Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تجزئة تدفق غير متماثل لتحجيم الجسيمات النانوية الذهبية في التعليق

Published: September 11, 2020 doi: 10.3791/61757
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Research & Development, Postnova Analytics GmbH

Summary

يصف هذا البروتوكول استخدام تجزئة تدفق تدفق التدفق غير المتماثل إلى جانب الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية فيس لتحديد حجم عينة جسيمات نانوية ذهبية غير معروفة.

Abstract

يمكن القول إن حجم الجسيمات هو أهم معلمة فيزياء-كيميائية مرتبطة بفكرة الجسيمات النانوية. المعرفة الدقيقة لحجم وحجم توزيع الجسيمات النانوية هي ذات أهمية قصوى لمختلف التطبيقات. نطاق الحجم مهم أيضا، لأنه يحدد العنصر الأكثر "نشاطا" من جرعة الجسيمات النانوية.

تجزئة تدفق التدفق غير المتماثل (AF4) هي تقنية قوية لتحجيم الجسيمات في التعليق في نطاق حجم حوالي 1-1000 نانومتر. هناك عدة طرق لاشتقاق معلومات الحجم من تجربة AF4. بالإضافة إلى اقتران AF4 على الإنترنت مع أجهزة الكشف الحساسة للحجم على أساس مبادئ تشتت الضوء متعدد الزاوية أو تشتت الضوء الديناميكي ، هناك أيضًا إمكانية الربط بين حجم العينة ووقت الاحتفاظ بها باستخدام نهج نظري راسخ (نظرية FFF) أو من خلال مقارنتها بأوقات الاحتفاظ بمعايير حجم الجسيمات المحددة جيدًا (معايرة الحجم الخارجي).

نحن هنا وصف التنمية والتحقق من داخل الشركة من إجراءات التشغيل القياسية (SOP) لتحجيم العينة غير معروف من الجسيمات النانوية الذهب من قبل AF4 إلى جانب الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية فيس باستخدام معيار حجم خارجي مع معايير جسيمات نانوية الذهب في نطاق حجم 20-100 نانومتر. هذا الإجراء يوفر وصفا مفصلا لسير العمل المتقدمة بما في ذلك إعداد العينة، AF4 إعداد الصك والتأهيل، AF4 تطوير طريقة وتجزئة العينة غير معروف من الجسيمات النانوية الذهب، فضلا عن ارتباط النتائج التي تم الحصول عليها مع معيار الحجم الخارجي المعمول بها. تم التحقق من صحة SOP الموصوف هنا بنجاح في إطار دراسة مقارنة بين الألواح تسلط الضوء على المتانة والموثوقية الممتازة لـ AF4 لتحجيم عينات الجسيمات النانوية في التعليق.

Introduction

كانت الجسيمات النانوية الذهبية (AuNP) في شكل ذهب الغروية جزءًا من الثقافة البشرية قبل وقت طويل من فهم ما هي الجسيمات النانوية وقبل أن يجد مصطلح الجسيمات النانوية طريقه إلى المفردات العلمية المعاصرة. دون معرفة واضحة من مظهرها النانومترية، تم بالفعل أو نب علقت تستخدم لأغراض طبية وغيرها في الصين القديمة، والجزيرة العربية، والهند في الخامس السادس قرون BC1، وأيضا الرومان القدماء استغلوا لونهم الأحمر روبي صبغة الشهيرة الفخار في معرض كأس Lycurgus في المتحف البريطاني2. في العالم الغربي، على مر القرون من العصور الوسطى إلى العصر الحديث، تم استخدام AUNP المعلقة في الغالب كعوامل التلوين للزجاج والمينا (أرجواني كاسيوس)3 وكذلك لعلاج مجموعة متنوعة من الأمراض (الذهب الصالح للشرب)، وخاصة الزهري4.

ومع ذلك ، فقد ركزت كل هذه الدراسات في المقام الأول على تطبيق AUNP المعلقة وكان الأمر متروك لمايكل فاراداي في عام 1857 لإدخال أول نهج عقلاني للتحقيق في تشكيلها وطبيعتها وكذلك خصائصها5. على الرغم من أن فاراداي كان يدرك بالفعل أن هذه AuNP يجب أن يكون لها أبعاد دقيقة جدا، فإنه لم يكن حتى تطوير المجهرية الإلكترونية عندما كان يمكن الوصول إلى معلومات واضحة حول توزيع حجمها6،7، في نهاية المطاف تمكين العلاقة بين حجم وخصائص أخرى AuNP.

في الوقت الحاضر، وذلك بفضل توليفها سهلة إلى حد ما ومباشرة، خصائص بصرية ملحوظة (الرنين البلازمون السطحية)، والاستقرار الكيميائي الجيد وبالتالي سمية طفيفة، فضلا عن براعة عالية من حيث الأحجام المتاحة والتعديلات السطحية، وقد وجدت AuNP تطبيقات واسعة النطاق في مجالات مثل nanoelectronics8، التشخيص9، علاج السرطان10، أو تسليم الأدوية11. ومن الواضح، لهذه التطبيقات، معرفة دقيقة من حجم وحجم توزيع AUNP التطبيقية شرط أساسي لضمان فعالية الأمثل12 وهناك طلب كبير على أدوات قوية وموثوق بها لتحديد هذا المعلمة الفيزيائية الكيميائية الحاسمة. اليوم ، هناك عدد كبير من التقنيات التحليلية القادرة على تحجيم AuNP في التعليق بما في ذلك ، على سبيل المثال، الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيفي (الأشعة فوق البنفسجية فيس)13، الحيوي تشتت الضوء (DLS)14 أو واحد الجسيمات موحية مترافق البلازما الطيفية الكتلة (SPICP-MS)15 مع تجزئة تدفق الحقل (FFF) يجري لاعبا رئيسيا في هذا المجال16،17،18،20.

تصور لأول مرة في عام 1966 من قبل J. كالفين Giddings21، FFF يضم عائلة من تقنيات تجزئة elution القائم على ، حيث يتم الفصل داخل رقيقة ، مثل الشريط قناة دون مرحلة ثابتة22،23. في FFF، يتم الحث على الفصل عن طريق تفاعل عينة مع حقل قوة خارجية يعمل عمودياً على اتجاه تدفق قناة لاصفار، حيث يتم نقل العينة في اتجاه المصب عادة نحو أجهزة الكشف الداخلية. ومن بين هذه التقنيات FFF ذات الصلة، تدفق تدفق غير متماثل تجزئة تدفق (AF4)، حيث تدفق الثانية (تدفق عبر) بمثابة حقل القوة، أصبح النوع الفرعي الأكثر استخداما على نطاق واسع24. في AF4، تم تجهيز أسفل القناة (جدار تراكم) مع غشاء الترشيح الفائق شبه قابل للنفاذ التي هي قادرة على الاحتفاظ العينة في حين يسمح في وقت واحد تدفق عبر لتمرير من خلال الغشاء وترك القناة عبر منفذ إضافي. بهذه الوسيلة، يمكن أن يدفع التدفق المتقاطع العينة نحو جدار التراكم وبالتالي يقاوم تدفقه الناجم عن الانتشار (الحركة البراشيان). (أ) في توازن ناتج عن ذلك من التدفقات الناجمة عن الميدان والانتشار؛ محاذاة مكونات عينة أصغر تظهر معاملات نشر أعلى أقرب إلى مركز القناة بينما المكونات عينة أكبر التي تظهر معاملات نشر أقل تحديد موقع أقرب إلى جدار التراكم. بسبب ملف تعريف التدفق المكافئ داخل القناة، يتم نقل مكونات العينة الأصغر في شكل رقي أسرع لتدفق القناة و الـ (elute) قبل مكونات العينة الأكبر. باستخدام FFF المعلمة استبقاء ستوكس آينشتاين معامل نشر المعادلات، والوقت elution، على التوالي حجم elution، من عينة في AF4 يمكن بعد ذلك تترجم مباشرة إلى حجمها الهيدروديناميكية22. هنا يشير سلوك elution الموصوفة إلى وضع elution العادي وعادة ما يكون صالحا ل AF4 داخل نطاق حجم الجسيمات بين ما يقرب من 1-500 نانومتر (في بعض الأحيان تصل إلى 2000 نانومتر اعتمادا على خصائص الجسيمات والمعلمات تجزئة) في حين أن steric-hyperlayer عادة ما يحدث فوق هذا الحجمعتبة 25.

هناك ثلاث طرق شائعة لاشتقاق معلومات الحجم بعد الانفصال بواسطة FFF. منذ FFF هو أداة وحدات، ويمكن الجمع بين المصب مع أجهزة الكشف عن متعددة مثل أجهزة الكشف عن تشتت الضوء الحساسة لحجم استنادا إلى مبدأ متعددة زاوية تشتت الضوء (MALS)26،27، تشتت الضوء الحيوي (DLS)28،29، أو حتى مزيج من كل من الحصول على معلومات إضافية شكل30،31. ومع ذلك، بما أن سلوك الاحتفاظ بالعينة في قناة FFF تحكمه بشكل عام قوى مادية محددة جيداً، يمكن أيضاً حساب الحجم باستخدام نهج رياضي (نظرية FFF)، حيث يكون كاشف التركيز البسيط (على سبيل المثال، كاشف الأشعة فوق البنفسجية) كافياً للإشارة إلى وجود عينة مُمَرِّجة32،33.

كخيار ثالث، ونحن هنا الإبلاغ عن تطبيق معايرة حجم خارجي34،35 باستخدام معايير أوب محددة جيدا في نطاق حجم 20-100 نانومتر لتحجيم العينة غير معروف نانو جسيمات الذهب في التعليق باستخدام AF4 مقرونة مع الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية فيس. تم اختيار هذا الإعداد التجريبي البسيط عن قصد للسماح لأكبر عدد ممكن من المختبرات بالانضمام إلى مقارنة دولية بين التخومات (ILC) ، والتي تم تنفيذها لاحقًا في إطار مشروع ACEnano الأفق للاتحاد الأوروبي 2020 استنادًا إلى البروتوكول المقدم هنا.

Protocol

1. AF4 إعداد النظام

  1. قم بتجميع خرطوشة AF4 وتوصيل جميع مكونات الأجهزة لنظام AF4 وكاشف الأشعة فوق البنفسجية(جدول المواد)باتباع التعليمات الواردة في دليل الشركة المصنعة.
  2. تثبيت جميع حزم البرامج اللازمة للسيطرة، وحيازة البيانات، وتجهيز وتقييم بعد التعليمات الواردة في دليل الشركة المصنعة.
  3. تأكد من إنشاء جميع وصلات الإشارة الضرورية بين نظام AF4 وجهاز الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية.
  4. تأكد من أن المنشأة AF4-UV-Vis اتصالات ضيقة ودون تسرب عن طريق مسح الإعداد مع الماء فائقة السخ (UPW) لمدة 15 دقيقة (معدل تدفق تلميح 1 مل •min-1، التركيز معدل التدفق 1 مل • min-1، وتقاطع معدل التدفق 1.5 مل • min-1. للقيام بذلك، افتح برنامج التحكم AF4 وأدخل معدلات التدفق في اللوحات المعنية على الجانب العلوي الأيمن من الصفحة المقصودة. تشديد الموصلات المعنية (التجهيزات)، إذا لزم الأمر، وتكرار الإجراء حتى لا تسرب ملحوظ.
    ملاحظة: يجب مراقبة ضغط النظام الداخلي أثناء جميع القياسات ويجب أن يكون ضمن 4 إلى 12 بار. في حالة الضغط أعلى أو أقل، يجب تعديل أنابيب الضغط الخلفي. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن يكون اتجاه ضغط القناة ثابتاً خلال وقت القياس الكامل.
    ملاحظة: إذا كان فرن القناة متوفرًا، فحدد درجة حرارته على 25 درجة مئوية لضمان ظروف قياس قابلة للمقارنة في جميع تجارب AF4.

2. إعداد الحلول وتعليق لAF4-UV-vis نظام التأهيل وتحليل العينة

  1. محلول التنظيف
    1. إضافة 8 غرام من هيدروكسيد الصوديوم الصلبة (NAOH) و 2 غرام من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) إلى 1 لتر من يو دبليو وتحريك الحل حتى الحل الكلي.
  2. إلوينت
    1. إضافة 500 ميكرولتر من خليط السطحي المصفى إلى 2 لتر من UPW المصفاة والمزيلة للحصول على eluent (0.025٪ (v/v)، والضاحية الاحيوية حوالي 9.4).
      ملاحظة: ويرد وصف مفصل لمركبات خليط السطحي في الجدول 1 (أيضا جدول المواد).
  3. معيار حجم AuNP التعسفي لتحديد الانتعاش الجماعي
    1. دوامة معيار حجم AuNP التعسفي (50 ملغ •L-1) لمدة 2 دقيقة وتمييع 1:4 مع UPW للحصول على تركيز كتلة النهائي من 12.5 ملغ •L -1. دوامة لمدة 2 دقيقة إضافية بعد التخفيف لتجانس تعليق الحصول عليها.
      تنبيه: يلزم اتخاذ تدابير احترازية ضرورية ومعدات حماية مناسبة عند العمل مع المواد الكيميائية، وخاصة كريات صوديوم صوديوم.
      ملاحظة: يوصى بشكل عام بفك الغاز وتصفية جميع الحلول الضرورية (باستثناء محلول التنظيف) باستخدام فلتر غشاء 0.1 ميكرومتر (PVDF هيدروفيلي أو ما شابه ذلك) لضمان وجود خلفيات جسيمات منخفضة أثناء التجارب AF4-UV-vis. ويمكن أن يتم إنشاء هذا إما عن طريق وحدة ترشيح فراغ مخصصة أو باستخدام مرشحات الحقن.

3. AF4-UV-فيس تأهيل النظام

  1. استخدام إعدادات البرنامج الموضحة في الخطوة 1.4 لطرد النظام مع محلول التنظيف لمدة 30 دقيقة (معدل تدفق تلميح 1 مل •min-1، تركيز معدل تدفق 1 مل • min-1، وتقاطع معدل التدفق 1.5 مل • min-1).
  2. تغيير زجاجة eluent على التوالي ومسح النظام مع UPW لمدة 20 دقيقة (تلميح معدل التدفق 1 م • min-1، التركيز على معدل التدفق 1 مل • min-1، ومعدل التدفق عبر 1.5 مل • min-1).
  3. استبدال مرشحات مضخة مضمنة المعنية.
  4. افتح خرطوشة AF4 واستبدل غشاء AF4. إعادة تجميع خرطوشة AF4 وإعادة توصيلها مع نظام AF4-UV-vis.
  5. تدفق تنظيف AF4-UV-فيس النظام مع eluent لمدة 30 دقيقة على الأقل من أجل اكويالغشاء واستقرار النظام (تلميح معدل تدفق 1 مل •min-1،التركيز معدل التدفق 1 مل •min-1، وتقاطع معدل التدفق 1.5 مل • min-1). التحقق من التسربات المحتملة مرة أخرى (راجع الخطوة 1.4).
  6. تأهيل AF4-UV-فيس النظام عن طريق تحديد الانتعاش الشامل والاختلاف من الوقت الاحتفاظ باستخدام معيار حجم AUNP التعسفي.
    1. إجراء عملية حقن مباشرة دون تطبيق قوة الفصل.
      1. إنشاء ملف قياس جديد عن طريق فتح ملف | | جديدة تشغيل في برنامج التحكم AF4.
      2. تعريف العينة ووصف القياس وكذلك حجم الحقن واسم العينة داخل علامة التبويب تشغيل. يتم عرض شروط القياس في الجدول 2.
      3. قم بتعيين معلمات القياس في طريقة FFF التبويب الثاني وفقاً للجدول 2.
      4. انقر على زر تشغيل لبدء القياس.
    2. تنفيذ تشغيل تجزئة مع تطبيق قوة فصل (تدفق عبر).
      1. قم بتعريف أسلوب الكسر كما هو موضح في المقطع السابق باستخدام شروط الكسر المحددة في الجدول 3.
      2. انقر على زر تشغيل لبدء القياس.
      3. إجراء القياس في رباعية.
        ملاحظة: يهدف التشغيل الأول إلى تكييف النظام (أي غشاء AF4) وسيتم استبعاده من التقييم النهائي لنتائج تأهيل النظام.
        ملاحظة: من المستحسن حفظ كافة الملفات التي تم إنشاؤها بواسطة فتح ملف | حفظ في برنامج التحكم AF4.
      4. النظر في AF4-UV-في نظام مؤهل إذا كان الانتعاش الشامل من > 80٪ والاختلاف من الوقت الاحتفاظ < 2٪ يتم الحصول على معيار حجم AuNP التعسفي.
      5. عند استخدام autosampler كنظام الحقن، تعبئة زجاجة خزان الغسيل الإبرة للإبتعاء مع نفس الحل الذي يتم ضخه من خلال نظام AF4-UV-vis (على سبيل المثال، محلول التنظيف، UPW، أو مَلَمُّتة كل منها) لضمان ظروف التشغيل المثلى. عند تغيير اللوين، يوصى عادةً باتباع إعادة توازن نظام AF4 من خلال مراقبة إشارة كاشف الأشعة فوق البنفسجية حتى يظل خط الأساس ثابتًا على مستوى ثابت.

4. AF4-UV-vis تحليل العينة

  1. إعداد جميع معايير حجم AuNP لمعايرة الحجم الخارجي من خلال دوامة تعليق AuNP المعنية (20 نانومتر، 40 نانومتر، 80 نانومتر، 100 نانومتر، كل 50 ملغ. L-1) لمدة 2 دقيقة وتمييع 1:4 مع UPW للحصول على تركيز كتلة النهائي من 12.5 ملغ •L-1. دوامة لمدة 2 دقيقة إضافية بعد التخفيف لتجانس التعليقات التي تم الحصول عليها.
  2. إعداد العينة أوب غير معروف للتحليل تطبيق نفس الإجراء كما لمعايير المعايرة الموضحة في الخطوة 4.1.
  3. إجراء قياس الحقن المباشر لجميع معايير حجم AuNP باستخدام طريقة AF4 المعروضة في الجدول 2.
    1. للقيام بذلك، أدخل القيم ذات الصلة الملخصة في الجدول 2 في برنامج الشركة المصنعة في المواضع المناسبة لتحديد معلمات الفصل وعينة واضغط على زر تشغيل لبدء التجربة.
  4. اكسر كل معيار حجم AuNP بشكل فردي باستخدام طريقة AF4 المعروضة في الجدول 3 لإنشاء وظيفة معايرة الحجم الخارجي.
    1. أدخل القيم الخاصة التي تم تلخيصها في الجدول 3 في برنامج الشركة المصنعة في المواضع المناسبة. يتم تعريف طريقة الكسر من خلال خطوة التركيز، عدة خطوات elution، وخطوة شطف. بعد إعداد الأسلوب، اضغط على الزر تشغيل لبدء التجربة.
  5. إجراء قياس الحقن المباشر لعينة أوينب غير معروف باستخدام طريقة AF4 المعروضة في الجدول 2.
  6. تنفيذ تجزئة عينة أوب غير معروف عن طريق إجراء أسلوب AF4 المذكورة في الجدول 3.
  7. تنفيذ جميع القياسات المذكورة في القسم 3 و 4 في ثلاث ية ما لم ينص على خلاف ذلك لضمان نتائج ذات مغزى وذات صلة إحصائيا.
    1. تخزين 50 ملغ •L-1 تعليق المخزون AuNP في 4-8 درجة مئوية قبل الاستخدام. يتم إعداد التعليقات المخففة AuNP بشكل مثالي في غضون 30 دقيقة قبل التطبيق.
      ملاحظة: الدوامة عادة ما تكون كافية ولا ultrasonication من التعليقات ضروري.
    2. من أجل تمكين ارتباط وقت الاحتفاظ بعينة AuNP غير المعروفة مع أوقات الاحتفاظ التي تم الحصول عليها لمعايير حجم AuNP ، قم بقياس جميع العينات باستخدام نفس الطريقة AF4.
      ملاحظة: لضمان وجود ظروف فصل ثابتة وصالحة، قم بتضمين/تكرار خطوة الكسر الموضحة في قسم تأهيل النظام (انظر الخطوة 3.6.2) بعد عدد محدد من قياسات العينات (على سبيل المثال، 10 قياسات). وبالإضافة إلى ذلك، سجل ضغط النظام و UV-vis الاستقرار الأساسي للكشف عن. وينبغي أن تبقى مستقرة وثابتة على طول كامل AF4-UV-vis البعيد.
      ملاحظة: عادةً، استبدال غشاء الترشيح الفائق عندما يغيب كاشف الأشعة فوق البنفسجية (أو كاشف تشتت الضوء متعدد الزوايا (MALS) إذا كان متوفراً) مستوى ضوضاء أعلى أو معايير تأهيل النظام المحددة مثل الاسترداد، شكل ذروة العينة، أو التكرار يتم تفويتها (أو إخضاع نظام AF4-UV-vis لإجراء تنظيف شامل). في ظل الظروف المذكورة هنا، فإن نظام AF4-UV-vis المؤهل عادة ما يكون مستقرًا لما لا يقل عن 50 قياسًا باستخدام نفس الغشاء؛ ومع ذلك، فإن عدد القياسات المتتالية المحتملة التي تفي بمعايير الجودة المحددة يمكن أن يختلف بشكل كبير حسب العينة ومصفوفة العينة وتكوين الرتّل.

5 - تقييم البيانات

  1. إجراء حساب استرداد الكتلة باستخدام إما برنامج تقييم البيانات المقدمة من قبل AF4-UV-vis تحليل النظام أو تحليل جدول البيانات بعد تصدير جميع البيانات الخام اللازمة (أي، الأشعة فوق البنفسجية في منطقة الذروة) من برنامج الحصول على البيانات المعنية بعد التعليمات الواردة في دليل الشركة المصنعة.
    1. حساب استعادة كتلة AuNP بمقارنة المناطق تحت الذروة للأشعة فوق البنفسجية لكل من قياس الكسر (Aتجزئة)وقياس الحقن المباشر(حقنة مباشرة)باستخدام المعادلة التالية:
      Equation 2
      ملاحظة: أثناء قياس الحقن المباشر، لا يتم تطبيق قوة الفصل، وبالتالي يمكن إهمال التفاعلات المحتملة لأنواع التحليلات مع جدار التراكم. المنطقة تحت ذروة الأشعة فوق البنفسجية على حدة كل يمكن أن تكون مرتبطة مباشرة إلى كتلة AuNP باستخدام قانون البيرة لامبرت على افتراض أن أي أنواع أخرى داخل العينة تمتص في الطول الموجي لكل منهما و / أو ط) يتم إزالة المستويات العليا في وقت الاحتفاظ بآخر تحت ظروف الكسر الثاني) من خلال غشاء AF4.
    2. استيراد الملفات dat. تم الحصول عليها من كل من الحقن المباشر وتشغيل الكسر.
    3. حدد تتبع كاشف الأشعة فوق البنفسجية في علامة التبويب نظرة عامة.
    4. حدد منطقة الاهتمام (ROI) و خط أساس في طريقة عرض الإشارة وخطوط الأساس لكافة القياسات.
    5. إدراج معايرة الحقن المباشر عبر إدراج.
    6. حدد كل عمليات الحقن المباشر في عرض إعدادات معايرة الحقن المباشر وأدخل معامل انقراض الأشعة فوق البنفسجية.
      ملاحظة: من المهم استخدام نفس معامل انقراض الـ UV-vis لكل من المعايرة وقياس الكسر.
    7. إنشاء خط المعايرة باستخدام المنطقة تحت أثر إشارة الأشعة فوق البنفسجية فيس داخل العائد على الاستثمار والكمية المحقونة محسوبة من التركيز المدخل وحجم الحقن. سيتم عرض المعايرة التي تم الحصول عليها في إطار وظيفة معايرة الحقن المباشر المنفصل.
    8. تعيين دالة المعايرة إلى قياسات الكسر المعنية.
      ملاحظة: لكل معيار من معايير حجم المعايرة وعينة AuNP غير المعروفة، يجب إنشاء وظيفة معايرة منفصلة بسبب امتصاص الأشعة فوق البنفسجية المعتمدة على الحجم من AUNP. ويمكن التحايل على هذا العيب من كاشف الأشعة فوق البنفسجية فيس باستخدام كاشف حساسة الشامل مثل ICP-MS.
    9. تنفيذ التحليلات عن طريق إدراج حساب النتائج الكمية وسيتم عرض النتائج داخل جدول على اليمين كقيم تركيز وكمية حقن.
  2. حساب اختلاف مدة الاحتفاظ باستخدام إما برنامج تقييم البيانات المقدمة من قبل الشركة المصنعة لنظام AF4 أو تحليل جدول البيانات بعد تصدير جميع البيانات الخام اللازمة (أي، أوقات الاحتفاظ بمعايير المعايرة AuNP في أقصى درجة قصوى للأشعة فوق البنفسجية فيس كل منهما وأوقات الفراغ المعنية) من برنامج الحصول على البيانات المعنية بعد التعليمات الواردة في دليل الشركة المصنعة.
    1. افتح نافذة النظرة العامة لعرض آثار الأشعة فوق البنفسجية الخاصة بكل القياسات المستوردة.
    2. وسيتم تنفيذ الكشف عن الذروة تلقائياً؛ ضبط معلمات الكشف الذروة داخل مربع أدوات معالجة الإشارة لتحسين الأداء. استخراج أقصى القصوى الذروة المعنية من خلال الذهاب من خلال جميع ملفات القياس.
    3. حساب الانحراف المعياري النسبي لكافة القياسات باستخدام المعادلة التالية:
      Equation 1
      يمكن أيضًا إجراء الحساب باستخدام برنامج جدول بيانات ذي الصلة.
  3. تنفيذ تحديد حجم باستخدام إما برنامج تقييم البيانات المقدمة من قبل الشركة المصنعة أو تحليل جدول البيانات بعد تصدير جميع البيانات الخام اللازمة (وقت الاحتفاظ في الأشعة فوق البنفسجية في الذروة القصوى من التحليل ووقت الفراغ على التوالي) من برنامج الحصول على البيانات المعنية بعد التعليمات الواردة في دليل الشركة المصنعة. ويمكن إنشاء وظيفة معايرة خارجية الحجم عن طريق رسم زمن الفراغ تصحيح أوقات الاحتفاظ (صافي أوقات الاحتفاظ ، انظر الجدول 5)من معايير حجم AuNP (20 نانومتر ، 40 نانومتر ، 80 نانومتر ، 100 نانومتر) مقابل أحجامها الهيدروديناميكية التي تم الحصول عليها من قياسات DLS التي تم تنفيذها سابقًا (انظر الجدول 4).
    ملاحظة: ينبغي إجراء قياسات DLS بشكل مثالي في نفس اليوم الذي يتم فيه إجراء قياسات الكسر الخاصة بها لضمان خصائص العينة القابلة للمقارنة.
    1. بعد استيراد الملفات .dat يتم عرض كافة القياسات في علامة التبويب نظرة عامة. حدد إشارة كاشف الأشعة فوق البنفسجية من قائمة أجهزة الكشف، والتي يتم عرضها أسفل نافذة التراكب. حدد عائد الاستثمار الأساسي لكل قياس، ويمكن ضبطهما في طريقة عرض الإشارة و"الأساس". استخدم مربع أدوات معالجة الإشارة على اليمين لسلاسة الإشارات الصاخبة. استخدم الدالة Assign Processing Parameters إلى تشغيلات أخرى للسماح بتخصيص المعلمات للقياسات الأخرى، على التوالي إشارات.
    2. حدد معايرة حجم الجسيمات من علامة التبويب إدراج.
    3. حدد كافة عمليات المعايرة بالنقر على القياس الخاص في جدول تحديد مراجع للمعايرة في الجانب الأيمن العلوي. سيتم عرض كافة القياسات المحددة في جدول أدناه. أدخل نصف القطر الهيدروديناميكية لكافة قياسات المعايرة المحددة في الجدول 4. سيتم عرض الدالة في معايرة حجم الجسيمات - سيتم عرض نافذة الدالة والمعادلة أيضًا.
      ملاحظة: يجب أن يكون معامل الارتباط (R2)من وظيفة معايرة الحجم المحددة ≥0.990.
    4. تعيين دالة المعايرة إلى قياسات عينة AuNP غير معروف عن طريق تحديد الكسور المعنية ضمن القائمة تحديد تشغيل للتعيين.
    5. عرض النتائج عن طريق فتح حساب توزيع حجم الجسيمات داخل علامة التبويب إدراج. سيتم إدراج معايرة حجم الجسيمات التي تم إنشاؤها سابقًا على أنها معايرة قياسات عينة AuNP غير المعروفة، والتي يتم عرضها في إعداداتالإطار الأيمن. سيتم عرض الحجم المحسوب في إطار توزيع الحجم المسمى إلى أقصى حد للذروة. حدد خانة الاختيار متوسط الإشارات للعينة لمتوسط جميع قياسات عينة واحدة وقم بإدراج النتيجة في التسمية القصوى القصوى للذروة.
    6. بالإضافة إلى ذلك، رسم خط المعايرة فوق fractogram عن طريق تحديد مربع الاختيار إظهار منحنى المعايرة. يتوفر توزيع حجم تراكمي عن طريق تحديد خانة الاختيار إظهار التوزيع التراكمي.
      ملاحظة: عند استخدام برنامج الشركة المصنعة لتقييم البيانات، من المستحسن إضافة كافة النتائج إلى تقرير، والتي يمكن إنشاؤها بالنقر فوق "تقرير" داخل علامة التبويب إدراج. يضيف الزر "تقرير" كافة النتائج والجداول والرسومات التخطيطية إلى مستند. ضمن علامة التبويب تقرير، يمكن تغيير إعدادات التقرير عن طريق فتح إعداد التقرير داخل المقطع المستند.

Representative Results

أولاً، تم تجزئة معايير حجم AuNP بواسطة AF4 وتم اكتشافها بواسطة الأشعة فوق البنفسجية في قياس امتصاص AUNP في طول موجي يبلغ 532 نانومتر (الرنين البلازمون السطحي لـ AuNP). يتم عرض تراكب من fractograms التي تم الحصول عليها في الشكل 1. وترد في الجدول 5أوقات الاحتفاظ بكل من الـ AUNP عند الذروة القصوى للأشعة فوق البنفسجية لكل منها التي تم الحصول عليها من القياسات ثلاثية الليكات. وكان الانحراف المعياري النسبي لجميع أوقات الاحتفاظ أقل من 1.1٪ مع تباين قياس متناقص مع زيادة الحجم. وعموما، تحققت إمكانية تكرار ممتازة. تم تطبيق قوة فصل مستمرة ، مما أدى إلى علاقة خطية من وقت elution والحجم الهيدروديناميكية. تم إنشاء خط معايرة الحجم الخارجي عن طريق رسم نصف قطر هيدرودينامي محدد مقابل وقت الفراغ تصحيح وقت elution (صافي وقت الاحتفاظ). نتج عن تحليل الانحدار الخطي دالة معايرة خطية مع اعتراض 3.373 نانومتر = ± 1.716 نانومتر ومنحدر ب = 1.209 نانومتر • min-1 ± 0.055 نانومتر • min-1. تم تأكيد السلوك الخطي لـ elution بمعامل ارتباط مربع R2 من 0.9958. يتم عرض وظيفة المعايرة الخاصة بها بصريًا في الشكل 2.

وتناول الجزء الثاني تحليل عينة أوينب غير معروفة. وقد أعدت ثلاث اسكوت عن العينة وفقا للإجراء الموصوف في قسم البروتوكول(القسم 4-2). تم التحقيق في كل من aliquots الثلاثة في ثلاث ية باستخدام نفس AF4 طريقة تجزئة التي تم تطبيقها أيضا لمعايير حجم AuNP. جميع تسعة AF4-UV-vis fractograms التي تم الحصول عليها من العينة غير معروف AUNP يتم عرضها في الشكل 3 ويتم تلخيصها في الجدول 6تقييمات كل منها . وكان الانحراف المعياري النسبي لأوقات الاحتفاظ بكل منهما منخفضاً بشكل ملحوظ وتراوح بين 0.1٪ و0.5٪. باستخدام وظيفة معايرة حجم الجسيمات التي تم الحصول عليها من تجزئة معايير حجم AuNP وربطها بأوقات الاحتفاظ التي تم الحصول عليها لعينة AuNP غير المعروفة عند الذروة القصوى للأشعة فوق البنفسجية، يمكن حساب متوسط نصف قطر هيدرودينامي إجمالي يبلغ 29.4 نانومتر ± 0.2 نانومتر. وعلاوة على ذلك، تم الحصول على استعادة كتلة معقولة بنسبة 83.1٪ ± 1.2٪ مما يشير إلى عدم وجود تجمع أو انحلال كبير لعينة AuNP أو الامتزاز الكبير للجسيمات على سطح الغشاء. ويعرض الشكل 4 توزيع حجم الجسيمات التي تم الحصول عليها مع وجود كل آثار إشارة الأشعة فوق البنفسجية التسعة التي تم تحديد متوسطها التي تبرز المتانة الممتازة لطريقة AF4 المطبقة.

Figure 1
الشكل 1: AF4-UV-vis fractograms التي تم الحصول عليها من تحليل ثلاثية المدى من معايير معايرة حجم أوNP الفردية الأربعة مع كثافة إشارة عادية وتطبيق معدل تدفق عبر ثابت (خط أسود). يتم تسليط الضوء على ذروة الفراغ باللون الرمادي في حوالي 5.9 دقيقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تم الحصول على وظيفة معايرة الحجم الخارجي، بما في ذلك شرائط الخطأ المستمدة من الانحرافات المعيارية الخاصة بقياسات DLS(الجدول 4)والتباينات في أوقات الاحتفاظ ب AF4 التي تم الحصول عليها(الجدول 5)،بعد رسم نصف قطرها هيدرودينامي محدد مقابل وقت الاحتفاظ بكل معيار معايرة لحجم AuNP في الحد الأقصى للذروة لكل منها. دالة معايرة خطية مع أخطاء قياسية في شكل y = a + bx مع -3.373 نانومتر ± 1.716 نانومتر و ب = 1.209 نانومتر ·min-1 ± 0.055 نانومتر·min-1 تم حسابه من تحليل الانحدار الخطي. تم تحديد معامل ارتباط مربع مع R2 = 0.9958، مما يشير إلى علاقة خطية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: AF4-UV-vis fractograms من قياسات ثلاثية من ثلاثة aliquots عرض أوب غير معروف. يتم توضيح معدل التدفق المتقاطع الثابت المطبق خلال وقت القياس كخط أسود. يتم تمييز ذروة الفراغ في حوالي 5.9 دقيقة باللون الرمادي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تراكب متوسط توزيع حجم الجسيمات (الأحمر) لعينة AuNP غير المعروفة ووظيفة المعايرة الخطية التطبيقية (الخط المنقط). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مكون CAS-No الوزن (٪)
الماء 7732-18-5 88.8
9-أوكتاديسينوويك حمض (Z)-, مركب مع 2,2',2''-nitrilotris[الإيثانول](1:1) 2717-15-9 3.8
كربونات الصوديوم 497-19-8 2.7
الكحول، C12-14-الثانوية، ethoxylated 84133-50-6 1.8
رباعيات الصوديوم EDTA 64-02-8 1.4
بولي ايثيلين جلايكول 25322-68-3 0.9
أوليات الصوديوم 143-19-1 0.5
بيكربونات الصوديوم 144-55-8 0.1

الجدول 1: قائمة مكونات خليط السطحي المستخدم لإعداد الوينت (انظر أيضاً جدول المواد).

AF4-UV-vis المعلمات وحده قيمه
سمك المسافة مكم 350
معدل تدفق الكاشف mL الحد الأدنى-1 0.5
معدل التدفق المتداخل mL الحد الأدنى-1 0 (ثابت لمدة 8 دقائق)
معدل تدفق التركيز mL الحد الأدنى-1 0
وقت التأخير / وقت التثبيت دقيقه 0
معدل تدفق الحقن mL الحد الأدنى-1 0.5
وقت الانتقال دقيقه 0
حقن الوقت دقيقه 0.1
خطوة Elution دقيقه 8
شطف وقت الخطوة دقيقه 0.1
شطف معدل تدفق الخطوة mL الحد الأدنى-1 0.1
حجم الحقن μL 10
تركيز العينة ملغ L-1 12.5
نوع الغشاء السليلوز المجدد
غشاء الوزن الجزيئي قطع قبالة kDa 10
إلوينت 0.025٪ (v/v) خليط السطحي
الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية نانومتر 532
حساسية للأشعة فوق البنفسجية - 0.001

الجدول 2: ملخص لـ AF4-UV-vis المعلمات طريقة تجزئة لأداء الحقن المباشر تشغيل دون تطبيق قوة الفصل.

AF4-UV-vis المعلمات وحده قيمه
سمك المسافة مكم 350
معدل تدفق الكاشف mL الحد الأدنى-1 0.5
معدل التدفق المتداخل mL الحد الأدنى-1 1 (60 دقيقة ثابتة، 10 دقائق خطية)
معدل تدفق التركيز mL الحد الأدنى-1 1.3
وقت التأخير / وقت التثبيت دقيقه 2
معدل تدفق الحقن mL الحد الأدنى-1 0.2
وقت الانتقال دقيقه 0.2
حقن الوقت دقيقه 5
خطوة Elution دقيقه 70 (60 دقيقة ثابتة، 10 دقائق خطية)
خطوة الشطف دقيقه 9
شطف معدل تدفق الخطوة mL الحد الأدنى-1 0.5
حجم الحقن μL 50
تركيز العينة ملغ L-1 12.5
نوع الغشاء السليلوز المجدد
غشاء الوزن الجزيئي قطع قبالة kDa 10
إلوينت 0.025٪ (v/v) خليط السطحي
الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية نانومتر 532
حساسية للأشعة فوق البنفسجية - 0.001

الجدول 3: ملخص لبارامترات طريقة الكسر AF4-UV-vis لتنفيذ الكسر تشغيل مع تطبيق تدفق عبر كقوة فصل.

معايرة القياسية وكيل الحدود متوسط الحجم (TEM) (نانومتر) السيرة الذاتية (متوسط الحجم TEM) (٪) زيتا المحتملة (mV) SD (زيتا المحتملة) (mV) نصف قطر هيدرودينامي (DLS) (نانومتر) SD (نصف قطر هيدرودينامي) (نانومتر) PDI SD (PDI)
AuNP 20 nm سترات 20.1 ≤ 8 -48.9 1.5 10.95 0.12 0.082 0.009
AuNP 40 نانومتر سترات 40.8 ≤ 8 -30.4 1.0 20.30 0.13 0.127 0.006
AuNP 80 nm سترات 79.2 ≤ 8 -51.5 1.3 38.85 0.23 0.138 0.013
AuNP 100 nm سترات 102.2 ≤ 8 -50.9 0.9 52.30 0.37 0.078 0.009

الجدول 4: ملخص للبارامترات الفيزيائية الكيميائية لمعايير المعايرة AUNP المطبقة، بما في ذلك عامل الحد الأقصى، TEM يعني الحجم، زيتا المحتملة المحددة في التعليق الأصلي وكذلك نصف قطر هيدرودينامي DLS، ومؤشر تعدد التخصصات (PDI) المحددة في eluent.

معايرة القياسية تشغيل وقت الاستبقاء في الذروة القصوى (دقيقة) صافي وقت الاحتفاظ في ذروة الحد الأقصى (دقيقة) متوسط صافي وقت الاحتفاظ (دقيقة) SD (٪) (صافي وقت الاحتفاظ) SD (دقيقة) (صافي وقت الاحتفاظ)
AuNP 20 nm 1 17.368 11.468 11.56 1.02 0.12
2 17.409 11.509
3 17.589 11.689
AuNP 40 نانومتر 1 25.316 19.416 19.49 0.68 0.13
2 25.32 19.42
3 25.548 19.648
AuNP 80 nm 1 42.095 36.195 36.29 0.23 0.08
2 42.219 36.319
3 42.257 36.357
AuNP 100 nm 1 50.975 45.075 45.06 0.07 0.03
2 50.924 45.024
3 50.986 45.086

الجدول 5: أوقات الاحتفاظ بمعايير المعايرة AUNP عند أقصى درجة قصوى للأشعة فوق البنفسجية-Vis المستمدة من صور FRA4-UV-vis ذات الصلة باستخدام الطريقة الموضحة في الجدول 3.

Aliquote تشغيل مدة الاستبقاء القصوى القصوى (دقيقة) متوسط وقت الاحتفاظ في الذروة القصوى (دقيقة) صافي وقت الاحتفاظ في ذروة الحد الأقصى (دقيقة) SD (٪) وقت الاستبقاء نصف قطر هيدرودينامي (نانومتر) التعافي (٪)
1 1 32.689 32.70 26.789 0.07 29.03 85.34
2 32.687 26.787
3 32.719 26.819
2 1 32.989 33.08 27.089 0.37 29.49 81.73
2 33.073 27.173
3 33.187 27.287
3 1 33.053 33.14 27.153 0.49 29.56 82.14
2 33.071 27.171
3 33.291 27.391

الجدول 6: ملخص أوقات الاحتفاظ في أقصى ذروة الأشعة فوق البنفسجية فيس المعنية، ونصف قطر الهيدروديناميكية المحسوبة من معايرة الحجم الخارجي (الشكل 2)ومعدل الاسترداد من العينة غير معروف AuNP التي تم الحصول عليها من AF4-UV-vis التحليل.

Discussion

تم تقييم حجم هيدرودينامي من غير معروف AuNP بدقة AF4 جنبا إلى جنب مع كاشف للأشعة فوق البنفسجية باستخدام معايير حجم AUNP محددة جيدا تتراوح بين 20 نانومتر إلى 100 نانومتر. تم تحسين طريقة AF4 المتقدمة باستخدام ملف تعريف التدفق المتقاطع الثابت من أجل تأسيس علاقة خطية بين وقت الاحتفاظ المقاس وحجم AuNP ، مما يسمح بتحديد حجم مباشر من تحليل الانحدار الخطي. وكان التركيز بشكل خاص أيضاً على تحقيق معدلات استرداد عالية بما فيه الكفاية تشير إلى عدم وجود فقدان كبير للعينات أثناء الكسر، وأن طريقة AF4 المطورة، بما في ذلك الغشاء المُطبَّق والغشاء متطابقان بشكل جيد مع جميع عينات AuNP المجزّأة.

ويمكن القول إن تطوير الأسلوب هو الخطوة الأكثر أهمية في AF4 والعديد من المعلمات، بما في ذلك أبعاد القناة، والمعلمات تدفق فضلا عن الرمز، والغشاء، وارتفاع المسافة، وحتى خصائص العينة يجب أن تؤخذ في الاعتبار من أجل تحسين تجزئة داخل إطار زمني elution معين. الغرض من هذه الفقرة هو توجيه القارئ من خلال الخطوات الهامة التي تم تحسينها بنجاح لتحديد حجم العينة أوينب غير معروف مناقشتها هنا. للحصول على وصف أكثر تفصيلا لكيفية وضع طريقة AF4 بشكل عام ، يتم الرجوع إلى القارئ إلى قسم AF4 من 'ISO/TS21362:2018 - تكنولوجيا النانو - تحليل الأجسام النانوية باستخدام التدفق غير المتماثل وتجزئة تدفق الحقل الطرد المركزي '25. بعد إلقاء نظرة فاحصة على ظروف الكسر المطبقة الواردة في الجدول 3، فإن الخطوة الحرجة الأولى هي مقدمة واسترخاء عينة AuNP في قناة AF4. وتحكم هذه الخطوة تدفق الحقن، وتدفق التركيز، وتدفق عبر، الذي التفاعل يجبر العينة لتحديد موقع قريب من سطح الغشاء وتركيزه في نطاق ضيق بالقرب من منفذ الحقن من قناة AF4 تحديد أساسا نقطة انطلاق الكسر. الاسترخاء الكافي للعينة إلزامي كما هو الحال خلال هذه الخطوة، عينة المكونات من مختلف الأحجام تحديد موقع في ارتفاعات مختلفة من قناة AF4 مما يوفر الأساس لتجزئة حجم ناجحة. الاسترخاء العينة غير مكتملة عادة ما تكون مرئية من خلال منطقة الذروة الزائدة الفراغ الناتجة عن غير المهينة (أي، غير استرخاء) مكونات العينة. ويمكن تخفيف هذا التأثير عن طريق زيادة وقت الحقن و / أو معدل التدفق عبر تطبيقها. ومع ذلك، كل من المعلمات تحتاج إلى التحسين الدقيق، وخاصة بالنسبة للعينات التي هي عرضة للتكتل والامتصاص على غشاء AF4، ويمكن رصدها من قبل معدلات الاسترداد الخاصة بها للحصول على إعدادات المعلمة المختلفة36،37. وقت الحقن المطبقة من 5 دقائق جنبا إلى جنب مع معدل تدفق عبر 1.0 مل •min-1 كشفت معدلات الاسترداد > 80٪ لجميع العينات AuNP ومنطقة الذروة الفراغ لا يذكر مما يدل على ظروف الاسترخاء شبه الأمثل. وبعد الاسترخاء الكافي لعينة AUNP، توقف تدفق التركيز وبدأ نقل العينة على طول قناة AF4 إلى كاشف الأشعة فوق البنفسجية ذات الصلة، مما يمثل الخطوة الحاسمة الثانية. من أجل ضمان قوة تجزئة عالية بما فيه الكفاية في أوقات التحليلات المعقولة، تم تطبيق معدل تدفق ثابت عبر 1.0 مل •min-1 لمدة 30-50 دقيقة (اعتمادا على معيار حجم AuNP المجزّء) متبوعاً بتحلل تدفق خطي 10 دقائق بمعدل تدفق كاشف قدره 0.5 مل-مين-1. باستخدام ثابت عبر ملف تعريف التدفق عبر فصل جميع معايير حجم AuNP كشفت عن علاقة خطية بين وقت الاحتفاظ وحجم AuNP بعد FFF نظرية22، وبالتالي تمكين تحديد حجم العينة غير معروف أوب بواسطة تحليل الانحدار الخطي بسيطة. ومع ذلك ، فقد تم استغلال ملامح أخرى غير تدفق عبر ثابت لتحجيم الجسيمات النانوية ، مما أدى في نهاية المطاف إلى علاقة غير خطية بين وقت الاحتفاظ وحجم الجسيمات38،39. وبالإضافة إلى ذلك، وتحديد حجم في AF4 باستخدام معايير حجم محددة جيدا لا يقتصر على AuNP، ولكن يمكن أيضا أن تطبق على الجسيمات النانوية مع أحجام أخرى وتكوين عنصري (على سبيل المثال، الفضة38،40 أو الجسيمات النانوية السيليكا41،42). بالإضافة إلى ذلك، عند العمل مع عينات مخففة، ICP-MS هو كاشف عنصر حساس للغاية، والتي يمكن أن يقترن AF4، إضافة إلى براعة هذا النهج التحليلي لتحجيم مجموعة كبيرة ومتنوعة من الجسيمات النانوية في التعليق.

على الرغم من تطبيقه على نطاق واسع ، معايرة الحجم الخارجي باستخدام معايير حجم محددة جيدا في AF4 لديه بعض الخصائص التي تحتاج إلى النظر عند استخدامه لتحجيم دقيق للعينات غير معروف. أولا وقبل كل شيء ، فإنه يعتمد اعتمادا كبيرا على تطبيق شروط مماثلة خلال تجزئة كل من حجم المعايير والعينة الفعلية. في الحالة المعروضة هنا، ولذلك فمن الإلزامي أن كل من معايير حجم AuNP وكذلك عينة غير معروفة AuNP يتم تجزئة باستخدام نفس طريقة AF4 فضلا عن نفس eluent والغشاء نفسه مما يجعل هذا النهج غير مرن تماما. وعلاوة على ذلك، فإن عدم وجود أجهزة كشف حساسة للحجم، مثل تشتت الضوء (قانون المخالفات والـ DLS) في متناول اليد، من الصعب تحديد ما إذا كانت طريقة AF4 ذات الصلة باستخدام معايير الحجم تعمل بشكل جيد بما فيه الكفاية أم لا. هذا ينطبق بشكل خاص على العينات غير المعروفة التي تظهر توزيعات حجم واسع جدا، حيث لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت جميع مكونات العينة تتبع نمط elution العادي: تجزئة من أصغر إلى جزيئات أكبر، أو ما إذا كانت أكبر مكونات عينة مائل بالفعل في وضع steric-hyperlayer وبالتالي يحتمل أن تشارك في الرتق مع أصغر مكونات عينة43،44. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من FFF-theory يؤكد أن AF4 يفصل فقط على أساس الاختلافات في حجم هيدرودينامي مع الجسيمات التي تعتبر كتل نقطة دون أي تفاعلات مع بيئتها22، الواقع يحكي قصة مختلفة مع الجسيمات الجسيمات والتفاعلات الجسيمات والغشاء الجسيمي (مثل الجذب الكهربائي / التنافر أو فان دير والز الجذب) قد تلعب دورا كبيرا ، ويمكن أن يدخل تحيزا قابلا للقياس في تحديد حجم عن طريق حجم خارجي معايرة45،46. ولذلك فمن المستحسن لاستخدام معايير الحجم التي تتطابق بشكل مثالي مع التكوين والخصائص السطحية (زيتا المحتملة) من الجسيمات من الفائدة40،42 أو ، إذا لم تكن هذه متوفرة، على الأقل استخدام معايير حجم الجسيمات ذات المواصفات (على سبيل المثال، جزيئات اللاتكس البوليسترين) وتقييم بعناية مقارنة مع الجسيمات ذات الاهتمام خاصة من حيث إمكاناتها زيتا سطحها في البيئة المعنية، والتي يجب إجراء التحليل بها41،47.

وغالبا ما يعتبر براعة AF4 قوتها الأكبر، كما أنه يقدم مجموعة التطبيقات التي تتجاوز معظم تقنيات التحجيم المشتركة الأخرى في هذا المجال22،48،49. وفي الوقت نفسه، ونظراً لتعقّدها المفترض، يمكن اعتباره أيضاً عيبه الأكثر أهمية، خاصةً ضد تقنيات التحجيم السريعة وسهلة الاستخدام ظاهرياً مثل DLS، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية، أو الجسيمات المفردة ICP-MS. ومع ذلك، عند وضع AF4 في منظور مع هذه التقنيات تحجيم شعبية، يصبح من الواضح أن جميع التقنيات لها إيجابيات وسلبيات، ولكن كل منهم يسهم في فهم أكثر شمولا للطبيعة الفيزيائية الكيميائية للجسيمات النانوية، وبالتالي ينبغي أن تعتبر متكاملة بدلا من المنافسة.

الإجراء التشغيلي القياسي (SOP) المعروض هنا، يسلط الضوء على التطبيق الممتاز لـ AF4-UV-vis مع معايرة الحجم الخارجي لتحجيم عينة أوينب غير معروفة في التعليق وتم تطبيقها في نهاية المطاف كمبدأ توجيهي موصى به لتحليل AF4 لعينة أوينب غير معروفة ضمن مقارنة دولية بينية (ILC) التي أجريت في إطار مشروع أفق 2020 ، ACEnano (ستكون نتيجة هذا القانون موضوع منشور مستقبلي). ولذلك، فإن هذا البروتوكول يضيف إلى الجهود الدولية المشجعة والمستمرة للتحقق من المنهجيات AF4 وتوحيدها25و50و51و52 مما يؤكد على الإمكانات الواعدة لـ AF4 في مجال توصيف الجسيمات النانوية.

Disclosures

جميع مؤلفي هذه المخطوطة هم من موظفي شركة Postnova Analytics GmbH، التي يتم استخدام منتجاتها في هذا البروتوكول.

Acknowledgments

ويود المؤلفان أن يشكرا اتحاد ACEnano بأكمله على المناقشات المثمرة التي دارت في جميع مراحل إعداد البروتوكول المعروض هنا. كما يقدر المؤلفان التمويل المقدم من برنامج أفق الاتحاد الأوروبي 2020 (H2020) بموجب اتفاق المنح رقم 720952 في إطار مشروع ACEnano.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 µm Membrane Filters (hydrophilic PVDF) Postnova Analytics GmbH Z-FIL-TEF-002 Used for filtration of aqueous solutions
0.22 µm PVDF Syringe Filter (d = 33 mm) Merck Millipore Durapore Millex Used for filtration of NovaChem100
Adjustable Volume Pipettes (1000 µL) Eppendorf AG Research Plus Used to prepare diluted AuNP suspensions
AF4 cartridge Postnova Analytics GmbH AF2000 MF - AF4 Analytical Channel Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO) Postnova Analytics GmbH Z-AF4-MEM-612-10KD Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Analytical Balance (0.1 mg precision) Sartorius ENTRIS124I-1S Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution
Autosampler Postnova Analytics GmbH PN5300 Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Channel Oven Postnova Analytics GmbH PN4020 Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Crossflow Module Postnova Analytics GmbH AF2000 MF Control Module Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Disposable Pipette Tips (1000 µL) Eppendorf AG ep T.I.P.S Used to prepare diluted AuNP suspensions
Flasks (e.g. 2 liter volume) neoLab 1-0199 Used for eluent storage
Focus Pump Postnova Analytics GmbH PN1131 Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) Postnova Analytics GmbH VIA-002 Used for sample storage
Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) Postnova Analytics GmbH NovaCal Gold 50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function
Magnetic Stirrer IKA VIBRAX-VXR Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW
Personal Computer (PC) Dell Technologies / Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual
Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.) / / In accordance with respective laboratory’s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials
Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) Postnova Analytics GmbH Z-VIA-09150868 Used for sample storage
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), ≥99 %, Blotting Grade Carl Roth GmbH & Co KG 2326.1 Used for the preparation of the cleaning solution
Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, ≥98 %, p.a Carl Roth GmbH & Co KG 6771.1 Used for the preparation of the cleaning solution
Software Package for Control and Data Acquisition Postnova Analytics GmbH NovaFFF AF2000 Software Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual
Software Package for Data Evaluation Postnova Analytics GmbH NovaAnalysis Software Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual
Software Package for final Data Processing OriginLab Corporation Origin 2019 Used for final data processing
Solvent Degasser Postnova Analytics GmbH PN7520 Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Solvent Selector Postnova Analytics GmbH PN7310 Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Solvent Organizer Postnova Analytics GmbH PN7140 Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Surfactant Mixture Postnova Analytics GmbH NovaChem100 Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation
Tip Pump Postnova Analytics GmbH PN1130 Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Unknown AuNP sample BBI Solutions EM.GC60 60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function
UV-vis Detector Postnova Analytics GmbH PN3211 UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system
Vacuum Filtration Unit Postnova Analytics GmbH Eluent Filtration System Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions
Vortex IKA Vortex Genie 2 Used for homogenization of diluted AuNP suspensions
Water Purification System Merck Millipore Milli-Q Integral 5 Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 MΩcm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Gold nanoparticles in biology and medicine: recent advances and prospects. Acta Naturae. 3 (2), 34-55 (2011).
  2. Wagner, F. E., et al. Before striking gold in gold-ruby glass. Nature. 407 (6805), 691-692 (2000).
  3. Hunt, L. B. The true story of Purple of Cassius. Gold Bulletin. 9 (4), 134-139 (1976).
  4. Higby, G. J. Gold in medicine. Gold Bulletin. 15 (4), 130-140 (1982).
  5. Faraday, M. X. The Bakerian Lecture. -Experimental relations of gold (and other metals) to light. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 147, 145-181 (1857).
  6. Borries, B. v, Kausche, G. A. Übermikroskopische Bestimmung der Form und Größenverteilung von Goldkolloiden. Kolloid-Zeitschrift. 90 (2), 132-141 (1940).
  7. Turkevich, J., Hillier, J. Electron Microscopy of Colloidal Systems. Analytical Chemistry. 21 (4), 475-485 (1949).
  8. Homberger, M., Simon, U. On the application potential of gold nanoparticles in nanoelectronics and biomedicine. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical, and Engineering Sciences. 368 (1915), 1405-1453 (2010).
  9. Cordeiro, M., Ferreira Carlos, F., Pedrosa, P., Lopez, A., Baptista, P. V. Gold Nanoparticles for Diagnostics: Advances towards Points of Care. Diagnostics. 6 (4), Basel, Switzerland. 43 (2016).
  10. Vines, J. B., Yoon, J. H., Ryu, N. E., Lim, D. J., Park, H. Gold Nanoparticles for Photothermal Cancer Therapy. Frontiers in Chemistry. 7, 167 (2019).
  11. Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery. Therapeutic Delivery. 3 (4), 457-478 (2012).
  12. Safh, B. P., Antosh, M. Effect of size on gold nanoparticles in radiation therapy: Uptake and survival effects. Journal of Nanomedicine. 2 (1), 1013-1020 (2019).
  13. Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of size and concentration of gold nanoparticles from UV-Vis spectra. Analytical Chemistry. 79 (11), 4215-4221 (2007).
  14. Zheng, T., Bott, S., Huo, Q. Techniques for accurate sizing of gold nanoparticles using dynamic light scattering with particular application to chemical and biological sensing based on aggregate formation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (33), 21585-21594 (2016).
  15. Liu, J., Murphy, K. E., MacCuspie, R. I., Winchester, M. R. Capabilities of single particle inductively coupled plasma mass spectrometry for the size measurement of nanoparticles: a case study on gold nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (7), 3405-3414 (2014).
  16. Contado, C., Argazzi, R. Size sorting of citrate reduced gold nanoparticles by sedimentation field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1216 (52), 9088-9098 (2009).
  17. Calzolai, L., Gilliland, D., Garcìa, C. P., Rossi, F. Separation and characterization of gold nanoparticle mixtures by flow-field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1218 (27), 4234-4239 (2011).
  18. Schmidt, B., et al. Quantitative characterization of gold nanoparticles by field-flow fractionation coupled online with light scattering detection and inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (7), 2461-2468 (2011).
  19. Mekprayoon, S., Siripinyanond, A. Performance evaluation of flow field-flow fractionation and electrothermal atomic absorption spectrometry for size characterization of gold nanoparticles. Journal of Chromatography. A. , (2019).
  20. López-Sanz, S., Rodríguez Fariñas, N., Zougagh, M., Rios, A., Rodriguez Martín-Doimeadios, R. C. C. AF4-ICP-MS as a powerful tool for the separation of gold nanorods and nanospheres. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. , Advance Article (2020).
  21. Giddings, C. J. A new separation concept based on a coupling of concentration and flow nonuniformities. Separation Science. 1 (1), 123-125 (1966).
  22. Schimpf, M. E., Caldwell, K., Giddings, J. C. Field-flow fractionation handbook. , Wiley-Interscience. (2000).
  23. Contado, C. Field flow fractionation techniques to explore the "nano-world". Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (10), 2501-2518 (2017).
  24. Wahlund, K. G., Giddings, J. C. Properties of an asymmetrical flow field-flow fractionation channel having one permeable wall. Analytical Chemistry. 59 (9), 1332-1339 (1987).
  25. ISO. ISO /TS 21362:2018 Nanotechnologies - of nano-objects using asymmetrical-flow and centrifugal field-flow fractionation. ISO. , (2018).
  26. Gogos, A., Kaegi, R., Zenobi, R., Bucheli, T. D. Capabilities of asymmetric flow field-flow fractionation coupled to multi-angle light scattering to detect carbon nanotubes in soot and soil. Environmental Science: Nano. 6 (1), 584-594 (2014).
  27. Müller, D., et al. Integration of inverse supercritical fluid extraction and miniaturized asymmetrical flow field-flow fractionation for the rapid analysis of nanoparticles in sunscreens. Analytical Chemistry. 90 (5), 3189-3195 (2018).
  28. Capomaccio, R., et al. Gold nanoparticles increases UV and thermal stability of human serum albumin. Biointerphases. 11 (4), (2016).
  29. Levak, M., et al. Effect of protein corona on silver nanoparticle stabilization and ion release kinetics in artificial seawater. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1259-1266 (2017).
  30. Mehn, D., et al. Larger or more? Nanoparticle characterisation methods for recognition of dimers. RSC Advances. 7 (44), 27747-27754 (2017).
  31. Sogne, V., Meier, F., Klein, T., Contado, C. Investigation of zinc oxide particles in cosmetic products by means of centrifugal and asymmetrical flow field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1515, 196-208 (2017).
  32. Cumberland, S. A., Lead, J. R. Particle size distributions of silver nanoparticles at environmentally relevant conditions. Journal of Chromatography. A. 1216 (52), 9099-9105 (2009).
  33. de Carsalade du pont, V., et al. Asymmetric field flow fractionation applied to the nanoparticles characterization: Study of the parameters governing the retention in the channel. International Congress of Metrology. , (2019).
  34. Loeschner, K., et al. Optimization and evaluation of asymmetric flow field-flow fractionation of silver nanoparticles. Journal of Chromatography. A. 1272, 116-125 (2013).
  35. Mudalige, T. K., Qu, H., Linder, S. W. An improved methodology of asymmetric flow field flow fractionation hyphenated with inductively coupled mass spectrometry for the determination of size distribution of gold nanoparticles in dietary supplements. Journal of Chromatography. A. 1420, 92-97 (2015).
  36. Dubascoux, S., Von Der Kammer, F., Le Hécho, I., Gautier, M. P., Lespes, G. Optimisation of asymmetrical flow field flow fractionation for environmental nanoparticles separation. Journal of Chromatography. A. 1206 (2), 160-165 (2008).
  37. Hagendorfer, H., et al. Application of an asymmetric flow field flow fractionation multi-detector approach for metallic engineered nanoparticle characterization - and limitations demonstrated on Au nanoparticles. Analytica Chimica Acta. 706 (2), 367-378 (2011).
  38. Geiss, O., Cascio, C., Gilliland, D., Franchini, F., Barrero-Moreno, J. Size and mass determination of silver nanoparticles in an aqueous matrix using asymmetric flow field flow fractionation coupled to inductively coupled plasma mass spectrometer and ultraviolet-visible detectors. Journal of Chromatography. A. 1321, 100-108 (2013).
  39. Makselon, J., Siebers, N., Meier, F., Vereecken, H., Klumpp, E. Role of rain intensity and soil colloids in the retention of surfactant-stabilized silver nanoparticles in soil. Environmental Pollution. 238, 1027-1034 (2018).
  40. Bolea, E., Jiménez-Lamana, J., Laborda, F., Castillo, J. R. Size characterization and quantification of silver nanoparticles by asymmetric flow field-flow fractionation coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (9), 2723-2732 (2011).
  41. Barahona, F., et al. Simultaneous determination of size and quantification of silica nanoparticles by asymmetric flow field-flow fractionation coupled to ICPMS using silica nanoparticles standards. Analytical Chemistry. 87 (5), 3039-3047 (2015).
  42. Aureli, F., D'Amato, M., Raggi, A., Cubadda, F. Quantitative characterization of silica nanoparticles by asymmetric flow field flow fractionation coupled with online multiangle light scattering and ICP-MS/MS detection. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30, 1266-1273 (2015).
  43. Myers, M. N., Giddings, J. C. Properties of the transition from normal to steric field-flow fractionation. Analytical Chemistry. 54 (13), 2284-2289 (1982).
  44. Giddings, J. C. Retention (steric) inversion in field-flow fractionation: practical implications in particle size, density and shape analysis. Analyst. 118 (12), 1487-1494 (1993).
  45. Wahlund, K. G. Flow field-flow fractionation: Critical overview. Journal of Chromatography. A. 1287, 97-112 (2013).
  46. Bendixen, N. L., Adlhart, S., Lattuada, C., Ulrich, A. Membrane-particle interactions in an asymmetric flow field flow fractionation channel studied with titanium dioxide nanoparticles. Journal of Chromatography A. 1334, 92-100 (2014).
  47. Qu, H., Quevedo, I. R., Linder, S. W., Fong, A., Mudalige, T. K. Importance of material matching in the calibration of asymmetric flow field-flow fractionation: material specificity and nanoparticle surface coating effects on retention time. Journal of Nanoparticle Research. 18 (10), 292 (2016).
  48. Giddings, J. C. Field-flow fractionation: analysis of macromolecular, colloidal, and particulate materials. Science. 260 (5113), 1456-1465 (1993).
  49. Cascio, C., Gilliland, D., Rossi, F., Calzolai, L., Contado, C. Critical experimental evaluation of key methods to detect, size and quantify nanoparticulate silver. Analytical Chemistry. 86 (24), 12143-12151 (2014).
  50. Caputo, F., et al. Measuring particle size distribution by asymmetric flow field flow fractionation: a powerful method for the pre-clinical characterisation of lipid-based nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 756-767 (2019).
  51. Parot, J., Caputo, F., Mehn, D., Hackley, V. A., Calzolai, L. Physical characterization of liposomal drug formulations using multi-detector asymmetrical-flow field flow fractionation. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 320, 495-510 (2020).
  52. ASTM. ASTM WK68060 - New Test Method for Analysis of Liposomal Drug Formulations using Multidetector Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation (AF4). ASTM. , (2019).

Tags

الهندسة الحيوية، الإصدار 163، تجزئة تدفق تدفق غير متماثل، AF4، الكشف بالأشعة فوق البنفسجية فيس، الجسيمات النانوية الذهبية، حجم الجسيمات، معايرة الحجم الخارجي، إجراء التشغيل القياسي
تجزئة تدفق غير متماثل لتحجيم الجسيمات النانوية الذهبية في التعليق
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Drexel, R., Sogne, V., Dinkel, M.,… More

Drexel, R., Sogne, V., Dinkel, M., Meier, F., Klein, T. Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension. J. Vis. Exp. (163), e61757, doi:10.3791/61757 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter