत्ता वाला टुकड़ा उदाहरण (दाएं पैनल) fEPSP अनुपात और एक उच्च fEPSP आयाम (>0.5 mV) के लिए एक छोटा एफवी दिखाता है। फाइबर वॉली वह संकेत है जो उत्तेजित न्यूरोनल फाइबर के डीपोलराइजेशन पर होता है और इसलिए पोस्टसिनैप्टिक शक्तिशाली (एफपीएसपी) से पहले होता है। एफईपीएसपी गुणों के लिए एफवी का संबंध अक्षीय और सिनैप्टिक गुणों के संरक्षण के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है। बरकरार तंत्रिका फाइबर के साथ उच्च गुणवत्ता वाले स्लाइस एफवी अनुपात के लिए एक उच्च fEPSP आयाम दिखाना चाहिए। इसके विपरीत, बिगड़ा चालन गुणों के साथ कम गुणवत्ता वाले स्लाइस में एफवी अनुपात में एफईएसपी में कमी आएगी। इसी तरह, एक मस्तिष्क टुकड़ा की व्यवहार्यता फाइबर वॉली आयाम(चित्रा 3 डी)बनाम fEPSP ढलानों की साजिश रचने से विश्लेषण किया जा सकता है ।

इसके अलावा, इनपुट-आउटपुट घटता (उत्तेजना तीव्रता पर fEPSP ढलान और एफवी आयाम) का उपयोग स्लाइस गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए मानक रूप से किया जाता है। मस्तिष्क के स्लाइस पर बढ़ती वर्तमान उत्तेजनाओं को लागू करके और बाद में fEPSP प्रतिक्रियाओं की निगरानी करके इस तरह के घटता प्राप्त किया जाता है। कम गुणवत्ता वाले मस्तिष्क स्लाइस खराब संरक्षित मस्तिष्क ऊतक(चित्रा 3ई, एफ)के उप-संरक्षित चालन गुणों के कारण कम इनपुट-आउटपुट वक्र दिखाते हैं। इसके अलावा, सिनैप्टिक प्रक्रियाओं की जांच के लिए आदर्श उत्तेजना तीव्रता सीमा को परिभाषित करने के लिए इनपुट-आउटपुट घटता आवश्यक है। आदर्श रूप से, उत्तेजना की तीव्रता अधिकतम प्रतिक्रियाओं के लिए तीव्रता का लगभग 50% सेट किया जाना चाहिए। इस चुने हुए उत्तेजना तीव्रता पर, fEPSP प्रतिक्रियाएं सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी में किसी भी परिवर्तन के लिए अत्यधिक संवेदनशील हैं, जो दीर्घकालिक शक्तिमान (एलटीपी) और दीर्घकालिक अवसाद (लिमिटेड) दोनों की जांच करने का अवसर प्रदान करता है।

सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का अध्ययन करने के लिए, चुने हुए 50% उत्तेजना तीव्रता पर मस्तिष्क स्लाइस (एफईपीएसपी ढलान) के सिनैप्टिक संचरण को कंडीशनिंग चरण से पहले लंबी समय अवधि (आमतौर पर 20-40 मिनट के बीच) के लिए निगरानी की जाती है। व्यवहार्य मस्तिष्क स्लाइस में स्थिर आधार रेखाएं होंगी, जबकि मस्तिष्क सर्किट(चित्रा 3जी,ऊपरी पैनल) की सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का अध्ययन करने के लिए अस्थिर बेसलाइन वाले मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग आगे कंडीशनिंग प्रोटोकॉल के लिए नहीं किया जा सकता है। सिनैप्टिक ट्रांसमिशन पर दवा प्रभावों की निगरानी के लिए ईपीएसपी बेसलाइन रिकॉर्डिंग भी उपयोगी हो सकती है(चित्रा 3जी,लोअर पैनल)। रिकॉर्ड किए गए एफईपीएसपी बेसलाइन संकेतों का मतलब आमतौर पर एफईपीएसपी समय पाठ्यक्रम को सामान्य करने के लिए उपयोग किया जाता है और मानक रूप से 100% पर सेट किया जाता है।

