Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kapillær elektroforese massespektrometri tilgange til karakterisering af protein og metabolit Corona erhvervet af nanomaterialer

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61760
Automatic Translation
*1, *2, *3, 4, 1, 2, 3
1School of Geography Earth and Environmental Sciences, University of Birmingham, 2Biomedical Microscale Analytics, Leiden University, 3Institute of Medical Biochemistry, Medical University of Innsbruck, 4AB Sciex UK Ltd
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at karakterisere den komplette biomolekylære korona, proteiner og metabolitter, erhvervet af nanomaterialer fra biofluider ved hjælp af en kapillær elektroforese – massespektrometri tilgang.

Abstract

Adsorptionen af biomolekyler fra omgivende biologiske matricer til overfladen af nanomaterialer (NMs) for at danne koronaen har været af interesse i det sidste årti. Interessen for bio-nano-grænsefladen skyldes, at den biomolekylære korona giver NMs en biologisk identitet og dermed får kroppen til at identificere dem som "selv". For eksempel har tidligere undersøgelser vist, at proteinerne i koronaen er i stand til at interagere med membranreceptorer for at påvirke cellulær optagelse og fastslået, at koronaen er ansvarlig for cellulær handel med NMs og deres eventuelle toksicitet. Til dato har de fleste undersøgelser fokuseret på protein-corona og overset de mulige virkninger af metabolitterne, der indgår i koronaen eller synergieffekterne mellem komponenter i den komplette biomolekylære korona. Som sådan demonstrerer dette arbejde metoder til at karakterisere både protein- og metabolitkomponenterne i den biomolekylære korona ved hjælp af bottom-up proteomics og metabolomics tilgange parallelt. Dette omfatter en on-partikel fordøje af proteinet korona med et overfladeaktivt middel, der anvendes til at øge protein opsving, og en passiv karakterisering af metabolit korona ved at analysere metabolit matricer før og efter NM engagementer. Dette arbejde introducerer kapillær elektroforese – massespektrometri (CESI-MS) som en ny teknik til NM koronakarakterisering. De protokoller, der er skitseret her, viser, hvordan CESI-MS kan bruges til pålidelig karakterisering af både protein og metabolit corona erhvervet af NMs. Overgangen til CESI-MS reducerer i høj grad den krævede prøvemængde (sammenlignet med traditionel væskekromatografi – massespektrometri (LC-MS) tilgange) med flere injektioner muligt fra så lidt som 5 μL prøve, hvilket gør det ideelt til volumenbegrænsede prøver. Desuden reduceres de miljømæssige konsekvenser af analysen med hensyn til LC-MS på grund af de lave strømningshastigheder (<20 nL/min) i CESI-MS og brugen af vandige elektrolytter, som eliminerer behovet for organiske opløsningsmidler.

Introduction

Bio-nano-interaktioner på grænsefladen mellem nanomaterialer (NM) overflader og biologiske matricer, hvorfra biomolekyler adsorberes til NM, er et intenst forskningsområde, der understøtter nanosikkerhed og nanomedicin1. Dette lag af adsorberet biomolekyler giver NMs en biologisk identitet, således at celler identificerer dem som "selv", der efterfølgende påvirker cellulær optagelse, distribution og biologiske slutpunkter2,3,4. Langt de fleste bio-nano undersøgelser har fokuseret på proteinerne i koronaen, og har vist, at proteiner varierer kvantitativt og kvalitativt mellem NMs af forskellige sammensætninger5. Denne variation afhænger både af NM's egenskaber, såsom størrelse, funktionalisering og materiale ud over egenskaberne af den biologiske matrix, herunder sammensætning og saltindhold5. Et stigende interesseområde i bio-nano-grænsefladen er de metabolitter, der adsorberer til NMs6. Flere undersøgelser har vist, at NM-egenskaber som med proteinerne er en nøglefaktor til bestemmelse af sammensætningen af metabolitterne i koronaen, og at de kan påvirke biologiske resultater af NM-eksponering6,7,8.

I undersøgelser af den biomolekylære korona er der fire forskellige faser til dens karakterisering, koronadannelse, isolering af biomolekylerne i koronaen, deres detektion via kvalitativ eller kvantitativ massespektrometri og identifikation9. Til dato er der vedtaget en række teknikker til at isolere proteinet korona, herunder kogning i SDS-PAGE kører buffer, opløsningsmiddel og salt ekstraktioner eller direkte fordøjelse af proteiner in situ på overfladen af NMs. Med hensyn til metabolitterne i koronaen er isolationen mere kompleks med forskellige metoder ved hjælp af opløsningsmidler eller endda opløsningen af NMs foreslået somopløsninger 8,10,11. Men i modsætning til proteinet korona en "one size fits all" tilgang er usandsynligt, at gælde for isolering af metabolitter fra NMs, på grund af det brede kemiske rum besat af metabolom og mangfoldigheden af mulige NMs. En alternativ metode er at karakterisere den biologiske matrix før og efter NM-eksponering med forskellen i metabolitkoncentrationer, der tilskrives adsorptionen af metabolitter til NMs.12

Denne alternative tilgang vil finde anvendelse på alle biofluider og NMs, og selv om den kræver dobbelt så meget analyse, giver den derfor et langt mere præcist mål for metabolit-koronaen og har ingen risiko for, at lav metabolitindvinding fra NM-overfladen forveksles med lav binding af den specifikke metabolit.

Det andet trin til den biomolekylære koronaanalyse er påvisning af biomolekylerne. Traditionelt for proteinerne i koronaen har dette været mandatet for nano-LC-MS, proteomics arbejdshest; andre tilgange såsom NMR13, 1D og 2D SDS-PAGE er også blevet anvendt. Med hensyn til metabolit corona LC-MS7, GC-MS8 og direkte infusionsmassespektrometri er blevet udnyttet14. Men en ny tilgang er for nylig begyndt at få trækkraft, nemlig kapillær elektroforese-massespektrometri (CE-MS)11,15 og har været til stede i NM labs som en standalone teknik til at karakterisere forskellige fysiske og kemiske egenskaber NMs16. CE-MS er en ortogonal separationsteknik til nanoLC-MS og GC-MS og er i stand til at gøre det muligt at detektere stærkt polære og ladede metabolitter17,18. Ce-MS er desuden velegnet til analyse af proteiner og deres efteroversættende modifikationer såsom fosforylering og glykosylering19,20,21,22. Det sidste trin, identifikation og dataanalyse kan udføres på flere måder afhængigt af, om der anvendes en kvantitativ / kvalitativ eller målrettet / ikke-målrettet tilgang, dette falder dog uden for denne protokols kompetenceområde.

CESI-MS, en kombination af CE og en nanoESI-grænseflade, er et nyligt fremskridt inden for CE-teknologi, der bruger en sheathless-grænseflade. Dette muliggør direkte tilslutning af ULTRA-low flow CE (<20 nL/min) til et massespektrometer med høj opløsning uden fortynding, hvilket resulterer i betydeligt forbedret detektionsfølsomhed23,24,25. CESI-MS gør det muligt at analysere volumenbegrænsede prøver (< 10 μL), samtidig med at der opretholdes en meget følsom analyse26. CESI-MS sammenligner også positivt med traditionelle nanoLC-MS-tilgange med lav strømningshastighed, der anvendes i proteomics og metabolomics med hensyn til reproducerbarhed27,28, gennemløb og overførsel, hvilket gør det til en spændende udsigt til den komplette biomolekylære koronakarakterisering.

For at fremhæve potentialet i CESI-MS til analyser af bio-nano-interaktioner beskriver dette arbejde det prøvepræparat, der kræves for at isolere NM biomolekylær korona fra en enkelt human plasmaprøve på en sådan måde, at data maksimeres fra både protein- og metabolitaspekterne af den komplette biomolekylære NM-korona. Mens vi rapporterer om brugen af humant plasma, vil denne protokol være lige så velegnet til andre biofluider såsom blodserum, komplet cellekultur medium, celle lysat, cerebrospinalvæske eller urin. Analyserne af disse to komponenter (proteiner og metabolitter) vil derefter blive beskrevet ved hjælp af neutrale belagte CESI kapillærer for protein korona og nøgne smeltet silica kapillærer for både kationiske og anioniske metabolitter.

Protocol

Brug af human biofluid blev godkendt i henhold til IRB-protokollen retningslinjer fra University of Leiden og Innsbruck Medical University. Når biofluider af mennesker eller dyr undersøges, kræves der etisk godkendelse fra forskningsinstitutionen, og den er opnået i forbindelse med de resultater, der er vist i denne protokol. Desuden bør der også foretages passende rapportering for at sikre gennemsigtighed og genanvendelighed af data i det fremtidige arbejde9,29,30.

1. Forberedelse af baggrundselektrolytter (BGE)

BEMÆRK: Alle opløsningsmidler skal fremstilles i en passende røghætte, og der skal anvendes passende personlige værnemidler til alle trin (labcoat, handsker og beskyttelsesbriller). I hvert trin kræves der lave bindende plastflasker for at minimere analysandtab og kontaminering af prøven med salte udvasket fra glasvarer.

  1. Forbered 10% eddikesyre BGE (v/v), pH 2.2 på daglig basis for metabolomics.
    1. I en 10 ml målekolbe tilsættes 1 ml eddikesyre efterfulgt af tilsætning af deioniseret (DI) vand til den markerede linje og grundig blanding.
  2. Forbered 100 mM eddikesyre, pH 2,9 på daglig basis for proteomics.
    1. I en 10 ml målekolbe tilsættes 57 μL eddikesyre efterfulgt af tilsætning af DI-vand til den markerede linje og grundig blanding.

