Summary
여기서 우리는 모세관 전기포고증 - 질량 분석 접근법을 사용하여 생물유체로부터 나노 물질에 의해 획득된 완전한 생체 분자 코로나, 단백질 및 대사산물을 특성화하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
주변 생물 성 행렬에서 나노 물질 (NM)의 표면에 생체 분자의 흡착은 코로나 형성하기 위해 지난 10 년 동안 관심을 왔습니다. 바이오 나노 인터페이스에 대한 관심은 생체 분자 코로나 (coona)가 NM에 생물학적 정체성을 부여하여 신체가 "자기"로 식별하게한다는 사실에서 발생합니다. 예를 들면, 이전 연구는 코로나에 있는 단백질이 세포 조리에 영향을 미치기 위하여 막 수용체와 상호 작용할 수 있다는 것을 보여주었고 코로나는 NM의 세포 인신 매매및 그들의 최종 독성에 책임 있다는 것을 확립했습니다. 현재까지 대부분의 연구는 단백질 코로나에 초점을 맞추고 코로나에 포함된 대사 산물의 가능한 영향 또는 완전한 생체 분자 코로나에 있는 성분 간의 시너지 효과를 간과했습니다. 이와 같이, 이 작품은 상향식 프로테오믹스와 메타볼로믹스를 병렬로 사용하여 생체 분자 코로나의 단백질과 대사산물 성분을 모두 특성화하는 방법론을 보여줍니다. 여기에는 단백질 회복을 증가시키는 데 사용되는 계면활성제를 사용한 단백질 코로나의 입자 내 다이제스트와 NM 노출 전후의 대사산물 행렬을 분석하여 대사산물 코로나의 수동특성화가 포함됩니다. 이 작품은 NM 코로나 특성화를 위한 새로운 기술로 모세관 전기포고(CESI-MS)를 소개합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 CESI-MS가 NM이 획득한 단백질과 대사산물 코로나 모두의 신뢰할 수 있는 특성화에 어떻게 사용될 수 있는지 를 보여줍니다. CESI-MS로의 이동은 필요한 시료의 부피를 크게 감소시킵니다 (기존의 액체 크로마토그래피에 비해 - 질량 분석법 (LC-MS) 접근 법) 샘플의 최소 5 μL에서 가능한 다중 주사와 함께, 부피 제한된 샘플에 이상적. 또한 CESI-MS의 낮은 유량(<20 nL/min)과 유기 용매의 필요성을 제거하는 수성 전해질의 사용으로 인해 LC-MS에 대한 분석의 환경적 결과가 감소합니다.
Introduction
생체분자가 NM에 흡착되는 나노물질(NM) 표면과 생물학적 행렬 사이의 인터페이스에서 바이오 나노 상호 작용은 나노안전 및 나노의학1을뒷받침하는 연구의 강렬한 영역이다. 흡착 생체 분자의이 층은 NM에 생물학적 정체성을 부여, 따라서 세포는 "자기"로 식별, 이후 세포 섭취량에 영향을 미치는 세포 섭취량, 분포 및 생물학적 종점2,3,4. 바이오 나노 연구의 대부분은 코로나 내의 단백질에 초점을 맞추고, 단백질이 다른 조성물의 NM 사이에 정량적으로 그리고 질적으로 변화한다는 것을입증했습니다 5. 이러한 변화는 조성및 염분함량을포함하는 생물학적 매트릭스의 특성 외에 크기, 기능화 및 재료와 같은 NM의 특성 모두에 의존한다. 바이오 나노 인터페이스에 대한 관심의 상승 영역은 NMs6에흡착 대사 산물이다. 몇몇 연구 결과는, 단백질과 같이, NM 속성은 코로나에 있는 대사산물의 조성을 결정하는 중요한 요인이고 NM 노출6,7,8의생물학 결과에 영향을 미칠 수 있다는 것을 보여주었습니다.