मस्तिष्क स्लाइस के लिए विशिष्ट कंडीशनिंग प्रोटोकॉल लागू करके सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का अध्ययन किया जा सकता है। ये प्रोटोकॉल जांच किए गए मस्तिष्क सर्किट और ब्याज के तंत्र (जैसे, एलटीपी या लिमिटेड) पर निर्भर करते हैं। डेंटेट जाइरस के एमपीपी में एलटीपी को प्रेरित करने के लिए, एमपीपी सिनेप्स38में मौजूद मजबूत गाबएर्गिक अवरोध के कारण एक मजबूत कंडीशनिंग प्रोटोकॉल आवश्यक है। यह बताया गया है कि गाबैर्ग अवरोध उच्च सुक्रोज स्लाइसिंग समाधान39के साथ तैयार मस्तिष्क स्लाइस में और भी अधिक स्पष्ट है। यहां, हम एक प्रोटोकॉल का उपयोग करते हैं जिसमेंगाबा ए रिसेप्टर विरोधी बिक्यूकुलिन(चित्रा 3 एच)के साथ इलाज किया जा रहा है, जबकि 5 मिनट के अंतराल में लागू 1 s लंबे 100 हर्ट्ज दालों की चार उत्तेजनाएं शामिल हैं। कंडीशनिंग अवधि के दौरान एनएमडीए और बिक्यूकुलिन के सह-जोड़ के परिणामस्वरूप एलटीपी(चित्रा 3H)में वृद्धि होती है। स्लाइस और अस्थिर सिनैप्टिक ट्रांसमिशन (एफईपीएसपी बेसलाइन) की कम गुणवत्ता के परिणामस्वरूप एलटीपी और लिमिटेड प्रेरण बदल सकते हैं। इसलिए, उच्च गुणवत्ता वाले स्लाइस तैयारी के साथ काम करना और कठोर अपवर्जन मानदंडों (फाइबर वॉली अनुपात (<3), छोटे एफईपीएसपी ढलान (<0.5 mV/ms) या आयाम (<0.5 mV) और अस्थिर एफपीएसपी बेसलाइन (5% से अधिक का परिवर्तन) का उपयोग करना उच्च महत्व का है। सिनैप्टिक प्रक्रियाओं की जांच करते समय अविजय स्लाइस के लिए।

डेंटेट जाइरस की कणिका कोशिका परत में कैल्शियम माइक्रोफ्लोरिमेट्रिक माप
वसूली के बाद, एक मस्तिष्क टुकड़ा कमरे के तापमान पर एक कैल्शियम के प्रति संवेदनशील डाई के 2 μM के साथ 1 घंटे के लिए carbogenated ASCF, प्रकाश से परिरक्षित किया गया था । टुकड़ा एक रिकॉर्डिंग चैंबर(चित्रा 3A)में एक ईमानदार फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर एक मल्टीचैनल गुरुत्वाकर्षण नियंत्रित परफ्यूजन प्रणाली से लैस में स्थानांतरित कर दिया गया था । फ्लोरेसेंस उत्सर्जन छवियों को 488 एनएम(चित्रा 4ए, बी)पर रोशनी के बाद हर 500 मिलीसेकंड प्राप्त किया गया था। एक्सोनन लैंप के साथ एक्सेच्योरेशन किया गया था और एक स्कैनर माउंटेड डिफेक्शन झंझरी मोनोक्रोमेटर और इमेज एक्विजिशन कंप्यूटर-नियंत्रित सीसीडी कैमरे के साथ किया गया था। माप के दौरान, स्लाइस को एनएमडीए रिसेप्टर विरोधी एपीवी के साथ इलाज किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप इंट्रासेलुलर कैल्शियम एकाग्रता में कमी आई। एक उच्च पोटेशियम एकाग्रता (50 mM) युक्त एक बाहाकार समाधान के साथ स्लाइस की उत्तेजना के परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स के depolarization और वोल्टेज-गेटेड आयन चैनलों(चित्रा 4C)के उद्घाटन के कारण बाहेल कैल्शियम की भारी आमद हुई।

यौगिक एकाग्रता (एमएमएम) आणविक वजन (जी/मोल) राशि (जी)
केसीएल 25 74.55 1.86
सीएसीएल2 * 2H2O 20 147.01 2.94
MgSO4 * 7H2O 10 246.48 2.46
केएच2पीओ4 12.5 136.08 1.7

तालिका 1: 10 x स्लाइस प्री-सॉल्यूशन (1 एल)।

यौगिक एकाग्रता (एमएमएम) आणविक वजन (जी/मोल) राशि (जी)
नैक 125 58.44 7.3
केसीएल 2.5 74.55 0.19
सीएसीएल2 * 2H2O 2 1 एम सीसीएल2 समाधान से 2 एमएल
MgSO4 * 7H2O 1 1 एम एमजीएसओ4 समाधान से 1 एमएल
एनएएच2पीओ4 * 2H2O 1.25 156.02 0.2
नाहको3 26 84.01 2.18
ग्लूकोज * एच2ओ 25 198.17 4.95

तालिका 2: 1x ACSF (1 एल) (305-315 mOsm के बीच ओस्मोलएरिटी)।

यौगिक एकाग्रता (एमएमएम) आणविक वजन (जी/मोल) राशि (जी)
10x स्लाइस प्रीसॉल्वशन N/A N/A 25 एमएल
इक्षु शर्करा 252 342.3 21.57
नाहको3 26 84.01 0.55
ग्लूकोज * एच2ओ 10 198.17 0.49

तालिका 3: 1x उच्च सुक्रोज स्लाइस समाधान (250 एमएल) (320-325 mOsm के बीच ऑस्मोलैरिटी)।

Figure 2
चित्रा 2: क्षैतिज हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी के बारे में विस्तृत जानकारी। (क)कृंतक मस्तिष्क के विच्छेदन और टुकड़ा करने की क्रिया के लिए आवश्यक उपकरणों की छवि: (क) ±2 सेमी लंबी और फिल्टर पेपर की ±0.5 सेमी चौड़ी पट्टियां (उदाहरण के लिए, ग्रेड 413); (ख) ब्लेड; (ग) सुपर गोंद; (घ) पिपेट टिप; (ङ) नमूना प्लेट (कंपन के साथ आता है); (च) 35 मिमी कल्चर डिश; (छ) ठीक ब्रश; (ज) स्पैटुला; (i) घुमावदार संदंश; (j) विच्छेदन कैंची; (k) मजबूत कैंची (10 सेमी से ऊपर ब्लेड की लंबाई); (l) व्यापक उद्घाटन के साथ प्लास्टिक पाश्चर पिपेट (व्यास में 0.6 से 0.8 सेमी के बीच); (एम) रिकवरी चैंबर (250 एमएल बीकर, प्लास्टिक रिंग, नायलॉन जाल, 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का टुकड़ा) के साथ स्वयं निर्मित; (n) ठंडा संस्कृति पकवान के शीर्ष पर बर्फ और (ओ) फिल्टर पेपर के वर्ग से भरा ९० मिमी संस्कृति पकवान । (ख)बर्फ से भरे स्लाइस चैंबर के (क) धारक के साथ एक वाइब्रेलोम की तस्वीर; (ख) स्लाइस चैंबर; (ग) कार्बोजन लाइन और (घ) टुकड़ा करने की क्रिया रेजर ब्लेड । (ग)कार्टून क्षैतिज टुकड़ा करने की क्रिया के लिए मस्तिष्क तैयार करने के क्रम में एक गोलार्द्ध के पृष्ठीय पक्ष के कट के अभिविन्यास चित्रण (चरण 3.9 देखें) । (घ)वाइब्रेटम की नमूना प्लेट पर मस्तिष्क अभिविन्यास का आइसोमेट्रिक प्रक्षेपण। (ई)नमूना प्लेट पर दो गोलार्द्धों की स्थिति का एक शीर्ष दृश्य दर्शाते कार्टून । (च)एक क्षैतिज मस्तिष्क टुकड़ा में हिप्पोकैम्पस की स्थिति दिखा कार्टून । हिप्पोकैम्पस के डेंटेट जाइरस (डीजी) और कॉर्नू अमोनिस (सीए) -सुबिकुलम (एसबी) क्षेत्रों को इंगित किया गया है। (जी)कार्बोजेनेटेड ACSF के साथ एक रिकवरी चैंबर की तस्वीर जिसमें दस हौसले से कटा हुआ क्षैतिज मस्तिष्क स्लाइस होते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग। (A)परफ्यूजन और सक्शन वाले रिकॉर्डिंग चैंबर की छवि, जो एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के तहत उपयोग की जाने वाली है। एक मस्तिष्क टुकड़ा कक्ष में रखा जाएगा और रिकॉर्डिंग की शुरुआत से पहले एक कागज क्लिप के एक टुकड़े के साथ स्थिर । (ख)एक ईमानदार माइक्रोस्कोप (10x उद्देश्य) के तहत एक हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क टुकड़ा की उज्ज्वल क्षेत्र तस्वीर । डेंटेट जाइरस (डीजी) और CA3 क्षेत्र को संकेत दिया जाता है और साथ ही उत्तेजना (नीचे बाएं) और रिकॉर्डिंग (नीचे दाएं) इलेक्ट्रोड, fEPSP रिकॉर्डिंग के दौरान मध्यकालीन छिद्र पथ को लक्षित करते हैं। (ग)बाएं: एक मजबूत फाइबर वॉली और एक छोटे आयाम के साथ एक fEPSP रिकॉर्डिंग के एक कम गुणवत्ता वाले टुकड़ा उदाहरण का प्रतिनिधित्व । सही: एक fEPSP रिकॉर्डिंग का उच्च गुणवत्ता वाला टुकड़ा उदाहरण। ग्रे लाइन बेसलाइन स्तर को इंगित करती है। बिंदीदार लाइनें 0.5 एमवी के कट-ऑफ आयाम को इंगित करते हैं। (घ)उच्च गुणवत्ता के लिए एफवी आयाम बनाम fEPSP ढलान की साजिश (काले; n = 10) और कम गुणवत्ता वाले मस्तिष्क स्लाइस (ग्रे; एन = 4) । उच्च गुणवत्ता वाले स्लाइस (ब्लैक; एन = 10) और कम गुणवत्ता वाले स्लाइस (ग्रे; एन = 4)) के लिए विभिन्न उत्तेजना तीव्रता (μA) के लिए मतलब ± SEM.(ई)इनपुट-आउटपुट प्लॉट (fEPSP ढलान) के रूप में दर्शाए गए डेटा। (एफ)में के रूप में ही(ई)लेकिन एफवी आयामों बनाम उत्तेजना तीव्रता के लिए । (जी)तीन अलग-अलग बेसलाइन एफईपीएसपी रिकॉर्डिंग का टाइम कोर्स (% में एफईपीएसपी की ढलान; पहले 5 मिनट के मतलब fEPSP ढलान को सामान्यीकृत)। ऊपरी पैनल एक सकारात्मक (काला) और नकारात्मक (लाल) उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है, जहां रिकॉर्डिंग के दौरान कारबोजन की चूक के कारण बाद में एक अस्थिर आधार रेखा होती है। लोअर पैनल इलाज में दो स्थिर बेसलाइन रिकॉर्डिंग से पता चलता है (स्थिर बेसलाइन के 20 मिनट के बाद, AMPA रिसेप्टर्स AMPA रिसेप्टर विरोधी DNQX (10 μM)) (नीले) और अनुपचारित हालत (काले) के आवेदन द्वारा अवरुद्ध किया गया । (एच)विभिन्न उपचार स्थितियों के लिए एलटीपी रिकॉर्डिंग का समय पाठ्यक्रम (निचले पैनल में इंगित) । कंडीशनिंग के दौरान बाइक्यूलाइन (20 माइक्रोन) और एनएमडीए (10 माइक्रोएम) के सह-अनुप्रयोग के लिए कंडीशनिंग और नीले रंग के दौरान बिक्यूकुलिन (20 माइक्रोन) के आवेदन के लिए काला रंग। ऊपरी पैनल में तीर उन समय बिंदुओं को इंगित करते हैं जहां उच्च आवृत्ति उत्तेजना लागू की गई थी (100Hz के 4 x 1s)। निचले पैनल में बार ग्राफ मतलब fEPSP ढलानों का प्रतिनिधित्व करता है (%) ऊपरी पैनल (प्रत्येक स्थिति के लिए एकल प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग) में दिखाए गए प्रयोगों के एलटीपी प्रेरण के बाद 50-60 मिनट के लिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस के कैल्शियम-माइक्रोफ्लोरिमेट्री। (ए और बी)फ्लोरेसेंस इमेज (488 एनएम पर उत्साहित)(ए)और माउस मस्तिष्क के क्षैतिज हिप्पोकैम्पस ब्रेन स्लाइस के इसी हीट मैप(बी)। डेंटेट जाइरस (डीजी), CA3 क्षेत्र, और ब्याज के एक क्षेत्र (आरओआई) का एक उदाहरण पैनल ए(सी)कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के समय पाठ्यक्रम (एफ488 एनएम)एनएमडीए रिसेप्टर विरोधी एपीवी (50 माइक्रोन) और उच्च बाह्य पोटेशियम (के+)(50 मीटर) वाले समाधान के साथ उपचार के दौरान एक तीव्र हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस के डेंटेट जाइरस में एक आरओआई से इंगित किया जाता है। ट्रेस उच्च कश्मीर+ perfusion के दौरान उच्चतम कैल्शियम प्रतिक्रिया के लिए सामान्यीकृत है और फोटोब्लैचिंग के लिए बेसलाइन सही है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

