JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

العزل والتقييم الوظيفي للخلايا الجذعية لسرطان الثدي البشري من عينات الخلايا والأنسجة

Published: October 02, 2020
doi:
10.3791/61775
, , , ,
1London Regional Cancer Program, 2Department of Anatomy & Cell Biology,Western University, 3Department of Oncology,Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

يصف هذا البروتوكول التجريبي عزل BCSCs من عينات خلايا وأنسجة سرطان الثدي بالإضافة إلى المقايسات في المختبر وفي الجسم الحي التي يمكن استخدامها لتقييم النمط الظاهري ووظيفة BCSC.

Abstract

الخلايا الجذعية لسرطان الثدي (BCSCs) هي خلايا سرطانية ذات خصائص شبيهة بالخلايا الجذعية الموروثة أو المكتسبة. على الرغم من تواترها المنخفض ، إلا أنها تساهم بشكل رئيسي في بدء سرطان الثدي والانتكاس وورم خبيث ومقاومة العلاج. من الضروري فهم بيولوجيا الخلايا الجذعية لسرطان الثدي من أجل تحديد أهداف علاجية جديدة لعلاج سرطان الثدي. يتم عزل الخلايا الجذعية لسرطان الثدي وتمييزها بناء على التعبير عن علامات سطح الخلية الفريدة مثل CD44 و CD24 والنشاط الأنزيمي لنازعة هيدروجين الألدهيد (ALDH). تشكل خلايا ALDHعاليةCD44 + CD24– مجموعة BCSC ويمكن عزلها عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) للدراسات الوظيفية النهائية. اعتمادا على السؤال العلمي ، يمكن استخدام طرق مختلفة في المختبر وفي الجسم الحي لتقييم الخصائص الوظيفية ل BCSCs. هنا ، نقدم بروتوكولا تجريبيا مفصلا لعزل BCSCs البشرية من كل من المجموعات غير المتجانسة من خلايا سرطان الثدي وكذلك أنسجة الورم الأولية التي تم الحصول عليها من مرضى سرطان الثدي. بالإضافة إلى ذلك ، نسلط الضوء على المصب في المقايسات الوظيفية في المختبر وفي الجسم الحي بما في ذلك فحوصات تشكيل المستعمرة ، ومقايسات الغلاف الجوي ، ونماذج ثقافة 3D ومقايسات الكسب غير المشروع للورم التي يمكن استخدامها لتقييم وظيفة BCSC.

Introduction

يعد فهم الآليات الخلوية والجزيئية للخلايا الجذعية البشرية لسرطان الثدي (BCSCs) أمرا بالغ الأهمية لمواجهة التحديات التي تواجه علاج سرطان الثدي. يعود ظهور مفهوم BCSC إلىأوائل القرن الحادي والعشرين ، حيث تم العثور على عدد صغير من خلايا سرطان الثدي CD44 + CD24 / منخفضة قادرة على توليد أورام غير متجانسة في الفئران 1,2. بعد ذلك ، لوحظ أن خلايا سرطان الثدي البشرية ذات النشاط الأنزيمي العالي لنازعة هيدروجين الألدهيد (ALDHhigh) أظهرت أيضا خصائص مماثلة تشبه الخلايا الجذعية3. تمثل هذه BCSCs مجموعة صغيرة من الخلايا القادرة على التجديد الذاتي والتمايز ، مما يساهم في الطبيعة غير المتجانسة للأورام السائبة1،2،3. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن التغييرات في مسارات الإشارات المحفوظة تطوريا تدفع بقاء BCSC وصيانته4،5،6،7،8،9،10،11،12،13،14 . بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن البيئة المكروية الخارجية للخلية تلعب دورا محوريا في إملاء وظائف BCSC المختلفة15،16،17. تساهم هذه المسارات الجزيئية والعوامل الخارجية التي تنظم وظيفة BCSC في انتكاس سرطان الثدي ، ورم خبيث18 وتطوير مقاومة للعلاجات19،20،21 ، مع الوجود المتبقي ل BCSCs بعد العلاج الذي يشكل تحديا كبيرا للبقاء على قيد الحياة بشكل عام لمرضى سرطان الثدي22،23 . لذلك فإن التقييم قبل السريري لهذه العوامل مهم جدا لتحديد العلاجات التي تستهدف BCSC والتي يمكن أن تكون مفيدة لتحقيق نتائج علاجية أفضل وتحسين البقاء على قيد الحياة بشكل عام لدى مرضى سرطان الثدي.

تم استخدام العديد من نماذج خط خلايا سرطان الثدي البشرية في المختبر ونماذج xenograft البشرية في الجسم الحي لتوصيف BCSCs24،25،26،27،28،29. إن قدرة خطوط الخلايا على إعادة الملء باستمرار بعد كل مقطع متتالي تجعلها نظاما نموذجيا مثاليا لإجراء دراسات قائمة على الأوميكس والصيدلة الجينية. ومع ذلك ، غالبا ما تفشل خطوط الخلايا في تلخيص عدم التجانس الذي لوحظ في عينات المرضى. وبالتالي ، من المهم استكمال بيانات خط الخلية بعينات مشتقة من المريض. يعد عزل BCSCs في أنقى صورها أمرا مهما لتمكين التوصيف التفصيلي ل BCSCs. يعتمد تحقيق هذا النقاء على اختيار علامات النمط الظاهري الخاصة ب BCSCs. حاليا ، يستخدم النمط الظاهريللخليةALDH CD44 + CD24 المرتفع بشكل شائع لتمييز وعزل BCSCs البشرية عن مجموعات خلايا سرطان الثدي السائبة باستخدام فرز الخلايا المنشط مضان (FACS) لتحقيق أقصى قدر من النقاء1 ، 3,26. علاوة على ذلك ، يمكن تقييم خصائص BCSCs المعزولة مثل التجديد الذاتي والانتشار والتمايز باستخدام تقنيات في المختبر وفي الجسم الحي.

على سبيل المثال ، يمكن استخدام فحوصات تشكيل مستعمرة في المختبر لتقييم قدرة خلية واحدة على التجديد الذاتي لتشكيل مستعمرة من 50 خلية أو أكثر في وجود ظروف علاج مختلفة30. يمكن أيضا استخدام فحوصات الماموسفير لتقييم إمكانات التجديد الذاتي لخلايا سرطان الثدي في ظل ظروف مستقلة عن المرساة. يقيس هذا الفحص قدرة الخلايا المفردة على التوليد والنمو ككرات (خليط من BCSCs وغير BCSCs) في كل ممر متتالي في ظروف الاستزراع غير الملتصقة الخالية من المصل31. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام نماذج الثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) لتقييم وظيفة BCSC ، بما في ذلك تفاعلات الخلية الخلوية ومصفوفة الخلية التي تلخص عن كثب البيئة المكروية في الجسم الحي وتسمح بالتحقيق في نشاط العلاجات المحتملة التي تستهدف BCSC32. على الرغم من التطبيقات المتنوعة للنماذج في المختبر ، من الصعب نمذجة تعقيد الظروف في الجسم الحي باستخدام المقايسات في المختبر فقط. يمكن التغلب على هذا التحدي باستخدام نماذج xenograft للفأر لتقييم سلوك BCSC في الجسم الحي. على وجه الخصوص ، تعمل هذه النماذج كنظام مثالي لتقييم ورم خبيث لسرطان الثدي 33 ، والتحقيق في التفاعلات مع البيئة المكروية أثناء تطور المرض 34 ، والتصوير في الجسم الحي 35 ، وللتنبؤ بالسمية الخاصة بالمريض وفعالية العوامل المضادة للأورام34.

يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لعزل ALDHالبشري عاليCD44 + CD24– BCSCs بأقصى درجات النقاء عن المجموعات السائبة من خلايا سرطان الثدي غير المتجانسة. كما نقدم وصفا مفصلا لثلاث تقنيات في المختبر (مقايسة تشكيل المستعمرة ، ومقايسة الغلاف الجوي ، ونموذج ثقافة 3D) ومقايسة الكسب غير المشروع للورم في الجسم الحي التي يمكن استخدامها لتقييم الوظائف المختلفة ل BCSCs. ستكون هذه الطرق مناسبة للاستخدام من قبل الباحثين المهتمين بعزل وتوصيف BCSCs من خطوط خلايا سرطان الثدي البشرية أو خلايا سرطان الثدي المشتقة من المريض الأولي وأنسجة الورم لأغراض فهم بيولوجيا BCSC و / أو التحقيق في علاجات جديدة تستهدف BCSC.

Protocol

تم جمع العينات الجراحية أو الخزعة المشتقة من المريض مباشرة من مرضى سرطان الثدي الموافقين بموجب بروتوكول أخلاقيات الإنسان المعتمد من قبل مجلس الأخلاقيات المؤسسية. تم الحفاظ على جميع الفئران المستخدمة لتوليد نماذج xenograft المشتقة من المريض وإيوائها في منشأة حيوانية معتمدة من المؤسسة. تم إنش…

Representative Results

يسمح البروتوكول الموصوف بعزل BCSCs البشرية عن مجموعة غير متجانسة من خلايا سرطان الثدي ، إما من خطوط الخلايا أو من أنسجة الورم المنفصلة. بالنسبة لأي خط خلية أو عينة نسيج معينة ، من الأهمية بمكان إنشاء معلق أحادي الخلية موحد لعزل BCSCs بأقصى درجات النقاء لأن تلويث السكان غير BCSC يمكن أن يؤدي إلى اس…

Discussion

أصبح ورم خبيث لسرطان الثدي ومقاومة العلاج سببا رئيسيا لوفيات النساء في جميع أنحاء العالم. يساهم وجود مجموعة فرعية من الخلايا الجذعية لسرطان الثدي (BCSCs) في تعزيز ورم خبيث26،43،44،45،46 ومقاومة العلاج21،47<sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر أعضاء مختبرنا على مناقشاتهم المفيدة ودعمهم. يتم تمويل أبحاثنا حول الخلايا الجذعية لسرطان الثدي والبيئة المكروية للورم من خلال منح من معهد أبحاث جمعية أبحاث السرطان الكندية وبرنامج سرطان الثدي التابع لوزارة الدفاع الأمريكية (Grant # BC160912). يتم دعم V.B. من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه الغربية (الجامعة الغربية) ، ويتم دعم كل من A.L.A. و V.B. من قبل جمعية سرطان الثدي في كندا. يتم دعم CL من خلال منحة Vanier Canada للدراسات العليا من حكومة كندا.

Materials

7-Aminoactinomycin D (7AAD) BD 51-68981E suggested: 0.25 µg/1×106 cells
Acetone Fisher A18-1
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation
Basement membrane extract (BME) Corning 354234 Sold under the commercial name Matrigel
Cell culture plates: 6 well Corning 877218
Cell culture plates: 60mm Corning 353002
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment Corning 3474
Cell strainer: 40 micron BD 352340
Collagen Stemcell Technologies 7001 Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS
Collagenase Sigma 11088807001 1x
Conical tubes: 50 mL Fisher scientific 05-539-7
Crystal violet Sigma C6158 Use 0.05% crystal violet solution in water for staining
Dispase Stemcell Technologies 7913 5U/mL
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
DNAse Sigma D5052 0.1 mg/mL final concentration
FBS Avantor Seradigm Lifescience 97068-085  
Flow tubes: 5ml BD 352063 Polypropylene round-bottom tubes
Methanol Fisher 84124
mouse anti-Human CD24 antibody BD 561646 R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5
mouse anti-Human CD44 antibody BD 555479 R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB) Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation
PBS Wisent Inc 311-425-CL 1x, Without calcium and magnesium
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Mammosphere Media Composition
B27 Gibco 17504-44 1x
bFGF Sigma F2006 10 ng/mL
BSA Bioshop ALB003 04%
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 20 ng/mL
Insulin Sigma 16634 5 µg/mL
3D Organoid Media Composition
A8301 Tocris 2939 500 nM
B27 Gibco 17504-44 1x
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 5 ng/mL
FGF10 Peprotech 100-26 20 ng/mL
FGF7 Peprotech 100-19 5 ng/mL
GlutaMax Invitrogen 35050-061 1x
HEPES Gibco 15630-080 10 mM
N-acetylcysteine Sigma A9165 1.25 mM
Neuregulin β1 Peprotech 100-03 5 nM
Nicotinamide Sigma N0636 5 mM
Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
R-spondin3 R&D 3500 250 ng/mL
SB202190 Sigma S7067 500 nM
Y-27632 Tocris 1254 5 µM
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  2. Shipitsin, M., et al. Molecular definition of breast tumor heterogeneity. Cancer Cell. 11 (3), 259-273 (2007).
  3. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  4. Sulaiman, A., et al. Dual inhibition of Wnt and Yes-associated protein signaling retards the growth of triple-negative breast cancer in both mesenchymal and epithelial states. Molecular Oncology. 12 (4), 423-440 (2018).
  5. Debeb, B. G., et al. Histone deacetylase inhibitors stimulate dedifferentiation of human breast cancer cells through WNT/β-catenin signaling. Stem Cells. 30 (11), 2366-2377 (2012).
  6. Klutzny, S., et al. PDE5 inhibition eliminates cancer stem cells via induction of PKA signaling. Cell Death & Disease. 9 (2), 192 (2018).
  7. DiMeo, T. A., et al. A novel lung metastasis signature links Wnt signaling with cancer cell self-renewal and epithelial-mesenchymal transition in basal-like breast cancer. Cancer Research. 69 (13), 5364-5373 (2009).
  8. Liu, C. C., Prior, J., Piwnica-Worms, D., Bu, G. LRP6 overexpression defines a class of breast cancer subtype and is a target for therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (11), 5136-5141 (2010).
  9. Miller-Kleinhenz, J., et al. Dual-targeting Wnt and uPA receptors using peptide conjugated ultra-small nanoparticle drug carriers inhibited cancer stem-cell phenotype in chemo-resistant breast cancer. Biomaterials. 152, 47-62 (2018).
  10. Mamaeva, V., et al. Inhibiting Notch Activity in Breast Cancer Stem Cells by Glucose Functionalized Nanoparticles Carrying γ-secretase Inhibitors. Molecular Therapy. 24 (5), 926-936 (2016).
  11. Ithimakin, S., et al. HER2 drives luminal breast cancer stem cells in the absence of HER2 amplification: implications for efficacy of adjuvant trastuzumab. Cancer Research. 73 (5), 1635-1646 (2013).
  12. Koike, Y., et al. Anti-cell growth and anti-cancer stem cell activities of the non-canonical hedgehog inhibitor GANT61 in triple-negative breast cancer cells. Breast Cancer. 24 (5), 683-693 (2017).
  13. Sun, Y., et al. Estrogen promotes stemness and invasiveness of ER-positive breast cancer cells through Gli1 activation. Molecular Cancer. 13, 137 (2014).
  14. Colavito, S. A., Zou, M. R., Yan, Q., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Significance of glioma-associated oncogene homolog 1 (GLI1) expression in claudin-low breast cancer and crosstalk with the nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NFκB) pathway. Breast Cancer Research. 16 (5), 444 (2014).
  15. Bhat, V., Allan, A. L., Raouf, A. Role of the Microenvironment in Regulating Normal and Cancer Stem Cell Activity: Implications for Breast Cancer Progression and Therapy Response. Cancers. 11 (9), (2019).
  16. Pio, G. M., Xia, Y., Piaseczny, M. M., Chu, J. E., Allan, A. L. Soluble bone-derived osteopontin promotes migration and stem-like behavior of breast cancer cells. PloS One. 12 (5), 0177640 (2017).
  17. Chu, J. E., et al. Lung-derived factors mediate breast cancer cell migration through CD44 receptor-ligand interactions in a novel ex vivo system for analysis of organ-specific soluble proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-191 (2014).
  18. McGowan, P. M., et al. Notch1 inhibition alters the CD44hi/CD24lo population and reduces the formation of brain metastases from breast cancer. Molecular Cancer Research. 9 (7), 834-844 (2011).
  19. Mao, J., et al. ShRNA targeting Notch1 sensitizes breast cancer stem cell to paclitaxel. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (6), 1064-1073 (2013).
  20. Duru, N., et al. HER2-associated radioresistance of breast cancer stem cells isolated from HER2-negative breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6634-6647 (2012).
  21. Croker, A. K., Allan, A. L. Inhibition of aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity reduces chemotherapy and radiation resistance of stem-like ALDHhiCD44+ human breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (1), 75-87 (2012).
  22. Creighton, C. J., et al. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13820-13825 (2009).
  23. Calcagno, A. M., et al. Prolonged drug selection of breast cancer cells and enrichment of cancer stem cell characteristics. Journal of the National Cancer Institute. 102 (21), 1637-1652 (2010).
  24. Feng, Y., et al. Breast cancer development and progression: Risk factors, cancer stem cells, signaling pathways, genomics, and molecular pathogenesis. Genes Dis. 5 (2), 77-106 (2018).
  25. Samanta, D., Gilkes, D. M., Chaturvedi, P., Xiang, L., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors are required for chemotherapy resistance of breast cancer stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5429-5438 (2014).
  26. Croker, A. K., et al. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (8), 2236-2252 (2009).
  27. Morel, A. P., et al. Generation of breast cancer stem cells through epithelial-mesenchymal transition. PloS One. 3 (8), 2888 (2008).
  28. Muntimadugu, E., Kumar, R., Saladi, S., Rafeeqi, T. A., Khan, W. CD44 targeted chemotherapy for co-eradication of breast cancer stem cells and cancer cells using polymeric nanoparticles of salinomycin and paclitaxel. Colloids Surf B Biointerfaces. 143, 532-546 (2016).
  29. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2014).
  30. Munshi, A., Hobbs, M., Meyn, R. E. Clonogenic cell survival assay. Methods in Molecular Medicine. 110, 21-28 (2005).
  31. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  32. Shin, C. S., Kwak, B., Han, B., Park, K. Development of an in vitro 3D tumor model to study therapeutic efficiency of an anticancer drug. Molecular Pharmaceutics. 10 (6), 2167-2175 (2013).
  33. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  34. Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse models of cancer. Annual Review of Pathology. 6, 95-119 (2011).
  35. Lyons, S. K. Advances in imaging mouse tumour models in vivo. Journal of Pathology. 205 (2), 194-205 (2005).
  36. Margaryan, N. V., et al. The Stem Cell Phenotype of Aggressive Breast Cancer Cells. Cancers. 11 (3), (2019).
  37. Ma, F., et al. Enriched CD44(+)/CD24(-) population drives the aggressive phenotypes presented in triple-negative breast cancer (TNBC). Cancer Letters. 353 (2), 153-159 (2014).
  38. Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER(+) Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388-401 (2019).
  39. Phan-Lai, V., et al. Three-dimensional scaffolds to evaluate tumor associated fibroblast-mediated suppression of breast tumor specific T cells. Biomacromolecules. 14 (5), 1330-1337 (2013).
  40. O’Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
  41. Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
  42. Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6468-6473 (2011).
  43. Abraham, B. K., et al. Prevalence of CD44+/CD24-/low cells in breast cancer may not be associated with clinical outcome but may favor distant metastasis. Clinical Cancer Research. 11 (3), 1154-1159 (2005).
  44. Balic, M., et al. Most early disseminated cancer cells detected in bone marrow of breast cancer patients have a putative breast cancer stem cell phenotype. Clinical Cancer Research. 12 (19), 5615-5621 (2006).
  45. Charafe-Jauffret, E., et al. Aldehyde dehydrogenase 1-positive cancer stem cells mediate metastasis and poor clinical outcome in inflammatory breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (1), 45-55 (2010).
  46. Marcato, P., et al. Aldehyde dehydrogenase activity of breast cancer stem cells is primarily due to isoform ALDH1A3 and its expression is predictive of metastasis. Stem Cells. 29 (1), 32-45 (2011).
  47. Lacerda, L., Pusztai, L., Woodward, W. A. The role of tumor initiating cells in drug resistance of breast cancer: Implications for future therapeutic approaches. Drug Resist Updat. 13 (4-5), 99-108 (2010).
  48. Liu, S., Wicha, M. S. Targeting breast cancer stem cells. Journal of Clinical Oncology. 28 (25), 4006-4012 (2010).
  49. D’Angelo, R. C., et al. Notch reporter activity in breast cancer cell lines identifies a subset of cells with stem cell activity. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (3), 779-787 (2015).
  50. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  51. Forozan, F., et al. Comparative genomic hybridization analysis of 38 breast cancer cell lines: a basis for interpreting complementary DNA microarray data. Cancer Research. 60 (16), 4519-4525 (2000).
  52. Lanier, L. L. Just the FACS. Journal of Immunology. 193 (5), 2043-2044 (2014).
  53. Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 19-39 (2007).
  54. Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
  55. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  56. Sun, C., et al. Immunomagnetic separation of tumor initiating cells by screening two surface markers. Scientific Reports. 7, 40632 (2017).
  57. Rodríguez, C. E., et al. Breast cancer stem cells are involved in Trastuzumab resistance through the HER2 modulation in 3D culture. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (2), 1381-1391 (2018).
  58. Kim, D. W., Cho, J. Y. NQO1 is Required for β-Lapachone-Mediated Downregulation of Breast-Cancer Stem-Cell Activity. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), (2018).
  59. Xu, L. Z., et al. p62/SQSTM1 enhances breast cancer stem-like properties by stabilizing MYC mRNA. Oncogene. 36 (3), 304-317 (2017).
  60. Huang, X., et al. Breast cancer stem cell selectivity of synthetic nanomolar-active salinomycin analogs. BMC Cancer. 16, 145 (2016).
  61. Liu, T. J., et al. CD133+ cells with cancer stem cell characteristics associates with vasculogenic mimicry in triple-negative breast cancer. Oncogene. 32 (5), 544-553 (2013).
  62. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  63. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  64. Palomeras, S., Ruiz-Martínez, S., Puig, T. Targeting Breast Cancer Stem Cells to Overcome Treatment Resistance. Molecules. 23 (9), (2018).
  65. McClements, L., et al. Targeting treatment-resistant breast cancer stem cells with FKBPL and its peptide derivative, AD-01, via the CD44 pathway. Clinical Cancer Research. 19 (14), 3881-3893 (2013).
  66. Berger, D. P., Henss, H., Winterhalter, B. R., Fiebig, H. H. The clonogenic assay with human tumor xenografts: evaluation, predictive value and application for drug screening. Annals of Oncology. 1 (5), 333-341 (1990).
  67. Tian, J., et al. Dasatinib sensitises triple negative breast cancer cells to chemotherapy by targeting breast cancer stem cells. British Journal of Cancer. 119 (12), 1495-1507 (2018).
  68. Samoszuk, M., Tan, J., Chorn, G. Clonogenic growth of human breast cancer cells co-cultured in direct contact with serum-activated fibroblasts. Breast Cancer Research. 7 (3), 274-283 (2005).
  69. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  70. Xu, Y., Hu, Y. D., Zhou, J., Zhang, M. H. Establishing a lung cancer stem cell culture using autologous intratumoral fibroblasts as feeder cells. Cell Biology International. 35 (5), 509-517 (2011).
  71. Palmieri, C., et al. Fibroblast growth factor 7, secreted by breast fibroblasts, is an interleukin-1beta-induced paracrine growth factor for human breast cells. Journal of Endocrinology. 177 (1), 65-81 (2003).
  72. Bourguignon, L. Y., Peyrollier, K., Xia, W., Gilad, E. Hyaluronan-CD44 interaction activates stem cell marker Nanog, Stat-3-mediated MDR1 gene expression, and ankyrin-regulated multidrug efflux in breast and ovarian tumor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (25), 17635-17651 (2008).
  73. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  74. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  75. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
  76. Okano, M., et al. Orthotopic Implantation Achieves Better Engraftment and Faster Growth Than Subcutaneous Implantation in Breast Cancer Patient-Derived Xenografts. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).
  77. Zhang, Y., et al. Establishment of a murine breast tumor model by subcutaneous or orthotopic implantation. Oncology Letters. 15 (5), 6233-6240 (2018).
  78. Zhang, W., et al. Comparative Study of Subcutaneous and Orthotopic Mouse Models of Prostate Cancer: Vascular Perfusion, Vasculature Density, Hypoxic Burden and BB2r-Targeting Efficacy. Scientific Reports. 9 (1), 11117 (2019).
  79. Kim, R., Emi, M., Tanabe, K. Cancer immunoediting from immune surveillance to immune escape. Immunology. 121 (1), 1-14 (2007).
  80. Rosato, R. R., et al. Evaluation of anti-PD-1-based therapy against triple-negative breast cancer patient-derived xenograft tumors engrafted in humanized mouse models. Breast Cancer Research. 20 (1), 108 (2018).
  81. Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 99 (2018).
  82. Meraz, I. M., et al. An Improved Patient-Derived Xenograft Humanized Mouse Model for Evaluation of Lung Cancer Immune Responses. Cancer Immunol Res. 7 (8), 1267-1279 (2019).
  83. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. Biodrugs. 32 (3), 245-266 (2018).

Tags

Breast Cancer Stem CellsCell IsolationSingle Cell SuspensionALDH AssayColony Forming AssayFunctional CharacterizationTumorigenicityMetastasis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., Rodriguez-Torres, M., Allan, A. L. Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples. J. Vis. Exp. (164), e61775, doi:10.3791/61775 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image