Summary
Denne protokollen beskriver bruken av asymmetrisk Flow Field-Flow Fractionation kombinert med UV-vis-deteksjon for bestemmelse av størrelsen på en ukjent gull nanopartikkel prøve.
Abstract
Partikkelstørrelse er uten tvil den viktigste fysikalisk-kjemiske parameteren forbundet med begrepet en nanopartikkel. Nøyaktig kunnskap om størrelse og størrelsesfordeling av nanopartikler er av største betydning for ulike applikasjoner. Størrelsesområdet er også viktig, da det definerer den mest "aktive" komponenten i en nanopartikkeldose.
Asymmetrisk Flow Field-Flow Fractionation (AF4) er en kraftig teknikk for størrelse på partikler i suspensjon i størrelsesområdet på ca. 1–1000 nm. Det er flere måter å utlede størrelsesinformasjon fra et AF4-eksperiment på. I tillegg til å koble AF4 online med størrelsesfølsomme detektorer basert på prinsippene for multivinklet lysspisering eller dynamisk lysspuping, er det også mulighet til å korrelere størrelsen på en prøve med oppbevaringstiden ved hjelp av en veletablert teoretisk tilnærming (FFF-teori) eller ved å sammenligne den med oppbevaringstidene til veldefinerte partikkelstørrelsesstandarder (ekstern størrelseskalibrering).
Vi beskriver her utviklingen og in-house validering av en standard driftsprosedyre (SOP) for størrelse av en ukjent gull nanopartikkel prøve av AF4 kombinert med UV-vis deteksjon ved hjelp av ekstern størrelse kalibrering med gull nanopartikkel standarder i størrelsesområdet på 20-100 nm. Denne prosedyren gir en detaljert beskrivelse av den utviklede arbeidsflyten, inkludert prøveklargjøring, AF4 instrumentoppsett og kvalifisering, AF4-metodeutvikling og fraksjonering av den ukjente gullnanopartikkelprøven, samt korrelasjonen av de oppnådde resultatene med den etablerte eksterne størrelseskalibreringen. SOP beskrevet her ble til slutt vellykket validert i rammen av en interlaboratory sammenligningsstudie som fremhever af4s utmerkede robusthet og pålitelighet for størrelse på nanopartikkelprøver i suspensjon.
Introduction
Gull nanopartikler (AuNP) i form av kolloidalt gull hadde vært en del av menneskelig kultur lenge før det var en forståelse av hva nanopartikler var og før begrepet nanopartikkel hadde funnet veien inn i moderne, vitenskapelig vokabular. Uten tydelig kunnskap om deres nanoskala utseende, suspendert AuNP hadde allerede blitt brukt til medisinske og andre formål i det gamle Kina, Arabia, og India i V-VI århundrerf.Kr. 1,og også de gamle romerne tok fordel av deres rubinrød farge for å berømt flekke deres keramikk i Lycurgus Cup utstillingen i British Museum2. I den vestlige verden, gjennom århundrene fra middelalderen til moderne tid, suspendert AuNP ble hovedsakelig brukt som fargestoffer for glass og emalje (Purple of Cassius)3 samt å behandle en rekke sykdommer (Potable Gold), spesielt syfilis4.
Imidlertid hadde alle disse studiene primært fokusert på anvendelsen av suspendert AuNP, og det var opp til Michael Faraday i 1857 å introdusere den første rasjonelle tilnærmingen til å undersøke dannelsen, deres natur så vel som deresegenskaper 5. Selv om Faraday allerede var klar over at disse AuNP må ha svært små dimensjoner, var det ikke før utviklingen av elektronmikroskopi når eksplisitt informasjon om deres størrelsesfordeling var tilgjengelig6,7, noe som til slutt muliggjør sammenhengen mellom størrelse og andre AuNP-egenskaper.
I dag, takket være deres ganske enkle og enkle syntese, bemerkelsesverdige optiske egenskaper (overflateplasmon resonans), god kjemisk stabilitet og dermed mindre toksisitet samt deres høye allsidighet i form av tilgjengelige størrelser og overflatemodifikasjoner, har AuNP funnet utbredte applikasjoner innen felt som nanoelektronikk8, diagnostikk9,kreftterapi10eller legemiddellevering11. Selvfølgelig, for disse programmene, presis kunnskap om størrelsen og størrelsen fordelingen av anvendt AuNP er en grunnleggende forutsetning for å sikre optimal effekt12, og det er en betydelig etterspørsel etter robuste og pålitelige verktøy for å bestemme denne avgjørende fysikalsk-kjemiske parameteren. I dag er det en mengde analytiske teknikker som er i stand til å skalere AuNP i suspensjon, inkludert, UV-vis spektroskopi (UV-vis)13, Dynamisk lysspøning (DLS)14 eller enkeltpartikkel induktivt koplet plasmamassespektrometri (spICP-MS)15 med Field-Flow Fractionation (FFF) som en nøkkelspiller i dettefeltet 16,17,18,19,20.
Først konseptualisert i 1966 av J. Calvin Giddings21,FFF består av en familie av elution-baserte fraksjonering teknikker, hvor separasjon foregår i en tynn, bånd-lignende kanal uten en stasjonær fase22,23. I FFF induseres separasjon av samspillet mellom en prøve med et eksternt kraftfelt som virker vinkelrett på retningen til en laminær kanalstrøm, der prøven transporteres nedstrøms vanligvis mot respektive in-line detektorer. Blant disse relaterte FFF-teknikkene har Asymmetrisk Flow Field-Flow Fractionation (AF4), der en annen flyt (kryssflyt) fungerer som kraftfeltet, blitt den mest brukte undertypen24. I AF4 er kanalbunnen (akkumuleringsveggen) utstyrt med en halvgjennomtrengelig ultrafiltreringsmembran som er i stand til å beholde prøven samtidig som kryssstrømmen kan passere gjennom membranen og forlate kanalen via et ekstra uttak. På denne måten kan kryssstrømmen presse prøven mot akkumuleringsveggen og dermed motvirke diffusjonsindusert fluks (Brownian bevegelse). I en resulterende likevekt av felt- og diffusjonsinduserte flukser; mindre prøvebestanddeler som viser høyere diffusjonskoeffisienter, justerer seg nærmere kanalsenteret, mens større prøvebestanddeler som viser lavere diffusjonskoeffisienter, finner nærmere akkumuleringsveggen. På grunn av den parabolske strømningsprofilen inne i kanalen transporteres derfor mindre prøvebestanddeler i den raskere laminae av kanalstrømmen og elute før større prøvebestanddeler. Ved hjelp av FFF-retensjonsparameter og Stokes-Einstein diffusjonskoeffisientligninger, elution tid og, henholdsvis elution volum, av en prøve i AF4 kan deretter oversettes direkte til sin hydrodynamiskestørrelse 22. Her refererer den beskrevne elution-virkemåten til normal elution-modus og er vanligvis gyldig for AF4 innenfor et partikkelstørrelsesområde mellom ca. 1–500 nm (noen ganger opptil 2000 nm avhengig av partikkelegenskaper og fraksjoneringsparametere), mens sterisk-hyperlayer elution vanligvis forekommer over denne størrelsenterskel 25.
Det er tre vanlige måter å utlede størrelsesinformasjon etter separasjon av FFF. Siden FFF er et modulært instrument, kan det kombineres nedstrøms med flere detektorer som størrelsesfølsomme lyssplagende detektorer basert på prinsippet om multivinklet lyssptrøing (MALS)26,27, Dynamisk lyssptrøing (DLS)28,29eller til og med en kombinasjon av begge for å få ytterligereforminformasjon 30,31. Men siden oppbevaringsatferden til en prøve i en FFF-kanal generelt styres av veldefinerte fysiske krefter, kan størrelsen også beregnes ved hjelp av en matematisk tilnærming (FFF-teori), hvor en enkel konsentrasjonsdetektor (f.eks. en UV-vis detektor) er tilstrekkelig til å indikere tilstedeværelsen av en eluting prøve32,33.
Som et tredje alternativ rapporterer vi her anvendelsen av en ekstern størrelseskalibrering34,35 ved hjelp av veldefinerte AuNP-standarder i størrelsesområdet 20-100 nm for størrelse på en ukjent gullnanopartikkelprøve i suspensjon ved hjelp av AF4 kombinert med UV-vis-deteksjon. Dette enkle eksperimentelle oppsettet ble valgt med vilje for å tillate så mange laboratorier som mulig å bli med i en internasjonal interlaboratorisk sammenligning (ILC), som senere ble utført i rammen av Eu Horizon 2020-prosjektet ACEnano basert på protokollen som presenteres her.
Protocol
1. OPPSETT AV AF4-systemet
- Monter AF4-kassetten og koble til alle maskinvarekomponentene i AF4-systemet og UV-vis-detektoren (Materials tabell) i følge instruksjonene i produsentens håndbok.
- Installer alle nødvendige programvarepakker for kontroll, datainnsamling, behandling og evaluering ved å følge instruksjonene i produsentens håndbok.
- Kontroller at alle nødvendige signaltilkoblinger mellom AF4-systemet og UV-vis-detektoren er opprettet.
- Kontroller at de etablerte AF4-UV-vis-tilkoblingene er tette og uten lekkasjer ved å skylle oppsettet med ultrarent vann (UPW) i 15 min (tuppstrømningshastighet 1 ml∙min-1,fokusstrømningshastighet 1 ml∙min-1og kryssstrømningshastighet 1,5 ml∙min-1). Dette gjør du ved å åpne AF4-kontrollprogramvaren og angi strømningshastighetene i de respektive panelene på høyre overside på landingssiden. Stram de respektive kontaktene (beslag), om nødvendig, og gjenta prosedyren til ingen lekkasjer er observerbare.
MERK: Det interne systemtrykket under alle målinger bør overvåkes og må være innenfor 4 til 12 bar. Hvis trykket er høyere eller lavere, må ryggtrykksslangen justeres. Videre bør kanaltrykktrenden være konstant over hele måletiden.
MERK: Hvis en kanalovn er tilgjengelig, setter du temperaturen til 25 °C for å sikre sammenlignbare måleforhold gjennom alle AF4-eksperimenter.
2. Utarbeidelse av løsninger og suspensjoner for AF4-UV-vis systemkvalifisering og prøveanalyse
- Rengjøring løsning
- Tilsett 8 g natriumhydroksid (NaOH) og 2 g natriumdylsulfat (SDS) til 1 L UPW og rør oppløsningen til total oppløsning.
- Eluent Leilighet
- Tilsett 500 μL filtrert overflateaktivt middelblanding til 2 L filtrert og avgasset UPW for å oppnå eluent (0,025 % (v/v), pH rundt 9,4).
MERK: En detaljert beskrivelse av forbindelsene til overflateaktive blandinger er gitt i tabell 1 (også Materialtabell).
- Tilsett 500 μL filtrert overflateaktivt middelblanding til 2 L filtrert og avgasset UPW for å oppnå eluent (0,025 % (v/v), pH rundt 9,4).
- Vilkårlig AuNP-størrelsesstandard for bestemmelse om massegjenoppretting
- Vortex en vilkårlig AuNP størrelse standard (50 mg ∙ L-1) i 2 min og fortynne den 1:4 med UPW for å oppnå en endelig massekonsentrasjon på 12,5 mg ∙ L-1. Vortex i ytterligere 2 min etter fortynning for å homogenisere den oppnådde suspensjonen.
FORSIKTIG: Nødvendige forholdsregler og egnet verneutstyr er nødvendig ved arbeid med kjemikalier, spesielt NaOH pellets.
MERK: Det anbefales generelt å avgasse og filtrere alle nødvendige løsninger (unntatt rengjøringsløsningen) ved hjelp av et 0,1 μm membranfilter (hydrofil PVDF eller lignende) for å sikre lav partikkelbakgrunn under AF4-UV-vis-eksperimenter. Dette kan etableres enten ved en dedikert vakuumfiltreringsenhet eller ved hjelp av sprøytefiltre.
- Vortex en vilkårlig AuNP størrelse standard (50 mg ∙ L-1) i 2 min og fortynne den 1:4 med UPW for å oppnå en endelig massekonsentrasjon på 12,5 mg ∙ L-1. Vortex i ytterligere 2 min etter fortynning for å homogenisere den oppnådde suspensjonen.
3. AF4-UV-vis systemkvalifisering
- Bruk programvareinnstillingene som er beskrevet i trinn 1.4 til å skylle systemet med rengjøringsløsningen i 30 min (Tipsstrømningshastighet 1 ml∙min-1,Fokusstrømningshastighet 1 ml∙min-1og Kryssstrømningshastighet 1,5 ml∙min-1).
- Endre den respektive eluent flasken og skyll systemet med UPW i 20 min (Tips strømningshastighet 1 ml∙min-1,Fokus strømningshastighet 1 ml∙min-1,og Cross strømningshastighet 1,5 ml∙min-1).
- Skift ut de respektive innebygde pumpefiltrene.
- Åpne AF4-kassetten og sett AF4-membranen tilbake. Monter AF4-kassetten igjen og koble den til AF4-UV-vis-systemet igjen.
- Skyll det rengjorte AF4-UV-vis-systemet med eluent i minst 30 min for å likevekte membranen og stabilisere systemet (Tuppstrømningshastighet 1 ml∙min-1, Fokusstrømningshastighet 1 ml∙min-1og Kryssstrømningshastighet 1,5 ml∙min-1). Se etter potensielle lekkasjer igjen (se trinn 1.4).
- Kvalifiser AF4-UV-vis-systemet ved å bestemme massegjenoppretting og variasjon av oppbevaringstid ved hjelp av en vilkårlig AuNP-størrelsesstandard.
- Utfør en direkte injeksjonskjøring uten påføring av en separasjonskraft.
- Opprette en ny målefil ved å åpne | Ny | Kjør i AF4-kontrollprogramvaren.
- Definer eksempel- og målebeskrivelsen samt injeksjonsvolum og eksempelnavn i kategorien Kjør. Målebetingelsene vises i tabell 2.
- Angi måleparameterne i den andre FFF-metoden i henhold til tabell 2.
- Klikk på Kjør-knappen for å starte målingen.
- Utfør en brøkkjøring med påføring av en separasjonskraft (kryssflyt).
- Definer brøkningsmetoden som beskrevet i forrige del ved hjelp av brøkningsbetingelsene som er angitt i tabell 3.
- Klikk på Kjør-knappen for å starte målingen.
- Utfør målingen i quadruplicate.
MERK: Den første kjøringen tar sikte på å kondisjonere systemet (det vil si AF4-membranen) og vil bli utelukket fra den endelige evalueringen av systemkvalifiseringsresultatene.
MERK: Det anbefales å lagre alle genererte kjørefiler ved å åpne File | Lagre i AF4-kontrollprogramvaren. - Vurder AF4-UV-vis-systemet som er kvalifisert hvis en massegjenoppretting på > 80 % og en variasjon av oppbevaringstid <2 % oppnås for den vilkårlige AuNP-størrelsesstandarden.
- Når du bruker en autosampler som injeksjonssystem, fyller du autosamplerens nålevaskebeholderflaske med samme løsning som pumpes gjennom AF4-UV-vis-systemet (f.eks. rengjøringsløsning, UPW eller respektive eluent) for å sikre optimale kjøreforhold. Når du endrer eluent, anbefales det vanligvis å følge re-likevekt av AF4-systemet ved å overvåke UV-vis-detektorsignalet til grunnlinjen forblir stabil på et konstant nivå.
- Utfør en direkte injeksjonskjøring uten påføring av en separasjonskraft.
4. AF4-UV-vis prøveanalyse
- Forbered alle AuNP-størrelsesstandarder for kalibrering av ekstern størrelse ved å virvle den respektive AuNP-fjæringen (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm, hver 50 mg. L-1) i 2 min og fortynne den 1:4 med UPW for å oppnå en endelig massekonsentrasjon på 12,5 mg∙L-1. Vortex i ytterligere 2 min etter fortynning for å homogenisere de oppnådde suspensjonene.
- Klargjør det ukjente AuNP-utvalget for analyse ved bruk av samme prosedyre som for kalibreringsstandardene som er beskrevet i trinn 4.1.
- Utfør en direkte injeksjonsmåling av alle AuNP-størrelsesstandarder ved hjelp av AF4-metoden som vises i tabell 2.
- Hvis du vil gjøre dette, skriver du inn de respektive verdiene som er oppsummert i tabell 2 i produsentens programvare på de riktige posisjonene for å definere separasjons- og eksempelparameterne og trykke på Kjør-knappen for å starte eksperimentet.
- Brøk hver AuNP-størrelsesstandard individuelt ved hjelp av AF4-metoden som vises i tabell 3 for å opprette funksjonen for ekstern størrelseskalibrering.
- Angi de respektive verdiene som er oppsummert i tabell 3, i produsentens programvare på de aktuelle posisjonene. Fraksjoneringsmetoden defineres av et fokustrinn, flere elitningstrinn og et skylletrinn. Når du har konfigurert metoden, trykker du på Kjør-knappen for å starte eksperimentet.
- Utfør en direkte injeksjonsmåling av den ukjente AuNP-prøven ved hjelp av AF4-metoden som vises i tabell 2.
- Utfør fraksjonen av det ukjente AuNP-utvalget ved å utføre AF4-metoden som er oppført i tabell 3.
- Utfør alle målinger nevnt i avsnitt 3 og 4 i triplicate med mindre annet er oppgitt for å sikre meningsfulle og statistisk relevante resultater.
- Oppbevar 50 mg∙L-1 AuNP lagersuspensjon ved 4–8 °C før bruk. Fortynnede AuNP-suspensjoner tilberedes ideelt innen 30 min før påføring.
MERK: Vortexing er vanligvis tilstrekkelig og ingen ultralydbehandling av suspensjonene er nødvendig. - For å muliggjøre en korrelasjon av oppbevaringstiden til det ukjente AuNP-utvalget med oppbevaringstidene som er oppnådd for AuNP-størrelsesstandardene, måler du alle eksemplene ved hjelp av samme AF4-metode.
MERK: For å sikre konstante og gyldige separasjonsforhold må du ta med/gjenta fraksjonstrinnet som er beskrevet i systemkvalifiseringsdelen (se trinn 3.6.2) etter et definert antall prøvemålinger (f.eks. 10 målinger). I tillegg registrerer du systemtrykk og UV-vis detektor baseline stabilitet. De bør forbli stabile og konstante langs en komplett AF4-UV-vis løp.
MERK: Bytt vanligvis ultrafiltreringsmembranen når UV-vis-detektoren (eller MULTI Angle Light Scattering(MALS)-detektoren, hvis tilgjengelig) viser et økt støynivå eller de definerte systemkvalifiseringskriteriene som gjenoppretting, prøvetoppform eller repeterbarhet er savnet (eller AF4-UV-vis-systemet ble utsatt for en grundig rengjøringsprosedyre). Under forholdene som er beskrevet her, er det kvalifiserte AF4-UV-vis-systemet vanligvis stabilt for minst 50 målinger ved hjelp av samme membran; Antall mulige påfølgende målinger som oppfyller de definerte kvalitetskriteriene, kan imidlertid variere betydelig avhengig av prøvematrise og eluent sammensetning.
- Oppbevar 50 mg∙L-1 AuNP lagersuspensjon ved 4–8 °C før bruk. Fortynnede AuNP-suspensjoner tilberedes ideelt innen 30 min før påføring.
5. Dataevaluering
- Utfør massegjenopprettingsberegningen ved hjelp av enten dataevalueringsprogramvare levert av AF4-UV-vis-systemprodusenten eller regnearkanalysen etter eksport av alle nødvendige rådata (det vil at UV-vis-toppområdet) fra den respektive datainnsamlingsprogramvaren følger instruksjonene i produsentens håndbok.
- Beregn AuNP-masseutvinningen ved å sammenligne områdene under de respektive UV-vis-toppene av fraksjoneringsmålingen(A-fraksjonering)og direkte injeksjonsmåling (Endirekte injeksjon) ved hjelp av følgende ligning:
MERK: Under en direkte injeksjonsmåling påføres ingen separasjonskraft, og derfor kan potensielle interaksjoner mellom en analyseart med akkumuleringsveggen bli neglisjert. Området under en respektive UV-vis topp kan være direkte korrelert til AuNP-massen ved hjelp av Øl-Lambert-loven forutsatt at ingen andre arter i prøven absorberer ved den respektive bølgelengden og / eller i) elutes på et annet oppbevaringstid under fraksjoneringsforhold ii) fjernes gjennom AF4-membranen. - Importer dat.-filene som er hentet fra både direkte injeksjon og fraksjoneringskjøring.
- Velg UV-vis-detektorsporingen i kategorien Oversikt.
- Definer en interesseområde (ROI) og en opprinnelig plan i signal- og grunnlinjevisningen for alle målinger.
- Sett inn en direkte injeksjonskalibrering via sett inn.
- Velg alle direkte injeksjonskjøringer i visningen Innstillinger for direkte injeksjonskalibrering og angi en UV-utryddelseskoeffisient.
MERK: Det er viktig å bruke samme UV-vis utryddelseskoeffisient for både kalibreringen og fraksjoneringsmålingen. - Opprett kalibreringslinjen ved hjelp av området under UV-vis-signalsporingen innenfor avkastningen og den injiserte mengden beregnet ut fra den angitte konsentrasjonen og injeksjonsvolumet. Den oppnådde kalibreringen vises i det separate vinduet funksjonsfunksjon for direkte injeksjonskalibrering.
- Tilordne kalibreringsfunksjonen til de respektive brøkningsmålingene.
MERK: For hver kalibreringsstørrelsesstandard og den ukjente AuNP-prøven må det opprettes en separat kalibreringsfunksjon på grunn av størrelsesavhengig UV-vis absorbans av AuNP. Denne ulempen med UV-vis detektoren kan omgås ved hjelp av en massesensitiv detektor som en ICP-MS. - Utfør analysene ved å sette inn en beregning av kvantitative resultater, og resultatene vises i en tabell til høyre som konsentrasjons- og injiserte mengdeverdier.
- Beregn AuNP-masseutvinningen ved å sammenligne områdene under de respektive UV-vis-toppene av fraksjoneringsmålingen(A-fraksjonering)og direkte injeksjonsmåling (Endirekte injeksjon) ved hjelp av følgende ligning:
- Beregn variasjonen av oppbevaringstid ved hjelp av enten dataevalueringsprogramvare levert av AF4-systemprodusenten eller regnearkanalysen etter eksport av alle nødvendige rådata (det vil at oppbevaringstidene til AuNP-kalibreringsstandardene er tilgjengelige på de respektive UV-vis peak maxima og respektive tomromstider) fra den respektive datainnsamlingsprogramvaren etter instruksjonene i produsentens håndbok.
- Åpne Oversikt-vinduet for å vise de respektive UV-sporene for alle importerte målinger.
- Toppdeteksjonen vil bli utført automatisk; justere toppdeteksjonsparametrene i verktøykassen for signalbehandling for å optimalisere ytelsen. Pakk ut den respektive topp maxima ved å gå gjennom alle målefiler.
- Beregn det relative standardavviket for alle målinger ved hjelp av følgende formel:
Beregningen kan også utføres ved hjelp av en respektive regnearkprogramvare.
- Utfør størrelsesbestemmelse ved hjelp av enten dataevalueringsprogramvare levert av produsenten eller regnearkanalysen etter eksport av alle nødvendige rådata (oppbevaringstid på UV-vis maksimal analyse og respektive tomtid) fra den respektive datainnsamlingsprogramvaren etter instruksjonene i produsentens håndbok. En ekstern størrelseskalibreringsfunksjon kan opprettes ved å plotte annulleringstid korrigert oppbevaringstider (netto oppbevaringstider, se tabell 5) av AuNP-størrelsesstandardene (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) mot deres hydrodynamiske størrelser hentet fra tidligere utførte DLS-målinger (se tabell 4).
MERK: DLS-målingene bør utføres ideelt sett samme dag som de respektive brøkningsmålingsmålingene for å sikre sammenlignbare utvalgsegenskaper.- Når du har .dat filene, vises alle mål i kategorien Oversikt. Velg UV-vis-detektorsignalet fra detektorlisten, som vises under overleggsvinduet. Definer en avkastning og opprinnelig plan for hver måling, som kan justeres i signal- og opprinnelig plan-visningen. Bruk verktøykassen for signalbehandling til høyre for å jevne ut støyende signaler. Bruk funksjonen Tilordne behandlingsparametere til andre kjøringer til å tillate at parameterne kan tildeles henholdsvis andre målinger.
- Velg kalibreringen for partikkelstørrelse fra sett inn-fanen.
- Velg alle kalibreringsløp ved å klikke på den respektive målingen i tabellen Velg referanser for kalibrering øverst til høyre. Alle valgte målinger vises i en tabell nedenfor. Angi den hydrodynamiske radiusen for alle kalibreringsmålinger som er angitt i tabell 4. Funksjonen vises i kalibreringen av partikkelstørrelse – Funksjonsvindu og ligningen vises også.
MERK: Korrelasjonskoeffisienten (R2) for den etablerte størrelseskalibreringsfunksjonen må være ≥ 0,990. - Tilordne kalibreringsfunksjonen til målene for det ukjente AuNP-utvalget ved å velge de respektive fraksjonene i listen Velg kjøringer for tildeling.
- Vis resultatene ved å åpne en beregning av partikkelstørrelsesfordeling i kategorien sett inn. Den tidligere opprettede kalibreringen av partikkelstørrelse vil bli oppført som kalibreringen for de ukjente AuNP-prøvemålingene, som vises i innstillingene for høyre vindu. Den beregnede størrelsen vises i størrelsesdistribusjonsvinduet merket til maksimumstoppen. Merk av for Gjennomsnittlige signaler for eksempel for å gjennomsnittlig alle målinger av ett utvalg, og oppgi resultatet i maksimal toppetikett.
- I tillegg plotter du kalibreringslinjen over fraktogrammet ved å merke av for Vis kalibreringskurve . En kumulativ størrelsesfordeling er tilgjengelig ved å merke av for Vis kumulativ distribusjon.
MERK: Når du bruker produsentens programvare for dataevaluering, anbefales det å legge til alle resultatene i en rapport, som kan genereres ved å klikke på Rapporter i kategorien Sett inn. Rapport-knappen legger til alle resultater, tabeller og diagrammer i et dokument. Under rapportfanen kan rapportinnstillingene endres ved å åpne Rapportoppsett i Dokument-delen.
Representative Results
For det første ble AuNP-størrelsesstandardene fraksjonert av AF4 og oppdaget ved UV-vis som målte absorbansen til AuNP ved en bølgelengde på 532 nm (overflateplasmonresonans av AuNP). Et overlegg av de oppnådde fractograms er presentert i figur 1. Oppbevaringstidene for hver AuNP på sin respektive UV-vis topp maksimum hentet fra triplicate målinger er oppført i tabell 5. Det relative standardavviket for alle oppbevaringstider var under 1,1 % med en avtagende måleavvik med økende størrelse. Samlet sett ble en utmerket repeterbarhet oppnådd. En konstant separasjonskraft ble brukt, noe som resulterte i et lineært forhold mellom elutiontid og hydrodynamisk størrelse. Den eksterne størrelseskalibreringslinjen ble etablert ved å plotte den angitte hydrodynamiske radiusen mot annulleringstiden korrigert elutiontid (netto oppbevaringstid). En lineær regresjonsanalyse resulterte i en lineær kalibreringsfunksjon med en avskjæring a = -3.373 nm ± 1.716 nm og en skråning b = 1.209 nm∙min-1 ± 0.055∙nm∙min-1. Den lineære virkemåten til elutionen ble bekreftet med en kvadrert korrelasjonskoeffisient R2 på 0,9958. Den respektive kalibreringsfunksjonen vises visuelt i figur 2.
Den andre delen behandlet analysen av det ukjente AuNP-utvalget. Tre aliquots av prøven ble utarbeidet i henhold til prosedyren beskrevet i protokolldelen (avsnitt 4.2). Hver av de tre aliquots ble undersøkt i triplicate ved hjelp av samme AF4 fraksjonering metode som også ble brukt for AuNP størrelse standarder. Alle de ni AF4-UV-vis-fraktogrammene som ble oppnådd i den ukjente AuNP-prøven er presentert i figur 3, og deres respektive evalueringer er oppsummert i tabell 6. Det relative standardavviket for de respektive oppbevaringstidene var signifikant lav og varierte mellom 0,1 % og 0,5 %. Ved hjelp av kalibreringsfunksjonen for partikkelstørrelse hentet fra fraksjoneringen av AuNP-størrelsesstandardene og korrelerer den med de oppnådde oppbevaringstidene til den ukjente AuNP-prøven på UV-vis-maksimum, kan en samlet gjennomsnittlig hydrodynamisk radius på 29,4 nm ± 0,2 nm beregnes. Videre ble en rimelig masseutvinning på 83,1% ± 1,2% oppnådd som indikerer ingen signifikant agglomerasjon eller oppløsning av AuNP-prøven eller betydelig adsorpsjon av partikler på membranoverflaten. Figur 4 viser den oppnådde partikkelstørrelsesfordelingen med alle de ni UV-vis-signalsporene som i gjennomsnitt fremhever den utmerkede robustheten til den påførte AF4-metoden.
Figur 1: AF4-UV-vis fractograms hentet fra triplicate analyse av de fire individuelle AuNP størrelse kalibrering standarder med normaliserte signalintensiteter og påført konstant kryssstrømningshastighet (svart linje). Den tomrommet toppen er uthevet i grått på rundt 5,9 min. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oppnådd ekstern størrelseskalibreringsfunksjon, inkludert feilfelt avledet fra de respektive standardavvikene for DLS-målingene (tabell 4) og avvik i de oppnådde AF4-oppbevaringstidene (tabell 5), etter å ha plottet den angitte hydrodynamiske radiusen mot oppbevaringstiden for hver enkelt AuNP-størrelseskalibreringsstandard på sitt respektive maksimumsnivå. En lineær kalibreringsfunksjon med standardfeil i form av y = a + bx med en = -3.373 nm ± 1.716 nm og b = 1.209 nm·min-1 ± 0.055 nm·min-1 ble beregnet fra en lineær regresjonsanalyse. En kvadrert korrelasjonskoeffisient med R2 = 0,9958 ble bestemt, noe som indikerer en lineær relasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: AF4-UV-vis fractograms av triplikate målinger av tre aliquots viser den ukjente AuNP. Den påførte konstante kryssstrømningshastigheten over måletiden illustreres som en svart linje. Tomrommet toppen på rundt 5,9 min er uthevet i grått. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Overlegg av den oppnådde gjennomsnittlige partikkelstørrelsesfordelingen (rød) for den ukjente AuNP-prøven og den påførte lineære kalibreringsfunksjonen (stiplet linje). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Komponent | CAS-Nei | Vekt (%) | |
| Vann | 7732-18-5 | 88.8 | |
| 9-octadecenoic acid (Z)-, sammensatt med 2,2',2''-nitrilotris[etanol](1:1) | 2717-15-9 | 3.8 | |
| Natriumkarbonat | 497-19-8 | 2.7 | |
| Alkoholer, C12-14-sekundær, etosylert | 84133-50-6 | 1.8 | |
| Tetrasodium EDTA | 64-02-8 | 1.4 | |
| Polyetylenglykol | 25322-68-3 | 0.9 | |
| Natrium oleat | 143-19-1 | 0.5 | |
| Natriumbikarbonat | 144-55-8 | 0.1 | |
Tabell 1: Liste over komponentene i overflateaktive blanding som brukes til å forberede eluent (se også Table of Materials).
| AF4-UV-vis parametere | Enhet | Verdi |
| Avstandsstykke tykkelse | Μm | 350 |
| Detektor strømningshastighet | ml min-1 | 0.5 |
| Kryssstrømningshastighet | ml min-1 | 0 (konstant i 8 min) |
| Fokusflythastighet | ml min-1 | 0 |
| Forsinkelsestid / stabiliseringstid | Min | 0 |
| Strømningshastighet for injeksjon | ml min-1 | 0.5 |
| Overgangstid | Min | 0 |
| Injeksjonstid | Min | 0.1 |
| Elution trinn | Min | 8 |
| Skyll trinntiden | Min | 0.1 |
| Skyll trinn strømningshastighet | ml min-1 | 0.1 |
| Injeksjonsvolum | μL (μL) | 10 |
| Konsentrasjon av prøve | mg L-1 | 12.5 |
| Membran type | Regenerert cellulose | |
| Membran molekylvekt cut-off | Kda | 10 |
| Eluent Leilighet | 0,025 % (v/v) overflateaktivt middel | |
| UV-vis bølgelengde | Nm | 532 |
| UV-vis følsomhet | - | 0.001 |
Tabell 2: Sammendrag av AF4-UV-vis fraksjoneringsmetodeparametrene for å utføre direkte injeksjonskjøring uten påføring av en separasjonskraft.
| AF4-UV-vis parametere | Enhet | Verdi |
| Avstandsstykke tykkelse | Μm | 350 |
| Detektor strømningshastighet | ml min-1 | 0.5 |
| Kryssstrømningshastighet | ml min-1 | 1 (60 min konstant, 10 min lineær) |
| Fokusflythastighet | ml min-1 | 1.3 |
| Forsinkelsestid / stabiliseringstid | Min | 2 |
| Strømningshastighet for injeksjon | ml min-1 | 0.2 |
| Overgangstid | Min | 0.2 |
| Injeksjonstid | Min | 5 |
| Elution trinn | Min | 70 (60 min konstant, 10 min lineær) |
| Skyll trinn | Min | 9 |
| Skyll trinn strømningshastighet | ml min-1 | 0.5 |
| Injeksjonsvolum | μL (μL) | 50 |
| Konsentrasjon av prøve | mg L-1 | 12.5 |
| Membran type | Regenerert cellulose | |
| Membran molekylvekt cut-off | Kda | 10 |
| Eluent Leilighet | 0,025 % (v/v) overflateaktivt middel | |
| UV-vis bølgelengde | Nm | 532 |
| UV-vis følsomhet | - | 0.001 |
Tabell 3: Sammendrag av AF4-UV-vis fraksjoneringsmetodeparametere for å utføre fraksjoneringskjøringen med påføring av en kryssstrøm som separasjonskraft.
| Kalibreringsstandard | Capping agent | Gjennomsnittlig størrelse (TEM) (nm) | CV (gjennomsnittlig størrelse TEM) (%) | Zeta potensial (mV) | SD (zeta potensial) (mV) | Hydrodynamisk radius (DLS) (nm) | SD (hydrodynamisk radius) (nm) | Pdi | SD (PDI) |
| AuNP 20 nm | Citrate | 20.1 | ≤ 8 år | -48.9 | 1.5 | 10.95 | 0.12 | 0.082 | 0.009 |
| AuNP 40 nm | Citrate | 40.8 | ≤ 8 år | -30.4 | 1.0 | 20.30 | 0.13 | 0.127 | 0.006 |
| AuNP 80 nm | Citrate | 79.2 | ≤ 8 år | -51.5 | 1.3 | 38.85 | 0.23 | 0.138 | 0.013 |
| AuNP 100 nm | Citrate | 102.2 | ≤ 8 år | -50.9 | 0.9 | 52.30 | 0.37 | 0.078 | 0.009 |
Tabell 4: Sammendrag av de fysikalske-kjemiske parametrene til de anvendte AuNP-kalibreringsstandardene, inkludert capping agent, TEM gjennomsnittlig størrelse, Zeta potensial bestemt i den innfødte suspensjon samt DLS hydrodynamisk radius, og polydispersity index (PDI) bestemt i eluent.
| Kalibreringsstandard | Kjøre | Oppbevaringstid på maksimal maksimal hastighet (min) | Netto oppbevaringstid på maksimal hastighet (min) | Gjennomsnittlig netto oppbevaringstid (min) | SD (%) (netto oppbevaringstid) | SD (min) (netto oppbevaringstid) |
| AuNP 20 nm | 1 | 17.368 | 11.468 | 11.56 | 1.02 | 0.12 |
| 2 | 17.409 | 11.509 | ||||
| 3 | 17.589 | 11.689 | ||||
| AuNP 40 nm | 1 | 25.316 | 19.416 | 19.49 | 0.68 | 0.13 |
| 2 | 25.32 | 19.42 | ||||
| 3 | 25.548 | 19.648 | ||||
| AuNP 80 nm | 1 | 42.095 | 36.195 | 36.29 | 0.23 | 0.08 |
| 2 | 42.219 | 36.319 | ||||
| 3 | 42.257 | 36.357 | ||||
| AuNP 100 nm | 1 | 50.975 | 45.075 | 45.06 | 0.07 | 0.03 |
| 2 | 50.924 | 45.024 | ||||
| 3 | 50.986 | 45.086 |
Tabell 5: Oppbevaringstider for AuNP-kalibreringsstandardene på den respektive UV-Vis-toppen som er avledet fra de respektive AF4-UV-vis-frakttogrammene ved hjelp av metoden som er beskrevet i tabell 3.
| Aliquote | Kjøre | Maksimal retensjonstid (min) | Gjennomsnittlig oppbevaringstid på maksimal maksimal hastighet (min) | Netto oppbevaringstid på maksimal hastighet (min) | SD (%) oppbevaringstid | Hydrodynamisk radius (nm) | Gjenoppretting (%) |
| 1 | 1 | 32.689 | 32.70 | 26.789 | 0.07 | 29.03 | 85.34 |
| 2 | 32.687 | 26.787 | |||||
| 3 | 32.719 | 26.819 | |||||
| 2 | 1 | 32.989 | 33.08 | 27.089 | 0.37 | 29.49 | 81.73 |
| 2 | 33.073 | 27.173 | |||||
| 3 | 33.187 | 27.287 | |||||
| 3 | 1 | 33.053 | 33.14 | 27.153 | 0.49 | 29.56 | 82.14 |
| 2 | 33.071 | 27.171 | |||||
| 3 | 33.291 | 27.391 |
Tabell 6: Sammendrag av oppbevaringstidene på den respektive UV-Vis-maksimumen, den hydrodynamiske radiusen beregnet ut fra den eksterne størrelseskalibreringen (figur 2) og utvinningshastigheten til den ukjente AuNP-prøven hentet fra AF4-UV-vis-analyse.
Discussion
Den hydrodynamiske størrelsen på en ukjent AuNP ble nøyaktig vurdert av AF4 kombinert med en UV-vis detektor ved hjelp av veldefinerte AuNP-størrelsesstandarder fra 20 nm til 100 nm. Den utviklede AF4-metoden ble optimalisert ved hjelp av en konstant kryssflytprofil for å etablere en lineær relasjon mellom målt oppbevaringstid og AuNP-størrelse, og dermed tillate en enkel størrelsesbestemmelse fra lineær regresjonsanalyse. Spesielt fokus var også på å oppnå tilstrekkelig høye utvinningsrater som indikerer ingen signifikant prøvetap under fraksjonering, og at den utviklede AF4-metoden, inkludert den påførte eluent og membranen matchet godt med alle fraksjonerte AuNP-prøver.
Metodeutvikling er uten tvil det mest kritiske trinnet i AF4 og flere parametere, inkludert kanaldimensjoner, strømningsparametere samt eluent, membran, avstandshøyde og til og med prøveegenskaper må tas i betraktning for å forbedre fraksjonering innen et gitt elution-tidsvindu. Formålet med dette avsnittet er å veilede leseren gjennom de kritiske trinnene som ble optimalisert for å kunne bestemme størrelsen på det ukjente AuNP-utvalget som er diskutert her. For en mer detaljert beskrivelse av hvordan man generelt utvikler en AF4-metode, henvises leseren til AF4-delen av 'ISO/TS21362:2018 - Nanoteknologier - Analyse av nanoobjekter ved hjelp av asymmetrisk flyt og sentrifugal feltstrømningsfraksjon'25. Å se nærmere på de anvendte brøkforholdene gitt i tabell 3, er det første kritiske trinnet innføringen og avslapningen av AuNP-prøven i AF4-kanalen. Dette trinnet styres av injeksjonsstrømmen, fokusflyten og kryssflyten, hvis samspill tvinger prøven til å lokalisere nær membranoverflaten og konsentrere den i et smalt bånd nær injeksjonsporten til AF4-kanalen som i utgangspunktet definerer utgangspunktet for fraksjoneringen. En tilstrekkelig avslapning av prøven er obligatorisk som i løpet av dette trinnet, prøve bestanddeler av forskjellige størrelser finnes i forskjellige høyder av AF4-kanalen og dermed gir grunnlag for en vellykket størrelse fraksjonering. Ufullstendig prøveavslapning er vanligvis synlig av et økt tomrom som følge av uopphetede (det vil at ikke-avslappet) prøvebestanddeler. Denne effekten kan reduseres ved å øke injeksjonstiden og/eller den påførte kryssstrømningshastigheten. Begge parametrene trenger imidlertid nøye optimalisering, spesielt for prøver som er utsatt for agglomerasjon og adsorpsjon på AF4-membranen, og kan overvåkes av de respektive utvinningsfrekvensene som er oppnådd for forskjellige parameterinnstillinger36,37. Den påførte injeksjonstiden på 5 min sammen med en kryssstrømningshastighet på 1,0 ml∙min-1 avslørte utvinningshastigheter > 80% for alle AuNP-prøver og et ubetydelig tomrom som indikerer nesten optimale avslapningsforhold. Etter tilstrekkelig avslapning av AuNP-prøven ble fokusflyten stoppet og prøvetransport langs AF4-kanallengden til den respektive UV-visdetektoren ble initiert som representerer det andre kritiske trinnet. For å sikre tilstrekkelig høy fraksjoneringseffekt til rimelige analyser ganger, ble en konstant kryssstrømningshastighet på 1,0ml∙min -1 for 30–50 min (avhengig av den respektive fraksjonerte AuNP-størrelsesstandarden) etterfulgt av en 10 min lineær kryssstrømningsforfall ved en detektorstrømningshastighet på 0,5 ml.min-1 brukt. Ved hjelp av en konstant kryssflytprofil på tvers av separasjonen av alle AuNP-størrelsesstandarder viste en lineær relasjon mellom oppbevaringstid og AuNP-størrelse etter FFF-teori22,og dermed muliggjør størrelsesbestemmelse av det ukjente AuNP-utvalget ved enkel lineær regresjonsanalyse. Profiler annet enn en konstant kryssstrøm har imidlertid også blitt utnyttet for størrelse på nanopartikler, noe som til slutt fører til et ikke-lineært forhold mellom oppbevaringstid og partikkelstørrelse38,39. I tillegg er størrelsesbestemmelse i AF4 ved hjelp av veldefinerte størrelsesstandarder ikke begrenset til AuNP, men kan også brukes på nanopartikler med andre størrelser og elementær sammensetning (f.eks sølv38,40 eller silika nanopartikler41,42). I tillegg, når du arbeider med fortynnede prøver, er ICP-MS en svært følsom elementdetektor, som kan pares med AF4, og legger til allsidigheten til denne analytiske tilnærmingen for størrelse på et stort utvalg av nanopartikler i suspensjon.
Til tross for sin utbredte anvendelse, har ekstern størrelseskalibrering ved hjelp av veldefinerte størrelsesstandarder i AF4 noen særegenheter som må vurderes når du bruker den for nøyaktig størrelse av ukjente prøver. Først av alt er det sterkt avhengig av anvendelsen av sammenlignbare forhold under fraksjonering av de respektive størrelsesstandardene og det faktiske utvalget. I saken som presenteres her, er det derfor obligatorisk at både AuNP-størrelsesstandardene samt den ukjente AuNP-prøven er fraksjonert ved hjelp av samme AF4-metode, samt samme eluent og samme membran som gjør denne tilnærmingen ganske lite fleksibel. Videre, uten størrelsesfølsomme detektorer, for eksempel lyssppreding (MALS og DLS) for hånden, er det vanskelig å avgjøre om en respektive AF4-metode ved hjelp av størrelsesstandarder fungerer tilstrekkelig bra eller ikke. Dette gjelder spesielt for ukjente prøver som viser svært brede størrelsesfordelinger, hvor det fortsatt er uklart om alle prøvebestanddeler følger det normale elutionmønsteret: fraksjonering fra mindre til større partikler, eller om større prøvebestanddeler allerede elutens i sterisk hyperlayer-modus og dermed potensielt samtidig med mindre prøvebestanddeler43,44. I tillegg kan selv om FFF-teorien understreker at AF4 skiller seg utelukkende basert på forskjeller i hydrodynamisk størrelse med partikler som anses som punktmasser uten interaksjoner med miljøet22, forteller virkeligheten en annen historie med partikkel- og partikkel- og partikkelmembraninteraksjoner (for eksempel elektrostatisk tiltrekning/ frastøting eller van-der-Waals attraksjon) kan spille en betydelig rolle og kan potensielt introdusere en målbar skjevhet i størrelsesbestemmelser via ekstern størrelse kalibrering45,46. Det anbefales derfor å bruke størrelsesstandarder som ideelt sett samsvarer med sammensetningen og overflateegenskapene (Zeta-potensialet) avinteressepartikkelen 40,42 eller, Hvis disse ikke er tilgjengelige, bruker du i det minste veleparerte partikkelstørrelsesstandarder (f.eks. polystyren latekspartikler) og nøye vurdere deres sammenlignbarhet med interessepartikkelen, spesielt når det gjelder deres overflate Zeta-potensial i det respektive miljøet, der analysen skal utføres41,47.
Allsidigheten til AF4 regnes ofte som den største styrken, da den tilbyr et applikasjonsområde som går utover de fleste andre vanlige størrelsesteknikker på dettefeltet 22,48,49. Samtidig, på grunn av sin tilknyttede antagelige kompleksitet, kan det også betraktes som sin viktigste ulempe, spesielt mot raske og tilsynelatende brukervennlige størrelsesteknikker som DLS, Nanopartikkelsporingsanalyse eller enkeltpartikkel ICP-MS. Likevel, når du setter AF4 i perspektiv med disse populære størrelsesteknikkene, blir det klart at alle teknikker har sine fordeler og ulemper, men alle bidrar til en mer omfattende forståelse av nanopartiklers fysikalske kjemiske natur og bør derfor betraktes som komplementære i stedet for konkurransedyktige.
Standard driftsprosedyre (SOP) som presenteres her, fremhever den utmerkede anvendelsen av AF4-UV-vis med ekstern størrelseskalibrering for størrelse av en ukjent AuNP-prøve i suspensjon og ble til slutt brukt som en anbefalt retningslinje for AF4-analyse av et ukjent AuNP-utvalg i en internasjonal interlaboratorisk sammenligning (ILC) som ble utført i rammen av Horizon 2020-prosjektet, ACEnano (utfallet av denne ILC vil være gjenstand for en fremtidig publikasjon). Denne protokollen legger derfor opp til den oppmuntrende og pågående internasjonale innsatsen for å validere og standardisere AF4-metoder25,50,51,52 som understreker det lovende potensialet til AF4 innen nanopartikkelkarakterisering.
Disclosures
Alle forfatterne av dette manuskriptet er ansatte i Postnova Analytics GmbH, hvis produkter benyttes i denne protokollen.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke hele ACEnano-konsortiet for fruktbare diskusjoner gjennom alle stadier av utarbeidelsen av protokollen som presenteres her. Forfatterne setter også pris på midler fra European Union Horizon 2020-programmet (H2020) i henhold til tilskuddsavtale nº 720952 i rammen av ACEnano-prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 µm Membrane Filters (hydrophilic PVDF) | Postnova Analytics GmbH | Z-FIL-TEF-002 | Used for filtration of aqueous solutions |
| 0.22 µm PVDF Syringe Filter (d = 33 mm) | Merck Millipore | Durapore Millex | Used for filtration of NovaChem100 |
| Adjustable Volume Pipettes (1000 µL) | Eppendorf AG | Research Plus | Used to prepare diluted AuNP suspensions |
| AF4 cartridge | Postnova Analytics GmbH | AF2000 MF - AF4 Analytical Channel | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO) | Postnova Analytics GmbH | Z-AF4-MEM-612-10KD | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Analytical Balance (0.1 mg precision) | Sartorius | ENTRIS124I-1S | Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution |
| Autosampler | Postnova Analytics GmbH | PN5300 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Channel Oven | Postnova Analytics GmbH | PN4020 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Crossflow Module | Postnova Analytics GmbH | AF2000 MF Control Module | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Disposable Pipette Tips (1000 µL) | Eppendorf AG | ep T.I.P.S | Used to prepare diluted AuNP suspensions |
| Flasks (e.g. 2 liter volume) | neoLab | 1-0199 | Used for eluent storage |
| Focus Pump | Postnova Analytics GmbH | PN1131 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) | Postnova Analytics GmbH | VIA-002 | Used for sample storage |
| Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) | Postnova Analytics GmbH | NovaCal Gold | 50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function |
| Magnetic Stirrer | IKA | VIBRAX-VXR | Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW |
| Personal Computer (PC) | Dell Technologies | / | Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual |
| Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.) | / | / | In accordance with respective laboratory’s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials |
| Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) | Postnova Analytics GmbH | Z-VIA-09150868 | Used for sample storage |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), ≥99 %, Blotting Grade | Carl Roth GmbH & Co KG | 2326.1 | Used for the preparation of the cleaning solution |
| Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, ≥98 %, p.a | Carl Roth GmbH & Co KG | 6771.1 | Used for the preparation of the cleaning solution |
| Software Package for Control and Data Acquisition | Postnova Analytics GmbH | NovaFFF AF2000 Software | Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual |
| Software Package for Data Evaluation | Postnova Analytics GmbH | NovaAnalysis Software | Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual |
| Software Package for final Data Processing | OriginLab Corporation | Origin 2019 | Used for final data processing |
| Solvent Degasser | Postnova Analytics GmbH | PN7520 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Solvent Selector | Postnova Analytics GmbH | PN7310 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Solvent Organizer | Postnova Analytics GmbH | PN7140 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Surfactant Mixture | Postnova Analytics GmbH | NovaChem100 | Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation |
| Tip Pump | Postnova Analytics GmbH | PN1130 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Unknown AuNP sample | BBI Solutions | EM.GC60 | 60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function |
| UV-vis Detector | Postnova Analytics GmbH | PN3211 | UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system |
| Vacuum Filtration Unit | Postnova Analytics GmbH | Eluent Filtration System | Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions |
| Vortex | IKA | Vortex Genie 2 | Used for homogenization of diluted AuNP suspensions |
| Water Purification System | Merck Millipore | Milli-Q Integral 5 | Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 MΩcm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions |
References
- Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Gold nanoparticles in biology and medicine: recent advances and prospects. Acta Naturae. 3 (2), 34-55 (2011).
- Wagner, F. E., et al. Before striking gold in gold-ruby glass. Nature. 407 (6805), 691-692 (2000).
- Hunt, L. B. The true story of Purple of Cassius. Gold Bulletin. 9 (4), 134-139 (1976).
- Higby, G. J. Gold in medicine. Gold Bulletin. 15 (4), 130-140 (1982).
- Faraday, M. X. The Bakerian Lecture. -Experimental relations of gold (and other metals) to light. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 147, 145-181 (1857).
- Borries, B. v, Kausche, G. A. Übermikroskopische Bestimmung der Form und Größenverteilung von Goldkolloiden. Kolloid-Zeitschrift. 90 (2), 132-141 (1940).
- Turkevich, J., Hillier, J. Electron Microscopy of Colloidal Systems. Analytical Chemistry. 21 (4), 475-485 (1949).
- Homberger, M., Simon, U. On the application potential of gold nanoparticles in nanoelectronics and biomedicine. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical, and Engineering Sciences. 368 (1915), 1405-1453 (2010).
- Cordeiro, M., Ferreira Carlos, F., Pedrosa, P., Lopez, A., Baptista, P. V. Gold Nanoparticles for Diagnostics: Advances towards Points of Care. Diagnostics. 6 (4), Basel, Switzerland. 43 (2016).
- Vines, J. B., Yoon, J. H., Ryu, N. E., Lim, D. J., Park, H. Gold Nanoparticles for Photothermal Cancer Therapy. Frontiers in Chemistry. 7, 167 (2019).
- Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery. Therapeutic Delivery. 3 (4), 457-478 (2012).
- Safh, B. P., Antosh, M. Effect of size on gold nanoparticles in radiation therapy: Uptake and survival effects. Journal of Nanomedicine. 2 (1), 1013-1020 (2019).
- Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of size and concentration of gold nanoparticles from UV-Vis spectra. Analytical Chemistry. 79 (11), 4215-4221 (2007).
- Zheng, T., Bott, S., Huo, Q. Techniques for accurate sizing of gold nanoparticles using dynamic light scattering with particular application to chemical and biological sensing based on aggregate formation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (33), 21585-21594 (2016).
- Liu, J., Murphy, K. E., MacCuspie, R. I., Winchester, M. R. Capabilities of single particle inductively coupled plasma mass spectrometry for the size measurement of nanoparticles: a case study on gold nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (7), 3405-3414 (2014).
- Contado, C., Argazzi, R. Size sorting of citrate reduced gold nanoparticles by sedimentation field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1216 (52), 9088-9098 (2009).
- Calzolai, L., Gilliland, D., Garcìa, C. P., Rossi, F. Separation and characterization of gold nanoparticle mixtures by flow-field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1218 (27), 4234-4239 (2011).
- Schmidt, B., et al. Quantitative characterization of gold nanoparticles by field-flow fractionation coupled online with light scattering detection and inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (7), 2461-2468 (2011).
- Mekprayoon, S., Siripinyanond, A. Performance evaluation of flow field-flow fractionation and electrothermal atomic absorption spectrometry for size characterization of gold nanoparticles. Journal of Chromatography. A. , (2019).
- López-Sanz, S., Rodríguez Fariñas, N., Zougagh, M., Rios, A., Rodriguez Martín-Doimeadios, R. C. C. AF4-ICP-MS as a powerful tool for the separation of gold nanorods and nanospheres. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. , Advance Article (2020).
- Giddings, C. J. A new separation concept based on a coupling of concentration and flow nonuniformities. Separation Science. 1 (1), 123-125 (1966).
- Schimpf, M. E., Caldwell, K., Giddings, J. C. Field-flow fractionation handbook. , Wiley-Interscience. (2000).
- Contado, C. Field flow fractionation techniques to explore the "nano-world". Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (10), 2501-2518 (2017).
- Wahlund, K. G., Giddings, J. C. Properties of an asymmetrical flow field-flow fractionation channel having one permeable wall. Analytical Chemistry. 59 (9), 1332-1339 (1987).
- ISO. ISO /TS 21362:2018 Nanotechnologies - of nano-objects using asymmetrical-flow and centrifugal field-flow fractionation. ISO. , (2018).
- Gogos, A., Kaegi, R., Zenobi, R., Bucheli, T. D. Capabilities of asymmetric flow field-flow fractionation coupled to multi-angle light scattering to detect carbon nanotubes in soot and soil. Environmental Science: Nano. 6 (1), 584-594 (2014).
- Müller, D., et al. Integration of inverse supercritical fluid extraction and miniaturized asymmetrical flow field-flow fractionation for the rapid analysis of nanoparticles in sunscreens. Analytical Chemistry. 90 (5), 3189-3195 (2018).
- Capomaccio, R., et al. Gold nanoparticles increases UV and thermal stability of human serum albumin. Biointerphases. 11 (4), (2016).
- Levak, M., et al. Effect of protein corona on silver nanoparticle stabilization and ion release kinetics in artificial seawater. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1259-1266 (2017).
- Mehn, D., et al. Larger or more? Nanoparticle characterisation methods for recognition of dimers. RSC Advances. 7 (44), 27747-27754 (2017).
- Sogne, V., Meier, F., Klein, T., Contado, C. Investigation of zinc oxide particles in cosmetic products by means of centrifugal and asymmetrical flow field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1515, 196-208 (2017).
- Cumberland, S. A., Lead, J. R. Particle size distributions of silver nanoparticles at environmentally relevant conditions. Journal of Chromatography. A. 1216 (52), 9099-9105 (2009).
- de Carsalade du pont, V., et al. Asymmetric field flow fractionation applied to the nanoparticles characterization: Study of the parameters governing the retention in the channel. International Congress of Metrology. , (2019).
- Loeschner, K., et al. Optimization and evaluation of asymmetric flow field-flow fractionation of silver nanoparticles. Journal of Chromatography. A. 1272, 116-125 (2013).
- Mudalige, T. K., Qu, H., Linder, S. W. An improved methodology of asymmetric flow field flow fractionation hyphenated with inductively coupled mass spectrometry for the determination of size distribution of gold nanoparticles in dietary supplements. Journal of Chromatography. A. 1420, 92-97 (2015).
- Dubascoux, S., Von Der Kammer, F., Le Hécho, I., Gautier, M. P., Lespes, G. Optimisation of asymmetrical flow field flow fractionation for environmental nanoparticles separation. Journal of Chromatography. A. 1206 (2), 160-165 (2008).
- Hagendorfer, H., et al. Application of an asymmetric flow field flow fractionation multi-detector approach for metallic engineered nanoparticle characterization - and limitations demonstrated on Au nanoparticles. Analytica Chimica Acta. 706 (2), 367-378 (2011).
- Geiss, O., Cascio, C., Gilliland, D., Franchini, F., Barrero-Moreno, J. Size and mass determination of silver nanoparticles in an aqueous matrix using asymmetric flow field flow fractionation coupled to inductively coupled plasma mass spectrometer and ultraviolet-visible detectors. Journal of Chromatography. A. 1321, 100-108 (2013).
- Makselon, J., Siebers, N., Meier, F., Vereecken, H., Klumpp, E. Role of rain intensity and soil colloids in the retention of surfactant-stabilized silver nanoparticles in soil. Environmental Pollution. 238, 1027-1034 (2018).
- Bolea, E., Jiménez-Lamana, J., Laborda, F., Castillo, J. R. Size characterization and quantification of silver nanoparticles by asymmetric flow field-flow fractionation coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (9), 2723-2732 (2011).
- Barahona, F., et al. Simultaneous determination of size and quantification of silica nanoparticles by asymmetric flow field-flow fractionation coupled to ICPMS using silica nanoparticles standards. Analytical Chemistry. 87 (5), 3039-3047 (2015).
- Aureli, F., D'Amato, M., Raggi, A., Cubadda, F. Quantitative characterization of silica nanoparticles by asymmetric flow field flow fractionation coupled with online multiangle light scattering and ICP-MS/MS detection. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30, 1266-1273 (2015).
- Myers, M. N., Giddings, J. C. Properties of the transition from normal to steric field-flow fractionation. Analytical Chemistry. 54 (13), 2284-2289 (1982).
- Giddings, J. C. Retention (steric) inversion in field-flow fractionation: practical implications in particle size, density and shape analysis. Analyst. 118 (12), 1487-1494 (1993).
- Wahlund, K. G. Flow field-flow fractionation: Critical overview. Journal of Chromatography. A. 1287, 97-112 (2013).
- Bendixen, N. L., Adlhart, S., Lattuada, C., Ulrich, A. Membrane-particle interactions in an asymmetric flow field flow fractionation channel studied with titanium dioxide nanoparticles. Journal of Chromatography A. 1334, 92-100 (2014).
- Qu, H., Quevedo, I. R., Linder, S. W., Fong, A., Mudalige, T. K. Importance of material matching in the calibration of asymmetric flow field-flow fractionation: material specificity and nanoparticle surface coating effects on retention time. Journal of Nanoparticle Research. 18 (10), 292 (2016).
- Giddings, J. C. Field-flow fractionation: analysis of macromolecular, colloidal, and particulate materials. Science. 260 (5113), 1456-1465 (1993).
- Cascio, C., Gilliland, D., Rossi, F., Calzolai, L., Contado, C. Critical experimental evaluation of key methods to detect, size and quantify nanoparticulate silver. Analytical Chemistry. 86 (24), 12143-12151 (2014).
- Caputo, F., et al. Measuring particle size distribution by asymmetric flow field flow fractionation: a powerful method for the pre-clinical characterisation of lipid-based nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 756-767 (2019).
- Parot, J., Caputo, F., Mehn, D., Hackley, V. A., Calzolai, L. Physical characterization of liposomal drug formulations using multi-detector asymmetrical-flow field flow fractionation. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 320, 495-510 (2020).
- ASTM. ASTM WK68060 - New Test Method for Analysis of Liposomal Drug Formulations using Multidetector Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation (AF4). ASTM. , (2019).