हालांकि आमतौर पर तंत्रिका विज्ञान समुदाय के बीच उपयोग किया जाता है, मस्तिष्क स्लाइस तैयारी भी कई नुकसान के साथ सामना कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए इनपुट और आउटपुट कनेक्शन अब मस्तिष्क के टुकड़े में नहीं जुड़े होते हैं। इसके अलावा, एक बार अलग, ऊतक समय के साथ धीरे-धीरे अपमानजनक शुरू होता है और इस प्रक्रिया को मस्तिष्क टुकड़ा की शारीरिक स्थितियों को बदल सकता है। विशेष रूप से यह विषय बहुत संबंधित है क्योंकि अधिकांश मस्तिष्क स्लाइस रिकॉर्डिंग कई मिनट से घंटों तक ले रही है, जिसके परिणामस्वरूप लंबे समय तक प्रयोगात्मक दिनों में ऊतक पर प्रदर्शन किया जाता है जो प्रयोग की शुरुआत से पहले 6-8 घंटे तक अलग-थलग हो जाता था। इसके अलावा, सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ और रक्त परिसंचरण स्लाइस तैयारी के दौरान बाधित हो जाते हैं, जिससे मस्तिष्क के टुकड़े के भीतर महत्वपूर्ण अंतर्जात यौगिकों की कमी हो सकती है। और सबसे स्पष्ट रूप से, टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया ही यांत्रिक ऊतक क्षति है कि प्राप्त परिणामों से समझौता हो सकता है कारण हो सकता है । हालांकि, मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी के वास्तविक लाभ अभी भी उनके नुकसान पल्ला झुकना है, यही वजह है कि वे तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में एक उच्च मूल्यवान और नियोजित तकनीक मौजूद हैं ।

तीव्र हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस जटिल मस्तिष्क सर्किट अध्ययन करने के लिए एक आणविक स्तर से न्यूरोनल प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली और इसलिए व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक मौजूद है। यह हिप्पोकैम्पस के आदर्श न्यूरोएनाटॉमी पर आधारित है जिसे स्लाइस तैयारी18में आसानी से संरक्षित किया जा सकता है। नतीजतन, हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क के स्लाइस का उपयोग विभिन्न प्रकार की वैज्ञानिक अनुसंधान परियोजनाओं में किया जाता है, जिसमें दवा स्क्रीनिंग17,संज्ञानात्मक कार्यों में शामिल न्यूरोनल और सिनैप्टिक गुणों का अध्ययन40,41,और पैथोलॉजिकल मस्तिष्क की स्थिति14, 42,43की जांच शामिल है। हालांकि, विभिन्न अनुप्रयोगों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम भी उपलब्ध स्लाइस तैयारी प्रोटोकॉल की एक विस्तृत श्रृंखला का कारण बनता है जो विभिन्न मापदंडों में भिन्न हो सकते हैं, जैसे विच्छेदन की स्थिति और विमान अभिविन्यास को काटना। इसलिए, एक वैज्ञानिक परियोजना के सटीक अनुसंधान प्रश्न के लिए एक उपयुक्त टुकड़ा तैयारी प्रोटोकॉल का चयन करने के लिए निर्धारित किया जाना है ।

टिश्यू हेलिकॉप्टर हिप्पोकैम्पल ब्रेन स्लाइस44,45तैयार करने के लिए सबसे पुरानी तकनीकों में से एक प्रस्तुत करता है । इस तैयारी विधि के प्रमुख फायदों में हेलिकॉप्टर की कम लागत और तेज और आसान उपयोगशामिलहैं । हालांकि, ऊतक हेलिकॉप्टर यांत्रिक तनाव का कारण बनते हैं जिसके परिणामस्वरूप रूपात्मक परिवर्तन और कोशिका मृत्यु47होती है। इसकी तुलना में, वाइब्रेकोम एक महंगी मशीन है और स्लाइस तैयार करने का समय काफी बढ़ जाता है जिसका टुकड़ा की गुणवत्ता पर प्रभाव पड़ सकता है। हालांकि, वाइब्रेटम आमतौर पर ऊतक से स्लाइस को अलग करने का एक अधिक सौम्य तरीका प्रदान करता है और मस्तिष्क को पूरी अलगाव प्रक्रिया पर अच्छी तरह से ठंडा और ऑक्सीजनयुक्त रखने की अनुमति देता है, जिससे स्लाइस गुणों में सुधार होता है46। इसलिए, कई समूह इस तकनीक को मानक रूप से नियोजित कर रहे हैं और वाइब्रेटोम16,30,48का उपयोग करके तीव्र हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क स्लाइस तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल को आगे लाए हैं । जबकि कुछ प्रोटोकॉल टुकड़ा करने की क्रिया के लिए केवल कुछ विवरण प्रदान करते हैं, बल्कि इस तरह के टुकड़ा तैयारी४८के एक विशिष्ट आवेदन पर ध्यान केंद्रित करते हैं, दूसरों को विस्तृत टुकड़ा प्रोटोकॉल है कि विमान या अंय प्रोटोकॉल विवरण (जैसे, agarose एम्बेडेड या टुकड़ा/वसूली समाधान) इस अनुच्छेद27,30में दिए गए काटने में अलग प्रदान करते हैं ।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल युवा जानवरों से उच्च गुणवत्ता वाले तीव्र क्षैतिज हिप्पोकैम्पस माउस मस्तिष्क स्लाइस तैयार करने के लिए एक सीधी विधि प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल विशेष रूप से छिद्रपूर्ण पथ (मध्य और पार्श्व) को संरक्षित करने के लिए उपयोगी है जो हिप्पोकैम्पस इनपुट मार्ग प्रस्तुत करता है, जो एंटोराइनल कॉर्टेक्स से हिप्पोकैम्पस8,49,50तक प्रोजेक्ट करता है। धनु, कोरोनल, साथ ही अलग हिप्पोकैम्पस ट्रांसवर्स स्लाइस तैयारी ठीक से छिद्रपूर्ण पथ को संरक्षित नहीं करती है, जो मुख्य रूप से कीटोरिनल कॉर्टेक्स की परतों द्वितीय और वी से निकलती है और हिप्पोकैम्पस18के भीतर कई क्षेत्रों में परियोजनाएं हैं। हिप्पोकैम्पस के संबंध में एंटोराहिनल कॉर्टेक्स की शारीरिक स्थिति के कारण, स्लाइस तैयारी31के भीतर पूरी तरह से बरकरार छिद्रपूर्ण पथ फाइबर को बनाए रखने के लिए क्षैतिज मस्तिष्क स्लाइस एक आवश्यकता है। इसके अतिरिक्त, क्षैतिज टुकड़ा करने की क्रिया आदर्श रूप से काई फाइबर को संरक्षित करतीहै जो हिप्पोकैम्पस9,30,50के भीतर डेंटेट जाइरस से सीए 3 न्यूरॉन्स तक परियोजना करती है। इसलिए, यह तैयारी विधि अध्ययनों के लिए उच्च मूल्य की है जो हिप्पोकैम्पस इनपुट रास्तों और डीजी से संबंधित प्रक्रियाओं की जांच करती है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल श्फर कोलैटरल पाथवे50की जांच की अनुमति देता है। हालांकि, SAGittal और कोरोनल मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी अधिक आमतौर पर जब CA3 CA1 फाइबर अनुमानों की जांच कर रहे हैं, संभवतः क्योंकि उनके थोड़ा तेजी से तैयारी समय है कि उच्च गुणवत्ता स्लाइस प्राप्त करने की संभावना बढ़ सकती है । फिर भी, क्षैतिज हिप्पोकैम्पस स्लाइस तैयारी एक शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण प्रस्तुत करती है क्योंकि यह एक स्लाइस गोलार्द्ध के भीतर सभी हिप्पोकैम्पस फाइबर रास्तों के संरक्षण और जांच की अनुमति देता है। यह विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब सर्किट प्रतिक्रियाओं का अध्ययन किया जाता है, उदाहरण के लिए, मल्टी इलेक्ट्रोड परख रिकॉर्डिंग में।

मस्तिष्क स्लाइस तैयार करते समय एक बड़ी चिंता मस्तिष्क के ऊतकों का उचित संरक्षण है। यह हमारे प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरणों द्वारा पूरा किया जाता है, जिसमें एक तेजी से विच्छेदन, ऊतक की निरंतर और पर्याप्त ऑक्सीजन और ठंडा होना, और कम सोडियम, उच्च सुक्रोज टुकड़ा करने की क्रिया समाधान39,51के साथ सुरक्षात्मक काटने की विधि के उपयोग से मस्तिष्क के ऊतकों की सुरक्षा शामिल है। इस तथ्य के बावजूद कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल 90% के आसपास सफलता दर प्रदान करता है, पुराने या आनुवंशिक रूप से विविध जानवरों से प्राप्त ऊतकों के साथ काम करते समय या एक विशिष्ट कोशिका आबादी को संरक्षित करने की कोशिश करते समय संभावित अतिरिक्त सुरक्षात्मक कदम उठाने की आवश्यकता हो सकती है। संवेदनशील मस्तिष्क ऊतक की तैयारी की रक्षा के लिए पहले से ही कई तरीकों की सूचना दी गई थी। इन तरीकों में सोडियम परमीशन52को कम करने के लिए एनएमडीजी आधारित स्लाइसिंग समाधानों का उपयोग, एनएमडीए रिसेप्टर गतिविधि को अवरुद्ध करने के लिए स्लाइसिंग समाधान में उच्च मैग्नीशियम के स्तर का उपयोग और वसूली अवधि23के दौरान सुरक्षात्मक समाधानों का लंबे समय तक उपयोग करना शामिल है। इन सभी उपायों के परिणामस्वरूप कम एक्सटॉक्सिकिटी होगी। इसके अतिरिक्त, पुराने जानवरों के साथ काम करते समय बर्फ-ठंडे सुरक्षात्मक ACSF समाधानों के साथ एक ट्रांस-कार्डियल परफ्यूजन अक्सर नियोजित और आवश्यकहोताहै।

तीव्र हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस आदर्श रूप से अनुकूल हैं और बड़े पैमाने पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाते हैं जैसे कि उच्च आयाम संकेत जो अपेक्षाकृत मोटी (300-500 माइक्रोन) तीव्र मस्तिष्क स्लाइस से प्राप्त किए जा सकते हैं, जो शोर अनुपात11के लिए एक उच्च संकेत की गारंटी देता है। मानक रूप से उपयोग किए जाने वाले इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अनुप्रयोगों में वोल्टेज या वर्तमान-क्लैंप मोड में एक्स्ट्रासेलुलर फील्ड रिकॉर्डिंग और इंट्रासेलुलर पूरी सेल रिकॉर्डिंग शामिल हैं। उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा प्राप्त करने के लिए, स्लाइस स्वास्थ्य प्राथमिक चिंता का विषय है और प्रस्तुत प्रोटोकॉल का कड़ाई से पालन करके गारंटी दी जा सकती है। हालांकि, स्लाइस तैयारी एक अत्यधिक संवेदनशील तकनीक पेश करती है, इसलिए प्रत्येक प्रयोग की शुरुआत से पहले एक गुणवत्ता की जांच नियमित रूप से शामिल की जानी चाहिए। कई मापदंडों का उपयोग स्लाइस की गुणवत्ता जांच के रूप में किया जा सकता है और इनपुट-आउटपुट घटता और बेसलाइन एफईपीएसपी या ईपीएससी रिकॉर्डिंग19के माध्यम से मानक रूप से मूल्यांकन किया जाता है। फिर भी, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि उप-विशिष्ट विद्युत भौतिक गुण इलेक्ट्रोड पोजिशनिंग, ओरिएंटेशन या यहां तक कि नुकसान जैसी प्रायोगिक त्रुटियों से उत्पन्न हो सकते हैं और पूरी तरह से तैयार स्लाइस के स्वास्थ्य का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। इसलिए, 40x उद्देश्य या डीएपीआई नाभिक धुंधला के तहत कोशिकाओं के सरल दृश्य और मूल्यांकन जैसे अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण करने की सलाह दी जाती है। इस तरह की गुणवत्ता की जांच कई टुकड़ा तैयारी सत्रों पर लगातार टुकड़ा स्वास्थ्य की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

कैल्शियम माइक्रोफ्लोरिमेट्री हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क स्लाइस का अध्ययन करने के लिए कम आमतौर पर उपयोग की जाने वाली तकनीक प्रस्तुत करता है। हालांकि, यह तकनीक मानक बाह्य और इंट्रासेलुलर इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के लिए अतिरिक्त मूल्य की है, क्योंकि यह इंट्रासेलुलर कैल्शियम फ्लक्स की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है, जो न्यूरोनल और सिनेप्टिक सिग्नलिंग में उच्च महत्व के हैं। इंट्रासेलुलर कैल्शियम सांद्रता में परिवर्तन न्यूरोट्रांसमीटर वेसिकल रिलीज, पोस्टसिनैप्टिक संभावित पीढ़ी, सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का विनियमन और अक्षीय तंत्रिका चालन54,55,56में शामिल हैं। इस तकनीक(चित्रा 4)के एक उदाहरण के रूप में, हमने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कैल्शियम डाई का उपयोग किया। यकीनन, कैल्शियम रंगों के साथ ऊतक स्लाइस के उपचार से बढ़ी हुई प्रयोगात्मक समय सीमा के साथ-साथ निचले स्थित न्यूरोनल कोशिकाओं की अक्षम लोडिंग जैसी कठिनाइयां उत्पींन हो सकती हैं। हालांकि, इस तकनीक पर बदलाव इन तकनीकी चुनौतियों को दरकिनार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, हिप्पोकैम्पस स्लाइस में कैल्शियम माप और पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग को जोड़ना संभव है। इस तरह, एक कैल्शियम फ्लोरोसेंट डाई पैच पिपेट के माध्यम से एक विशिष्ट कोशिका में लोड किया जा सकता है, ब्याज57की एक विशिष्ट कोशिका में कैल्शियम गतिशीलता के माप की अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, कैल्शियम संकेतक, GCaMP58,या तो पूरे मस्तिष्क में, या एक सेल विशिष्ट प्रमोटर द्वारा संचालित व्यक्त आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जानवरों का उपयोग किया जा सकता है। दिलचस्प बात यह है कि जीएमपी जानवरों से मस्तिष्क ऊतक ब्याज के प्रोटीन के लिए एक सीधा लिंकर के साथ न्यूरोनल अभिव्यक्ति पैटर्न निर्धारित करने या कैल्शियम स्पार्क्स और तरंगों में शामिल होने की जांच करने के अवसर प्रदान कर सकता है।

कुल मिलाकर, हम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और इमेजिंग रिकॉर्डिंग के लिए चूहों से स्वस्थ और व्यवहार्य क्षैतिज हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क स्लाइस की सफल तैयारी के लिए दिशानिर्देश प्रदान करते हैं। यह पद्धति मस्तिष्क की विकृतियों में होने वाले न्यूरोलॉजिकल परिवर्तनों तक पहुंचने के लिए बहुत उपयोगी है जो डेंटेट जाइरस में वर्णित हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम अपनी शोध सुविधाओं के उपयोग के लिए डॉ कीम्पे वीरडा और प्रो डॉ जोरिस डी बुद्धि की देखरेख में मस्तिष्क और रोग अनुसंधान के लिए VIB-KU Leuven केंद्र की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी इकाई को धन्यवाद देते हैं । इसके अलावा, हम आयन चैनल अनुसंधान की प्रयोगशाला के सभी सदस्यों और एंडोमेट्रियम, एंडोमेट्रियोसिस और प्रजनन चिकित्सा की प्रयोगशाला केयू Leuven में उनके सहायक चर्चाओं और टिप्पणियों के लिए धन्यवाद देते हैं।