2. NM forberedelse

  1. Spred kraftigt NMs i vand ved hjælp af offentliggjorte retningslinjer31,32,33.
    BEMÆRK: Ved udviklingen af denne protokol blev der anvendt 7 NMs som følger: Henholdsvis 100 og 1.000 nm carboxyleret polystyren blev anvendt til henholdsvis protein og metabolit corona. 100 nm uændret polystyren NMs, 13 nm anatase TiO2 NMs, som var uændret eller belagt med enten polyacrylat eller PVP polymerer og 22 nm uændret SiO2 NMs blev brugt til både protein og metabolit koronaer. Mens metoden blev udviklet og demonstreret ved hjælp af disse NMs, skal det bemærkes, at denne tilgang ville være gældende for en bred vifte af NM kompositioner, størrelser, former og morfologier.
  2. Karakterisere partikelstørrelse ved hjælp af enten dynamisk lysspredning34,35, enkelt partikelinduktivt koblet plasmamassespektrometri36, nanopartikelsporingsanalyse37eller transmissionselektronmikroskopi og overfladeladning som zetapotentiale ved hjælp af en zeta sizer34.

3. Biomolekylær koronadannelse

  1. 2 mL humant plasma (eller biofluid af valg) opdeles i 1 mL aliquots, en for metabolit og protein korona og den anden for plasmametabolomkarakterisering.
  2. 1 mg/mL NMs i det menneskelige plasma inkuberes i 1 time ved 37 °C, mens der forsigtigt blandes ved 500 omdrejninger i en termomixer. Efter inkubationscentrifuge prøven ved 4.000 x g i 15 minutter ved 4 °C for at pellete NMs.
  3. Indsaml plasma-supernatanten til metabolit-koronaanalyse. Bevar NM-protein corona-komplekset til protein corona karakterisering.

4. Protein corona isolation

  1. Resuspend NM-protein kompleks (pellet) i 1 mL af 10x PBS Buffer og vortex kraftigt i 2 min for at fjerne ubundne proteiner. PBS-opløsningen centrifuges ved 4.000 x g i 15 minutter ved 4 °C for at pellete NMs, og fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre pellet.
  2. Resuspend pellet i 1 mL ammonium bicarbonat buffer (ABC) (100 mM, pH 8,0) og vortex kraftigt i 2 min for at fjerne ubundne proteiner og uønskede salte. Centrifuge ved 4.000 x g i 15 minutter ved 4 °C for at pellete NMs; fjerne og kassere supernatanten. Gentag dette trin.
  3. Reducer protein disulfidbindinger ved at opløse NM-proteinpillen i 20 μL ABC-buffer (100 mM pH 8), der indeholder 10 mM dithiotheritol. Reduktionsopløsningen inkuberes i 30 min. ved 56 °C.
  4. For at fordøje proteiner tilsættes 2 μg sekventeringskvalitet Trypsin til 20 μL ABC indeholdende 0,1% overfladeaktivt middel. Fordøjelsesopløsningen inkuberes i 16 timer ved 37 °C.
  5. Alkylatprøven ved tilsætning af 20 μL iodoacetamid ved 55 mM i 100 mM ABC og inkuberes ved stuetemperatur i 20 min.
  6. Der tilsættes 20 μL på 0,1 M HCl for at kløve overfladeaktivtmidlet og efterlade det i 10 minutter ved stuetemperatur.
  7. Berige og afsalt peptider ved hjælp af en C18 pakket afsaltning pipette spids.
    1. Våd spidsen med 80 μL 0,1% myresyre 50% acetonistril 5 gange, 10 gange udtages og udtages en afsaltprøve ved at skylle 80 μL 0,1 % myresyre 5 gange og udvisker prøven 2 gange med 80 μL 0,1 % myresyre på et rent lavt bindende PCR-rør.
  8. Prøverne skal lyofiliseres og opbevares ved -20 °C indtil analyse.

5. Metabolit corona isolation

  1. Kontrolplasmaet og supernatanten fra NM-plasmainkubationen fra trin 3.3 tages på is under prøveforberedelsen.
  2. Der hældes 50 μL fra hver i separate hætteglas, og 1 ud af 10 fortyndes med DI-vand. Der udtages 50 μL af hver fortyndet prøve, og der flyttes til nye hætteglas til trin 5.3.
  3. Der tilsættes 200 μL chloroform, 250 μL methanol og 350 μL DI vand og kraftigt vortexblanding i 2 min. Centrifuge i 10 minutter ved 20.800 x g ved 4 °C.
  4. Der tages 500 μL supernatant, og der filtreres gennem et 3 kDa centrifugalfilter i 2 timer ved 10.000 x g ved 4 °C. Tag 430 μL ultrafiltrer og tør i en hastighed vac. Prøver kan nu fryses inden analyse.

6. Forberedelse af CESI-MS-system38

BEMÆRK: Før kapillærerne installeres, skal det kontrolleres, at kapillærernes indløbs- og udløbsende er intakte, og at der ikke er synlige brud i kapillæren.

  1. Installation af en neutral belagt kapillær til protein koronaanalyse39.
    1. Sæt en ny neutral kapillær (90 cm længde med en indvendig diameter på 30 μm) i CESI-instrumentet i henhold til fabrikantens retningslinjer.
  2. Forberedelse af CESI-kapillærer til proteomic analyse.
    1. Udskyl separationskapillæren i fremadgående retning ved hjælp af 100 mM HCl i 5 min ved 100 psi, og kontroller, om der er dråbedannelse ved kapillærens udløb. Skyl separation kapillær med BGE ved 100 psi i 10 min og derefter DI vand ved 100 psi i 30 min (dette er kun påkrævet for nye kapillærer).
    2. Skyl både separationskapillæren og den ledende kapillær med BGE ved 90 psi i 5 minutter, og sørg for, at der dannes dråber i udløbsenden af begge kapillærer.
    3. Skyl separationskapillæren med DI-vand ved 90 psi i 10 minutter, derefter 50 psi i 10 minutter med 0,1 M HCl, efterfulgt igen af 90 psi i 10 minutter med DI-vand og til sidst BGE ved 90 psi i 10 minutter. Par CESI til MS ved hjælp af en nanospray kilde og adapter som tidligere beskrevet38.
  3. Installation af bare smeltet silica kapillær til metabolit koronakarakterisering38.
    1. En ny bare smeltet silicakapillar (90 cm lang med en indvendig diameter på 30 μm) anbringes i CESI-instrumentet i nedenstående retningslinjer.
  4. Forberedelse af CESI-kapillærer til metabolomics-analyse.
    1. Væs separationskapillæren i fremadgående retning ved hjælp af 100% MeOH ved 50 psi i 15 minutter, og kontroller, om der er dråbedannelse ved kapillærens udløb. Skyl både separationskapillæren og den ledende kapillær med BGE ved 90 psi i 5 minutter, og sørg for, at der dannes dråber ved udgangen af begge kapillærer.
    2. Skyl separationskapillæren med DI-vand ved 90 psi i 10 minutter, derefter 50 psi i 10 minutter med 0,1 M NaOH, efterfulgt igen af 90 psi i 10 minutter med DI-vand og til sidst BGE ved 90 psi i 10 minutter. Par CESI til ESI-MS ved hjælp af en nanospraykilde og -adapter som tidligere beskrevet. 38 år

7. CE-MS til protein corona analyse

  1. Resuspendprøver fra trin 4.8 i 20 μL på 50 mM ammoniumacetat pH 4.0.
  2. Udfør 5 psi 10 s hydrodynamisk injektion af prøven. Separat ved hjælp af en 30 kV adskillelse spænding med følgende trykgradient: 0-10 min ved 1 psi, 10-35 min ved 1,5 psi og 35-45 min ved 5 psi ved hjælp af 100 mM, pH 2,9 eddikesyre som BGE.
  3. Opsaml massespektre mellem 250-2000 m/z med top-10 dataafhængig fragmenteringserhvervelse.
  4. Mellem prøverne skylles kapillær med 0,1 M HCl i 3 min ved 100 psi og 10 min 100 psi BGE for separation kapillær og i 3 min ved 100 psi for den ledende flydende kapillær.

8. CESI-MS til analyse af metabolit-koronaer

BEMÆRK: Alle prøver skal analyseres to gange, en gang i positiv tilstand til påvisning af kationer og en gang i negativ tilstand til påvisning af anioner. Kontrolplasmaprøverne skal analyseres mindst 5 gange.

  1. Genudnyttede NM-eksponerede og ueksponerede plasmaprøver fra trin 5.4 i 430 μL DI-vand og kraftigt hvirvelstrøm i 2 min. Filter gennem et 0,1 μm membranfilter.
  2. Der tages 95 μL filtrat, og der tilsættes 5 μL interne standarder ved 200 μM for kationer (L-methioninsulfon) og 400 μM for anioner (2,2,4,4-D4-citronsyre) og hvirvelstrøm. Centrifuge ved 4.000 x g ved 4 °C i 10 minutter før CESI-MS-analyse.
  3. Prøven indsprøjtes hydrodynamisk i 30 s (kationer) og 40 s (anioner) ved 2 psi.
  4. Separate metabolitter i 10% eddikesyre med en adskillelsesspænding på 30 kV i fremadgående (kationer) og omvendt (anions) tilstand. Omvendt adskillelsestilstand bistås med 0,5 psi fremadgående tryk på separationskapillæren.
  5. Indstil massespektrometeret til at indsamle data i positiv (kation) eller negativ (anions) tilstand over masseområdet 65-1000 m/z. Mellem prøverne skylles kapillær med 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, DI vand og BGE ved 50 psi i 2 min.

Representative Results

Den beskrevne metode er den første til at karakterisere både proteiner og metabolitter i NM biomolekylær korona ved hjælp af den samme humane plasmaprøve. Denne metode er i stand til at detektere >200 proteiner og >150 metabolitter, hvilket gør det muligt at bestemme det mest omfattende overblik over den komplette biomolekylære korona, hvilket gør det muligt at forbedre forståelsen af NMs cellulære vedhæftede fil, optagelse og virkninger.

Brugen af CESI-MS til både proteomics (Figur 1) og metabolomics (Figur 2) adskillelse og detektion viser gode adskillelsesvinduer på begge kapillærer for hver metode.

Denne metode er i stand til at skelne mellem proteinerne i koronaen på tværs af en lang række NM-sammensætninger, hvilket viser metodernes anvendelighed for NMs på tværs af en bred vifte af fysiske og kemiske egenskaber (Tabel 1).

De unikke fingeraftryk af metabolit-koronaen kan også skelnes ved hjælp af den metabolomiske gren af denne metode (Figur 3). Selv om denne tilgang bruger en passiv tilgang til at karakterisere NM metabolit corona, er den stadig i stand til at afdække interessant indsigt i metabolitternes rolle i den biomolekylære korona, såsom differential adsorption af isomerer (Figur 4).

