Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

ספקטרומטריית מסה אלקטרופורזיס נימית גישות לאפיון החלבון וקורונה מטבולית שנרכשו על ידי ננו-חומרים

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61760
Automatic Translation
*1, *2, *3, 4, 1, 2, 3
1School of Geography Earth and Environmental Sciences, University of Birmingham, 2Biomedical Microscale Analytics, Leiden University, 3Institute of Medical Biochemistry, Medical University of Innsbruck, 4AB Sciex UK Ltd
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאפיון קורונה ביומולקולרית מלאה, חלבונים ומטבוליטים, שנרכשו על ידי ננו-חומרים מביופלואידים באמצעות אלקטרופורזה נימית – גישת ספקטרומטריית מסה.

Abstract

הספיגה של ביומולקולים ממטריזות ביולוגיות סביב אל פני השטח של ננו-חומרים (NMs) כדי ליצור את הקורונה הייתה מעניינת בעשור האחרון. העניין בממשק הביו-ננו נובע מהעובדה שהקורונה הביומולקולרית מעניקה זהות ביולוגית ל-NMs ובכך גורמת לגוף לזהות אותם כ"עצמיים". לדוגמה, מחקרים קודמים הראו כי החלבונים בקורונה מסוגלים לקיים אינטראקציה עם קולטני ממברנה כדי להשפיע על ספיגת התאים וקבעו כי הקורונה אחראית לסחר תאי של NMs והרעילות שלהם בסופו של דבר. עד כה, רוב המחקרים התמקדו בחלבון הקורונה והתעלמו מההשפעות האפשריות של המטבוליטים הכלולים בקורונה או מההשפעות הסינרגיסטיות בין מרכיבים בקורונה הביומולקולרית המלאה. ככזה, עבודה זו מדגימה מתודולוגיות המאפיינות הן את רכיבי החלבון והן את מרכיבי המטבוליט של הקורונה הביומולקולרית באמצעות פרוטאומיקים מלמטה למעלה וגישות מטבולומיות במקביל. זה כולל תקציר על חלקיקים של קורונה חלבון עם פעילי שטח המשמש להגברת התאוששות חלבון, ואפיון פסיבי של קורונה מטבולית על ידי ניתוח מטריצות מטבוליט לפני ואחרי חשיפות NM. עבודה זו מציגה אלקטרופורזה נימית – ספקטרומטריית מסה (CESI-MS) כדכניקה חדשה לאפיון קורונה NM. הפרוטוקולים המתוארים כאן מדגימים כיצד CESI-MS יכול לשמש לאפיון אמין של החלבון והקורונה המטבולית שנרכשו על ידי NMs. המעבר CESI-MS מקטין מאוד את נפח המדגם הנדרש (בהשוואה לכרומטוגרפיה נוזלית מסורתית – ספקטרומטריית מסה (LC-MS) גישות) עם זריקות מרובות אפשריות מ 5 μL קטן של מדגם, מה שהופך אותו אידיאלי עבור דגימות מוגבל נפח. יתר על כן, ההשלכות הסביבתיות של ניתוח מופחתות ביחס LC-MS בשל שיעורי זרימה נמוכים (<20 nL / min) ב CESI-MS, ואת השימוש אלקטרוליטים מימית אשר מבטל את הצורך בממסים אורגניים.

Introduction

אינטראקציות ביו-ננו, בממשק בין משטחים ננו-חומריים (NM) לבין מטריצות ביולוגיות שמהן ביומולקולס ספיחה ל- NM, הוא תחום מחקר אינטנסיבי העומד בבסיס ננו-בטיחותוננו-רפואה 1. שכבה זו של ביומולקולים מסוחפים מעניקה זהות ביולוגית ל- NMs, ובכך תאים מזהים אותם כ"עצמיים ", ובהמשך משפיעים על ספיגת תאים, הפצה ונקודות קצה ביולוגיות2,3,4. הרוב המכריע של מחקרי ביו-ננו התמקדו בחלבונים בתוך הקורונה, והוכיחו כי חלבונים משתנים כמותית ואיכותית בין NMs של קומפוזיציות שונות5. וריאציה זו תלויה הן במאפיינים של NM כגון גודל, פונקציונליזציה, וחומר בנוסף למאפיינים של המטריצה הביולוגית כולל הרכב ותכולת מלח5. תחום עולה של עניין בממשק ביו-ננו הם המטבוליטים כי ספיח ל- NMs6. מספר מחקרים הראו כי, כמו עם החלבונים, תכונות NM הם גורם מפתח בקביעת הרכב המטבוליטים בקורונה וכי הם יכולים להשפיע על התוצאות הביולוגיות שלחשיפהNM 6,7,8.

במחקרים על הקורונה הביומולקולרית ישנם ארבעה שלבים נפרדים לאפיון שלה, היווצרות קורונה, בידוד הביומולקולות בתוך הקורונה, איתורם באמצעות ספקטרומטריית מסה איכותית או כמותית וזיהוי9. עד כה אומצו מגוון טכניקות לבידוד החלבון קורונה, כולל רתיחה במאגר הריצה SDS-PAGE, עקירות ממס ומלח או עיכול ישיר של חלבונים במקום על פני השטח של NMs. מבחינת המטבוליטים בקורונה, הבידוד מורכב יותר בשיטות שונות באמצעות ממיסים או אפילו פירוק של NMs המוצעים כפתרונות8,10,11. עם זאת, בניגוד לקורונה חלבון גישה "גודל אחד מתאים לכולם" לא סביר להחיל על בידוד של מטבוליטים מ- NMs, בשל המרחב הכימי הרחב הכבוש על ידי חילוף החומרים ואת המגוון של NMs אפשריים. גישה חלופית היא לאפיין את המטריצה הביולוגית לפני ואחרי חשיפה ל- NM עם ההבדל בריכוזים מטבוליטים המיוחסים לספיגת מטבוליטים ל- NMs.12

גישה חלופית זו תחול על כל הביופלואידים וה- NMs ולמרות שהיא דורשת ניתוח כפול, היא מציעה מידה מדויקת הרבה יותר של קורונה מטבולית ואין לה סיכון להתאוששות מטבולית נמוכה מפני השטח של NM בטעות כריכה נמוכה של המטבוליט הספציפי.