इस परियोजना को रिसर्च फाउंडेशन-फ्लैंडर्स (G.084515N और G.0B1819N से जेवी) और केयू Leuven के अनुसंधान परिषद (C1-funding C14/18/106 से जेवी) को धन प्राप्त हुआ है । केपी एक एफडब्ल्यूओ [पेगासस]2 मैरी स्क्लोडोस्का-क्यूरी फेलो है और मैरी स्क्लोडोवस्का-क्यूरी ग्रांट एग्रीमेंट (665501) के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से फंडिंग प्राप्त की, जिसमें रिसर्च फाउंडेशन फ्लैंडर्स (एफडब्ल्यूओ) (12T0317N) है। केएच रिसर्च फाउंडेशन फ्लैंडर्स, बेल्जियम (12U7918N) का पोस्टडॉक्टोरल फेलो है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia chamber home made - Generic N/A plexiglas
Anesthesia vaporizer Dräger & MSS International Ltd Isoflurane Vapor 19.3 & MSS Isoflurane to vaporize isoflurane for rodent anesthetization
Barrels for the perfusion system TERUMO Hypodermic syringes without needle https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html
Bicuculline methiodide hellobio HB0893 https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html
Borosilcate glass capillaries Science Products GB150F-8P https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished
Calcium chlorid dihydrate Merck 102382 https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Calcium Imaging software Till Photonics LiveAcquisition v2.3.0.18
Carbogen tank Air Liquide Alphagaz mix B50 Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5
Cluster microelectrode FHC CE2C55 https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/
Culture dish (35 mm) Corning Life Sciences 353001 https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001
Culture dish (90 mm) Thermo Fisher Scientific 101VR20 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20
Curved forceps Fine Science tools 11270-20 https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20
D-AP5 hellobio HB0225 https://www.hellobio.com/dap5.html
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma Aldrich 16301 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en&region=BE
Digital CMOS camera HAMAMATSU ORCA-spark C11440-36U https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html
Dissection scissors Fine Science tools 14058-09 https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut®/14058-09
DNQX hellobio HB0262 https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html
EMCCD camera Andor iXon TM + DU-897E-CSO-#BV https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE
EPC10 USB Double Patch Clamp Amplifier HEKA Elektronik 895278 https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf
Filter paper VWR 516-0818 grade 413
Fine brush Raphael Kaerell 8204 Size #1
18G needle Henke Sass Wolf Fine-Ject 18G X 1 1/2" 4710012040 https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/
Isoflurane Dechra Veterinary Products Iso-Vet 1000mg/g 250 ml bottle
Loctite 406 Henkel Adhesive technologies Loctite 406 Super glue
Magnesium sulfate heptahydrate Merck 105886 https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Micromanipulator Luigs & Neumann SM-10 with SM-7 remote control system https://www.luigs-neumann.org
Microscope (for calcium imaging) Olympus BX51WI https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/
Microscope (for ephys recordings) Zeiss Axio Examiner.A1 https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/
Microscope light source CAIRN Research dual OptoLed power supply https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/
Monochromator Till Photonics Polychrome V
N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA) Sigma Aldrich M3262 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en&region=BE
Oregon Green® 488 BAPTA-1 Invitrogen Molecular Probes #06807 10x50ug
Osmometer Wescor 5500 vapor pressure osmometer to verify osmolarity of salt solutions
Peristaltic pump Thermo Fisher Scientific Masterflex C/L 77120-62 https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229
pH meter WTW inoLab series pH 720 https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf
Pipette puller Sutter Instrument P-1000 https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html
Potassium chlorid Chem-lab CL00.1133 https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528
Potassium dihydrogen phosphate Merck 104873 https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Razor blade to prepare hemispheres SPI supplies Safety Cartridge Dispenser - Pkg/10 GEM Scientific Single Edge Razor Blades
Razor blade for vibratome Ted Pella Inc 121-6 double edge breakable style razor blades (PTFE-coated stainless steel)
Recovery chamber home made - Generic N/A to collect and store brain slices in (see details in manuscript)
Scissors Any company N/A Blade should be well sharpened and at least 15 cm long for easy decapitation
Silver electrode wire Any company for recording and reference electrodes
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Merck 106342 https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Sodium hydrogen carbonate Alfa Aesar 14707 https://www.alfa.com/en/catalog/014707/
Sodium chlorid Fisher Scientific S/3160/60 https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420
Software for field recordings HEKA Elektronik PatchMaster https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf
Spatula Sigma Aldrich S9147-12EA https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en&region=BE
Stimulator A.M.P.I ISO-FLEX http://www.ampi.co.il/isoflex.html
Sucrose VWR International Ltd. 102745C https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 1 Warner Instruments 64-0167 Tygon tubing (TY-50) for standard valve systems
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 2 Fisher Scientific 800/100/200 & 800/100/280 Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE Tubing
Vacuum pump home made - Generic N/A
8 valve multi-barrel perfusion system home made N/A consists of barrels, tubing and a self-made automated valve control (specifications of all purchased parts can be found in this Table)
Magnetic valves (to control the perfusion lines) NResearch Inc. p/n 161P011 https://nresearch.com/
Vibratome Leica 14912000001 Semi-automatic vibrating blade microomei VT1200
Water bath Memmert WNB 7 https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf
Water purification system Merck Synergy millipore to obtain highly purified water
12-well plates Greiner Bio-One CELLSTAR, 665180 http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf

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Van Hoeymissen, E., Philippaert, K., Vennekens, R., Vriens, J., Held, K. Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (163), e61753, doi:10.3791/61753 (2020).

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