Figure 1
Figur 1: Eksemplarisk elektropherogram af en SiO2 protein corona separation ved hjælp af CESI-MS efter en on-partikel fordøje. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Eksempel på ekstraherede ionelektrografogrammer fremstillet af endogene forbindelser i plasma af CE-MS. De nummererede forbindelser er som følger: 1. Ornitin; 2. Lysin; 3. Arginin; 4. Histidin; 5. Kreatin; 6) Glycin; 7. Alanin; 8. Valine; 9. Isoleucin 10. Leucine; 11. Serin; 12. Threonine; 13. Asparagine; 14. Methionin; 15. Glutamin 16. Glutamsyre 17. Phenyl-D5-alanin; 18. Phenylalanin; 19. Tyrosin; 20. Proline; 21. Methionin sulfon (intern standard). Udgivet under en open access Creative Commons CC BY licens og gengivet fra Zhang et al17. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: Analyse af protein corona på tværs af en række 6 NMs. Varmekort over proteinklasser identificeret på silica (SiO2), titania (TiO2), PVP udjævnet titania (TiO2-PVP), dispex udjævnet titania (TiO2-Dispex), polystyren og carboxyleret polystyren NMs. Procenter henviser til proteinernes overflod i forhold til det samlede proteinindhold baseret på top 3 peptider overflod for hvert protein. I betragtning af de forskelle, der er observeret i den relative overflod af proteiner i de forskellige NM-koronaer, er det klart, at denne foreslåede protokol er tilstrækkelig følsom til at skelne mellem protein koronaen af forskellige NMs. Figur gengivet fra en CESI-MS-analyse af proteinet korona, offentliggjort under en åben adgang Creative Commons CC BY licens11. Klik her for at downloade denne tabel.

Figure 3
Figur 3: Målrettet analyse af de kationiske metabolitter i NM-koronaen. Adsorption af kationer til SiO2 og TiO2 NMs. Rød refererer til den oprindelige koncentration af metabolitter, mens blå refererer til koncentrationen af metabolitter efter en 1 h inkubation med NMs ved 37 °C. Reduktionen i metabolitkoncentrationen i opløsningen er et resultat af metabolit adsorption på NM-overfladen. Der blev ikke observeret nogen signifikant adsorption af metabolitter for polystyren-NMs. Kasseplotterne repræsenterer minimums- og maksimumsværdierne, median- og interkvartilområderne. Figur gengivet fra en CESI-MS målrettet analyse af metabolit corona offentliggjort under en open access Creative Commons CC BY licens15. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Målrettet analyse af anioniske metabolitter i NM-koronaen med fokus på isomer adsorption. Adsorption af anioner til en række titania NMs viser klare forskelle mellem forskellige isomerer såsom sukkerfosfater. Rød refererer til den oprindelige koncentration af metabolitter, mens blå refererer til koncentrationen af metabolitter efter en 1 h inkubation med NM ved 37 °C. Reduktionen i metabolitkoncentrationen i opløsning er et resultat af metabolit adsorption på NM-overfladen. Der blev ikke observeret nogen signifikant adsorption af metabolitter for SiO2 og polystyrenN NMs. Box-plots repræsenterer minimums- og maksimumsværdierne, median- og interkvartilområderne. Figur gengivet fra en CESI-MS målrettet analyse af metabolit corona offentliggjort under en åben adgang Creative Common CC BY licens15. Klik her for at se en større version af dette tal.

Analyte Gennemsnitligt topareal for RSD Gennemsnitlig RSD-overførselstid
1928 peptider intradag (n=3) 15% 0.30%
27 kationer intradag (n=16) 5.80% 2.20%
27 kation mellem dagen (n=36) 8.60% 1.80%

Tabel 2: Reproducerbarhed af tekniske replikater fra CESI-MS til peptider og kationiske metabolitter. RSD: relativ standardafvigelse som et mål for reproducerbarhed. Reproducerbarheden af CESI-MS med hensyn til spidsbelastningsområder og migrationstider er meget god, idet alle analysetter har en gennemsnitlig RSD-<15 % og migrationstider <2,2 %. Disse resultater viser den høje grad af tillid, der kan tilskrives de data, der er indsamlet ved hjælp af denne teknik, og bekræfter, at de påviste variationer skyldes reelle forskelle i stikprøvesammensætningen (berigelse af NMs) snarere end analytisk variation. Tabel 2 er udstreret af tidligere11-15resultater .

Discussion

Dette er den første metode, der foreslås for at karakterisere den komplette biomolekylære korona, der indeholder proteiner og metabolitter, fra samme prøve ved hjælp af CESI-MS. Evnen til at karakterisere både proteiner og metabolitter fra samme prøve vil øge mængden af data indsamlet fra en enkelt eksperimentel eksponering betydeligt, hvilket muliggør ny indsigt i koronadannelsesprocessen og dens virkninger for NMs toksicitet og effektivitet som nanomedicin. Desuden er CESI-MS en ideel platform til at karakterisere begge klasser af biomolekyler med blot en ændring af kapillær påkrævet. Fremadrettet vil nye metoder udviklet til ikke-vandig CE gøre det muligt at udføre lipidomics ved hjælp af CE-MS40, så det nu er muligt at analysere proteiner, metabolitter og lipider ved hjælp af en enkelt platform. De nuværende konventionelle tilgange ville kræve to dedikerede LC-MS-platforme, en til protein-corona og en til metabolit-koronaen. Således kan denne tilgang indsamle dobbelt så mange data ved hjælp af en enkelt analytisk platform.

Der er nogle forbehold over for denne tilgang, især med metabolit corona, da denne protokol foreslår en indirekte måling af koronaen. Som sådan kan der opstå problemer, når metabolitniveauerne er til stede ved høje koncentrationer i forhold til NMs, og det efterfølgende fald i metabolitkoncentrationen i matrixen er lille. Men i modsætning til protein corona er det usandsynligt, at en "one size fits all" tilgang til isolering af metabolit corona vil blive udviklet på grund af, at hver NM har unikke overfladekemier. Fremadrettet er det mere sandsynligt, at NM specifikke tilgange til at isolere metabolit corona vil blive udviklet og valideret dog; dette vil kun gælde for den specifikke NM. På trods af dette vil CESI-MS stadig være en yderst velegnet platform til karakterisering af de polære ladede metabolitter, uanset hvordan de isoleres. Det er også bemærkelsesværdigt, at hvis der ikke dannes en pellet under centrifugeringstrinnene, der er designet til at pellete NMs, kan der være behov for en højere centrifugalkraft; Dette vil sandsynligvis ske med mindre tætte NMs. Det er også afgørende, at alle filtreringstrin overholdes i protokollen på grund af kapillærernes smalle boring, som disse let kan blokeres, hvis partikler ikke er blevet tilstrækkeligt fjernet fra prøven.

Mens protein corona har været et intenst forskningsområde i en årrække evnen til at kombinere det med metabolit corona er et nyt interesseområde for forskere, der undersøger bio-nano interface6,14. Til dato har de fleste af disse undersøgelser fokuseret på den ikke-polære, lipidfraktion af metabolitten corona9,28. Denne nuværende metode muliggør karakterisering af de meget polære og ladede metabolitter i koronaen, som omfatter vigtige metabolitter involveret i energimetabolisme, glykolyse og DNA-syntese. Som et resultat, når det kombineres med proteomics-arbejdsgangen, er en mere holistisk karakterisering af den biomolekylære korona mulig. Dette muliggør en mere dybdegående analyse af bio-nano-interaktioner fremadrettet. Denne metode muliggør forbedret mekanistisk indsigt i receptormedieret endokytose via protein- og metabolitinteraktioner med membranreceptorer. Desuden kan interaktioner mellem proteiner og små molekyler mellem og inden for koronaer undersøges; for eksempel er det for nylig blevet vist, at proteinerne i koronaen spiller en central rolle i rekrutteringen af metabolitter15. Det er værd at bemærke, at de repræsentative resultater i figur 3 og figur 4 er absolut kvantificering af metabolitter, men en ikke-målrettet tilgang ved hjælp af multivariat dataanalyse til sammenligning af alle CE-MS-funktioner i kontroller sammenlignet med eksponeret plasma ville også belyse metabolitbinding. Der er således et betydeligt spillerum til at undersøge, hvordan og hvilke metabolitter og proteiner der påvirker deres respektive rekruttering til NM-coronas. Disse yderligere undersøgelser kan hjælpe med at designe coronas for at optimere leveringen af nanomedicin eller afdække yderligere forhindringer for deres udvikling, såsom undertrykkelse af farmaceutisk handling på grund af den biomolekylære koronablokering eller maskering af målretningsfunktioner.

CESI-MS med sine nanoskalastrømhastigheder på ca. 20 nL/min. og minimal brug af organiske opløsningsmidler giver en forbedring af de grønne og økonomiske akkreditiver i forhold til henholdsvis standard LC-MS og nanoLC-MS med hensyn til anvendelse af opløsningsmidler, de største udfordringer for metabolomics og proteomics-undersøgelser. CESI-MS tilbyder meget reproducerbare resultater for både overflytningstid og spidsbelastningsområde , som sammenligner positivt med LC-MS-baserede metoder11,15. Sammenlignet med nanoLC-MS er fremførsel desuden ikke et problem i CESI-MS. Derfor er der ikke behov for omfattende systemoprydning mellem stikprøveanalyser, hvilket i høj grad forbedrer prøvegennedringshastigheden11.

Sammenfattende er den foreslåede arbejdsgang den første til at specificere en tilgang til at karakterisere både protein- og metabolitkomponenterne i den komplette biomolekylære korona af NMs. Dette låser op for et nyt aspekt af bio-nano-interaktioner, metabolittens korona, hvilket gør det muligt at indsamle dobbelt så mange data fra den samme prøve, hvilket muliggør en mere komplet forståelse af interaktioner på bio-nano-grænsefladen.

Disclosures

J.A.T er ansat hos AB Sciex UK Ltd, der deltager som branchepartner på ACEnano-projektet, J.A.T. og alle andre forfattere har ingen interessekonflikt i dette arbejde.

Acknowledgments

A.J.C, J.A.T og I.L anerkender finansiering fra Europa-Kommissionen via Horizon 2020-projektet ACEnano (Grant no. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z anerkender ph.d.-finansiering fra China Scholarship Council (CSC, No. 201507060011). R.R anerkender den finansielle støtte til Vidi-tilskudsordningen under Den Nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO Vidi 723.0160330).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithiothreitol Sigma 10197777001
2,2,4,4-D4-citric Simga 485438-1G Internal standard anion
Ammonium Acetate >98% Sigma A1542
Ammonium Bicarbonate >99.5% Sigma 09830
Capillary cartridge coolant Sciex 359976
CESI 8000 instrument Sciex A98089
CESI Cap Sciex B24699
CESI Vials Sciex B11648
Chloroform Sigma 650498 Toxic, use in a fume hood
Glacial Acetic acid Sigma A6283
Hydrochloric acid 1mol/L Sigma 43617
Iosoacetamide Sigma I1149
L-methionine sulfone Sigma M0876-1G Internal standard cation
Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve) Sigma 14262 Use in a fume hood
Microvials Sciex 144709
nanoVials Sciex 5043467
Neutral Surface Cartridge 30 µM ID x 90 cm total length Sciex B07368
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source Sciex B07363 B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers
OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 µm ID x 90 cm total length Sciex B07367
Phospahte buffered saline 10x Sigma P7059
Pierce C18 Tips, 100 µL bed Thermo Fisher Scientific 87784
Polystyrene 100 nm Polysciences Inc 876
Polystyrene carboxylated 100 nm Polysciences Inc 16688
Polystyrene carboxylated 1000 nm Polysciences Inc 08226
Rapigest SF (surfactant) Waters 186001860
Sequencing Grade modified Trypsin Promega V5111
SiO2 Ludox TM-40 Sigma 420786
Sodium Hydroxide solution Simga 72079
TiO2 Dispex coated Promethion particles Bespoke particles
TiO2 PVP coated Promethion particles Bespoke particles
TiO2 uncoated Promethion particles Bespoke particles

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ke, P. C., Lin, S., Parak, W. J., Davis, T. P., Caruso, F. A Decade of the Protein Corona. ACS Nano. 11 (12), 11773-11776 (2017).
  2. Sasidharan, A., Riviere, J. E., Monteiro-Riviere, N. A. Gold and silver nanoparticle interactions with human proteins: impact and implications in biocorona formation. Journal of Materials Chemistry B. 3 (10), 2075-2082 (2015).
  3. Albanese, A., et al. Secreted biomolecules alter the biological identity and cellular interactions of nanoparticles. ACS Nano. 8 (6), 5515-5526 (2014).
  4. Lynch, I., Dawson, K. A. Protein-nanoparticle interactions. Nano Today. 3 (1-2), 40-47 (2008).
  5. Tenzer, S., et al. Rapid formation of plasma protein corona critically affects nanoparticle pathophysiology. Nature Nanotechnology. 8 (10), 772-781 (2013).
  6. Chetwynd, A. J., Lynch, I. The rise of the nanomaterial metabolite corona, and emergence of the complete corona. Environmental Science: Nano. 7 (4), 1041-1060 (2020).
  7. Lee, J. Y., et al. Analysis of lipid adsorption on nanoparticles by nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 1-10 (2018).
  8. Pink, M., Verma, N., Kersch, C., Schmitz-Spanke, S. Identification and characterization of small organic compounds within the corona formed around engineered nanoparticles. Environmental Science: Nano. 5 (6), 1420-1427 (2018).
  9. Chetwynd, A. J., Wheeler, K. E., Lynch, I. Best practice in reporting corona studies: Minimum information about Nanomaterial Biocorona Experiments (MINBE). Nano Today. 28, 100758 (2019).
  10. Zhang, H., et al. Quantitative proteomics analysis of adsorbed plasma proteins classifies nanoparticles with different surface properties and size. Proteomics. 11 (23), 4569-4577 (2011).
  11. Faserl, K., Chetwynd, A. J., Lynch, I., Thorn, J. A., Lindner, H. H. Corona isolation method matters: Capillary electrophoresis mass spectrometry based comparison of protein corona compositions following on-particle versus in-solution or in-gel digestion. Nanomaterials. 9 (6), 898 (2019).
  12. Nasser, F., Lynch, I. Secreted protein eco-corona mediates uptake and impacts of polystyrene nanoparticles on Daphnia magna. Journal of Proteomics. 137, 45-51 (2016).
  13. Hellstrand, E., et al. Complete high-density lipoproteins in nanoparticle corona. FEBS Journal. 276 (12), 3372-3381 (2009).
  14. Grintzalis, K., Lawson, T. N., Nasser, F., Lynch, I., Viant, M. R. Metabolomic method to detect a metabolite corona on amino functionalised polystyrene nanoparticles. Nanotoxicology. , 1-12 (2019).
  15. Chetwynd, A. J., Zhang, W., Thorn, J. A., Lynch, I., Ramautar, R. The nanomaterial metabolite corona determined using a quantitative metabolomics approach: A pilot study. Small. , (2020).
  16. Chetwynd, A. J., Guggenheim, E. J., Briffa, S. M., Thorn, J. A., Lynch, I., Valsami-Jones, E. Current application of capillary electrophoresis in nanomaterial characterisation and its potential to characterise the protein and small molecule corona. Nanomaterials. 8 (2), 99 (2018).
  17. Zhang, W., et al. Assessing the suitability of capillary electrophoresis-mass spectrometry for biomarker discovery in plasma-based metabolomics. Electrophoresis. , 00126 (2019).
  18. Ramautar, R., Somsen, G. W., de Jong, G. J. CE-MS for metabolomics: Developments and applications in the period 2016-2018. Electrophoresis. 40 (1), 165-179 (2019).
  19. Sarg, B., Faserl, K., Lindner, H. H. Identification of novel site-specific alterations in the modification level of myelin basic protein isolated from mouse brain at different ages using capillary electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 17 (19), 1700269 (2017).
  20. Faserl, K., Sarg, B., Maurer, V., Lindner, H. H. Exploiting charge differences for the analysis of challenging post-translational modifications by capillary electrophoresis-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1498, 215-223 (2017).
  21. Zhang, Z., Qu, Y., Dovichi, N. J. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for bottom-up proteomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 108, 23-37 (2018).
  22. Shen, X., et al. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for top-down proteomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 120, 115644 (2019).
  23. Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (2), 885-892 (2012).
  24. Faserl, K., Kremser, L., Müller, M., Teis, D., Lindner, H. H. Quantitative proteomics using ultralow flow capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 87 (9), 4633-4640 (2015).
  25. Faserl, K., Sarg, B., Kremser, L., Lindner, H. Optimization and evaluation of a sheathless capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry platform for peptide analysis: comparison to liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (19), 7297-7305 (2011).
  26. Segers, K., et al. CE-MS metabolic profiling of volume-restricted plasma samples from an acute mouse model for epileptic seizures to discover potentially involved metabolomic features. Talanta. 217, 121107 (2020).
  27. Chetwynd, A. J., David, A. A review of nanoscale LC-ESI for metabolomics and its potential to enhance the metabolome coverage. Talanta. 182, 380-390 (2018).
  28. Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-Mass spectrometry at trial by metabo-ring: Effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
  29. Faria, M., et al. Minimum information reporting in bio-nano experimental literature. Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).
  30. Leong, H. S., et al. On the issue of transparency and reproducibility in nanomedicine. Nature Nanotechnology. 14 (7), 629-635 (2019).
  31. Kaur, I., et al. Dispersion of nanomaterials in aqueous media: Towards protocol optimization. Journal of Visualized Experiments. (130), e56074 (2017).
  32. Bihari, P., et al. Optimized dispersion of nanoparticles for biological in vitro and in vivo studies. Particle and Fibre Toxicology. 5 (1), 1-14 (2008).
  33. Taurozzi, J. S., Hackley, V. A., Wiesner, M. R. Ultrasonic dispersion of nanoparticles for environmental, health and safety assessment - and recommendations. Nanotoxicology. 5 (4), 711-729 (2011).
  34. Lu, P. J., et al. Methodology for sample preparation and size measurement of commercial ZnO nanoparticles. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (2), 628-636 (2018).
  35. Langevin, D., et al. Inter-laboratory comparison of nanoparticle size measurements using dynamic light scattering and differential centrifugal sedimentation. NanoImpact. 10, 97-107 (2018).
  36. Lee, S., Bi, X., Reed, R. B., Ranville, J. F., Herckes, P., Westerhoff, P. Nanoparticle size detection limits by single particle ICP-MS for 40 elements. Environmental Science and Technology. 48 (17), 10291-10300 (2014).
  37. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).
  38. Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples. Journal of Visualized Experiments. , e54535 (2016).
  39. Faserl, K., Sarg, B., Lindner, H. H. Application of CE-MS for the analysis of histones and histone modifications. Methods. , (2020).
  40. Azab, S., Ly, R., Britz-Mckibbin, P. Robust method for high-throughput screening of fatty acids by multisegment injection-nonaqueous capillary electrophoresis-mass spectrometry with Sstringent quality control. Analytical Chemistry. 91 (3), 2329-2336 (2019).
  41. Zhang, X., Pandiakumar, A. K., Hamers, R. J., Murphy, C. J. Quantification of lipid corona formation on colloidal nanoparticles from lipid vesicles. Analytical Chemistry. 19 (24), 14387-14394 (2018).

Tags

Kemi erhvervet biomolekyle korona nanomateriale metabolomics proteomics CE-MS nanomedicin kapillær elektrophoresis CESI-MS
Kapillær elektroforese massespektrometri tilgange til karakterisering af protein og metabolit Corona erhvervet af nanomaterialer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chetwynd, A. J., Zhang, W., Faserl,… More

Chetwynd, A. J., Zhang, W., Faserl, K., Thorn, J. A., Lynch, I., Ramautar, R., Lindner, H. H. Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials. J. Vis. Exp. (164), e61760, doi:10.3791/61760 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter