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Cancer Research

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

Published: October 02, 2020
doi:
10.3791/61775
, , , ,
1London Regional Cancer Program, 2Department of Anatomy & Cell Biology,Western University, 3Department of Oncology,Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

この実験プロトコルでは、乳がん細胞および組織サンプルからのBCSCの単離、ならびにBCSCの表現型と機能を評価するために使用できるin vitro および in vivo アッセイについて説明します。

Abstract

乳がん幹細胞(BCSC)は、遺伝性または後天性の幹細胞のような特徴を持つがん細胞です。頻度が低いにもかかわらず、乳がんの開始、再発、転移、治療抵抗性の主な原因です。乳がんを治療するための新しい治療標的を特定するためには、乳がん幹細胞の生物学を理解することが不可欠です。乳がん幹細胞は、CD44、CD24などのユニークな細胞表面マーカーの発現およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)の酵素活性に基づいて単離および特徴付けられます。これらのALDH高CD44+CD24– 細胞はBCSC集団を構成し、下流の機能研究のために蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって単離することができます。科学的問題に応じて、異なるインビ トロ および インビボ の方法を使用して、BCSCの機能的特性を評価することができます。ここでは、乳がん細胞の不均一な集団と乳がん患者から得られた原発腫瘍組織の両方からヒトBCSCを単離するための詳細な実験プロトコルを提供します。さらに、BCSC機能の評価に使用できるコロニー形成アッセイ、マンモスフェアアッセイ、3D培養モデル、腫瘍異種移植アッセイなど、下流のin vitro および in vivo 機能アッセイを強調しています。

Introduction

ヒト乳がん幹細胞(BCSC)の細胞的および分子的メカニズムを理解することは、乳がん治療で直面する課題に取り組むために重要です。BCSCの概念の出現は21世紀初頭にさかのぼり、CD44 + CD24-/低乳がん細胞の小さな集団がマウスで不均一な腫瘍を生成できることが判明しました1,2。その後、アルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性が高い(ALDHhigh)ヒト乳がん細胞も同様の幹細胞様特性を示すことが観察されました3。これらのBCSCは、自己複製および分化が可能な細胞の小さな集団を表し、バルク腫瘍の不均一な性質に寄与する1、2、3。進化的に保存されたシグナル伝達経路の変化がBCSCの生存と維持を促進することを示唆する証拠の蓄積4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 .さらに、細胞外因性微小環境は、異なるBCSC機能を指示する上で極めて重要な役割を果たすことが示されている15、16、17。これらの分子経路とBCSC機能を調節する外的要因は、乳がんの再発、転移18、および治療に対する耐性の発達に寄与しており19,20,21、治療後のBCSCの残存存在は、乳がん患者の全生存に大きな課題をもたらします22,23。.したがって、これらの因子の前臨床評価は、乳がん患者のより良い治療結果と全生存期間の改善を達成するために有益である可能性のあるBCSC標的療法を特定するために非常に重要です。

いくつかのインビトロヒト乳癌細胞株モデルおよびインビボヒト異種移植片モデルが、BCSCを特徴付けるために使用されています24、25、26、27、28、29。連続継代のたびに細胞株が継続的に再増殖する能力により、これらはオミクスベースおよび薬理ゲノム研究を実施するための理想的なモデルシステムになります。しかし、細胞株は、患者サンプルで観察された不均一性を再現できないことがよくあります。したがって、細胞株データを患者由来のサンプルで補完することが重要です。BCSCを最も純粋な形で単離することは、BCSCの詳細な特性評価を可能にするために重要です。 この純度を達成することは、BCSCに特異的な表現型マーカーの選択に依存します。 現在、ALDH高CD44 + CD24–細胞表現型は、最大純度の蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して、バルク乳がん細胞集団からヒトBCSCを区別および分離するために最も一般的に使用されています1、3,26。さらに、自己複製、増殖、分化などの単離されたBCSCの特性は、in vitroおよびin vivo技術を使用して評価できます。

例えば、インビトロコロニー形成アッセイは、異なる処理条件30の存在下で50個以上のコロニーを形成するために単一細胞が自己複製する能力を評価するために使用することができる。マンモスフェアアッセイは、足場非依存条件下での乳がん細胞の自己複製の可能性を評価するためにも使用できます。このアッセイは、無血清非接着培養条件における各連続継代において、単一細胞がスフェア(BCSCと非BCSCの混合物)として生成および増殖する能力を測定する31。さらに、3次元(3D)培養モデルを使用して、 in vivo 微小環境を厳密に再現し、潜在的なBCSC標的療法の活性の調査を可能にする細胞-細胞間および細胞-マトリックス相互作用を含むBCSC機能を評価できます32。in vitroモデルの多様なアプリケーションにもかかわらず、in vitroアッセイのみを使用して in vivo 条件の複雑さをモデル化することは困難です。この課題は、マウス異種移植片モデルを使用して in vivoでのBCSC挙動を評価することで克服できます。特に、このようなモデルは、乳癌転移33を評価し、疾患進行中の微小環境との相互作用を調査し34、 in vivo イメージング35、および抗腫瘍剤34の患者特異的毒性および有効性を予測するための理想的なシステムとして役立つ。

このプロトコルは、不均一な乳がん細胞のバルク集団から最大純度でヒトALDH高CD44 + CD24-BCSCを単離するための詳細な説明を提供します。また、3つのin vitro技術(コロニー形成アッセイ、マンモスフェアアッセイ、および3D培養モデル)と、BCSCのさまざまな機能を評価するために使用できるin vivo腫瘍異種移植アッセイの詳細な説明も提供します。これらの方法は、BCSC生物学の理解および/または新規BCSC標的療法の調査を目的として、ヒト乳がん細胞株または初代患者由来の乳がん細胞および腫瘍組織からのBCSCの単離および特性評価に関心のある研究者による使用に適しています。

Protocol

同意した乳がん患者から直接患者由来の外科的または生検サンプルを収集することは、施設倫理委員会によって承認された承認された人間の倫理プロトコルの下で実施されました。患者由来の異種移植片モデルを生成するために使用されたすべてのマウスは、施設が承認した動物施設で維持および収容された。マウスを用いた患者由来の異種移植片モデルからの腫瘍組織は、施設動物管理委?…

Representative Results

記載されたプロトコルは、細胞株または解離した腫瘍組織のいずれかからの乳癌細胞の不均一な集団からのヒトBCSCの単離を可能にする。特定の細胞株または組織サンプルについて、汚染された非BCSC集団が変動する可能性があるため、BCSCを最大純度で単離するための均一な単一細胞懸濁液を生成することが重要です。 厳格な選別戦略を適用すると、汚染された非BCSCの存在が最小限に抑えら?…

Discussion

乳がんの転移と治療に対する抵抗性は、世界中の女性の死亡の主な原因となっています。乳がん幹細胞(BCSC)の亜集団の存在は、転移の増強に寄与する26、43、44、45、46および治療抵抗性21、47、48に寄与する。<sup class="xre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

研究室のメンバーの有益な議論とサポートに感謝します。乳がん幹細胞と腫瘍微小環境に関する私たちの研究は、カナダがん研究協会研究所および米国陸軍国防総省乳がんプログラム(Grant # BC160912)からの助成金によって資金提供されています。V.B.はウエスタン・ポスドク・フェローシップ(ウエスタン大学)の支援を受けており、A.L.A.とV.B.はどちらもカナダ乳がん協会の支援を受けています。CLは、カナダ政府からのバニエカナダ大学院奨学金によってサポートされています。

Materials

7-Aminoactinomycin D (7AAD) BD 51-68981E suggested: 0.25 µg/1×106 cells
Acetone Fisher A18-1
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation
Basement membrane extract (BME) Corning 354234 Sold under the commercial name Matrigel
Cell culture plates: 6 well Corning 877218
Cell culture plates: 60mm Corning 353002
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment Corning 3474
Cell strainer: 40 micron BD 352340
Collagen Stemcell Technologies 7001 Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS
Collagenase Sigma 11088807001 1x
Conical tubes: 50 mL Fisher scientific 05-539-7
Crystal violet Sigma C6158 Use 0.05% crystal violet solution in water for staining
Dispase Stemcell Technologies 7913 5U/mL
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
DNAse Sigma D5052 0.1 mg/mL final concentration
FBS Avantor Seradigm Lifescience 97068-085  
Flow tubes: 5ml BD 352063 Polypropylene round-bottom tubes
Methanol Fisher 84124
mouse anti-Human CD24 antibody BD 561646 R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5
mouse anti-Human CD44 antibody BD 555479 R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB) Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation
PBS Wisent Inc 311-425-CL 1x, Without calcium and magnesium
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Mammosphere Media Composition
B27 Gibco 17504-44 1x
bFGF Sigma F2006 10 ng/mL
BSA Bioshop ALB003 04%
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 20 ng/mL
Insulin Sigma 16634 5 µg/mL
3D Organoid Media Composition
A8301 Tocris 2939 500 nM
B27 Gibco 17504-44 1x
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 5 ng/mL
FGF10 Peprotech 100-26 20 ng/mL
FGF7 Peprotech 100-19 5 ng/mL
GlutaMax Invitrogen 35050-061 1x
HEPES Gibco 15630-080 10 mM
N-acetylcysteine Sigma A9165 1.25 mM
Neuregulin β1 Peprotech 100-03 5 nM
Nicotinamide Sigma N0636 5 mM
Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
R-spondin3 R&D 3500 250 ng/mL
SB202190 Sigma S7067 500 nM
Y-27632 Tocris 1254 5 µM
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Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., Rodriguez-Torres, M., Allan, A. L. Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples. J. Vis. Exp. (164), e61775, doi:10.3791/61775 (2020).
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