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Developmental Biology

Genaue Follikel-Aufzählung in adulten Maus-Ovarien

Published: October 16, 2020 doi: 10.3791/61782
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Development and Stem Cells Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, and Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University

Summary

Hier beschreiben, vergleichen und kontrastieren wir zwei verschiedene Techniken für die genaue Follikelzählung von festen Eierstockgeweben der Maus.

Abstract

Sexuell reproduzierende weibliche Säugetiere werden mit ihrer gesamten lebensleinen Versorgung mit Eizellen geboren. Unreife, stille Eizellen finden sich in den Urfollikel, der Speichereinheit der weiblichen Keimbahn. Sie sind nicht erneuerbar, so dass ihre Zahl bei der Geburt und anschließende Verlustrate weitgehend die weibliche fruchtbare Lebensdauer diktiert. Eine genaue Quantifizierung der Urfollikelzahlen bei Frauen und Tieren ist für die Bestimmung der Auswirkungen von Arzneimitteln und Giftstoffen auf die Eierstockreserve von entscheidender Bedeutung. Es ist auch notwendig, die Notwendigkeit und den Erfolg bestehender und neu entstehender Techniken zur Erhaltung der Fruchtbarkeit zu bewerten. Derzeit gibt es keine Methoden, um die Anzahl der Urfollikel, die die Eierstockreserve bei Frauen umfassen, genau zu messen. Darüber hinaus ist es oft nicht möglich, Eierstockgewebe von großen Tieren oder gefährdeten Arten für Experimente zu erhalten. So sind Mäuse zu einem wesentlichen Modell für solche Studien geworden, und die Fähigkeit, urfolale Follikelzahlen in ganzen Eierstöcken der Maus zu bewerten, ist ein entscheidendes Werkzeug. Berichte über absolute Follikelzahlen in den Eierstöcken der Maus in der Literatur sind jedoch sehr variabel, was es schwierig macht, Daten zu vergleichen und/oder zu replizieren. Dies ist auf eine Reihe von Faktoren wie Belastung, Alter, Behandlungsgruppen sowie technische Unterschiede in den methoden zur Zählung zurückzuführen. In diesem Artikel stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Vorbereitung histologischer Abschnitte und das Zählen von Urfollikel in Denstöcken der Maus mit zwei verschiedenen Methoden bereit: [1] Stereologie, die sich auf die Fraktionator-/optische Dissektortechnik stützt; und [2] die direkte Zähltechnik. Einige der wichtigsten Vor- und Nachteile jeder Methode werden hervorgehoben, so dass die Reproduzierbarkeit vor Ort verbessert werden kann und die Forscher die am besten geeignete Methode für ihre Studien auswählen können.

Introduction

Die unreifen, meiotisch verhafteten Eizellen, die in Urfollikel im Eierstock gelagert werden, sind die Lagereinheit für die weibliche Keimbahn und bilden die lebenslange Eierstockreserve eines Individuums. Primordial Follikel Zahlen sinken natürlich mit dem Alter1, oder alternativ, kann vorzeitig nach der Exposition gegenüber exogenen Chemikalien, einschließlich einiger Pharmazeutika und Umweltgifte in Luft, Lebensmittel und Wasser2. Da die ursprüngliche Follikelzahl endlich ist, bestimmen die Menge und Qualität der Follikel innerhalb des Eierstocks weitgehend die weibliche Fruchtbarkeit und die Gesundheit der Nachkommen. Daher ist eine genaue Quantifizierung der Urfollikelzahl bei Frauen für die Bewertung der außerhalb des Ziels von exogenen Beleidigungen auf die Eierstockreserve wichtigen Bedeutung.

Bei Frauen ist eine Analyse des gesamten Eierstocks im Allgemeinen nicht möglich, so dass nicht-invasive Ersatzmaßnahmen der Ovarialreserve in einem klinischen Umfeld eingesetzt werden müssen. Das Anti-M-Llerian-Hormon (AMH) ist der am weitesten verbreitete Ersatz-Biomarker klinisch3. Serum AMH-Spiegel werden oft bei Frauen im fortgeschrittenen mütterlichen Alter oder vor und nach der Krebsbehandlung, wie Chemotherapie, gemessen. AMH wird jedoch durch den Anbau von Follikel und nicht durch Urfollikel erzeugt, und daher informieren serumspiegel nicht über die absolute Urfollikelzahl.

Da es keine Methoden gibt, um die Primordialzahl bei Frauen in situgenau zu bestimmen, bleibt die Zählung der Eierstockfollikel in Kleintiermodellen wie Nagetieren ein wesentliches Forschungsinstrument, um zu beurteilen, inwieweit exogene Beleidigungen Auswirkungen auf die Urfollikel und damit auf die Fruchtbarkeit haben. Leider sind die Berichte in der gesamten Literatur über urfolgische Zahlen in Nagetiermodellen sehr variabel4. Ein Hauptgrund dafür sind weithin berichtete technische Unterschiede in der eingesetzten Zählmethode. Vor allem gibt es zwei verschiedene Techniken, die in der Literatur beschrieben werden, um Urfollikel bei Mäusen aufzuzählen. Dazu gehören die Stereologie, die die optische Dissektormethode des Fraktionators verwendet, und die Anzahl der direkten Follikel.

Die Stereologie wird weithin als Goldstandard angesehen, da sie systematische einheitliche Stichproben5verwendet, was sie zur genauesten Methode zur Quantifizierung der urtypischen Follikelzahl in der ganzen Maus oder Ratteneierstöcke4,6,7macht. Die Stereologie ist unvoreingenommen, da sie die dreidimensionale Struktur desObjektsvon Interesse 8 berücksichtigt. Mit Hilfe einer optischen Dissektor-/Fraktionatormethode werden drei Stichprobenebenen angewendet, um Urfollikel mit dicken Gewebeabschnitten (z. B. 20 m) innerhalb eines bekannten Bruchteils des gesamten Mausovarials zu quantifizieren. Zunächst wird das Stichprobenintervall (z. B. jederdritte Abschnitt) zu einem zufälligen Start gewählt (Sampling-Fraktion 1, f1)4. Die Abschnitte werden dann systematisch und einheitlich von diesem Punkt an durch den gesamten Eierstock abgetastet. Dann wird ein unvoreingenommener Zählrahmen über dem Eierstockbereich überlagert und nach und nach entlang eines definierten, randomisierten Zählrasters bewegt (Sampling-Fraktion 2, f2)8. Schließlich wird ein bekannter Bruchteil der Schnittdicke optisch beprobt (z.B. 10 m) und Follikel in diesem Bereich gezählt (Probenahmefraktion 3, f3)4. Die rohe Follikelzahl wird mit der Umkehrung dieser Stichprobenfraktionen multipliziert, um den Endwert zu erhalten. Diese Methode erfordert eine fachkundige Schulung und Ausrüstung, einschließlich eines Mikroskops mit einer motorisierten Bühne, die von stereologischer Software angetrieben wird. Gewebe sollten in einem speziellen Bouin-Fixativ konserviert und in Glycolmethacrylatharz eingebettet werden, damit dicke Gewebeabschnitte mit einem Glycolmethacrylatharz-Mikrotom mit einem Glasmesser geschnitten werden können. Diese Methode wurde entwickelt, um Gewebeschrumpfung und Verformung zu berücksichtigen, um die dreidimensionale morphologische Struktur des Eierstocks und der Follikel am besten zu erhalten9.

Die direkte Follikelzählung ist die am häufigsten verwendete Methode zum Zählen von Follikel10. Es können häufigere Fixative (d. h. Formalin) verwendet werden, gefolgt von Paraffinwachseinbettung und erschöpfender serieller Schnitte mit einem Standardmikrotome mit einer Dicke zwischen 4 und 6 m. Follikel werden systematisch im gesamten Gewebeabschnitt in einem definierten Intervall gezählt und dann mit der Umkehrung des Probenahmeintervalls multipliziert, um die Gesamtfollikelschätzung zu erhalten. Diese Methode ist schnell und einfach, kann mit archivierten Geweben durchgeführt und mit standardmäßigen histologischen Techniken vorbereitet werden. Es erfordert nur ein Lichtmikroskop mit Standard-Bildgebungsfunktionen. Trotz dieser Vorteile fehlt es der direkten Follikelzählung jedoch an Genauigkeit und strengen Zählparametern der Stereologie, was sie anfälliger für Voreingenommenheit der Prüfer macht. Darüber hinaus können Gewebe während der Verarbeitung schrumpfen und verformt werden, wodurch die Integrität und Morphologie des Eierstocks gestört wird und somit die Follikelklassifizierung und -quantifizierung erschwert wird.

Ziel dieses Artikels ist es, zwei häufig verwendete Methoden zur quantitativen Bewertung der Urfollikelzahl in den Eierstöcken der Maus zu beschreiben: Stereologie und direkte Follikelzählung. Wir werden detaillierte Protokolle für diese beiden Methoden bereitstellen und einige ihrer Stärken und Schwächen aufzeigen, um die Reproduzierbarkeit in unserem Bereich zu verbessern und es den Forschern zu ermöglichen, eine fundierte Entscheidung über die am besten geeignete Zählmethode für ihre Studien zu treffen.

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Protocol

Eierstöcke wurden von weiblichen C57BL6J-Mäusen gesammelt. Alle tierischen Verfahren und Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Australischen Verhaltenskodex für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt und von der Monash Animal Research Platform Animal Ethics Committee genehmigt.

ANMERKUNG: Ein Chemotherapeutikum, das nachweislich primordiale Follikeloozyten erschöpft, wie mit Stereologie11 und direktenZählungen 12bestimmt,13 wurde in diesem Bericht verwendet, um die beiden Zählmethoden bei demselben Tier zu vergleichen. Weibliche, 8 Wochen alte (junge Erwachsene) Mäuse wurden vor einer einzigen intraperitonealen Injektion von 75 mg/kg/Körpergewicht von Cyclophosphamid oder einer sainen Fahrzeugkontrolle (n=5/Gruppe) gewogen. Es hat sich gezeigt, dass diese Dosis eine Erschöpfung der Urfollikel von ca. 50 % verursacht, aber nicht berichtet, dass sie Morbidität oder Mortalität bei Mäusen verursacht14. Die Eierstöcke wurden 48 Stunden nach der Behandlung geerntet. Ein Eierstock von jedem Tier wurde in 10% (v/v) neutral gepufferte Formalin-Lösung für 24 Stunden fixiert, und der andere in Bouins Lösung für 24 Stunden fixiert. Das Gewebe wurde dann entweder in Glykolmethacrylatharz eingebettet und seriell auf 20 m oder in Paraffin und seriell auf 5 m geschnitten. Alle Gewebe wurden mit Periodensäure Schiff und Hämatoxylin gefärbt.

1. Histologische Präparation: Fixierung, Verarbeitung, Einbettung und Schnitt von Maus-Ovarien

  1. Sezieren Sie die Eierstöcke der Maus, indem Sie das Eileiter und das gesamte umgebende Fett schneiden, ohne den Eierstock selbst zu beschädigen oder zu schneiden. Verwenden Sie bei Bedarf für diesen Schritt ein Sezieren von Mikroskop und eine feine Klinge (Abbildung 1A).
  2. Beheben Sie Gewebe sofort, indem Sie es in ein kleines, beschriftetes Rohr legen, das entweder Bouins fixative (Stereologie) oder formalin fixative (direkte Zählungen) für 24 Stunden enthält(Abbildung 1B), bevor Gewebe in 70 % Ethanol übertragen werden.
    HINWEIS: Die Follikelmorphologie wird am besten in Bouins festem Eierstockgewebe konserviert und in Glykolmethacrylatharz eingebettet (Abbildung 2).
  3. Verarbeiten Sie ganze feste Eierstöcke und betten Sie dann in Glykolmethacrylatharz für die Stereologie (Ergänzende Akte 1), oder Paraffinwachs für direkte Zählungen mit einem Standard histologisches Protokoll.
    VORSICHT: Harz ist giftig, so stellen Sie sicher, dass alle Gewebeverarbeitungsschritte in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden und Handschuhe zu jeder Zeit getragen werden.
  4. Verwenden Sie ein spezielles Harzmethacrylat-Mikrotom (Abbildung 1C), das mit einem Glasmesser (Abbildung 1D) ausgestattet ist, um dicke Glycolmethacrylatharzabschnitte (z. B. 20 m) erschöpfend zu schneiden. Sammeln Sie die Abschnitte in regelmäßigen Abständen (z. B. jeden3. Abschnitt) auf Glasmikroskop-Dias für die Stereologie.
  5. Verwenden Sie ein Standard-Mikrotom, um dünne Paraffinabschnitte (z. B. 4-6 m) zu schneiden. Sammeln Sie Gewebeabschnitte in regelmäßigen Abständen (z. B. jeden9. Abschnitt) auf einem Glasmikroskopschlitten für direkte Follikelzahlen.
  6. Die Dias mit periodischer Säure Schiff und Hämatoxylin(Ergänzungsdatei 2) beflecken
  7. Coverslip mit Standard-DPX für Paraffinprofile oder dickes DPX für Glycolmethacrylatharzabschnitte (Abbildung 1E).
    VORSICHT: Glycolmethacrylatharz DPX ist gefährlich, also führen Sie diesen Schritt in, um Dunstabzugshaube zu verwenden.
    HINWEIS: Glycolmethacrylatharz DPX ist extrem zähflüssig. Der Glasdeckel muss fest mit einem Spachtel nach unten gedrückt werden, um sicherzustellen, dass der DPX gleichmäßig und dünn dispergiert ist und unter dem Deckschein keine Luftblasen vorhanden sind (Abbildung 1F).

2. Stereologische Schätzung der urzeitlichen Follikelzahl mit dem optischen Fractionator

  1. Schalten Sie den Computer, die Multi-Control-Einheit, die Kamera und die Lichtquelle innerhalb des stereologischen Setups ein und stellen Sie das Mikroskopobjektiv auf eine geringe Vergrößerung (z. B. 10x).
  2. Öffnen Sie die Stereologie-Software.
  3. Setzen Sie den ersten Schlitten sicher auf die Mikroskopstufe.
  4. Stellen Sie die Lichtbelichtung ein, indem Sie im Bedienfeld "Kameraeinstellungen" (Ergänzende Abbildung 1A ) unter Automatisch unter Belichtung überprüfen. Alternativ können Sie die Lichtbelichtung manuell einstellen.
  5. Verwenden Sie den Joystick, um die erste Gewebeprobe zu lokalisieren und die Probe in den Fokus zu rücken.
  6. Passen Sie den Weißabgleich an, indem Sie entweder auf Weitere Einstellungen (unten rechts im Bedienfeld Kameraeinstellungen) klicken und dann auf Weißabgleich und auf Automatisch klicken (Ergänzende Abbildung 1B). Alternativ können Sie auf die Schaltfläche Weißabgleich neben der Schaltfläche Weitere Einstellungen (oder Bereich in weiteren Einstellungen auswählen ) klicken, um den Weißabgleich manuell festzulegen, indem Sie einen weißen Bereich im Abschnitt auswählen.
  7. Gehen Sie zum Dropdown-Menü "Sonden" und klicken Sie auf Optical Fractionator Workflow. Klicken Sie dann auf Neues Projekt starten und klicken Sie auf OK.
    1. Wenn eine vorhandene Sampling-Konfiguration gespeichert wurde, klicken Sie unter Sampling-Parameter auf Ja | ... und wählen Sie die gewünschte Sampling-Konfiguration aus.
    2. Wenn dies nicht der Fall ist, klicken Sie auf Nein, und geben Sie die Informationen zum seriellen Abschnitt (Ergänzende Abbildung 1C) manuell ein, und definieren Sie die Prüfpunktkonfiguration in Schritt 2.13.
  8. Klicken Sie auf Weiter, stellen Sie das Mikroskop auf Niedrige Vergrößerung ein und wählen Sie aus dem Dropdown-Menü die 10-fache Vergrößerung aus.
  9. Klicken Sie auf Weiter, und verfolgen Sie dann den gesamten Eierstockbereich – beginnen Sie mit einem links klickenden Abschnitt und klicken Sie am Ende mit der rechten Maustaste und wählen Sie Kontur schließen.
  10. Klicken Sie auf Weiter, stellen Sie das Mikroskop auf Hohe Vergrößerung und wählen Sie 100x Ölvergrößerung aus dem Dropdown-Menü.
  11. Legen Sie einen Tropfen Öl auf den Gewebebereich auf dem Dia und bewegen Sie das Mikroskopobjektiv auf die 100-fache Vergrößerung.
  12. Passen Sie die Lichtbelichtung an (wie in Schritt 2.4) und klicken Sie auf Weiter.
  13. Richten Sie die Sampling-Parameter ein, um die Prüfpunktkonfiguration zu definieren. Hier wurde der Zählrahmen auf 47,5 x 47,5 m (2.256,25 m2) und die Schrittlänge auf 100 x 100 m (10.000 m2) eingestellt (Zusatzabbildung 2). Nachdem die Samplingparameter festgelegt wurden, speichern Sie die Vorlage und öffnen Sie sie während der nachfolgenden Analysesitzungen unter Schritt 2.7 erneut.
  14. Klicken Sie auf Counting starten (Zusatzabbildung 1D). Konzentrieren Sie sich auf den Oberen Rand des Beispiels, klicken Sie auf OK, und beginnen Sie mit der Zählung.
  15. Verwenden Sie den Fokussierknopf, um sich durch die 10 m Probentiefe zu bewegen und alle Urfollikel zu zählen, deren Eizellenkern in den Fokus rückt. Klicken Sie auf Weiter, um zum nächsten Bereich zu wechseln.
    1. Klassifizieren Sie Follikel als Ur-Ur-Zellen, wenn die Oozyte von Plattenzellen (abgeflachten) Granulosazellen umgeben ist, aber keine quakodenalen Granulosazellen (Abbildung 2A).
      ANMERKUNG: Primordialfollikel unterscheiden sich von Zwischen-/Übergangsfollikel, die eine Kombination von quatolen und Plattenepithelzellen(Abbildung 2B) und Primärfollikel umfassen, die überwiegend von quaderalen Granulosazellen umgeben sind (Abbildung 2C). Diese Follikelklassen sollten separat quantifiziert werden.
    2. Zählen Sie nur Follikel, in denen der Eizellkern sichtbar ist. Der Oozytenkern muss innerhalb des Zählrahmens erscheinen oder die grünen Einschlusslinien des Zählrahmens berühren (Zusatzabbildung 1E,F).
    3. Wenn der Oozytenkern außerhalb des Zählrahmens liegt (Zusatzabbildung 1G) oder die roten Ausschlusslinien des Zählrahmens berührt, zählen Sie diesen Follikel nicht.
    4. Bei der Beurteilung des Urfollikelabbaus als Reaktion auf eine exogene Chemikalie (z. B. Chemotherapie) stellen Sie sicher, dass alle gezählten Follikel gesund sind und somit eine normale Morphologie haben (Abbildung 2). Zählen Sie alle abnormalen oder atretischen Follikel separat. Oft wird der Follikeltod durch Beleidigungen wie Chemotherapie induziert, und die Quantifizierung der atretischen Follikel sollte separat erfolgen, um zwischen gesunden und atretischen Follikel zu unterscheiden, da nur gesunde Follikel die Ovarialreserve15umfassen.
  16. Führen Sie nach Abschluss der Zählung in diesem Abschnitt eine der folgenden Schritte aus:
    1. Klicken Sie auf Neuer Abschnitt hinzufügen, und kehren Sie dann zu Schritt 2.3 zurück, um den nächsten Abschnitt für die Zählung einzurichten.
    2. Klicken Sie auf Ich habe die Zählung beendet, um die Sitzung zu beenden. Setzen Sie das Objektiv auf 10x zurück, beenden Sie die Stereologie-Software und schalten Sie die Lichtquelle, Kamera, Multi-Control-Einheit und Computer aus.
  17. Beziehen Sie die Summe Rohfollikelzahl (Q) aus jedem Gewebeabschnitt aus dem gesamten Eierstock, dann mit einer Tabelle, verwenden Sie die Gleichung unten, um den endgültigen Wert von jedem replizierenden Tier (N)4zu erhalten.
    Equation 1Wo:
    N = Gesamtgeschätzte Anzahl der Follikel innerhalb des Eierstocks.
    Q = Rohe Urfollikelzahl.
    f1 = Abtastintervall. Jederdritte Abschnitt wurde so abgetastet. Equation 2
    f2 = Beziehung zwischen Zählrahmen (Beispielfläche) und Stepper, berechnet als Equation 3 . Da die Probenfläche 2256 m2 (47,5 x 47,5 m) betrug und die Schrittfläche 10000 m2 (100 x 100 m) Equation 4 betrug.
    f3 = Anteil des Eierstockschnitts. Da 10 m des 20-mm-Abschnitts abgetastet wurden, Equation 5 .
    Daher. Equation 6
    ANMERKUNG: Dieses Protokoll beschreibt, wie diese Prinzipien der stereologischen Analysen mit einer viel zitierten Stereologie-Software (Tabelle der Materialien)angewendet werden können; es steht jedoch eine andere stereologische Software zur Verfügung. Die Prinzipien, die bei stereologischen Analysen von Eierstockfollikel angewendet werden, sind die gleichen, unabhängig von der Software, die zum Einrichten der Parameter verwendet wird. Die Stereologie ist am genauesten, wenn 100 oder mehr Objekte in einem erwachsenen Maus-Ovarial4gezählt werden, da dies einen Fehlerkoeffizienten für die Schätzung unter 10%16ergibt. Die hier beschriebenen Stichprobenparameter wurden optimiert, um sicherzustellen, dass mindestens 100 Objekte (d. h. Ur-, Übergangs- und Primärfollikel) in der Kontrolle der adulten Wild-Typ C57BL6J-Eierstöcke gezählt werden können. Eine Pilotstudie mit einem kleinen Stichprobenumfang kann durchgeführt werden, um die optimalen Stichprobenparameter zu ermitteln, wie das Intervall und die Anzahl der zu analysierenden Abschnitte und die Anzahl der optischen Dissektoren innerhalb der stichprobenartig untersuchten Abschnitte17.

3. Schätzung der Urfollikelzahl durch direkte Ovarialfollikelzahl

  1. Platzieren Sie den Mikroskopschlitten sicher unter einem Standard-Lichtmikroskop und führen Sie direkte Zählungen durch, um eine rohe Urfollikelzahl zu erhalten.
    1. Klassifizieren Sie Follikel als Ur-Granulosa-Zellen, aber keine quaroilen Granulosazellen (Abbildung 2D).
      ANMERKUNG: Primordialfollikel unterscheiden sich von Zwischen-/Übergangsfollikel, die eine Kombination von quatolen und Plattenepithelzellen (Abbildung 2E) und Primärfollikel umfassen, die überwiegend von quaderalen Granulosazellen umgeben sind (Abbildung 2F). Diese Follikelklassen sollten separat quantifiziert werden.
    2. Stellen Sie sicher, dass alle gezählten Follikel gesund sind und somit eine normale Morphologie haben (Abbildung 2). Zählen Sie alle abnormalen oder atretischen Follikel separat, da nur gesunde Follikel die Eierstockreserve umfassen.
  2. Alternativ können Sie mehrere oder genähte Hochleistungsphotomikroskope (z. B. 20x) des gesamten Eierstockgewebeabschnitts verwenden, um Zählungen durchzuführen, indem Sie die Bilddatei(en) öffnen. Dies kann manuell oder mit einem automatisierten Diascanner erfolgen.
  3. Erhalten Sie die Summe Rohfollikelzahl (Q) aus jedem Gewebeabschnitt, der im vorgegebenen Intervall aus dem gesamten Eierstock entnommen wird. Multiplizieren Sie diese Zahl mit der Umkehrung des Stichprobenbruchs, um den Endwert für jedes Replizierungstier (N) zu erhalten, wobei die folgende Gleichung verwendet wird.
    Equation 7Wo:
    N = Gesamtgeschätzte Anzahl der Follikel innerhalb des Eierstocks.
    Q = Rohfollikelzahl (von jedem einzelnen Typ, separat berechnet).
    f1 = Abtastintervall. Jeder9. Abschnitt wurde so Equation 8 abgetastet.
    Daher. Equation 9

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Representative Results

Es wurde ein gut charakterisiertes Modell der Follikeldepletion verwendet, bei dem jungen erwachsenen weiblichen Mäusen eine Einzeldosis Cyclophosphamid-Chemotherapie oder kochische Fahrzeugkontrolle (n=5/Gruppe) verabreicht wurde und beide Eierstöcke nach 48 Stunden von jedem Tier geerntet wurden. Für jede der beiden Methoden wurde ein Eierstock pro Tier hergestellt, wie in Schritt 1 beschrieben: Stereologie oder direkte Zählung. Der linke und rechte Eierstock jedes Tieres wurde jeder Gruppe zufällig zugeordnet. Diese Daten zeigen, dass bei der Verwendung der Stereologie eine signifikante Erschöpfung der Maus-Urfollikel nach einer Chemotherapie (387 ± 11 Follikel) im Vergleich zur Kontrolle (1043 ± 149; p=0,0024) (Abbildung 3) nachgewiesen werden kann. Im Gegensatz dazu konnten die direkten Follikelzählungen bei Verwendung der kontralateralen Eierstöcke derselben Tiere ± im Vergleich zur Kontrolle (752 ± 139; p=0,1063)(Abbildung 3) keine signifikante Verringerung der Eierstockreserve feststellen. Bemerkenswert ist, dass die Urfollikelzahl bei jungen erwachsenen Wildtieren variabel ist, da die Verteilung der mit Saline behandelten Tiere im Vergleich zu den Cyclophosphamidgruppen breiter ist, selbst wenn die Zählungen mit Hilfe der Stereologie durchgeführt wurden (Abbildung 3).

Figure 1
Abbildung 1: Histologische Präparation von Bouins-fixierten, glykolmethacrylatharzeingebetteten Eierstöcken zur stereoologischen Analyse. A) Ein erwachsener Maus-Ovarial (Kreis, Pfeil) wurde eng von allem Fett und dem Eileiter aus dem Maus-Ovarial mit einer Federklinge getrimmt. B) Kontralaterale Maus-Ovarien (Kreis, Pfeil) von demselben weiblichen Erwachsenen wurden seziert, gestutzt, dann entweder in Bouins Fixativ (links) für stereologie fixiert, oder Formalin für direkte Zählungen (rechts). C) Ein spezielles Harzmethacrylat-Mikrotom D) mit einem Glasmesser (Pfeil) wurde verwendet, um Glykolmethacrylat-Harzblöcke in 20 m Abschnitte zu schneiden, die auf Glasmikroskop-Dias gesammelt wurden. E) Periodisch säuregebeiteilte Eierstockgewebeabschnitte auf Glasmikroskop-Dias (Pfeile) wurden in frisches Histolene (grüner Behälter) in eine Dunstabzugshaube getaucht, dann wurde ein Glasdeckel auf Tropfen von GMA DPX hinzugefügt. Ein Spachtel wurde verwendet, um überschüssige DPX und Luftblasen zu entfernen. Die Rutschen wurden über Nacht in der Dunstabzugshaube luftgetrocknet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Urfollikelklassifizierung. Repräsentative Bilder von Ur-, Übergangs- und Primärfollikel in Glycolmethacrylatharz-eingebetteten (A-C) und Paraffin-eingebetteten (D-F) Eierstockabschnitten. A: Urfollikel umgeben von Plattenepithel-Granulosa-Zellen (Pfeil). Bar = 10 m. B: Übergangsfollikel, umgeben von Plattenepithelzellen (Pfeil) und Quader (Pfeilspitze). Bar = 10 m. C: Primärfollikel umgeben von quaderalen (Pfeilspitzen) Granulosazellen. Bar = 25 m. D: Urfollikel umgeben von Plattenepithel-Granulosa-Zellen (Pfeil). Bar = 10 m. E: Übergangsfollikel, umgeben von Plattenepithelzellen (Pfeil) und Quader (Pfeilspitze). Bar = 10 m. F: Primärfollikel umgeben von quaderalen (Pfeilspitzen) Granulosazellen. Bar = 25 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Vergleich des optischen Fractionators und der direkten Zählmethoden zur Bewertung der Urfollikel der Maus. Als Modell wurde ein etabliertes Modell der Follikeldepletion verwendet, bei dem 8 Wochen alte weibliche C57BL6J-Mäuse intraperitoneal mit Kochsaline oder einer Dosis von 75 mg/kg/Körpergewicht des Chemotherapeutikums Cyclophosphamid (n=6/Gruppe) behandelt wurden. Dies ermöglichte den Vergleich der beiden Follikelzählmethoden, um Veränderungen der Eierstockreserve zu erkennen. In derselben Tierkohorte konnten die Gesamtfollikelschätzungen keine signifikante Follikeldeschöpfung erkennen, im Gegensatz zur Stereologie, die eine größere und signifikante Erschöpfung des Eierstockreservats feststellte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Stärken Schwächen
STEREOLOGIE Die genaueste Methode zur Schätzung von Follikel Zeitaufwändig und teuer
Verwendet mehrere Stichprobenparameter, wodurch er statistisch robust ist Erfordert fachkundige Ausrüstung und Software
Hochempfindlich, kann kleinere Veränderungen der Urfollikelzahlen erkennen Die Proben müssen mit spezifischen, spezialisierten histologischen Techniken erstellt werden.
Follikelstruktur wird bei der Gewebeverarbeitung besser erhalten
Einheitliche Regeln, die von verschiedenen Prüfern angewendet werden können, wodurch die Voreingenommenheit
DIREKTE ZÄHLUNGEN Zeit- und Kosteneffizienz Weniger genau und empfindlich als die Stereologie
Erfordert Standard-Laborgeräte, z.B. Lichtmikroskop Es wird nur ein Stichprobenparameter verwendet, wodurch er bei der Erkennung kleiner Änderungen der Follikelzahlen weniger effektiv ist.
Retention von Eierstockabschnitten, die für immunhistochemische oder andere Analysen verwendet werden können Gewebe ist anfälliger für Volumen- und Follikelveränderungen während der Verarbeitung
Kein einheitliches Regelwerk, das angewendet werden kann, also anfälliger für Voreingenommenheit durch den Prüfer

Tabelle 1: Vergleich der Stärken und Schwächen von Follikelzählmethoden: Stereologie vs. direkte Zählungen.

Ergänzende Abbildung 1: Screenshots des Stereologie-Softwareprotokolls. A) Passen Sie die Belichtung an, indem Sie im Bedienfeld Kameraeinstellungen (weißes Feld) unter Belichtung (rotes Kästchen) automatisch (rotes Kästchen) ankreuzen. B) Legen Sie den Weißabgleich fest, indem Sie zuerst im Bedienfeld Kameraeinstellungen auf das Symbol "Weitere Einstellungen" unter Andere klicken. Wählen Sie dann Weißabgleich aus und klicken Sie auf Automatisch (rotes Feld). C) Wenn keine vorhandene Samplingkonfiguration festgelegt wurde, klicken Sie auf Nein (rotes Feld) und geben Sie die Informationen zum seriellen Abschnitt ein (grünes Feld). D) Um mit der Zählung zu beginnen, klicken Sie auf Zählung starten (weißer Pfeil). E) Wenn der Kern eines Urfollikels innerhalb des Zählrahmens sichtbar ist, wird dieser Follikel gezählt (weißer gepunkteter Kreis). F) Wenn der Kern eines Urfollikels die grünen Einschlusslinien des Zählrahmens berührt, wird auch dieser Follikel gezählt (weißer gepunkteter Kreis). G) Wenn der Kern eines Urfollikels innerhalb des Zählrahmens nicht sichtbar ist oder die roten Ausschlusslinien des Zählrahmens berührt, wird dieser Follikel nicht gezählt (weißer gepunkteter Kreis). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Einrichten der Sampling-Parameter. Führen Sie sequenzielle Schritte im linken Bereich aus, um die Probekonfiguration zu definieren. A) Messen Sie die montierte Dicke. Stellen Sie sicher, dass "Neufokus auf den oberen Abschnitt an jedem Rasterstandort" nicht angekreuzt ist (rotes Kästchen). Aktivieren Sie 'Manuell die durchschnittliche montierte Dicke eingeben' (grüne Box). Geben Sie die durchschnittliche Montagedicke von 20,00 m (blaue Box) ein. B) Definieren Sie die Größe des Zählrahmens. Aktivieren Sie unter Zählrahmenanzeige "Erzwingen der Anzeige des Zählrahmens, um quadratisch zu sein" und "Zentrum auf Live-Bild" (rotes Feld). Geben Sie unter Zählrahmengröße 47,5 m für X und Y (grünes Feld) ein. C) Definieren Sie das SRS-Rasterlayout. Geben Sie die Rastergröße manuell als 110 für X und Y (rotes Feld) ein. D) Definieren Sie Dissektoroptionen. Geben Sie für die Höhe der oberen Schutzzone 1,00 m (rotes Feld) ein. Geben Sie für die optische Dissektorhöhe 10 m (grüne Box) ein. Wählen Sie unter Fokusmethode "Manueller Fokus" (blaues Feld). E) Speichern Sie Diesstichprobenparameter. Um diese Einstellungen zu speichern, geben Sie einen Namen und Kommentar ein und klicken Sie dann auf "Aktuelle Einstellungen speichern" (weißer Pfeil). F) Unter Aktuelle Parameterparametereinstellungen für Sampling-Parameter stellen Sie sicher, dass Ihre Einstellungen mit den angezeigten übereinstimmen. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Dieser Artikel enthält ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Goldstandard-Technik zur Aufzählung von Maus-Urfollikel, Stereologie und die am häufigsten verwendete Methode der direkten Follikelzählung. Die Chemotherapie wurde verwendet, um die Ergebnisse dieser beiden verschiedenen Methoden innerhalb des linken und rechten Eierstocks desselben Tieres zu vergleichen und zu vergleichen. Beide Methoden zeigten eine hohe variabilile Zwischentiervariabilität bei den ursprünglichen Follikelzahlen. Eine signifikante Erschöpfung der Ovarialreserve wurde mit Hilfe der Stereologie registriert, aber die direkte Zählung konnte keine signifikante Verringerung der Primordialfollikelzahl nach Chemotherapie-Verabreichung versus Kontrolle erkennen.

Bemerkenswert ist, dass selbst bei einem inzuchtartigen Mäusestamm, wie C57BL6J, die Eierstockreserve bei jungen erwachsenen Wildweibchen weit verbreitet ist, wie es beim Menschen der Fall ist. Faktoren, die dies beeinflussen und zur Einrichtung der Eierstockreserve beitragen, werden noch untersucht18. Eine hohe Variabilität zwischen den Studien zur Eierstockfunktion der Maus stellt das Feld vor zahlreiche Herausforderungen, Daten zu vergleichen oder zu replizieren und die klinische Übersetzung neuartiger Therapeutika zum Schutz der Oozytenzahl und Der Qualität zu fördern4. Diese Variabilität ist wahrscheinlich auf eine Reihe von Faktoren zurückzuführen, darunter nicht nur die eingesetzten Zählmethoden, sondern auch zusätzliche Faktoren wie Unterschiede zwischen tierischem Stamm und Alter; Behandlungsschemas wie Dosis und Timing. Diese Faktoren müssen alle beim Vergleich von Daten aus verschiedenen Studien berücksichtigt werden. Unabhängig davon hebt das in dieser Studie verwendete Follikel-Erschöpfungsmodell insgesamt die genaue und empfindliche Natur des stereologischen Protokolls hervor und zeigt gleichzeitig, dass die weithin gemeldete Methode der direkten Zählung nicht in der Lage ist, eine bekannte signifikante Urfollikelerschöpfung zu erkennen.

Es gibt Stärken und Einschränkungen jeder Zählmethode, die in diesem Artikel (Tabelle 1) beschrieben wird. Die Stereologie gilt aufgrund ihrer Genauigkeit als goldstandardmethode, wenn sie zur Bestimmung der Zellzahl in einer Vielzahl verschiedener Organe verwendet wird5. Zu den Nachteilen dieser Technik gehören jedoch die Zeit und die Kosten sowie die Anforderung an spezielle Ausrüstung und Fachwissen. Zusammen hat dies die weit verbreitete Anwendung dieses Verfahrens zur Gewinnung der sensibelsten Daten eingeschränkt.

Im Gegensatz dazu ist die Methode der direkten Zählung schnell, einfach, kann mit archivierten Geweben durchgeführt und mit standardmäßigen histologischen Techniken vorbereitet werden. Es erfordert nur ein Lichtmikroskop mit Standard-Bildgebungsfunktionen. Volumenänderungen, die durch histologische Verarbeitung induziert werden, werden jedoch nicht berücksichtigt, was die dreidimensionale Struktur des Eierstocks stören kann. Folglich ist die Follikelmorphologie nicht immer ausreichend erhalten, was die Identifikations- und Zählgenauigkeit vor allem für unerfahrene Forscher schwierig macht. Während Formalin das Fixativ für direkte Zählungen in dieser Studie war, kann Bouins-fixiertes Gewebe in Paraffin eingebettet werden und dies kann eine bessere Morphologie bieten und Forschern helfen, Urfollikel leichter zu identifizieren. Darüber hinaus variieren die Stichprobenfraktionen für die Methode der direkten Zählung innerhalb der Literatur stark und reichen von jedem3. bis jeden10. 5 m Paraffinabschnitt19, was zu großen Diskrepanzen bei den Follikelzahlen zwischen den Studien beitragen kann. Da Paraffinwachsabschnitte so dünn sind, hilft das Zählen jedes9. Abschnitts, Übersampling und unnötiges Zählen zu verhindern.

Zusätzliche Methoden, die nicht in diesem Leitfaden beschrieben, aber häufig in der Literatur berichtet werden, zählen nur in einem zentralen Abschnitt aus dem gesamten Eierstock und betrachten dies als repräsentativ für den gesamten Eierstock, oder Follikeldichte. Diese erste Methode ist höchst problematisch, da Urfollikel nicht gleichmäßig im Eierstock verteilt sind und in Clustern gefunden werden können. Dies bedeutet, dass ein einzelner oder sogar ein paar Abschnitte des Eierstocks nicht repräsentativ für das gesamte Organ sind, was eine systematische Probenahme zu einem wesentlichen Bestandteil jeder Zählmethode macht. Die Follikeldichte beinhaltet das Zählen von Follikel in einer Eierstockgewebeprobe und dann die Angabe der Zählungen pro Gewebebereich. Angesichts der Grenzen der Gewinnung von primärem menschlichem Gewebe, Follikeldichte wird oft als Ersatz-Maß für absolute Follikelzahl in menschlichen Eierstöcken verwendet, obwohl Berichte bei Mäusen auch häufig sind. Diese Quantifizierungsmethode berücksichtigt jedoch nicht die ungleichmäßige Verteilung der Follikel im gesamten Eierstock oder Schwankungen des Eierstockvolumens, die routinemäßig während des ovariellen endokrinen (lauten) Zyklus auftreten. Dies ist wichtig, da ein genaues Maß der Dichte unter den Proben auf konservierten Gewebebereich beruht. Darüber hinaus wird bei dieser Methode bei der Analyse des menschlichen Gewebes oft nur eine kleine Biopsie oder ein Bruchteil des Eierstocks entnommen, was somit nicht repräsentativ für den gesamten Eierstock ist. Die Follikeldichte fehlt die Genauigkeit, die mit der Stereologie erreichbar ist. Selbst unter Verwendung des gleichen ganzen Eierstocks entsprachen vergleichende Messgrößen der Follikelquantifizierung nach stereologischer Analyse mit Follikeldichte nicht in den Eierstöcken der Maus20.

Obwohl es das am häufigsten verwendete Versuchstier ist, ist die Maus nur eine Modellart. Die Gewinnung von Eierstöcken von größeren Arten, einschließlich Haustiere oder nicht-menschlicher Primaten, ist möglich, so dass Follikelzahlen aus ganzen Eierstockproben mit einem modifizierten stereologischen Protokoll21,22erreicht werden können. Schließlich ist die Fähigkeit, Follikelzahlen in ganzen menschlichen Eierstöcken zu analysieren, in der Tat sehr schwierig, aber dennoch kann es geschehen, wenn Proben verfügbar sind, mit einem modifizierten stereologischen Protokoll23,24,25.

Zukünftige Richtungen in diesem Bereich können die Erweiterung und Übernahme neuer Techniken umfassen. Beispielsweise wurde eine neue Methodik der automatisierten Erkennung und Zählung für Urfollikeloozyten beschrieben26. Diese Methode verwendet konvolutionale neuronale Netzwerke, die von beschrifteten Datasets gesteuert werden, und einen gleitenden Fensteralgorithmus, um Testdaten auszuwählen. Allerdings wurde dieser Algorithmus nur über zwei Eierstöcke getestet und eine weit verbreitete Aufnahme muss noch ermittelt werden. Alternativ haben die jüngsten Fortschritte in der optischen Geweberäumung und lichtbogenmikroskopie eine umfassende Analyse intakter Gewebe ermöglicht, und einige Studien haben dies für die Follikelaufzählung im Maus-Ovarialuntersucht 27,28.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die direkte Follikelzählung zwar eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Aufzählung der Urfollikel innerhalb des Eierstocks ist, diese Technik jedoch möglicherweise nicht sensibel, präzise und anfällig für Voreingenommenheit der Prüfer ist. Daher bleibt die Stereologie trotz ihrer Nachteile die beste verfügbare Technik, um urfolale Follikelzahlen genau und reproduzierbar zu definieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch die Operational Infrastructure Support der viktorianischen Staatsregierung und die australische Regierung NHMRC IRIISS ermöglicht und durch finanzielle Unterstützung des National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) und des Australian Research Council (KJH #FT190100265) unterstützt. Die Autoren möchten die technische Unterstützung der Monash Animal Research Platform, Monash Histology Platform und Monash Micro Imaging Facility würdigen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Butanol (HPLC) Fisher Chemical #A383-1
Acid alcohol Amber Scientific #ACDL
Bouin’s fixative Sigma-Aldrich #HT10132 Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)
Cyclophosphamide Sigma-Aldrich #C0768-5G
Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX) Sigma-Aldrich #06522
Ethanol Amber Scientific #ETH Ethanol 100%
Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle Designs for Vision #FEA-745-SR Feather blade for dissections (seen in Figure 1)
Formalin fixative Australian Biostain #ANBFC
Glass coverslip Thermo Scientific #MENCS22501GP 22 mm x 50 mm
Glycomethacrylate resin RM2165 microtome Leica Microsystems #RM2165
Glycolmethacrylate DPX *made in house *Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks
Histolene Trajan #11031
Mayer’s haematoxylin Amber Scientific #MH
Olympus BX50 microscope Olympus #BX50 Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)
Olympus immersion oil type-F Olympus #IMMOIL-F30CC
Olympus TH4-200 light source Olympus #TH4-200
Paraffin wax Sigma-Aldrich #03987
Periodic acid Trajan #PERI1% Periodic acid 1%
Rotary Microtome CUT 4060 MicroTec #4060R/F Used to cut paraffin sections
Schiff’s reagent Trajan #SCHF
Scott's tap water Amber Scientific #SCOT Potassium carbonate, magnesium sulphate, water
StereoInvestigator Stereological System MBF Bioscience Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick
Superfrost microscope slides Thermo Scientific #MENSF41296SP 1 mm, 72 pcs
Technovit 7100 Plastic embedding system Emgrid Australia #64709003 500 mL/5 x 1 g/40 mL
Technovit 3040 yellow Emgrid Australia #64708805 100 g/80 mL

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References

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Entwicklungsbiologie Ausgabe 164 Eierstock Oozyte Fruchtbarkeit Urfollikel Stereologie Follikelschätzungen direkte Zählungen
Genaue Follikel-Aufzählung in adulten Maus-Ovarien
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Winship, A. L., Sarma, U. C., Alesi, L. R., Hutt, K. J. Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries. J. Vis. Exp. (164), e61782, doi:10.3791/61782 (2020).

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