השלב השני בניתוח הקורונה הביומולקולרי הוא גילוי הביומולקולות. באופן מסורתי עבור החלבונים בקורונה, זה היה ההעברה של ננו-LC-MS, סוס העבודה של פרוטאומיקה; גישות אחרות כגון NMR13, 1D ו- 2D SDS-PAGE הוחלו גם כן. במונחים של קורונה מטבוליט LC-MS7,GC-MS8 וספקטרומטריית מסת עירוי ישיר נוצלו14. עם זאת, גישה חדשה החלה לאחרונה לצבור תאוצה, כלומר ספקטרומטריה אלקטרופורזה-מסה נימית (CE-MS)11,15 ונוכח במעבדות NM כדכניקה עצמאית לאפיון תכונות פיזיות וכימיות שונות של NMs16. CE-MS היא טכניקת הפרדה אורתוגונלית לננו-אל-אם-אס ו-GC-MS ומסוגלת לאפשר זיהוי של מטבוליטים קוטביים וטעוניםמאוד 17,18. יתר על כן, CE-MS מתאים היטב לניתוח חלבונים ושינויים שלאחר דרכם כגון זרחן וגליקוסילציה19,20,21,22. השלב הסופי, זיהוי וניתוח נתונים יכול להתבצע במספר דרכים תלוי אם גישה כמותית / איכותית או ממוקדת / לא מיועדת משמשת, עם זאת, זה, נופל מחוץ למסר של פרוטוקול זה.

CESI-MS, שילוב של CE וממשק nanoESI, הוא התקדמות אחרונה בטכנולוגיית CE המשתמשת בממשק ללא נדן. זה מאפשר חיבור ישיר של CE זרימה נמוכה במיוחד (<20 nL / min) ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה ללא דילול, וכתוצאה מכך רגישות זיהוי משופרת באופן משמעותי23,24,25. CESI-MS מאפשר ניתוח דגימות מוגבלות בנפח (< 10 μL) תוך שמירה על ניתוח רגיש ביותר26. CESI-MS גם משווה לטובה לגישות ננו-ל-MS מסורתיות של קצב זרימה נמוכה המשמשות בפרוטומיקה ובמטבולומיה במונחים של רבייה27,28, תפוקה, וממשיכים הלאה מה שהופך אותו לסיכוי מרגש לאפיון קורונה ביומולקולרי מלא.

כדי להדגיש את הפוטנציאל של CESI-MS עבור ניתוחים של אינטראקציות ביו-ננו עבודה זו מתארת את הכנת המדגם הנדרש כדי לבודד את קורונה biomolecular NM מדגימת פלזמה אנושית אחת באופן כזה כדי למקסם נתונים הן החלבון והן מטבוליט היבט של קורונה NM ביומולקולרית מלאה. בעוד אנו מדווחים על השימוש בפלזמה אנושית, פרוטוקול זה יהיה מתאים באותה מידה עבור biofluids אחרים כגון סרום דם, מדיום תרבית תאים מלאה, ליסאט התא, נוזל השדרתי או שתן. הניתוחים של שני רכיבים אלה (חלבונים ומטבוליטים) יתוארו לאחר מכן באמצעות נימי CESI מצופים ניטרליים לקורונה החלבון ונימי סיליקה מותכים חשופים הן למטבוליטים קטיוניים והן מטבוליטים אניוניים.

Protocol

השימוש בביופלואיד אנושי אושר בהתאם להנחיות פרוטוקול IRB מאוניברסיטת ליידן והאוניברסיטה הרפואית של אינסברוק. כאשר נבדקים ביופלואידים אנושיים או בעלי חיים, נדרש אישור אתי ממכון המחקר, והושגו במקרה של התוצאות המוצגות בפרוטוקול זה. יתר על כן, יש לבצע דיווח הולם גם כדי להבטיח שקיפות וביצוע שימוש חוזר של נתונים בעבודה עתידית9,29,30.

1. הכנת אלקטרוליטים ברקע (BGE)

הערה: כל הממיסים צריכים להיות מוכנים במכסה אדים מתאים וציוד מגן אישי הולם חייב לשמש לכל השלבים (מעיל, כפפות ומשקפי מגן). בכל שלב, בקבוקוני פלסטיק מחייבים נמוכים נדרשים כדי למזער אובדן ניתוח וזיהום של מדגם עם מלחים שטיפה מכלי זכוכית.

  1. הכן 10% חומצה אצטית BGE (v/v), pH 2.2 על בסיס יומי עבור מטבולומיקה.
    1. לתוך בקבוקון נפחי 10 מ"ל להוסיף 1 מ"ל של חומצה אצטית, ואחריו תוספת של מים deionized (DI) לקו המסומן ערבוב יסודי.
  2. הכן 100 mM חומצה אצטית, pH 2.9 על בסיס יומי עבור proteomics.
    1. לתוך בקבוקון נפחי 10 מ"ל להוסיף 57 μL של חומצה אצטית, ואחריו תוספת של מי DI לקו המסומן ערבוב יסודי.

2. הכנת ננומטרי

  1. פזרו במרץ את ה- NMs במים באמצעות הנחיות שפורסמו31,32,33.
    הערה: בפיתוח פרוטוקול זה, 7 NMs שימשו כדלקמן: 100 ו 1,000 ננומטר carboxylated פוליסטירן שימשו חלבון וקורונה מטבולית, בהתאמה. 100 ננומטר NMs פוליסטירן לא שינוי, 13 ננומטר anatase TiO2 NMs אשר היו לא מודרניים או מצופים עם פוליאקרילט או PVP פולימרים ו 22 ננומטר SiO2 NMs לא שינוי שימשו הן חלבון מטבוליט קורונה. בעוד שהשיטה פותחה והודגמה באמצעות NMs אלה, יש לציין כי גישה זו תהיה ישימה עבור מגוון רחב של קומפוזיציות NM, גדלים, צורות, ומורפולוגיות.
  2. לאפיין את גודל החלקיקים באמצעות אור דינמי פיזור34,35, חלקיק יחיד אינדוקטיבית ספקטרומטר מסהפלזמה 36, ניתוח מעקב חלקיקים37, או מיקרוסקופיה אלקטרונים שידור ומטען פני השטח כפוטנציאל זטה באמצעות זטה sizer34.

3. היווצרות קורונה ביומולקולרית

  1. לפצל 2 מ"ל של פלזמה אנושית (או biofluid של בחירה) לתוך 1 mL aliquots, אחד עבור מטבוליט וחלבון קורונה והשני עבור אפיון מטבולום פלזמה.
  2. דגירה 1 מ"ג /מ"ל של NMs בפלזמה האנושית עבור 1 שעות ב 37 °C (500 סל"ד) בתרמומיקסר. לאחר צנטריפוגה דגירה המדגם ב 4,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 °C (55 °F) כדי pellet את NMs.
  3. לאסוף את supernatant הפלזמה לניתוח קורונה מטבוליט. שמרו על קומפלקס הקורונה NM-חלבון לאפיון קורונה חלבונים.

4. בידוד חלבון קורונה

  1. resuspend קומפלקס חלבון NM (הכדור) ב 1 מ"ל של 10x PBS Buffer ומערבולת במרץ במשך 2 דקות כדי להסיר חלבונים לא מאוגדים. צנטריפוגה פתרון PBS ב 4,000 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (4 °F) כדי pellet את NMs, ולהסיר בזהירות את supernatant מבלי להפריע לכדור.
  2. resuspend הכדור ב 1 מ"ל של אמוניום ביקרבונט חוצץ (ABC) (100 mM, pH 8.0) ומערבולת במרץ במשך 2 דקות כדי להסיר חלבונים לא מאוגדים ומלחים לא רצויים. צנטריפוגה ב 4,000 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (55 °F) כדי כדורי NMs; להסיר ולהשליך את supernatant. חזור על שלב זה.
  3. להפחית את קשרי דיסולפיד חלבון על ידי המסת גלולה חלבון NM ב 20 μL של חוצץ ABC (100 mM pH 8) המכיל 10 mM dithiotheritol. לדגור על פתרון ההפחתה במשך 30 דקות ב 56 °C (56 °F).
  4. כדי לעכל חלבונים, להוסיף 2 מיקרוגרם של טריפסין כיתה רצף ל 20 μL של ABC המכיל 0.1% פעילי שטח. לדגור על פתרון העיכול עבור 16 שעות ב 37 °C (7 °F).
  5. Alkylate המדגם על ידי תוספת של 20 μL של iodoacetamide ב 55 mM ב 100 mM ABC ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
  6. הוסף 20 μL של 0.1 M HCl כדי לבקע את פעילי השטח ולהשאיר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. העשרה ויתד פפטידים באמצעות טיפ פיפטת התפלה C18 ארוז.
    1. רטוב את הקצה עם 80 μL 0.1% חומצה פורמית 50% acetonitrile 5 פעמים, נקי עם 80 μL 0.1% חומצה פורמית 5 פעמים, לצייר ולחמוק מדגם 10 פעמים, דגימת התפלה על ידי שטיפה 80 μL 0.1 % חומצה פורמית 5 פעמים ולחמוק המדגם 2 פעמים עם 80 μL 0.1% חומצה פורמית 70% acetonitrile לתוך צינור PCR מחייב נמוך ונקי.
  8. ליופיליזציה הדגימות ולאחסן ב -20 °C (50 °F) עד ניתוח.

5. בידוד מטבוליט קורונה

  1. קח את פלזמת הבקרה ואת supernatant מדגרת הפלזמה NM מ שלב 3.3 ולשמור על קרח במהלך הכנת מדגם.
  2. קח 50 μL מכל בקבוקונים נפרדים לדלל 1 מתוך 10 עם מים DI. קח 50 μL של כל מדגם מדולל ולעבור בקבוקונים חדשים לשלב 5.3.
  3. הוסף 200 כלורופורם μL, 250 μL מתנול ו 350 μL DI מים תערובת מערבולת נמרצת במשך 2 דקות. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 20,800 x גרם ב 4 °C (70 °F).
  4. קח 500 μL של supernatant ולסנן דרך מסנן צנטריפוגלי 3 kDa עבור 2 שעות ב 10,000 x g ב 4 °C (70 °F). יש ליטול 430 מיקרו-אל של אולטרה-סינון ויבש בניקוי מהיר. כעת ניתן להקפיא דגימות לפני הניתוח.

6. הכנת מערכת CESI-MS38

הערה: לפני ההתקנה של נימים, לבדוק כי הכניסה ואת קצה המוצא של הנימים הם ללא פגע וכי אין שברים גלויים בניני.

  1. התקנת נימי מצופה נייטרלי לניתוח קורונה חלבון39.
    1. יש להניח נימי מצופה נייטרלי חדש (אורך 90 ס"מ בקוטר פנימי של 30 מיקרומטר) במכשיר CESI בהתאם להנחיות היצרן.
  2. הכנת נימי CESI לניתוח פרוטאומי.
    1. לשטוף את נימי ההפרדה בכיוון הקדמי באמצעות 100 mM של HCl במשך 5 דקות ב 100 פסאיי ולבדוק היווצרות טיפה בשקע של נימי. לשטוף נימי הפרדה עם BGE ב 100 פסאיי במשך 10 דקות ולאחר מכן מים DI ב 100 פסאיי במשך 30 דקות (זה נדרש רק עבור נימים חדשים).
    2. לשטוף הן את נימי ההפרדה ואת נימי מוליך עם BGE ב 90 פסאיי במשך 5 דקות ולהבטיח טיפות טופס בקצה השקע של שני נימים.
    3. לשטוף את נימי ההפרדה עם מים DI ב 90 psi במשך 10 דקות, ואז 50 psi במשך 10 דקות עם 0.1 M HCl, ואחריו שוב 90 psi במשך 10 דקות עם מים DI ולבסוף BGE ב 90 psi במשך 10 דקות. זוג CESI ל- MS באמצעות מקור ננו-ספריי ומתאם כפי שתואר בעבר38.
  3. התקנת נימי סיליקה מותכים חשופים לאפיון קורונה מטבולית38.
    1. מניח נימי סיליקה מותכים חשופים חדשים (אורך 90 ס"מ בקוטר פנימי של 30 מיקרומטר) למכשיר CESI בהתאם להנחיות היצרן.
  4. הכנת נימי CESI לניתוח מטבולומיה.
    1. לשטוף את נימי ההפרדה בכיוון הקדמי באמצעות 100% MeOH ב 50 psi במשך 15 דקות ולבדוק היווצרות טיפה בשקע של נימי. לשטוף הן את נימי ההפרדה ואת נימי מוליך עם BGE ב 90 פסאיי במשך 5 דקות ולהבטיח טיפות טופס בשקע של שני נימים.
    2. לשטוף את נימי ההפרדה עם מים DI ב 90 psi במשך 10 דקות, ואז 50 פסאיי במשך 10 דקות עם 0.1 M NaOH, ואחריו שוב 90 psi במשך 10 דקות עם מים DI ולבסוף BGE ב 90 psi במשך 10 דקות. זוג CESI ל- ESI-MS באמצעות מקור ננו-ספריי ומתאם כפי שתואר בעבר. 38

7. CE-MS לניתוח קורונה חלבונים

  1. דגימות resuspend בשלב 4.8 ב 20 μL של 50 mM אמוניום אצטט pH 4.0.
  2. בצע 5 psi 10 s הזרקה הידרודינמית של מדגם. נפרד באמצעות מתח הפרדה של 30 kV עם שיפוע הלחץ הבא: 0-10 דקות ב 1 psi, 10-35 דקות ב 1.5 psi ו 35-45 דקות ב 5 psi באמצעות 100 mM, pH 2.9 חומצה אצטית כמו BGE.
  3. לאסוף ספקטרום מסה בין 250-2000 m/z עם 10 העליון נתונים תלוי פיצול רכישה.
  4. בין הדגימות, לשטוף נימי עם 0.1 M HCl במשך 3 דקות ב 100 פסאיי ו 10 דקות 100 פסאיי של BGE עבור נימי הפרדה במשך 3 דקות ב 100 פסאיי עבור נימי נוזל מוליך.

8. CESI-MS לניתוח קורונה מטבולית

הערה: יש לנתח את כל הדגימות פעמיים, פעם אחת במצב חיובי לזיהוי נקודות ופעם במצב שלילי לאיתור אניונים. דגימות פלזמת הבקרה צריך להיות מנותח לפחות 5 פעמים.

  1. Resuspend NM חשוף ודגימות פלזמה שלא נחשפו מ שלב 5.4 ב 430 μL של מים DI מערבולת נמרצת במשך 2 דקות. סנן דרך מסנן ממברנה 0.1 מיקרומטר.
  2. קח 95 μL של סינון ולהוסיף 5 μL של סטנדרטים פנימיים ב 200 μM עבור cations (L-מת'ionine גופרתי) ו 400 מיקרומטר עבור אניונים (2,2,4,4-D4-חומצת לימון) ומערבולת במרץ. צנטריפוגה ב 4,000 x g ב 4 °C (50 °F) במשך 10 דקות לפני ניתוח CESI-MS.
  3. הזריקו דגימה הידרודינמית עבור 30 s (cations) ו 40 s (אניונים) ב 2 פסאיי.
  4. מטבוליטים נפרדים בחומצה אצטית של 10% עם מתח הפרדה של 30 kV במצב קדימה (cations) ומצב הפוך (אניונים). מצב הפרדה הפוכה נעזר בלחץ קדימה של פסאיי 0.5 psi על נימי ההפרדה.
  5. הגדר ספקטרומטר מסה כדי לאסוף נתונים במצב חיובי (cations) או שלילי (אניונים) מעל טווח המסה 65-1000 m/z. בין הדגימות, לשטוף נימי עם 0.1 M HCl, 0.1 M NaOH, DI מים ו BGE ב 50 psi במשך 2 דקות.

Representative Results

השיטה המתוארת היא הראשונה לאפיין הן את החלבונים והן את המטבוליטים בקורונה הביומולקולרית של NM באמצעות אותה דגימת פלזמה אנושית. שיטה זו מסוגלת לזהות >200 חלבונים ומטבוליטים >150, ובכך לאפשר את הסקירה המקיפה ביותר של הקורונה הביומולקולרית המלאה, המאפשרת הבנה משופרת של חיבור תאי NMs, ספיגה והשפעות.

השימוש ב- CESI-MS הן עבור פרוטאומיה(איור 1)והן עבור מטבולומיה(איור 2)הפרדה וזיהוי מראה חלונות הפרדה טובים בשני הנימים עבור כל גישה.

שיטה זו מסוגלת להבחין בין החלבונים בקורונה על פני מגוון רחב של הרכבי NMs, ובכך להדגים את תחולת השיטות על NMs על פני מגוון רחב של מאפיינים פיזיים וכימיים (טבלה 1).

ניתן להבחין בין טביעות האצבע הייחודיות של הקורונה המטבולית גם באמצעות הענף המטבולי של מתודולוגיה זו (איור 3). למרות שגישה זו מנצלת גישה פסיבית כדי לאפיין את הקורונה המטבולית של NM, היא עדיין מסוגלת לחשוף תובנות מעניינות על תפקידם של מטבוליטים בקורונה הביומולקולרית כמו ספיח דיפרנציאלי של איזומרים (איור 4).

Figure 1
איור 1: אלקטרופרוגרמה מופתית של הפרדת קורונה של חלבון SiO2 באמצעות CESI-MS בעקבות תקציר על חלקיקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דוגמה לאלקטרופרוגמות יונים שחולצו התקבלו מתרכובות אנדוגניות בפלזמה על ידי CE-MS. התרכובות ממוספרות הן כדלקמן: 1. אורניתין; 2. ליסין; 3. ארגינין; 4. היסטידין; 5. קריאטין; 6. גליצין; 7. אלנין; 8. ואלין; 9. איזולאוצין; 10. לאוצין; 11. סרין; 12. ת'ריונין; 13. אספרגין; 14. מת'ינין; 15. גלוטמין; 16. חומצה גלוטמית; 17. פניל-D5-אלנין; 18. פנילאלנין; 19. טירוסין; 20. פרולין; 21. מת'יונין סולפון (תקן פנימי). פורסם תחת גישה פתוחה Creative Commons CC BY רישיון ושכפל מ Zhang ואח17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: ניתוח של חלבון קורונה על פני מערך של 6 NMs. מפת חום של מחלקות חלבון שזוהו על סיליקה (SiO2),טיטניה (TiO2),טיטניה כתרים PVP (TiO2-PVP), דיפקס capped טיטניה (TiO2-Dispex), פוליסטירן ו polystyrene carboxylated NMs. אחוזים מתייחסים לשפע החלבונים ביחס לתכולת החלבון הכוללת המבוססת על שפע 3 הפפטידים העליון עבור כל חלבון. בהתחשב בהבדלים שנצפו בשפע היחסי של חלבונים בקורונה NM השונה, ברור כי פרוטוקול מוצע זה רגיש מספיק כדי להבדיל בין קורונה חלבון של NMs שונים. איור שוחזר מניתוח CESI-MS של קורונה חלבון, שפורסם תחת גישה פתוחה Creative Commons CC BY רישיון11. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Figure 3
איור 3: ניתוח ממוקד של המטבוליטים הקטיוניים בקורונה. ספיחות של cations ל- SiO2 ו- TiO2 NMs. אדום מתייחס לריכוז הראשוני של מטבוליטים ואילו כחול מתייחס לריכוז של מטבוליטים לאחר דגירה של 1 שעות עם NMs ב 37 °C (50 °F). הירידה בריכוז המטבוליט בתמיסה היא תוצאה של ספיחה מטבולית לפני השטח של NM. לא נצפתה ספיגה משמעותית של מטבוליטים עבור החלקות הפוליסטירן NMs. חלקות תיבה מייצגות את הערכים המינימליים והמקסימליים, טווחים חציוניים ובין-שווים. איור שוחזר מניתוח ממוקד CESI-MS של קורונה מטבולית שפורסם תחת גישה פתוחה Creative Commons CC BY רישיון15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח ממוקד של המטבוליטים האנוניים בקורונה עם דגש על ספירת איזומר. ספיחות של אניונים למגוון של NMs טיטניה מראה הבדלים ברורים בין isomers שונים כגון פוספטים סוכר. אדום מתייחס לריכוז הראשוני של מטבוליטים ואילו כחול מתייחס לריכוז של מטבוליטים לאחר דגירה של שעה 1 עם NM ב 37 °C (50 °F). הירידה בריכוז המטבוליט בתמיסה היא תוצאה של ספיחה מטבולית למשטח NM. לא נצפתה ספיגה משמעותית של מטבוליטים עבור SiO2 ואת החלקות NMs פוליסטירן. איור שוחזר מניתוח ממוקד CESI-MS של קורונה מטבוליט שפורסם תחת גישה פתוחה Creative Common CC BY רישיון15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח אזור שיא ממוצע של RSD זמן העברת RSD ממוצע
1928 פפטידים תוך יומיים (n=3) 15% 0.30%
27 ציטוטים תוך-יומיים (n=16) 5.80% 2.20%
27 cation בין-יומי (n=36) 8.60% 1.80%

טבלה 2: יכולת רבייה של CESI-MS טכני משכפל עבור פפטידים ומטבוליטים קטיקטיים. RSD: סטיית תקן יחסית, כמדד לשחזור. השכפול של CESI-MS במונחים של אזורי שיא וזימני הגירה הוא טוב מאוד, עם כל הניתוחים שיש RSD ממוצע <15% זמני הגירה <2.2%. תוצאות אלה ממחישות את רמת הביטחון הגבוהה שניתן לייחס לנתונים שנאספו בטכניקה זו ומאשרות כי וריאציות שזוהו נובעות מהבדלים אמיתיים בהרכב המדגם (העשרה על NMs) ולא וריאציה אנליטית. טבלה 2 נוצרת מתוצאות שהוצגו בעבר11,15.

Discussion

זוהי השיטה הראשונה המוצעת לאפיין את הקורונה הביומולקולרית המלאה המשלבת חלבונים ומטבוליטים, מאותה מדגם, באמצעות CESI-MS. היכולת לאפיין הן את החלבונים והן את המטבוליטים מאותה דגימה תגדיל באופן משמעותי את כמות הנתונים שנאספו מחשיפה ניסיונית אחת, ותאפשר תובנות חדשות על תהליך היווצרות הקורונה והשפעותיו על רעילות ויעילות NMs כננו-רפואה. יתר על כן, CESI-MS היא פלטפורמה אידיאלית לאפיון שני המעמדות של biomolecules עם רק שינוי של נימים נדרש. במבט קדימה, שיטות חדשות שפותחו עבור CE לא מימי יאפשרו ליפידומיקה להתבצע באמצעות CE-MS40 ולכן ניתן כעת לנתח חלבונים, מטבוליטים ושומנים באמצעות פלטפורמה אחת. הגישות הקונבנציונליות הנוכחיות ידרשו שתי פלטפורמות LC-MS ייעודיות, אחת לחלבון קורונה ואחת לקורונה המטבולית. לפיכך, גישה זו יכולה לאסוף כמות כפולה של נתונים באמצעות פלטפורמה אנליטית אחת.

יש כמה אזהרות לגישה זו במיוחד עם הקורונה המטבולית כמו פרוטוקול זה מציע מדידה עקיפה של הקורונה. ככזה, עלולה להתעורר בעיה כאשר רמות חילוף החומרים נמצאות בריכוזים גבוהים ביחס ל- NMs והירידה הבאה בריכוז המטבוליט במטריצה קטנה. עם זאת, בניגוד לקורונה החלבון, לא סביר כי גישה "גודל אחד מתאים לכולם" לבידוד קורונה מטבולית תפותח בשל כל NM שיש כימיה משטח ייחודית. בהמשך סביר יותר כי גישות ספציפיות של NM לבודד את הקורונה המטבולית יפותחו ויאומתו עם זאת; זה יהיה תקף רק על NM ספציפי זה. למרות זאת, CESI-MS עדיין יהיה פלטפורמה מתאימה מאוד לאפיון של מטבוליטים טעונים בקטבים ללא קשר לאופן שבו הם מבודדים. כמו כן ראוי לציין כי אם גלולה לא נוצרת במהלך שלבי הצנטריפוגה שנועדו גלולה NMs, כוח צנטריפוגלי גבוה יותר עשוי להידרש; סביר להניח שזה יקרה עם NMs פחות צפוף. זה גם קריטי כי כל שלבי הסינון הם דבקים בתוך הפרוטוקול בשל משעמם צר של נימים אלה יכולים בקלות להיות חסום אם כל חומר חלקיקי לא בוטל כראוי מן המדגם.

בעוד הקורונה החלבון כבר תחום אינטנסיבי של מחקר במשך מספר שנים היכולת לשלב את זה עם קורונה מטבולית הוא תחום עניין חדש עבור מדענים החוקרים את ממשק ביו-ננו6,14. עד כה, רוב המחקרים האלה התמקדו בשבר הלא קוטבי, השומנים שלקורונהמטבולית 9,28. שיטה זו מאפשרת אפיון של מטבוליטים קוטביים וטעונים מאוד בקורונה הכוללים מטבוליטים חשובים המעורבים בחילוף חומרים אנרגטי, גליקוליזה וסינתזת DNA. כתוצאה מכך, בשילוב עם זרימת העבודה של הפרוטאומיקס, ניתן אפיון הוליסטי יותר של הקורונה הביומולקולרית. זה מאפשר ניתוח מעמיק יותר של אינטראקציות ביו-ננו לנוע קדימה. שיטה זו מאפשרת תובנות מכאניסטיות משופרות על אנדוציטוזיס בתיווך קולטן באמצעות אינטראקציות חלבון ומטבוליט עם קולטני ממברנה. יתר על כן, ניתן לחקור אינטראקציות בין-אינטר ואינטרה קורונה בין חלבונים למולקולות קטנות; לדוגמה, לאחרונה הוכח כי החלבונים בקורונה ממלאים תפקיד מרכזי בגיוס מטבוליטים15. ראוי לציין כי התוצאות הייצוגיות באיור 3 ובאיור 4 הן כימות מוחלט של מטבוליטים, עם זאת, גישה לא טרוגה המשתמשת בניתוח נתונים רב-משתני כדי להשוות את כל תכונות CE-MS בפקדים בהשוואה לפלסמה חשופה תבהיר גם כריכת מטבוליט. לכן, יש היקף משמעותי לחקור כיצד, ואשר, מטבוליטים וחלבונים להשפיע על הגיוס שלהם לתוך קורונה NM. מחקרים נוספים אלה עשויים לסייע בתכנון קורונה כדי לייעל את המסירה של ננו-רפואה או לחשוף משוכות נוספות להתפתחותם כגון דיכוי פעילות התרופות בגלל חסימת קורונה ביומולקולרית או מיסוך פונקציות מיקוד.

CESI-MS עם קצבי זרימה בקנה מידה ננו של סביב 20 nL / min ושימוש מינימלי של ממיסים אורגניים מציע שיפור אישורים ירוקים וכלכליים על פני LC-MS סטנדרטי nanoLC-MS במונחים של שימוש ממס, האתגרים העיקריים עבור מטבולומיקה ומחקרי פרוטאומיקה, בהתאמה. CESI-MS מציע תוצאות ניתנות לשחזור גבוה הן עבור זמן ההעברה והן עבור אזור השיא, אשר משווים לטובה עם שיטות מבוססות LC-MS11,15. יתר על כן, בהשוואה nanoLC-MS, לשאת מעל אינו בעיה CESI-MS. לכן, ניקוי מערכת נרחב בין ניתוחי מדגם אינו נדרש, אשר משפר מאוד את תפוקת המדגם11.