생체 분자 코로나의 연구에서는 코로나 내의 특성, 코로나 형성, 생체 분자의 분리, 질적 또는 정량적 질량 분석 및 식별9을통한 검출에 4개의 뚜렷한 단계가 있다. 현재까지, SDS-PAGE 실행 완충제, 용매 및 염 추출 또는 NM 의 표면에 있는 단백질의 직접 소화에서 끓는 것을 포함하여 단백질 코로나를 격리하기 위하여 기술의 범위가 채택되었습니다. 코로나내 대사산물의 관점에서, 용매를 이용한 다양한 방법이나용액으로제안된 NM의 용해8,10,11로더욱 복잡하다. 그러나, 단백질 코로나와는 달리 "한 가지 크기는 모두 맞는" 접근법은 메타볼로메와 가능한 NM의 다양성에 의해 점유된 넓은 화학 공간으로 인해 NM에서 대사산물의 분리에 적용될 가능성이 낮습니다. 대안적인 접근법은 NM 노출 전후에 NM에 대사산물 농도의 차이를 특징으로 하는것입니다.
이 대체 접근법은 모든 생물 유체 및 NM에 적용 될 것이며 두 배의 많은 분석이 필요하지만 결과적으로 대사 산물 코로나훨씬 더 정확한 측정을 제공하며 NM 표면에서 낮은 대사 산물 회수의 위험이 없습니다.
생체 분자 코로나 분석에 대한 두 번째 단계는 생체 분자의 검출이다. 전통적으로 코로나단백질을 위해, 이것은 나노 LC-MS, 프로테오믹스의 주력의 송금이었습니다; NMR13, 1D및 2D SDS-PAGE와 같은 다른 접근 방식도 적용되었습니다. 대사산물 코로나 LC-MS7,GC-MS8 및 직접 주입 질량 분석법의 관점에서14를활용하였습니다. 그러나, 새로운 접근법은 최근에 견인력을 얻기 시작했다, 즉 모세관 전기 포근질량 분광법 (CE-MS)11,15 및 NM 의 다양한 물리적 및 화학적 특성을 특성화하는 독립 실행형 기술로 NM 실험실에 존재하고있다16. CE-MS는 나노LC-MS 및 GC-MS에 직교 분리 기술이며 고극성 및 충전 된 대사 산물17,18의검출을 가능하게 할 수 있습니다. 더욱이, CE-MS는 단백질의 분석에 적합하며 인산화 및 글리코실화(19,20,21,22)와같은 이들의 번역 후 변형에 적합하다. 최종 단계, 식별 및 데이터 분석은 정량적/ 질적 또는 표적/표적/표적 접근 방식이 사용되는 경우에 따라 여러 가지 방법으로 수행될 수 있지만, 그러나, 이 프로토콜의 송금 외부에 떨어진다.
CEI-MS는 CE와 나노ESI 인터페이스의 조합으로, 칼집없는 인터페이스를 활용한 CE 기술의 최근 진출이다. 이를 통해 초저유량 CE(<20nL/min)를 희석 없이 고해상도 질량 분광계에 직접 연결할 수 있어 검출 감도23,24,25를현저히 개선하였다. CESI-MS는 매우 민감한분석(26)을유지하면서 부피 제한 샘플(< 10μL)을 분석할 수 있게 한다. CESI-MS는 또한 재현성27,28,처리량의 관점에서 프로테오믹스 및 메타볼로믹스에 사용되는 기존의 낮은 유량 나노LC-MS 접근법과 호의적으로 비교하고, 완전한 생체 분자 코로나 특성화에 대한 흥미로운 전망을 만드는 이월.
바이오 나노 상호 작용의 분석을 위한 CESI-MS의 잠재력을 강조하기 위해 이 작품은 완전한 생체 분자 NM 코로나의 단백질 및 대사 산물 양상으로부터 데이터를 최대화하는 방식으로 단일 인간 혈장 샘플로부터 NM 생체 분자 코로나분리에 필요한 샘플 준비를 설명한다. 우리는 인간 혈장의 사용에 보고하는 동안, 이 프로토콜은 혈액 혈청과 같은 그밖 생물액체, 완전한 세포 배양 매체, 세포 lysate, 뇌척수액 또는 소변과 같은 그밖 생물액체에 동등하게 적일 것입니다. 이 두 성분의 분석 (단백질 및 대사 산물) 다음 단백질 코로나 및 벌거 벗은 융합 실리카 모세 혈관에 대한 중성 코팅 CESI 모세 혈관을 사용하여 설명 될 것이다 양이온 및 음이온 대사 산물 모두에 대한.
Protocol
인간 생물 유체의 사용은 라이덴 대학과 인스 브루크 의과 대학에서 IRB 프로토콜 지침에 따라 승인되었다. 인간 또는 동물 생물유체를 조사하는 경우, 연구기관의 윤리적 승인이 필요하며, 본 프로토콜에 나타난 결과의 경우 입수되었다. 또한향후 작업9,29,30에서데이터의 투명성과 재사용성을 보장하기 위해 적절한 보고도 수행해야 합니다.
1. 배경 전해질 준비 (BGE)
참고: 모든 용매는 적절한 연기 후드로 준비해야 하며, 적절한 개인 보호 장비는 모든 단계(랩코트, 장갑 및 고글)에 사용해야 합니다. 각 단계에서는 유리제품에서 침출된 염분으로 시료의 손실과 오염을 최소화하기 위해 낮은 결합 플라스틱 바이알이 필요합니다.
- 메타볼로믹스를 위해 매일 10% 아세트산 BGE(v/v), pH 2.2를 준비한다.
- 10mL 체피플라스크에 아세트산 1mL을 추가하고, 그 다음에는 현수선에 탈이온화된(DI) 물을 첨가하고 철저한 혼합을 한다.
- 프로테오믹스를 위해 매일 100mM 아세트산, pH 2.9를 준비한다.
- 10mL 체피 플라스크에 아세트산 57 μL을 추가하고, 표시된 라인에 DI 물을 첨가하고 철저한 혼합을 한다.
2. NM 준비
- 공표된 가이드라인31,32,33을사용하여 물에NM을적극적으로 분산시한다.
참고: 이 프로토콜의 개발에서, 7 개의 NM은 다음과 같이 사용되었다 : 100 및 1,000 nm 카박스 폴리스티렌은 각각 단백질과 대사 산물 코로나에 사용되었다. 100 nm 수정되지 않은 폴리스티렌 NM, 13 nm 아나타제 TiO2 NM은 폴리아크릴레이트 또는 PVP 폴리머와 22 nm 수정되지 않은 SiO2 NM로 수정되지 않았거나 코팅되어 단백질 과 대사 산물 코로나 모두에 사용되었습니다. 이 메서드는 이러한 NM을 사용하여 개발 및 시연되었지만 이 방법은 다양한 NM 컴포지션, 크기, 모양 및 형태학에 적용할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. - 제타시저(34)를이용한 제타 전위로서 다이나믹 광 산란34,35,단일 입자 유도 결합 플라즈마 질량 분광법36,나노입자 추적 분석37,또는 송신 전자 현미경 및 표면 전하를 이용하여 입자 크기를 특성화한다.
3. 생체 분자 코로나 형성
- 인간 플라즈마 (또는 선택의 생체 유체)의 2 mL을 1 mL 알리쿼트로 분할하고, 하나는 대사 산물 및 단백질 코로나및 플라즈마 메타볼로메 특성화를 위한 두 번째.
- 체모믹서에서 500rpm에서 부드럽게 혼합하면서 인간 플라즈마에 1 mg/mL을 37°C로 배양합니다. 4°C에서 15분 동안 4,000 x g의 샘플을 배양 원심분리하여 NM을 펠릿하였다.
- 대사 산물 코로나 분석을 위한 플라즈마 상체를 수집합니다. 단백질 코로나 특성화를 위한 NM 단백질 코로나 복합체를 유지하십시오.
4. 단백질 코로나 절연
- NM 단백질 복합체(펠릿)를 10x PBS 버퍼의 1mL로 재중단하고 2분 동안 적극적으로 소용돌이하여 불바운드 단백질을 제거합니다. PBS 용액을 4,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리하여 NM을 펠릿으로 만들고 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 조심스럽게 제거합니다.
- 1mL의 암모늄 중탄산염 완충(ABC) (100mMM, pH 8.0) 및 소용돌이를 2분 동안 격렬하게 재보페식하여 불합리한 단백질과 원치 않는 염을 제거한다. 4,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리기에서 NM을 펠릿; 상체를 제거하고 폐기합니다. 이 단계를 반복합니다.
- 10mMm 디티더리톨을 함유한 ABC 버퍼(100mM pH 8)의 20 μL에서 NM 단백질 펠릿을 용해시켜 단백질 이황화물 결합을 줄입니다. 56°C에서 30분 동안 환원을 배양한다.
- 단백질을 소화하려면 0.1% 계면활성제를 함유한 ABC의 20 μL에 시퀀싱 등급 트립신 2μg을 추가합니다. 37°C에서 16h의 다이제스트 용액을 배양한다.
- 100mM ABC에서 55mM에서 20 μL의 요오도아세타미드를 첨가하여 샘플을 알킬레이트하고 실온에서 20분 동안 배양한다.
- 0.1 M HCl의 20 μL을 추가하여 계면 활성제를 잘라내고 실온에서 10 분 동안 둡니다.
- C18 포장 된 탈염 파이펫 팁을 사용하여 분화 및 탈염 펩티드를 풍부하게합니다.
- 80 μL 0.1% 아세토니틀릴 5회, 80 μL 0.1% 포믹산 5회, 시료 10회, 황산 시료 80μL 0.1% 0.1%로 샘플을 5배, 비염 시료를 5배, 시료를 80L μ 0.1%로 2배, 피킹하여 80L μ 0.1%로 샘플을 2배, 비산 70%로 2배 를 유도한다.
- 리오필화 시료를 분석할 때까지 -20°C에 저장합니다.
5. 대사산물 코로나 격리
- 3.3단계에서 NM 플라즈마 배양에서 제어 플라즈마 및 상체를 취하고 시료 준비 중에 얼음을 유지하십시오.
- 각각 50 μL을 별도의 바이알로 가져 와서 DI 물로 10에서 1을 희석하십시오. 각 희석 된 샘플의 50 μL을 가져 와서 5.3 단계를 위해 새로운 바이알로 이동하십시오.
- 200 μL 클로로폼, 250 μL 메탄올 및 350 μL DI 물을 넣고 2분 동안 격렬하게 소용돌이 혼합물을 넣습니다. 4°C에서 20,800 x g에서 10 분 동안 원심 분리기.
- 500 μL의 상피를 가지고 4 °C에서 10,000 x g에서 2 시간 동안 3 kDa 원심 필터를 통해 필터링하십시오. 430 μL의 울트라 필로테레이트를 복용하고 속도 진공 청소기로 건조하십시오. 이제 분석 전에 샘플을 동결할 수 있습니다.
6. CESI-MS 시스템 준비38
참고: 모세혈관을 설치하기 전에 모세혈관의 입구와 출구 끝이 손상되지 않고 모세혈관에 눈에 보이는 파손이 없는지 확인합니다.
- 단백질 코로나 분석을 위한 중성 코팅모세관의 설치(39).
- 제조업체 지침에 따라 새로운 중성 코팅 모세관(30μm 내부 직경의 90cm 길이)을 CESI 기기에 넣습니다.
- 프로테오믹 분석을 위한 CESI 모세혈관 제제.
- 100 psi에서 5 분 동안 HCl의 100 mMM을 사용하여 전방 방향으로 분리 모세관을 플러시하고 모세관의 출구에서 액적 형성을 확인하십시오. BGE를 100 psi에서 10분 동안 플러시 한 다음 100 psi에서 30 분 동안 DI 물을 플러시하십시오 (이것은 새로운 모세 혈관에만 필요합니다).
- 분리 모세관과 전도성 모세관을 90 psi에서 5분 동안 BGE로 플러시하고 두 모세혈관의 출구 끝에 액적 형태를 보장합니다.
- 10분 동안 90psi에서 DI 물로 분리 모세관을 플러시한 다음 0.1 M HCl로 10분 동안 50psi를, 디워터로 10분 동안 90psi, 마침내 BGE가 90 psi에서 10분 동안 90psi로 뒤를 이었다. 이전에 설명된 바와 같이 나노 스프레이 소스 및 어댑터를 사용하여 MS에 CESI를 결합하던38.
- 대사 산물 코로나 특성화38에대한 베어 융합 실리카 모세관의 설치.
- 제조업체 지침에 따라 CESI 기기에 새로운 베어 융합 실리카 모세관(길이 30μm 의 길이 90cm)을 배치합니다.
- 메타볼로믹스 분석을 위한 CESI 모세혈관 제제.
- 15분 동안 50 psi에서 100% MeOH를 사용하여 전방 방향으로 분리 모세관을 플러시하고 모세관의 출구에서 액적 형성을 확인합니다. 분리 모세관과 전도성 모세관을 90 psi에서 5분 동안 BGE로 플러시하고 두 모세혈관의 출구에서 액적 형태를 보장합니다.
- 10분 동안 90psi에서 DI 물로 분리 모세관을 플러시한 다음, 0.1 M NaOH로 10분 동안 50psi를, 디워터로 10분 동안 90psi, 마침내 BGE가 90 psi에서 10분 동안 10분 동안 다시 뒤를 이었다. 이전에 설명한 바와 같이 나노 스프레이 소스 및 어댑터를 사용하여 ESI-MS에 CESI를 결합하십시오. 38
7. 단백질 코로나 분석을 위한 CE-MS
- 50mM 암모늄 아세테이트 pH 4.0의 20 μL에서 4.8 단계에서 샘플을 재차 판하한다.
- 시료의 5 psi 10s 유체 역학 주입을 수행합니다. 다음 압력 그라데이션과 30 kV 분리 전압을 사용하여 분리: 1 psi에서 0-10 분, 1.5 psi에서 10-35 분, 100 mM을 사용하여 5 psi에서 35-45 분, pH 2.9 아세트산을 BGE로 사용하십시오.
- 상위 10개 데이터 종속 조각화 획득을 통해 250-2000 m/z 사이의 질량 스펙트럼을 수집합니다.
- 샘플 사이, 0.1 M HCl을 가진 헹구는 100 psi에서 3 분 및 분리 모세관을 위한 BGE의 10 분 100 psi 및 전도성 액체 모세관을 위한 100 psi에서 3 분 동안.
8. 대사 산물 코로나 분석을위한 CESI-MS
참고: 모든 샘플을 양온 검출을 위한 양수 모드로 한 번, 음의 검출을 위해 음수 모드로 두 번 분석해야 음이온 검출을 위해. 제어 플라즈마 샘플을 5회 이상 분석해야 합니다.
- D 수의 430 μL에서 5.4 단계에서 노출 및 노출되지 않은 플라즈마 샘플을 다시 중단하고 2 분 동안 적극적으로 소용돌이합니다. 0.1 μm 멤브레인 필터를 통해 필터링합니다.
- 95μL의 여과를 복용하고 양온 (L-메티오닌 설폰)에 대한 200 μM에서 내부 표준의 5 μL을 추가하고 음이온 (2,2,4,D4-구연산) 및 소용돌이에 대해 400 μM을 적극적으로 추가하십시오. 심분리기4,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 세심분리기 분석 전에.
- 2 psi에서 30 s (양이온) 및 40 s (음이온)에 대한 유체 역학적으로 샘플을 주입하십시오.
- 전방(양이온) 및 역(anions) 모드에서 30kV의 분리 전압을 가진 10% 아세트산에 분리된 대사산물. 역분리 모드는 분리 모세관에 대한 0.5 psi 전방 압력을 지원한다.
- 질량 분광계를 설정하여 질량 범위 65-1000 m/z에 걸쳐 양수(양이온) 또는 음수(음이온) 모드로 데이터를 수집합니다. 샘플 사이, 0.1 M HCl, 0.1 M NaOH, DI 물 및 BGE를 2 분 동안 50 psi로 헹구는 모세관.
Representative Results
상기 기술된 방법은 동일한 인간 혈장 샘플을 이용하여 NM 생체 분자 코로나내 단백질과 대사산물을 모두 특성화하는 최초의 방법이다. 이 방법은 >200 단백질 과 >150 대사 산물을 검출할 수 있으므로 완전한 생체 분자 코로나에 대한 가장 포괄적인 개요를 확인할 수 있으므로 NM 세포 부착, 섭취 및 영향에 대한 향상된 이해를 가능하게 합니다.
프로테오믹스(도1)와메타볼로믹스(도2)분리 및 검출모두에 대한 CESI-MS의 사용은 각 접근법에 대해 두 모세혈관에 좋은 분리 창을 나타낸다.
이 방법은 광범위한 NM 조성물에 걸쳐 코로나내 단백질을 구별할 수 있으므로 광범위한 물리적 및 화학적특성(표 1)에걸쳐 NM에 대한 방법의 적용가능성을 입증할 수 있다.
대사 산물 코로나의 독특한 지문은 또한이 방법론의 메타볼로믹 분기를 사용하여 구별 될 수있다(도 3). 이러한 접근법은 NM 대사산물 코로나 특성화에 수동적인 접근법을 활용하지만 여전히 이소머의 차동 흡착과 같은 생물분자 코로나에서 대사산물의 역할에 대한 흥미로운 통찰력을 발견할 수있다(도 4).
도 1: 시오2 단백질 코로나 분리의 예시 전체는 온 파티클 다이제스트 다음 CESI-MS를 이용하여 분리한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: CE-MS에 의해 플라즈마내내생 화합물로부터 얻어낸 추출된 이온 전기페로그램의 예. 번호가 매겨진 화합물은 다음과 같습니다: 1. Ornithine; 2. 리신; 3. 아르기닌; 4. 히스티딘; 5. 크레아틴; 6. 글리신; 7. 알라닌; 8. 발린; 9. 이솔루신; 10. 류신; 11화 세린; 12화 스레오닌; 13. 아스파라진; 14화 메티오닌; 15. 글루타민; 16. 글루타믹 산; 17화 페닐-D5-알라닌; 18. 페닐알라닌; 19화 티로신; 20. 프롤린; 21. 메티오닌 설포네 (내부 표준). 오픈 액세스 크리에이티브 커먼즈 CC BY 라이선스에 따라 게시및 장 외17에서재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 6개의 NM의 배열에 걸쳐 단백질 코로나분석. 실리카(SiO2),티타니아(TiO2),PVP 캡티타니아(TiO 2-PVP), 디스펙스 캡 티타니아(TiO2-Dispex),폴리스티렌 및 카박스 폴리스티렌 NM에 명시된 단백질 클래스의 히트 맵은 단백질 함량이 3%에 달하는 단백질 함량을 기준으로 단백질의 풍부함을 나타낸다. 다른 NM 코로나에서 단백질의 상대적 풍부에서 관찰된 차이를 감안할 때, 이 제안된 프로토콜은 다른 NMs의 단백질 코로나 를 구별하기에 충분히 민감하다는 것이분명합니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: NM 코로나에서 의 양이온 대사 산물의 표적 분석. SiO2 및 TiO2 NMs에 대한 양이온의 흡착은 대사 산물의 초기 농도를 의미하는 반면, 파란색은 37°C에서 NM을 가진 1h 배양 후 대사 산물의 농도를 의미한다. 용액의 대사산물 농도의 감소는 NM 표면에 대사산물 흡착의 결과입니다. 폴리스티렌 NM. Box 플롯에 대해 대사 산물의 중요한 흡착은 최소 값, 중앙값 및 중사 범위를 나타내지 않았다. 오픈 액세스 크리에이티브 커먼즈 CC BY 라이선스15에따라 게시된 대사산물 코로나에 대한 CESI-MS 표적 분석에서 재현된 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 이소성 흡착에 초점을 맞춘 NM 코로나에서 의 성대사 산물의 표적 분석. 다양한 티타니아 NM에 대한 음이온의 흡착은 설탕 인산염과 같은 다양한 이좀사이의 명확한 차이를 보여줍니다. 빨간색은 대사 산물의 초기 농도를 의미하는 반면 블루는 37°C에서 NM을 가진 1h 배양 후 대사 산물의 농도를 지칭한다. 용액의 대사산물 농도감소는 NM 표면에 대사산물 흡착의 결과입니다. SiO2및 폴리스티렌 NM. Box 플롯에 대해 대사 산물의 유의한 흡착이 관찰되지 않았으며 상자 플롯은 최소 및 최대 값, 중앙값 및 중사 범위를 나타냅니다. 오픈 액세스 크리에이티브 커먼 CC BY 라이선스15에따라 게시된 대사산물 코로나에 대한 CESI-MS 표적 분석에서 재현된 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 애일리테 | 평균 RSD 피크 영역 | 평균 RSD 마이그레이션 시간 |
| 1928 펩티드 장중 (n=3) | 15% | 0.30% |
| 장중 27개의 양이온(n=16) | 5.80% | 2.20% |
| 27 매일 양이온 (n =36) | 8.60% | 1.80% |
표 2: 펩타이드 및 양이온 대사 산물에 대한 CESI-MS 기술 복제의 재현성. RSD: 상대적 표준 편차, 재현성의 척도로. 피크 영역 및 마이그레이션 시간의 측면에서 CESI-MS의 재현성은 매우 좋으며, 모든 분석자들은 평균 RSD <15% 및 마이그레이션 시간 < 2.2%를 가지고 있습니다. 이러한 결과는 이 기술을 사용하여 수집된 데이터에 기인할 수 있는 높은 신뢰도를 보여주고 검출된 변화는 분석 적 변화가 아닌 샘플 조성(NM에 대한 농축)의 진정한 차이 때문임을 확인합니다. 표 2는 이전에 제시된 결과로부터 생성된다11,15.
Discussion
이것은 CESI-MS를 사용하여 동일한 샘플에서 단백질과 대사 산물을 통합하는 완전한 생체 분자 코로나특성화하기 위해 제안된 첫 번째 방법입니다. 동일한 샘플에서 단백질과 대사산물을 모두 특성화하는 능력은 단일 실험 노출에서 수집된 데이터의 양을 크게 증가시켜 코로나 형성 과정에 대한 새로운 통찰력과 NM독성 및 나노 의약품의 효능에 미치는 영향에 대한 새로운 통찰력을 가능하게 합니다. 또한 CESI-MS는 모세관의 변화만으로 두 종류의 생체 분자를 특성화하는 이상적인 플랫폼입니다. 앞으로 비수성 CE를 위해 개발된 새로운 방법은 CE-MS40을 사용하여 리피도믹스를 수행할 수 있게 되므로 이제 단일 플랫폼을 사용하여 단백질, 대사산물 및 지질을 분석할 수 있게 되었다. 현재 기존의 접근법은 단백질 코로나용과 대사산물 코로나용 2개의 전용 LC-MS 플랫폼이 필요합니다. 따라서 이 방법은 단일 분석 플랫폼을 사용하여 두 배의 데이터를 수집할 수 있습니다.
이 프로토콜은 코로나의 간접 측정을 제안하기 때문에 특히 대사 산물 코로나이 접근 방식에 대한 몇 가지 주의 사항이 있습니다. 이와 같이, 대사산물 수준이 NM에 비해 고농도로 존재하고 행렬에서 대사산물 농도가 감소할 때 문제가 발생할 수 있다. 그러나, 단백질 코로나와는 달리, 대사 산물 코로나 격리에 대한 "하나의 크기는 모두에 맞는" 접근 방식이 각 NM에 의한 독특한 표면 화학으로 인해 개발될 가능성은 낮습니다. 앞으로 대사 산물 코로나 격리를 위한 NM 특이적 접근법이 개발되고 검증될 가능성이 더 높습니다. 이는 특정 NM에만 적용됩니다. 그럼에도 불구하고, CESI-MS는 여전히 극충전 대사 산물의 특성화에 매우 적합한 플랫폼이 될 것입니다. 또한 주목할 만한 점은 탄환이 NM을 펠릿하도록 설계된 원심 분리 단계 중에 펠릿이 형성되지 않으면 원심력이 높을 수 있다는 점입니다. 밀도가 낮은 NM에서 발생할 가능성이 큽분입니다. 또한 미립자 물질이 시료에서 적절히 제거되지 않으면 모세혈관의 좁은 보어로 인해 모든 필터링 단계가 프로토콜 내에서 부착되는 것이 중요합니다.
단백질 코로나는 수년 동안 연구의 강렬한 영역이었지만 대사 산물 코로나와 결합하는 능력은 바이오 나노 인터페이스6,14를조사하는 과학자들에게 새로운 관심 분야이다. 현재까지, 이러한 연구의 대부분은 대사 산물 코로나9,28의비 극성, 지질 분획에 초점을 맞추고있다. 이 현재 방법은 에너지 대사, 글리코리시스 및 DNA 합성에 관여하는 중요한 대사산물을 포함하는 코로나에서 극성 및 충전된 대사산물의 특성화를 가능하게 한다. 그 결과, 프로테오믹스 워크플로우와 결합될 때, 생체 분자 코로나보다 더 전체적인 특성화가 가능하다. 이를 통해 바이오 나노 상호 작용에 대한 보다 심층적인 분석을 진행할 수 있습니다. 이 방법은 단백질및 막 수용체와의 대사 산물 상호 작용을 통해 수용체 매개 내분비증에 대한 향상된 기계론적 통찰력을 가능하게 합니다. 더욱이, 단백질과 작은 분자 사이 인터 및 내 코로나 상호 작용탐구될 수 있습니다; 예를 들어, 최근에코로나내 단백질이대사산물(15)의모집에 핵심적인 역할을 한다는 것이 나타났다. 도 3 및 도 4의 대표적인 결과는 대사 산물의 절대적인 정량화이지만, 다변량 데이터 분석을 사용하여 노출된 플라즈마에 비해 컨트롤의 모든 CE-MS 기능을 비교하는 표적 접근 방식은 대사 산물 결합을 해명할 것이다. 따라서 대사 산물과 단백질이 NM 코로나에 대한 각각의 모집에 미치는 영향을 조사하는 중요한 범위가 있습니다. 이러한 추가 연구는 코로나 설계를 통해 나노의약품의 전달을 최적화하거나 생체 분자 코로나 차단 또는 마스킹 기능으로 인해 제약 작용억제와 같은 개발에 추가 장애물을 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다.
약 20nL/min의 나노 스케일 유량과 유기 용매의 최소한의 사용으로 CESI-MS는 용매 사용 측면에서 표준 LC-MS 및 나노LC-MS에 비해 녹색 및 경제적 자격 증명의 개선을 제공합니다, 메타볼로믹스 및 proteomics 연구의 주요 과제. CESI-MS는 LC-MS 기반 방법11,15와유리하게 비교되는 마이그레이션 시간과 피크 영역 모두에 대해 매우 재현 가능한 결과를 제공합니다. 또한 나노LC-MS에 비해 이월은 CESI-MS에서 문제가 되지 않습니다. 따라서 샘플 분석 간의 광범위한 시스템 정리가 필요하지 않으므로 샘플처리량(11)이크게 향상됩니다.
요약하자면, 제안된 워크플로우는 NM의 완전한 생체 분자 코로나단백질 및 대사산물 성분을 모두 특성화하는 접근법을 상세히 설명하는 최초의 작업입니다. 이를 통해 바이오 나노 상호 작용의 새로운 측면인 대사산물 코로나(metabolite corona)가 잠금 해제되어 동일한 샘플에서 두 배나 많은 데이터를 수집하여 바이오 나노 인터페이스에서 상호 작용을 보다 완벽하게 이해할 수 있습니다.
Disclosures
J.A.T는 ACEnano 프로젝트의 업계 파트너로 참여하고 있는 AB Sciex UK Ltd의 직원으로, J.A.T와 다른 모든 저자는 이 작업에 대해 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
A.J.C, J.A.T 및 I.L은 호라이즌 2020 프로젝트 ACEnano (그랜트 No.)를 통해 유럽 위원회의 자금을 인정합니다. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z는 중국 장학위원회(CSC, no. no. 201507060011)로부터 박사 학위 기금을 인정합니다. R.R은 네덜란드 과학 연구 기구 (NWO Vidi 723.0160330)의 Vidi 보조금 제도의 재정 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol | Sigma | 10197777001 | |
| 2,2,4,4-D4-citric | Simga | 485438-1G | Internal standard anion |
| Ammonium Acetate >98% | Sigma | A1542 | |
| Ammonium Bicarbonate >99.5% | Sigma | 09830 | |
| Capillary cartridge coolant | Sciex | 359976 | |
| CESI 8000 instrument | Sciex | A98089 | |
| CESI Cap | Sciex | B24699 | |
| CESI Vials | Sciex | B11648 | |
| Chloroform | Sigma | 650498 | Toxic, use in a fume hood |
| Glacial Acetic acid | Sigma | A6283 | |
| Hydrochloric acid 1mol/L | Sigma | 43617 | |
| Iosoacetamide | Sigma | I1149 | |
| L-methionine sulfone | Sigma | M0876-1G | Internal standard cation |
| Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve) | Sigma | 14262 | Use in a fume hood |
| Microvials | Sciex | 144709 | |
| nanoVials | Sciex | 5043467 | |
| Neutral Surface Cartridge 30 µM ID x 90 cm total length | Sciex | B07368 | |
| OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source | Sciex | B07363 | B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers |
| OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 µm ID x 90 cm total length | Sciex | B07367 | |
| Phospahte buffered saline 10x | Sigma | P7059 | |
| Pierce C18 Tips, 100 µL bed | Thermo Fisher Scientific | 87784 | |
| Polystyrene 100 nm | Polysciences Inc | 876 | |
| Polystyrene carboxylated 100 nm | Polysciences Inc | 16688 | |
| Polystyrene carboxylated 1000 nm | Polysciences Inc | 08226 | |
| Rapigest SF (surfactant) | Waters | 186001860 | |
| Sequencing Grade modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SiO2 Ludox TM-40 | Sigma | 420786 | |
| Sodium Hydroxide solution | Simga | 72079 | |
| TiO2 Dispex coated | Promethion particles | Bespoke particles | |
| TiO2 PVP coated | Promethion particles | Bespoke particles | |
| TiO2 uncoated | Promethion particles | Bespoke particles |
References
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