לסיכום, זרימת העבודה המוצעת היא הראשונה לפרט גישה לאפיון מרכיבי החלבון והמטבוליט של הקורונה הביומולקולרית המלאה של NMs. זה פותח היבט חדש של אינטראקציות ביו-ננו, קורונה מטבולית, ובכך מאפשר איסוף של פי שניים נתונים מאותה מדגם, ומאפשר הבנה מלאה יותר של אינטראקציות בממשק הביו-ננו.

Disclosures

J.A.T הוא עובד של AB Sciex בריטניה בע"מ אשר משתתפים כשותף בתעשייה בפרויקט ACEnano, J.A.T וכל המחברים האחרים אין ניגוד אינטרסים בעבודה זו.

Acknowledgments

איי.ג'יי.C, J.A.T ו-I.L. מכירים במימון מהנציבות האירופית באמצעות פרויקט Horizon 2020 ACEnano (גרנט לא. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z מכיר במימון הדוקטורט ממועצת המלגות של סין (CSC, מס ' 201507060011). R.R מכיר בתמיכה הכספית של תוכנית המענקים Vidi של הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO Vidi 723.0160330).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithiothreitol Sigma 10197777001
2,2,4,4-D4-citric Simga 485438-1G Internal standard anion
Ammonium Acetate >98% Sigma A1542
Ammonium Bicarbonate >99.5% Sigma 09830
Capillary cartridge coolant Sciex 359976
CESI 8000 instrument Sciex A98089
CESI Cap Sciex B24699
CESI Vials Sciex B11648
Chloroform Sigma 650498 Toxic, use in a fume hood
Glacial Acetic acid Sigma A6283
Hydrochloric acid 1mol/L Sigma 43617
Iosoacetamide Sigma I1149
L-methionine sulfone Sigma M0876-1G Internal standard cation
Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve) Sigma 14262 Use in a fume hood
Microvials Sciex 144709
nanoVials Sciex 5043467
Neutral Surface Cartridge 30 µM ID x 90 cm total length Sciex B07368
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source Sciex B07363 B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers
OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 µm ID x 90 cm total length Sciex B07367
Phospahte buffered saline 10x Sigma P7059
Pierce C18 Tips, 100 µL bed Thermo Fisher Scientific 87784
Polystyrene 100 nm Polysciences Inc 876
Polystyrene carboxylated 100 nm Polysciences Inc 16688
Polystyrene carboxylated 1000 nm Polysciences Inc 08226
Rapigest SF (surfactant) Waters 186001860
Sequencing Grade modified Trypsin Promega V5111
SiO2 Ludox TM-40 Sigma 420786
Sodium Hydroxide solution Simga 72079
TiO2 Dispex coated Promethion particles Bespoke particles
TiO2 PVP coated Promethion particles Bespoke particles
TiO2 uncoated Promethion particles Bespoke particles

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ke, P. C., Lin, S., Parak, W. J., Davis, T. P., Caruso, F. A Decade of the Protein Corona. ACS Nano. 11 (12), 11773-11776 (2017).
  2. Sasidharan, A., Riviere, J. E., Monteiro-Riviere, N. A. Gold and silver nanoparticle interactions with human proteins: impact and implications in biocorona formation. Journal of Materials Chemistry B. 3 (10), 2075-2082 (2015).
  3. Albanese, A., et al. Secreted biomolecules alter the biological identity and cellular interactions of nanoparticles. ACS Nano. 8 (6), 5515-5526 (2014).
  4. Lynch, I., Dawson, K. A. Protein-nanoparticle interactions. Nano Today. 3 (1-2), 40-47 (2008).
  5. Tenzer, S., et al. Rapid formation of plasma protein corona critically affects nanoparticle pathophysiology. Nature Nanotechnology. 8 (10), 772-781 (2013).
  6. Chetwynd, A. J., Lynch, I. The rise of the nanomaterial metabolite corona, and emergence of the complete corona. Environmental Science: Nano. 7 (4), 1041-1060 (2020).
  7. Lee, J. Y., et al. Analysis of lipid adsorption on nanoparticles by nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 1-10 (2018).
  8. Pink, M., Verma, N., Kersch, C., Schmitz-Spanke, S. Identification and characterization of small organic compounds within the corona formed around engineered nanoparticles. Environmental Science: Nano. 5 (6), 1420-1427 (2018).
  9. Chetwynd, A. J., Wheeler, K. E., Lynch, I. Best practice in reporting corona studies: Minimum information about Nanomaterial Biocorona Experiments (MINBE). Nano Today. 28, 100758 (2019).
  10. Zhang, H., et al. Quantitative proteomics analysis of adsorbed plasma proteins classifies nanoparticles with different surface properties and size. Proteomics. 11 (23), 4569-4577 (2011).
  11. Faserl, K., Chetwynd, A. J., Lynch, I., Thorn, J. A., Lindner, H. H. Corona isolation method matters: Capillary electrophoresis mass spectrometry based comparison of protein corona compositions following on-particle versus in-solution or in-gel digestion. Nanomaterials. 9 (6), 898 (2019).
  12. Nasser, F., Lynch, I. Secreted protein eco-corona mediates uptake and impacts of polystyrene nanoparticles on Daphnia magna. Journal of Proteomics. 137, 45-51 (2016).
  13. Hellstrand, E., et al. Complete high-density lipoproteins in nanoparticle corona. FEBS Journal. 276 (12), 3372-3381 (2009).
  14. Grintzalis, K., Lawson, T. N., Nasser, F., Lynch, I., Viant, M. R. Metabolomic method to detect a metabolite corona on amino functionalised polystyrene nanoparticles. Nanotoxicology. , 1-12 (2019).
  15. Chetwynd, A. J., Zhang, W., Thorn, J. A., Lynch, I., Ramautar, R. The nanomaterial metabolite corona determined using a quantitative metabolomics approach: A pilot study. Small. , (2020).
  16. Chetwynd, A. J., Guggenheim, E. J., Briffa, S. M., Thorn, J. A., Lynch, I., Valsami-Jones, E. Current application of capillary electrophoresis in nanomaterial characterisation and its potential to characterise the protein and small molecule corona. Nanomaterials. 8 (2), 99 (2018).
  17. Zhang, W., et al. Assessing the suitability of capillary electrophoresis-mass spectrometry for biomarker discovery in plasma-based metabolomics. Electrophoresis. , 00126 (2019).
  18. Ramautar, R., Somsen, G. W., de Jong, G. J. CE-MS for metabolomics: Developments and applications in the period 2016-2018. Electrophoresis. 40 (1), 165-179 (2019).
  19. Sarg, B., Faserl, K., Lindner, H. H. Identification of novel site-specific alterations in the modification level of myelin basic protein isolated from mouse brain at different ages using capillary electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 17 (19), 1700269 (2017).
  20. Faserl, K., Sarg, B., Maurer, V., Lindner, H. H. Exploiting charge differences for the analysis of challenging post-translational modifications by capillary electrophoresis-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1498, 215-223 (2017).
  21. Zhang, Z., Qu, Y., Dovichi, N. J. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for bottom-up proteomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 108, 23-37 (2018).
  22. Shen, X., et al. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for top-down proteomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 120, 115644 (2019).
  23. Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (2), 885-892 (2012).
  24. Faserl, K., Kremser, L., Müller, M., Teis, D., Lindner, H. H. Quantitative proteomics using ultralow flow capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 87 (9), 4633-4640 (2015).
  25. Faserl, K., Sarg, B., Kremser, L., Lindner, H. Optimization and evaluation of a sheathless capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry platform for peptide analysis: comparison to liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (19), 7297-7305 (2011).
  26. Segers, K., et al. CE-MS metabolic profiling of volume-restricted plasma samples from an acute mouse model for epileptic seizures to discover potentially involved metabolomic features. Talanta. 217, 121107 (2020).
  27. Chetwynd, A. J., David, A. A review of nanoscale LC-ESI for metabolomics and its potential to enhance the metabolome coverage. Talanta. 182, 380-390 (2018).
  28. Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-Mass spectrometry at trial by metabo-ring: Effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
  29. Faria, M., et al. Minimum information reporting in bio-nano experimental literature. Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).
  30. Leong, H. S., et al. On the issue of transparency and reproducibility in nanomedicine. Nature Nanotechnology. 14 (7), 629-635 (2019).
  31. Kaur, I., et al. Dispersion of nanomaterials in aqueous media: Towards protocol optimization. Journal of Visualized Experiments. (130), e56074 (2017).
  32. Bihari, P., et al. Optimized dispersion of nanoparticles for biological in vitro and in vivo studies. Particle and Fibre Toxicology. 5 (1), 1-14 (2008).
  33. Taurozzi, J. S., Hackley, V. A., Wiesner, M. R. Ultrasonic dispersion of nanoparticles for environmental, health and safety assessment - and recommendations. Nanotoxicology. 5 (4), 711-729 (2011).
  34. Lu, P. J., et al. Methodology for sample preparation and size measurement of commercial ZnO nanoparticles. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (2), 628-636 (2018).
  35. Langevin, D., et al. Inter-laboratory comparison of nanoparticle size measurements using dynamic light scattering and differential centrifugal sedimentation. NanoImpact. 10, 97-107 (2018).
  36. Lee, S., Bi, X., Reed, R. B., Ranville, J. F., Herckes, P., Westerhoff, P. Nanoparticle size detection limits by single particle ICP-MS for 40 elements. Environmental Science and Technology. 48 (17), 10291-10300 (2014).
  37. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).
  38. Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples. Journal of Visualized Experiments. , e54535 (2016).
  39. Faserl, K., Sarg, B., Lindner, H. H. Application of CE-MS for the analysis of histones and histone modifications. Methods. , (2020).
  40. Azab, S., Ly, R., Britz-Mckibbin, P. Robust method for high-throughput screening of fatty acids by multisegment injection-nonaqueous capillary electrophoresis-mass spectrometry with Sstringent quality control. Analytical Chemistry. 91 (3), 2329-2336 (2019).
  41. Zhang, X., Pandiakumar, A. K., Hamers, R. J., Murphy, C. J. Quantification of lipid corona formation on colloidal nanoparticles from lipid vesicles. Analytical Chemistry. 19 (24), 14387-14394 (2018).

Tags

כימיה גיליון 164 קורונה ביו-מולקולית נרכשה ננו-חומרים מטבולומיקה פרוטאומיקה CE-MS ננו-רפואה אלקטרופורזה נימית CESI-MS
ספקטרומטריית מסה אלקטרופורזיס נימית גישות לאפיון החלבון וקורונה מטבולית שנרכשו על ידי ננו-חומרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chetwynd, A. J., Zhang, W., Faserl,… More

Chetwynd, A. J., Zhang, W., Faserl, K., Thorn, J. A., Lynch, I., Ramautar, R., Lindner, H. H. Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials. J. Vis. Exp. (164), e61760, doi:10.3791/61760 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter