Summary
यहां, हम निश्चित माउस अंडाशय ऊतकों की सटीक कूप गिनती के लिए दो अलग-अलग तकनीकों का वर्णन, तुलना और इसके विपरीत करते हैं।
Abstract
यौन प्रजनन महिला स्तनधारियों oocytes के अपने पूरे जीवन काल की आपूर्ति के साथ पैदा होते हैं । अपरिपक्व, शांत ओसाइट्स मौलिक रोम के भीतर पाए जाते हैं, जो मादा जर्मलाइन की भंडारण इकाई है। वे गैर अक्षय हैं, इस प्रकार जन्म पर उनकी संख्या और नुकसान की बाद की दर काफी हद तक महिला उपजाऊ उम्र तय करती है । अंडाशय रिजर्व पर दवाओं और विषाक्त पदार्थों के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए महिलाओं और जानवरों में मौलिक कूप संख्या का सटीक मात्राकरण आवश्यक है। यह भी की जरूरत है, और की सफलता, मौजूदा और उभरती प्रजनन संरक्षण तकनीकों के मूल्यांकन के लिए आवश्यक है । वर्तमान में, महिलाओं में अंडाशय रिजर्व को शामिल करने वाले मौलिक रोम की संख्या को सही ढंग से मापने के लिए कोई तरीका मौजूद नहीं है। इसके अलावा, प्रयोग के लिए बड़े जानवरों या लुप्तप्राय प्रजातियों से अंडाशय ऊतक प्राप्त करना अक्सर संभव नहीं होता है। इस प्रकार, चूहों इस तरह के अध्ययनों के लिए एक आवश्यक मॉडल बन गए हैं, और पूरे माउस अंडाशय में मौलिक कूप संख्या का मूल्यांकन करने की क्षमता एक महत्वपूर्ण उपकरण है। हालांकि, साहित्य में माउस अंडाशय में पूर्ण कूप संख्या की रिपोर्ट अत्यधिक चर रहे हैं, यह मुश्किल की तुलना करने के लिए और/ यह तनाव, आयु, उपचार समूहों, साथ ही नियोजित गिनती के तरीकों में तकनीकी अंतर सहित कई कारकों के कारण है । इस लेख में, हम हिस्टोलॉजिकल वर्गों को तैयार करने और दो अलग-अलग तरीकों का उपयोग करके माउस अंडाशय में मौलिक रोम की गिनती के लिए एक कदम-दर-कदम अनुदेशात्मक गाइड प्रदान करते हैं: [1] स्टीरियोलॉजी, जो आंशिक/ऑप्टिकल विच्छेदन तकनीक पर निर्भर करता है; और [2] प्रत्यक्ष गिनती तकनीक। प्रत्येक विधि के कुछ प्रमुख फायदों और कमियों पर प्रकाश डाला जाएगा ताकि क्षेत्र में प्रजनन क्षमता में सुधार किया जा सके और शोधकर्ताओं को उनके अध्ययन के लिए सबसे उपयुक्त विधि का चयन करने में सक्षम बनाया जा सके ।
Introduction
अपरिपक्व, meiotically-अंडाशय में मौलिक रोम के भीतर संग्रहीत oocytes गिरफ्तार महिला जर्मलाइन के लिए भंडारण इकाई है और एक व्यक्ति के जीवन भर अंडाशय रिजर्व शामिल हैं । मौलिक कूप संख्या1वर्ष की आयु के साथ स्वाभाविक रूप से गिरावट आती है, या वैकल्पिक रूप से, हवा, भोजन और पानी2में कुछ फार्मास्यूटिकल्स और पर्यावरण विषाक्त पदार्थों सहित बहिर्जात रसायनों के संपर्क में आने के बाद समय से पहले समाप्त हो सकती है। यह देखते हुए कि मौलिक कूप संख्या परिमित है, अंडाशय के भीतर मौजूद रोम की मात्रा और गुणवत्ता काफी हद तक महिला प्रजनन क्षमता और संतानों के स्वास्थ्य को निर्धारित करती है। इस प्रकार, अंडाशय रिजर्व पर बहिर्जात अपमान के ऑफ-टारगेट प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए महिलाओं में मौलिक कूप संख्या का सटीक मात्राकरण आवश्यक है।
महिलाओं में, पूरे अंडाशय का विश्लेषण आम तौर पर संभव नहीं है, इस प्रकार अंडाशय रिजर्व के गैर-आक्रामक सरोगेट उपायों का उपयोग नैदानिक सेटिंग में किया जाना चाहिए। एंटी-Mϋllerian हार्मोन (एएमएच) सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला सरोगेट बायोमार्कर चिकित्सकीय रूप से3है। सीरम AMH स्तर अक्सर उन्नत मातृ आयु की महिलाओं में मापा जाता है, या पहले और कैंसर के इलाज के बाद, जैसे कीमोथेरेपी । हालांकि, एएमएच का उत्पादन रोम बढ़ने से होता है न कि मौलिक रोम द्वारा, और इस प्रकार, सीरम का स्तर पूर्ण मौलिक कूप संख्या पर सूचित नहीं करता है।
सीटूमें महिलाओं में मौलिक कूप संख्या को सही ढंग से निर्धारित करने के तरीकों के अभाव के साथ, छोटे पशु मॉडलों में अंडाशय के रोम की गिनती, जैसे कृंतक, उस डिग्री का आकलन करने के लिए एक आवश्यक अनुसंधान उपकरण बना हुआ है जिसके द्वारा बहिर्जात अपमान मौलिक रोम पर प्रभाव डालता है और इस प्रकार, प्रजनन क्षमता। दुर्भाग्य से, कृंतक मॉडल में मौलिक कूप संख्या के साहित्य भर में रिपोर्ट अत्यधिक चर4हैं । इस के लिए एक प्रमुख कारण व्यापक रूप से नियोजित गिनती विधि में तकनीकी मतभेदों की सूचना दी है । मुख्य रूप से, चूहों में मौलिक रोम की गणना के लिए साहित्य में दो अलग-अलग तकनीकों का वर्णन किया गया है। इनमें स्टीरियोलॉजी शामिल है, जो आंशिक ऑप्टिकल विच्छेदन विधि को नियोजित करता है, और प्रत्यक्ष कूप मायने रखता है।
स्टीरियोलॉजी को व्यापक रूप से सोने के मानक माना जाता है क्योंकि यह व्यवस्थित समान यादृच्छिक नमूना5का उपयोग करता है, जिससे यह पूरे माउस में मौलिक कूपसंख्या, या चूहे के अंडाशय4,6,7में मात्रा निर्धारित करने की सबसे सटीक विधि है। स्टीरियोलॉजी निष्पक्ष है, क्योंकि यह ब्याज8की वस्तु की त्रि-आयामी संरचना के लिए खाता है। एक ऑप्टिकल विच्छेदन/अंश विधि का उपयोग करके, नमूने के तीन स्तरों को कुल माउस अंडाशय के एक ज्ञात अंश के भीतर मोटी ऊतक वर्गों (जैसे, 20 माइक्रोन) का उपयोग करके मौलिक रोम की मात्रा निर्धारित करने के लिए लागू किया जाता है। सबसे पहले, नमूना अंतराल को यादृच्छिक शुरुआत (नमूना अंश 1, एफ1)4 पर (उदाहरण केलिए, हर 3 अनुभाग) चुनाजाताहै। धाराओं तो पूरे अंडाशय के माध्यम से इस बिंदु से एक व्यवस्थित, एक समान तरीके से नमूना कर रहे हैं । फिर, एक निष्पक्ष गिनती फ्रेम अंडाशय अनुभाग पर आरोपित है और उत्तरोत्तर एक परिभाषित, यादृच्छिक गिनती ग्रिड (नमूना अंश 2, एफ2)8के साथ चला गया है । अंत में, खंड मोटाई का एक ज्ञात अंश ऑप्टिकल रूप से नमूना है (उदाहरण के लिए, 10 माइक्रोन) और इस क्षेत्र के भीतर रोम (नमूना अंश 3, एफ3)4)गिना जाता है। कच्चे कूप संख्या अंतिम मूल्य प्राप्त करने के लिए इन नमूना अंशों के विलोम से गुणा किया जाता है। इस विधि के लिए विशेषज्ञ प्रशिक्षण और उपकरणों की आवश्यकता होती है, जिसमें स्टीरियोलॉजिकल सॉफ्टवेयर द्वारा संचालित मोटरचालित चरण के साथ एक माइक्रोस्कोप शामिल है। ऊतकों को एक विशेष बोइन के फिक्सेटिव में संरक्षित किया जाना चाहिए, और ग्लाइकोलेथाक्रिएलेट राल में एम्बेडेड किया जाना चाहिए ताकि मोटी ऊतक वर्गों को कांच के चाकू के साथ ग्लाइकोलेथाक्र्रेल राल माइक्रोटॉम का उपयोग करके काटा जा सके। इस विधि को ऊतक सिकुड़न और विरूपण के लिए खाते में डिज़ाइन किया गया है, ताकि अंडाशय और रोम 9 की त्रि-आयामी रूपात्मक संरचना को सबसे अच्छासंरक्षितकिया जा सके।
10कूपों की गणना के लिए प्रत्यक्ष कूप गणना सबसे अधिक बार उपयोग की जाने वाली विधि है । अधिक आम फिक्सेटिव्स (यानी, फॉर्मेलिन) का उपयोग किया जा सकता है, इसके बाद पैराफिन वैक्स एम्बेडिंग और संपूर्ण धारावाहिक अनुभागिंग के बीच 4-6 माइक्रोम की मोटाई पर एक मानक माइक्रोटॉम का उपयोग करके। रोम व्यवस्थित रूप से एक निर्धारित अंतराल पर पूरे ऊतक अनुभाग में गिना जाता है, और फिर कुल कूप अनुमान प्राप्त करने के लिए नमूना अंतराल के विपरीत से गुणा किया जाता है। यह विधि त्वरित, आसान है, संग्रहीत ऊतकों का उपयोग करके किया जा सकता है, और मानक हिस्टोलॉजिकल तकनीकों का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है। इसके लिए मानक इमेजिंग क्षमताओं के साथ केवल एक हल्के माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। हालांकि, इन फायदों के बावजूद, प्रत्यक्ष कूप गिनती सटीकता और स्टीरियोलॉजी के सख्त गिनती मापदंडों का अभाव है, यह अधिक अन्वेषक पूर्वाग्रह के लिए प्रवण बना रही है । इसके अतिरिक्त, ऊतकों को प्रसंस्करण के दौरान सिकुड़न और विरूपण से गुजरना पड़ सकता है, अंडाशय की अखंडता और आकृति विज्ञान को बाधित किया जा सकता है और इस प्रकार कूप वर्गीकरण और मात्राकरण को मुश्किल बना सकता है।
इस लेख का उद्देश्य माउस अंडाशय में मौलिक कूप संख्या का मात्रात्मक रूप से आकलन करने के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले दो तरीकों का वर्णन करना है: स्टीरियोलॉजी और प्रत्यक्ष कूप गिनती। हम इन दो तरीकों के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करेंगे और उनकी कुछ ताकतों और कमजोरियों को उजागर करेंगे, ताकि हमारे क्षेत्र में प्रजनन क्षमता को बढ़ाया जा सके और शोधकर्ताओं को उनके अध्ययन के लिए सबसे उपयुक्त गिनती विधि का एक सूचित निर्णय लेने की अनुमति दी जा सके ।
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Protocol
अंडाशय महिला C57BL6J चूहों से एकत्र किए गए थे। सभी पशु प्रक्रियाओं और प्रयोगों की देखभाल और पशुओं के उपयोग के लिए एनएचएमआरसी ऑस्ट्रेलियाई अभ्यास संहिता के अनुसार प्रदर्शन किया गया और मोनाश पशु अनुसंधान मंच पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।
नोट: एक कीमोथेरेपी एजेंट मौलिक कूप oocytes समाप्त करने के लिए दिखाया गया है, के रूप में स्टीरियोलॉजी11 और प्रत्यक्ष मायने रखता है12,13 का उपयोग कर निर्धारित इस रिपोर्ट में इस्तेमाल के लिए एक ही जानवर में दो गिनती तरीकों की तुलना की थी । महिला, 8 सप्ताह पुराने (युवा वयस्क) चूहों ७५ मिलीग्राम/किलो/साइक्लोफोस्पामाइड, या खारा वाहन नियंत्रण (n= 5/समूह) के शरीर के एक इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन से पहले तौला गया । इस खुराक को मौलिक रोम की लगभग 50% कमी का कारण दिखाया गया है, लेकिन चूहों14में रुग्णता या मृत्यु दर का कारण नहीं बताया गया है। उपचार के 48 घंटे बाद अंडाशय को काटा गया। प्रत्येक जानवर से एक अंडाशय 24 घंटे के लिए 10% (v/v) तटस्थ बफर फॉर्मेलिन समाधान में तय किया गया था, और दूसरा 24 घंटे के लिए Bouin के समाधान में तय किया गया था । ऊतक तो या तो ग्लाइकोलेथाक्राइनल राल में एम्बेडेड और धारावाहिक 20 μm पर अनुभागित किया गया था, या पैराफिन में और धारावाहिक 5 माइक्रोन पर अनुभागित । सभी ऊतकों को आवधिक एसिड शिफ और हीमैटोक्सीलिन से सना हुआ था।
1. हिस्टोलॉजिकल तैयारी: निर्धारण, प्रसंस्करण, एम्बेडिंग और माउस अंडाशय को खंडित करना
- अंडाशय को नुकसान पहुंचाए बिना या काटने के बिना, अंडाशय और आसपास के सभी वसा को ट्रिम करके माउस अंडाशय को विच्छेदन करें। यदि आवश्यक हो, तो इस चरण के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप और ठीक ब्लेड का उपयोग करें(चित्रा 1A)।
- ऊतकों को 70% इथेनॉल में स्थानांतरित करने से पहले 24 घंटे(चित्रा 1B)के लिए या तो बोइन के फिक्सेटिव (स्टीरियोलॉजी), या फॉर्मेलिन फिक्सेटिव (प्रत्यक्ष गिनती) युक्त एक छोटे लेबल वाली ट्यूब में रखकर तुरंत ऊतकों को ठीक करें।
नोट: कूप आकृति विज्ञान को बोइन के निश्चित अंडाशय ऊतक के भीतर सबसे अच्छा संरक्षित किया जाता है, जो ग्लाइकोलेथाक्रिएलेट राल(चित्र 2)में एम्बेडेड है। - पूरी निश्चित अंडाशय की प्रक्रिया करें और फिर एक मानक हिस्टोलॉजिकल प्रोटोकॉल का उपयोग करके सीधे गिनती के लिए स्टीरियोलॉजी(पूरक फ़ाइल 1)के लिए ग्लाइकोलेथाक्र्रेट राल में एम्बेड करें।
सावधानी: राल विषाक्त है, इसलिए सुनिश्चित करें कि सभी ऊतक प्रसंस्करण चरण एक धुएं हुड में किए जाते हैं और दस्ताने हर समय पहने जाते हैं। - एक विशेष राल मेथाक्रिलेट माइक्रोटॉम(चित्रा 1 सी)का उपयोग करें, जिसमें ग्लास नाइफ(चित्रा 1D)के साथ लगे हैं ताकि मोटी ग्लाइकोलेथाक्रिलेट राल वर्गों (जैसे, 20 माइक्रोन) को पूरी तरह से काटा जा सके। स्टीरियोलॉजी के लिए ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर नियमित अंतराल (उदाहरण के लिए, हर3 अनुभाग) पर अनुभागों को एकत्र करें।
- पतले पैराफिन सेक्शन (जैसे, 4-6 माइक्रोन) को काटने के लिए एक मानक माइक्रोटॉम का उपयोग करें। सीधे कूप मायने रखता है के लिए एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एक नियमित अंतराल (उदाहरण के लिए, हर9 अनुभाग) पर ऊतक अनुभागों को ले लीजिए।
- समय-समय पर एसिड शिफ और हीमैटोक्सीलिन(अनुपूरक फाइल 2) केसाथ स्लाइड्स पर दाग दें ।
- पैराफिन सेक्शन के लिए स्टैंडर्ड डीपीएक्स के साथ कवरलिप, या ग्लाइकोलेथाक्राइनल रेसिन सेक्शन(चित्रा 1E)के लिए मोटी डीपीएक्स।
सावधानी: ग्लाइकोलमेथाक्रिलेट राल डीपीएक्स खतरनाक है, इसलिए इस कदम को धूम हुड में करें।
नोट: ग्लाइकोलमेथा्क्रिलेट राबिन डीपीएक्स बेहद चिपचिपा है। डीपीएक्स को समान रूप से और बारीकी से फैलाया गया है, यह सुनिश्चित करने के लिए ग्लास कवरलिप का दृढ़ता से पालन किया जाना चाहिए, और कवरस्लिप(चित्रा 1F)के तहत कोई हवा के बुलबुले मौजूद नहीं हैं।
2. ऑप्टिकल फ्रैक्शनेटर का उपयोग करके मौलिक कूप संख्या का स्टीरियोलॉजिकल अनुमान
- कंप्यूटर, मल्टी-कंट्रोल यूनिट, कैमरा और स्टीरियोलॉजी सेटअप के भीतर प्रकाश स्रोत को चालू करें और माइक्रोस्कोप उद्देश्य को कम आवर्धन (जैसे, 10x) में सेट करें।
- स्टीरियोलॉजी सॉफ्टवेयर खोलें।
- पहली स्लाइड को माइक्रोस्कोप स्टेज पर सुरक्षित रखें।
- कैमरा सेटिंग पैनल(सप्लीमेंट्री फिगर 1ए)में ऑटोमैटिक अंडर एक्सपोजर की जांच करके लाइट एक्सपोजर को एडजस्ट करें । वैकल्पिक रूप से, प्रकाश एक्सपोजर को मैन्युअल रूप से समायोजित करें।
- पहले ऊतक नमूने का पता लगाने और ध्यान में नमूना लाने के लिए जॉयस्टिक का उपयोग करें।
- व्हाइट बैलेंस को समायोजित करें, या तो अधिक सेटिंग्स (कैमरा सेटिंग पैनल के नीचे दाईं ओर स्थित) पर क्लिक करके, और फिर व्हाइट बैलेंस पर क्लिक करें और स्वचालित (अनुपूरक चित्रा 1B)पर क्लिक करें। वैकल्पिक रूप से, अनुभाग पर एक सफेद क्षेत्र का चयन करके मैन्युअल रूप से सफेद शेष सेट करने के लिए अधिक सेटिंग्स बटन (या अधिक सेटिंग्समें क्षेत्र का चयन) के निकट व्हाइट बैलेंस बटन पर क्लिक करें।
- प्रोब्स ड्रॉप डाउन मेनू पर जाएं और ऑप्टिकल फ्रैक्शनेटर वर्कफ्लोपर क्लिक करें। इसके बाद स्टार्ट न्यू प्रोजेक्ट पर क्लिक करें और ओके पर क्लिक करें।
- यदि कोई मौजूदा नमूना विन्यास सहेजा गया है, तो नमूना मापदंडों के तहत हां | पर क्लिक करें ... और वांछित नमूना विन्यास का चयन करें।
- यदि नहीं, तो सीरियल सेक्शन की जानकारी(सप्लीमेंट्री फिगर 1सी)दर्ज करें और चरण 2.13 पर जांच विन्यास को परिभाषित करें।
- नेक्स्टपर क्लिक करें, माइक्रोस्कोप को कम आवर्धन के लिए सेट करें और ड्रॉपडाउन मेनू से 10x आवर्धन चुनें।
- अगलेपर क्लिक करें, और फिर पूरे अंडाशय अनुभाग के आसपास ट्रेस करें - अनुभाग के चारों ओर बाएं क्लिक करके शुरू करें और अंत में, सही क्लिक करें और क्लोज कंटूरचुनें।
- नेक्स्टपर क्लिक करें, माइक्रोस्कोप को हाई आवर्धन के लिए सेट करें और ड्रॉपडाउन मेनू से 100x तेल आवर्धन चुनें।
- स्लाइड पर ऊतक अनुभाग पर तेल की एक बूंद रखें और माइक्रोस्कोप उद्देश्य को 100x आवर्धन में ले जाएं।
- प्रकाश एक्सपोजर (चरण 2.4 में) समायोजित करें और आगेक्लिक करें।
- जांच विन्यास को परिभाषित करने के लिए नमूना मापदंडों की स्थापना करें। यहां, मतगणना फ्रेम को 47.5 माइक्रोन x 47.5 माइक्रोन (2,256.25 माइक्रोन2)पर सेट किया गया था और चरण की लंबाई 100 माइक्रोन x 100 माइक्रोन (10,000 माइक्रोन2)(अनुपूरक चित्रा 2)के लिए निर्धारित की गई थी। एक बार नमूना मापदंड स्थापित हो जाने के बाद, टेम्पलेट को सहेजें और बाद के विश्लेषण सत्रों के दौरान चरण 2.7 पर फिर से खुलें।
- स्टार्ट काउंटिंग (सप्लीमेंट्री फिगर 1D)पर क्लिक करें । नमूने के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित करें, ठीक क्लिक करें और गिनती शुरू करें।
- 10 माइक्रोन सैंपलिंग गहराई के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए फोकसिंग नॉब का उपयोग करें और किसी भी मौलिक रोम की गणना करें जिसका ओसाइट नाभिक ध्यान में आता है। अगले क्षेत्र में जाने के लिए आगे क्लिक करें।
- यदि ओसाइट स्क्वैमस (चपटा) ग्रैनुलोसा कोशिकाओं से घिरा हुआ है, तो रोम को मौलिक रूप से वर्गीकृत करें, लेकिन कोई क्यूबोइडल ग्रेनुलोसा कोशिकाएं(चित्रा 2 ए)नहीं।
नोट: मौलिक रोम मध्यवर्ती/संक्रमणकालीन रोम से अलग हैं, जिनमें क्यूबोइडल और स्क्वैमस ग्रेनुलोसा कोशिकाओं(चित्रा 2B)और प्राथमिक रोम का संयोजन शामिल है, जो मुख्य रूप से क्यूबोइडल ग्रेनुलोसा कोशिकाओं(चित्रा 2C)से घिरे हुए हैं। इन कूप कक्षाओं की अलग से मात्रा निर्धारित की जानी चाहिए । - केवल रोम की गणना करें जिसमें ओसाइट नाभिक दिखाई देता है। ओसाइट नाभिक मतगणना फ्रेम के भीतर दिखाई देना चाहिए या मतगणना फ्रेम(अनुपूरक चित्रा 1E, एफ)की हरी समावेशन लाइनों को छूना चाहिए।
- यदि ओसाइट नाभिक मतगणना फ्रेम(अनुपूरक चित्रा 1G)के बाहर गिरता है या मतगणना फ्रेम की लाल अपवर्जन लाइनों को छूता है, तो इस कूप को न गिनें ।
- एक बहिर्जात रासायनिक (जैसे, कीमोथेरेपी) के जवाब में मौलिक कूप की कमी का आकलन करते समय, यह सुनिश्चित करें कि गिने गए सभी कूप स्वस्थ हैं और इस प्रकार सामान्य आकृति विज्ञान(चित्रा 2)है। किसी भी असामान्य या अचरबर रोम को अलग से गिनें। अक्सर, कूप मृत्यु कीमोथेरेपी जैसे अपमान से प्रेरित होती है, और स्वस्थ और अचरज के बीच अंतर करने के लिए अत्रेयिक रोम का मात्राकरण अलग से प्राप्त किया जाना चाहिए, क्योंकि केवल स्वस्थ रोम में ओवेरियन रिजर्व15शामिल होते हैं।
- यदि ओसाइट स्क्वैमस (चपटा) ग्रैनुलोसा कोशिकाओं से घिरा हुआ है, तो रोम को मौलिक रूप से वर्गीकृत करें, लेकिन कोई क्यूबोइडल ग्रेनुलोसा कोशिकाएं(चित्रा 2 ए)नहीं।
- एक बार जब उस अनुभाग पर गिनती पूरी हो जाती है, तो निम्नलिखित में से एक करें:
- क्लिक करें New Section जोड़ें,और फिर मतगणना के लिए अगला अनुभाग स्थापित करने के लिए चरण 2.3 पर लौटें।
- क्लिक करें मैं सत्र समाप्त करने के लिए गिनती समाप्त कर दिया है. उद्देश्य को 10x पर लौटा दें, स्टीरियोलॉजी सॉफ्टवेयर से बाहर निकलें और लाइट सोर्स, कैमरा, मल्टी कंट्रोल यूनिट और कंप्यूटर को बंद कर दें।
- पूरे अंडाशय से नमूना प्रत्येक ऊतक अनुभाग से कुल कच्चे कूप संख्या (क्यू) प्राप्त करें, फिर एक स्प्रेडशीट का उपयोग करके, प्रत्येक दोहराने वाले जानवर (एन) 4 से अंतिम मूल्य प्राप्त करने के लिएनीचेदिए गए समीकरण का उपयोग करें।
कहां:
N = अंडाशय के भीतर रोम की कुल अनुमानित संख्या।
प्रश्न = कच्चे मौलिक कूप गिनती।
एफ1 = नमूना अंतराल। इस प्रकारप्रत्येक 3 खंड का नमूना लिया गया
.
एफ2 = गिनती फ्रेम (नमूना क्षेत्र) और स्टेपर के बीच संबंध, के रूप में गणना
. चूंकि नमूना क्षेत्र 2256 माइक्रोन2 (47.5 माइक्रोन x 47.5 माइक्रोन) था और स्टेपर क्षेत्र 10000 माइक्रोन2 (100 माइक्रोन x 100 माइक्रोन) 
था।
f3 = अंडाशय अनुभाग के अंश का नमूना लिया गया। चूंकि 20 माइक्रोन सेक्शन के 10 माइक्रोन का नमूना लिया गया
था।
इसलिए,
।
नोट: यह प्रोटोकॉल एक व्यापक रूप से उद्धृत स्टीरियोलॉजी सॉफ्टवेयर(सामग्रियोंकी तालिका) का उपयोग करके स्टीरियोलॉजिकल विश्लेषणों के इन सिद्धांतों को कैसे लागू करता है; हालांकि, अन्य स्टीरियोलॉजिकल सॉफ्टवेयर उपलब्ध है। ओवेरियन रोम के स्टीरियोलॉजिकल विश्लेषणों के दौरान लागू सिद्धांत समान हैं, मापदंडों को स्थापित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉफ्टवेयर की परवाह किए बिना। स्टीरियोलॉजी सबसे सटीक है जब 100 या उससे अधिक वस्तुओं को वयस्क माउस अंडाशय में गिना जाता है4, क्योंकि यह 10%16से नीचे के अनुमान के लिए त्रुटि का गुणांक देता है। यहां उल्लिखित नमूना मापदंडों को कम से कम 100 वस्तुओं (यानी मौलिक, संक्रमणकालीन और प्राथमिक रोम) को सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया गया है, जिसे नियंत्रण वयस्क जंगली-प्रकार C57BL6J अंडाशय में गिना जा सकता है। इष्टतम नमूना मापदंडों को स्थापित करने के लिए एक छोटा नमूना आकार सहित एक प्रायोगिक अध्ययन किया जा सकता है, जैसे कि विश्लेषण किए जाने वाले अनुभागों के अंतराल और संख्या और नमूना अनुभाग17के भीतर ऑप्टिकल विच्छेदन की संख्या।
कहां:
.
. चूंकि नमूना क्षेत्र 2256 माइक्रोन2 (47.5 माइक्रोन x 47.5 माइक्रोन) था और स्टेपर क्षेत्र 10000 माइक्रोन2 (100 माइक्रोन x 100 माइक्रोन) 
था।
था।
।3. प्रत्यक्ष अंडाशय कूप मायने रखता है द्वारा मौलिक कूप संख्या का आकलन
- माइक्रोस्कोप स्लाइड को एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे सुरक्षित रूप से रखें और कच्चे मौलिक कूप संख्या प्राप्त करने के लिए प्रत्यक्ष गणनाएं करें।
- यदि ओसाइट स्पष्ट रूप से दिखाई देता है और स्क्वैमस (चपटा) ग्रैनुलोसा कोशिकाओं से घिरा हुआ है, तो रोम को मौलिक रूप से वर्गीकृत करें, लेकिन कोई क्यूबोइडल ग्रेनुलोसा कोशिकाएं(चित्रा 2D)नहीं हैं।
नोट: मौलिक रोम मध्यवर्ती/संक्रमणकालीन रोम से अलग हैं, जिनमें क्यूबोइडल और स्क्वैमस ग्रेनुलोसा कोशिकाओं(चित्रा 2E)और प्राथमिक रोम का संयोजन शामिल है, जो मुख्य रूप से क्यूबोइडल ग्रेनुलोसा कोशिकाओं(चित्रा 2F)से घिरे हुए हैं। इन कूप कक्षाओं की अलग से मात्रा निर्धारित की जानी चाहिए । - सुनिश्चित करें कि गिने गए सभी रोम स्वस्थ हैं और इस प्रकार सामान्य आकृति विज्ञान(चित्रा 2) है। किसी भी असामान्य या अचरज वाले रोम को अलग से गिनें, क्योंकि केवल स्वस्थ रोम में अंडाशय रिजर्व शामिल होता है।
- यदि ओसाइट स्पष्ट रूप से दिखाई देता है और स्क्वैमस (चपटा) ग्रैनुलोसा कोशिकाओं से घिरा हुआ है, तो रोम को मौलिक रूप से वर्गीकृत करें, लेकिन कोई क्यूबोइडल ग्रेनुलोसा कोशिकाएं(चित्रा 2D)नहीं हैं।
- वैकल्पिक रूप से, छवि फ़ाइल (एस) खोलकर गिनती करने के लिए पूरे अंडाशय ऊतक अनुभाग के कई, या सिले उच्च शक्ति (जैसे, 20x) फोटोमाइक्रोग्राफ लें। यह मैन्युअल रूप से किया जा सकता है, या एक स्वचालित स्लाइड स्कैनर का उपयोग कर सकता है।
- पूर्व निर्धारित अंतराल पर पूरे अंडाशय से नमूना प्रत्येक ऊतक अनुभाग से राशि कच्चे कूप संख्या (क्यू) प्राप्त करें। नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करके प्रत्येक दोहराने वाले जानवर (एन) के लिए अंतिम मूल्य प्राप्त करने के लिए नमूना अंश के विपरीत इस संख्या को गुणा करें।
कहां:
N = अंडाशय के भीतर रोम की कुल अनुमानित संख्या।
प्रश्न = कच्चे कूप गिनती (प्रत्येक व्यक्ति प्रकार की, अलग से गणना) ।
एफ1 = नमूना अंतराल। इस प्रकारप्रत्येक 9 खंड का नमूना लिया गया
.
इसलिए,
।
कहां:
.
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Representative Results
कूप की कमी का एक अच्छी तरह से विशेषता मॉडल का उपयोग किया गया था, जिससे युवा वयस्क महिला चूहों को साइक्लोफोस्फामाइड कीमोथेरेपी, या नमकीन वाहन नियंत्रण (n = 5/समूह) की एक खुराक दिलाई गई थी और दोनों अंडाशय को ४८ घंटे के बाद प्रत्येक जानवर से काटा गया था । स्टीरियोलॉजी या डायरेक्ट काउंट्स: प्रति जानवर एक अंडाशय को दो तरीकों में से प्रत्येक के लिए चरण 1 में वर्णित के रूप में तैयार किया गया था। प्रत्येक जानवर से बाएं और दाएं अंडाशय को बेतरतीब ढंग से प्रत्येक समूह को सौंपा गया था। इन आंकड़ों से पता चलता है कि स्टीरियोलॉजी का उपयोग करते समय, कीमोथेरेपी उपचार (387 ± 11 रोम), बनाम नियंत्रण (1043 ± 149; पी = 0.0024)(चित्रा 3)के बाद माउस मौलिक रोम की एक महत्वपूर्ण कमी का पता लगाया जा सकता है। इसके विपरीत, एक ही जानवरों से कॉन्ट्रालेटरल अंडाशय का उपयोग करते हुए, प्रत्यक्ष कूप मायने रखता है कीमोथेरेपी (४९० ± ४०) के बाद अंडाशय रिजर्व की एक महत्वपूर्ण कमी का पता लगाने में विफल रहा है, जब नियंत्रण (७५२ ± १३९; p = ०.१०६३)(चित्रा 3) कीतुलना में । ध्यान दें, यह स्पष्ट है कि युवा वयस्क जंगली प्रकार के जानवरों में मौलिक कूप संख्या चर है, क्योंकि खारा इलाज जानवरों का वितरण व्यापक है, साइक्लोफोस्पामाइड समूहों की तुलना में, यहां तक कि जब गिनती स्टीरियोलॉजी(चित्रा 3)का उपयोग करके किया गया था ।
चित्रा 1: बाँझ विश्लेषण के लिए बोइन के फिक्स्ड, ग्लाइकोलेथाक्रिलेट राल-एम्बेडेड अंडाशय की हिस्टोलॉजिकल तैयारी। A)एक वयस्क माउस अंडाशय (चक्र, तीर) को पंख ब्लेड का उपयोग करके माउस अंडाशय से सभी वसा और अंडाशय की बारीकी से छंटनी की गई थी। B)एक ही महिला वयस्क से कॉन्ट्रालेट्रल माउस अंडाशय (चक्र, तीर) को विच्छेदित किया गया था, छंटनी की गई थी, फिर या तो स्टीरियोलॉजी के लिए बोइन के फिक्सेटिव (बाएं) में तय किया गया था, या प्रत्यक्ष गिनती (दाएं) के लिए फॉर्मेलिन। C)ग्लास नाइफ (एरो) के साथ लगे एक विशेष राल मेथाक्रिलेट माइक्रोटोम डीका उपयोग ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एकत्र ग्लाइकोलेथ्रिलेट राल ब्लॉक को 20 माइक्रोन सेक्शन में पूरी तरह से काटने के लिए किया जाता था । ई)आवधिक एसिड शिफ-कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड (तीर) पर अंडाशय ऊतक वर्गों को एक धुएं हुड में ताजा हिस्ल (हरे कंटेनर) में डूबा दिया गया था, फिर जीएमए डीपीएक्स की बूंदों के शीर्ष पर एक ग्लास कवरलिप जोड़ा गया था। अतिरिक्त डीपीएक्स और हवा के बुलबुले को हटाने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग किया गया था। स्लाइड्स में है रात भर धुएं के हुड में सूखी हवा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: मौलिक कूप वर्गीकरण। ग्लाइकोलेथाक्राइनल राल एम्बेडेड(ए-सी)और पैराफिन-एम्बेडेड(डी-एफ)ओवेरियन वर्गों में मौलिक, संक्रमणकालीन और प्राथमिक रोम की प्रतिनिधि छवियां। एक: स्क्वैमस ग्रैनुलोसा कोशिकाओं (तीर) से घिरा मौलिक कूप। बार = 10 माइक्रोन बी: संक्रमणकालीन कूप दोनों स्क्वैमस (तीर) और क्यूबोइडल (एरोहेड) ग्रैनुलोसा कोशिकाओं से घिरा हुआ है। बार = 10 माइक्रोन सी: प्राथमिक कूप क्यूबोइडल (एरोहेड) ग्रैनुलोसा कोशिकाओं से घिरा हुआ है। बार = 25 माइक्रोन डी: मौलिक कूप स्क्वैमस ग्रैनुलोसा कोशिकाओं (तीर) से घिरा हुआ है। बार = 10 माइक्रोन ई: संक्रमणकालीन कूप दोनों स्क्वैमस (तीर) और क्यूबोइडल (एरोहेड) ग्रैनुलोसा कोशिकाओं से घिरा हुआ है। बार = 10 माइक्रोन एफ: प्राथमिक कूप क्यूबोइडल (एरोहेड) ग्रैनुलोसा कोशिकाओं से घिरा हुआ है। बार = 25 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: माउस मौलिक रोम का मूल्यांकन करने के लिए ऑप्टिकल आंशिक और प्रत्यक्ष गिनती विधियों की तुलना। कूप की कमी का एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया था, जिसमें 8 सप्ताह पुरानी महिला C57BL6J चूहों खारा, या एक ७५ मिलीग्राम/किलो/कीमोथैरेमेटिक, साइक्लोफोफोस्फामाइड (n = 6/समूह) के शरीर का वजन खुराक के साथ इंट्रापरिटोनली इलाज किया गया । इसने ओवेरियन रिजर्व में परिवर्तन का पता लगाने के लिए दो कूप गिनती विधियों की तुलना सक्षम की। जानवरों की एक ही पलटन में, कुल कूप का अनुमान महत्वपूर्ण कूप की कमी का पता लगाने में विफल रहा, स्टीरियोलॉजी के विपरीत, जिसने ओवेरियन रिजर्व की एक बड़ी और महत्वपूर्ण कमी का पता लगाया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| ताकत | कमजोरियों | |
| स्टीरियोलॉजी | रोम का अनुमान लगाने का सबसे सटीक तरीका | समय लेने वाली और महंगी |
| कई नमूना मापदंडों का उपयोग करता है, यह सांख्यिकीय मजबूत बना रही है | विशेषज्ञ उपकरण और सॉफ्टवेयर की आवश्यकता है | |
| अत्यधिक संवेदनशील, मौलिक कूप संख्या में छोटे परिवर्तनों का पता लगा सकते हैं | नमूने विशिष्ट, विशेष हिस्टोलॉजिकल तकनीकों का उपयोग करके तैयार किया जाना चाहिए | |
| कूप संरचना ऊतक प्रसंस्करण के दौरान बेहतर संरक्षित है | ||
| एक समान नियम जो विभिन्न जांचकर्ताओं द्वारा लागू किए जा सकते हैं, इस प्रकार पूर्वाग्रह को कम करते हैं | ||
| प्रत्यक्ष मायने रखता है | समय और लागत प्रभावी | स्टीरियोलॉजी की तुलना में कम सटीक और संवेदनशील |
| मानक प्रयोगशाला उपकरण की आवश्यकता है, जैसे प्रकाश माइक्रोस्कोप | केवल एक नमूना पैरामीटर का उपयोग किया जाता है, जिससे कूप संख्या में छोटे परिवर्तनों का पता लगाने में यह कम प्रभावी हो जाता है | |
| ओवेरियन वर्गों की अवधारण जिनका उपयोग इम्यूनोहिस्टोकेमिकल या अन्य विश्लेषणों के लिए किया जा सकता है | ऊतक प्रसंस्करण के दौरान मात्रा और कूप संरचना में परिवर्तन के लिए अतिसंवेदनशील होता है | |
| नियमों का कोई समान सेट जो लागू किया जा सकता है, इस प्रकार अन्वेषक से पूर्वाग्रह के लिए अधिक प्रवण |
तालिका 1: कूप गिनती विधियों की ताकत और कमजोरियों की तुलना: स्टीरियोलॉजी बनाम प्रत्यक्ष मायने रखता है।
अनुपूरक चित्रा 1: स्टीरियोलॉजी सॉफ्टवेयर प्रोटोकॉल के स्क्रीनशॉट। A)कैमरा सेटिंग पैनल (व्हाइट बॉक्स) में एक्सपोजर के तहत ऑटोमैटिक (रेड बॉक्स) को टिक करके एक्सपोजर को एडजस्ट करें । B)कैमरा सेटिंग्स पैनल में अन्य के तहत अधिक सेटिंग्स आइकन पर क्लिक करके पहले सफेद संतुलन सेट करें। इसके बाद व्हाइट बैलेंस चुनें और ऑटोमैटिक (रेड बॉक्स) पर क्लिक करें। C)यदि कोई मौजूदा नमूना कॉन्फ़िगरेशन सेट नहीं किया गया है, तो नंबर (रेड बॉक्स) पर क्लिक करें और सीरियल सेक्शन की जानकारी (ग्रीन बॉक्स) दर्ज करें। D)गिनती शुरू करने के लिए, क्लिक करें शुरू गिनती (सफेद तीर) शुरू करते हैं । ई)यदि मतगणना फ्रेम के भीतर मौलिक कूप का नाभिक दिखाई देता है, तो इस कूप की गणना (सफेद बिंदीदार चक्र) की जाती है। च)यदि किसी मौलिक कूप का नाभिक मतगणना फ्रेम की हरी समावेशन रेखाओं को छू रहा है, तो इस कूप को भी गिना जाता है (सफेद बिंदीदार चक्र)। जी)यदि एक मौलिक कूप का नाभिक गिनती फ्रेम के भीतर दिखाई नहीं देता है या गिनती फ्रेम की लाल अपवर्जन लाइनों को छू रहा है, तो इस कूप की गणना (सफेद बिंदीदार चक्र) नहीं है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक चित्रा 2: नमूना मापदंडों की स्थापना। जांच विन्यास को परिभाषित करने के लिए बाएं हाथ के पैनल में अनुक्रमिक कदमों का पालन करें। A)माउंटेड मोटाई को मापें। सुनिश्चित करें कि 'प्रत्येक ग्रिड साइट पर अनुभाग के शीर्ष पर Refocus' unticked (लाल बॉक्स) है। टिक 'मैन्युअल रूप से औसत घुड़सवार मोटाई दर्ज करें' (हरा बॉक्स)। 20.00 माइक्रोन (ब्लू बॉक्स) के रूप में औसत घुड़सवार मोटाई दर्ज करें। B)काउंटिंग फ्रेम आकार को परिभाषित करें। काउंटिंग फ्रेम डिस्प्ले के तहत, टिक 'काउंटिंग फ्रेम डिस्प्ले को स्क्वायर होने के लिए मजबूर करें' और 'सेंटर ऑन लाइव इमेज' (रेड बॉक्स)। काउंटिंग फ्रेम साइज के तहत एक्स और वाई (ग्रीन बॉक्स) के लिए 47.5 माइक्रोन दर्ज करें। C)एसआरएस ग्रिड लेआउट को परिभाषित करें। मैन्युअल रूप से ग्रिड का आकार एक्स और वाई (लाल बॉक्स) के लिए 110 के रूप में दर्ज करें। घ)विच्छेदन विकल्पों को परिभाषित करें। शीर्ष गार्ड क्षेत्र ऊंचाई के लिए, 1.00 माइक्रोन (लाल बॉक्स) दर्ज करें। ऑप्टिकल विच्छेदन ऊंचाई के लिए, 10 माइक्रोन (ग्रीन बॉक्स) दर्ज करें। फोकस विधि के तहत, 'मैनुअल फोकस' (ब्लू बॉक्स) का चयन करें। ई)सैंपलिंग पैरामीटर्स को सेव करें। इन सेटिंग्स को सेव करने के लिए, एक नाम दर्ज करें और टिप्पणी करें फिर 'सेव योर करंट सेटिंग्स' (सफेद तीर) पर क्लिक करें। F)वर्तमान नमूना पैरामीटर सेटिंग्स के तहत, सुनिश्चित करें कि आपकी सेटिंग्स प्रदर्शित लोगों से मेल खाती हैं। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यह लेख माउस मौलिक रोम, स्टीरियोलॉजी, और प्रत्यक्ष कूप गिनती की अधिक सामान्य रूप से नियोजित विधि की गणना के लिए सोने के मानक तकनीक के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है। कीमोथेरेपी उपचार का उपयोग एक ही जानवर से बाएं और दाएं अंडाशय के भीतर इन दो अलग-अलग तरीकों से प्राप्त परिणामों की तुलना और इसके विपरीत करने के लिए किया गया था। दोनों तरीकों से मौलिक कूप संख्या में उच्च अंतर-पशु परिवर्तनशीलता का पता चला। ओवेरियन रिजर्व की एक महत्वपूर्ण कमी स्टीरियोलॉजी का उपयोग करके दर्ज की गई थी, लेकिन प्रत्यक्ष गिनती कीमोथेरेपी प्रशासन बनाम नियंत्रण के बाद मौलिक कूप संख्या में महत्वपूर्ण कमी का पता लगाने में विफल रही।
विशेष रूप से, यह स्पष्ट है कि चूहों के एक inbred तनाव में भी, जैसे C57BL6J, युवा वयस्क जंगली प्रकार (नियंत्रण) महिलाओं में अंडाशय रिजर्व व्यापक रूप से वितरित किया जाता है, जैसा कि मनुष्यों में मामला है। इस पर प्रभाव ण करने वाले और ओवेरियन रिजर्व की स्थापना में योगदान देने वाले कारक जांच के घेरेमेंरहते हैं . माउस ओवेरियन फ़ंक्शन के अध्ययनों के बीच उच्च परिवर्तनशीलता क्षेत्र की तुलना करने, या डेटा को दोहराने और ओसाइट संख्या और गुणवत्ता4की रक्षा के लिए उपन्यास चिकित्सा के नैदानिक अनुवाद को आगे बढ़ाने के लिए कई चुनौतियां बन गई है। यह परिवर्तनशीलता न केवल नियोजित गणना विधियों सहित कई कारकों के कारण होने की संभावना है, बल्कि पशु तनाव और उम्र के बीच मतभेद जैसे अतिरिक्त कारक हैं; साथ ही उपचार आहार, जैसे खुराक और समय। विभिन्न अध्ययनों से डेटा की तुलना करते समय इन कारकों पर विचार किया जाना चाहिए। भले ही, इस अध्ययन में नियोजित कूप कमी मॉडल समग्र रूप से स्टीरियोलॉजी प्रोटोकॉल की सटीक और संवेदनशील प्रकृति पर प्रकाश डालता है, जबकि यह भी प्रदर्शित करता है कि व्यापक रूप से रिपोर्ट की गई प्रत्यक्ष गणना विधि एक ज्ञात महत्वपूर्ण मौलिक कूप की कमी का पता लगाने में असमर्थ है।
इस लेख(तालिका 1)में विस्तृत प्रत्येक गणना विधि की ताकत और सीमाएं हैं। विभिन्न अंगों की एक किस्म में सेल संख्या निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली इसकी सटीकता के कारण स्टीरियोलॉजी को सोने के मानक विधि के रूप में मानाजाता है। हालांकि, इस तकनीक की कमियों में शामिल समय और लागत, साथ ही विशेष उपकरण और विशेषज्ञता के लिए आवश्यकता शामिल है। एक साथ, यह सबसे संवेदनशील डेटा प्राप्त करने के लिए इस प्रक्रिया के व्यापक प्रसार उपयोग सीमित है ।
इसके विपरीत, प्रत्यक्ष गणना विधि त्वरित, आसान है, संग्रहीत ऊतकों का उपयोग करके किया जा सकता है, और मानक हिस्टोलॉजिकल तकनीकों का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है। इसके लिए मानक इमेजिंग क्षमताओं के साथ केवल एक हल्के माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। हालांकि, यह हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग द्वारा प्रेरित वॉल्यूम परिवर्तनों के लिए खाता नहीं है, जो अंडाशय की त्रि-आयामी संरचना को बाधित कर सकता है। नतीजतन, कूप आकृति विज्ञान हमेशा पर्याप्त रूप से संरक्षित नहीं है, पहचान और सटीकता की गिनती चुनौतीपूर्ण बना रही है, विशेष रूप से अनुभवहीन जांचकर्ताओं के लिए । जबकि फॉर्मेलिन इस अध्ययन में प्रत्यक्ष गिनती के लिए उपयोग किया जाने वाला सुधारक था, बोइन के निश्चित ऊतकों को पैराफिन में एम्बेडेड किया जा सकता है और यह बेहतर आकृति विज्ञान प्रदान कर सकता है और शोधकर्ताओं को मौलिक रोम की अधिक आसानी से पहचानने में मदद कर सकता है। इसके अलावा, साहित्य के भीतर, प्रत्यक्ष गिनती विधि के लिए नमूने अंश व्यापक रूप से भिन्न होते हैं, हर 3से लेकर हर 10 वें 5 माइक्रोन पैराफिन सेक्शन19,जो अध्ययनों के बीच कूप गिनती में बड़ी विसंगतियों में योगदान कर सकते हैं। यह देखते हुए कि पैराफिन मोम वर्ग इतने पतले हैं, हर9 अनुभाग की गिनती ओवरसैंपलिंग और अनावश्यक गिनती को रोकने में मदद करती है।
अतिरिक्त तरीकों इस गाइड में उल्लिखित नहीं है, लेकिन आमतौर पर साहित्य में रिपोर्ट, पूरे अंडाशय से केवल एक केंद्रीय खंड में गिनती कर रहे है और इस पर विचार करने के लिए पूरे अंडाशय, या कूप घनत्व का प्रतिनिधि हो । यह पहली विधि अत्यधिक समस्याग्रस्त है, क्योंकि मौलिक रोम अंडाशय में समान रूप से वितरित नहीं किए जाते हैं और समूहों में पाए जा सकते हैं। इसका मतलब यह है कि एक एकल, या यहां तक कि अंडाशय के कुछ वर्ग पूरे अंग के प्रतिनिधि नहीं हैं, जो व्यवस्थित नमूना किसी भी गिनती विधि के लिए एक आवश्यक घटक बनाते हैं। कूप घनत्व एक अंडाशय ऊतक नमूने में रोम गिनती शामिल है, तो ऊतक के प्रति क्षेत्र गिनती व्यक्त । प्राथमिक मानव ऊतक प्राप्त करने की सीमाओं को देखते हुए, कूप घनत्व अक्सर मानव अंडाशय में पूर्ण कूप संख्या के लिए एक किराए के उपाय के रूप में प्रयोग किया जाता है, हालांकि चूहों में रिपोर्ट भी आम हैं । हालांकि, यह मात्राकरण विधि पूरे अंडाशय में रोम के असमान वितरण, या अंडाशय की मात्रा में उतार-चढ़ाव के लिए खाता नहीं है, जो नियमित रूप से अंडाशय एंडोक्राइन (ल्यूटियल) चक्र में होता है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि नमूनों के बीच घनत्व का एक सटीक उपाय संरक्षित ऊतक क्षेत्र पर निर्भर करता है । इसके अलावा, यह विधि अक्सर मानव ऊतकों का विश्लेषण करते समय अंडाशय की एक छोटी बायोप्सी या अंश का नमूने लेते हैं, इस प्रकार पूरे अंडाशय का प्रतिनिधि नहीं होता है। कूप घनत्व स्टीरियोलॉजी के साथ प्राप्त सटीकता का अभाव है। यहां तक कि एक ही पूरे अंडाशय का उपयोग कर, कूप मात्राकरण के तुलनात्मक उपायों के बाद स्टीरियोलॉजिकल विश्लेषण के बाद, कूप घनत्व के साथ, माउस अंडाशय20में अनुरूप नहीं था ।
हालांकि यह सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक जानवर है, माउस केवल एक मॉडल प्रजातियों है । घरेलू जानवरों या गैर-मानव वानरों सहित बड़ी प्रजातियों से अंडाशय प्राप्त करना संभव है, इस प्रकार पूरे अंडाशय के नमूनों से कूप मायने रखता है एक संशोधित स्टीरियोलॉजिकल प्रोटोकॉल21,22का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है। अंत में, जबकि पूरे मानव अंडाशय में कूप मायने रखता है का विश्लेषण करने की क्षमता वास्तव में बहुत मुश्किल है, फिर भी यह किया जा सकता है जब नमूने उपलब्ध हैं, एक संशोधित स्टीरियोलॉजिकल प्रोटोकॉल23,24,25का उपयोग कर ।
क्षेत्र में भविष्य की दिशाओं में नई तकनीकों का विस्तार और तेज शामिल हो सकता है । उदाहरण के लिए, मौलिक कूप ओसाइट्स के लिए स्वचालित पहचान और गिनती की एक नई पद्धति26वर्णित की गई है। यह विधि परीक्षण डेटा का चयन करने के लिए लेबल किए गए डेटासेट और स्लाइडिंग विंडो एल्गोरिदम द्वारा संचालित जटिल तंत्रिका नेटवर्क का उपयोग करती है। हालांकि, इस एल्गोरिथ्म केवल दो अंडाशय पर परीक्षण किया गया था और व्यापक तेज निर्धारित किया जाना बाकी है । वैकल्पिक रूप से, ऑप्टिकल ऊतक समाशोधन और प्रकाश पत्रक माइक्रोस्कोपी में हाल ही में हुई प्रगति ने अक्षुण्ण ऊतकों के व्यापक विश्लेषण की अनुमति दी है और कुछ अध्ययनों ने माउस अंडाशय27, 28में कूप गणना के लिए इसकी जांच की है।
अंत में, जबकि प्रत्यक्ष कूप गिनती अंडाशय के भीतर मौलिक रोम की गणना के लिए एक आसान, त्वरित और लागत प्रभावी तरीका है, इस तकनीक में संवेदनशीलता, सटीकता की कमी हो सकती है और अन्वेषक पूर्वाग्रह से ग्रस्त हो सकता है। इसलिए, इसकी कमियों के बावजूद, स्टीरियोलॉजी मौलिक कूप संख्याओं को सही और पुन: पेश करने के लिए सबसे अच्छी उपलब्ध तकनीक बनी हुई है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम विक्टोरियन राज्य सरकार परिचालन बुनियादी ढांचे के समर्थन और ऑस्ट्रेलियाई सरकार NHMRC IRIISS के माध्यम से संभव बनाया गया था और राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (ALW #1120300) और ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (KJH #FT190100265) से धन द्वारा समर्थित । लेखक मोनाश एनिमल रिसर्च प्लेटफॉर्म, मोनाश हिस्टोलॉजी प्लेटफॉर्म और मोनाश माइक्रो इमेजिंग फैसिलिटी की तकनीकी मदद को स्वीकार करना चाहेंगे ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol (HPLC) | Fisher Chemical | #A383-1 | |
| Acid alcohol | Amber Scientific | #ACDL | |
| Bouin’s fixative | Sigma-Aldrich | #HT10132 | Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v) |
| Cyclophosphamide | Sigma-Aldrich | #C0768-5G | |
| Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX) | Sigma-Aldrich | #06522 | |
| Ethanol | Amber Scientific | #ETH | Ethanol 100% |
| Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle | Designs for Vision | #FEA-745-SR | Feather blade for dissections (seen in Figure 1) |
| Formalin fixative | Australian Biostain | #ANBFC | |
| Glass coverslip | Thermo Scientific | #MENCS22501GP | 22 mm x 50 mm |
| Glycomethacrylate resin RM2165 microtome | Leica Microsystems | #RM2165 | |
| Glycolmethacrylate DPX | *made in house | *Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks | |
| Histolene | Trajan | #11031 | |
| Mayer’s haematoxylin | Amber Scientific | #MH | |
| Olympus BX50 microscope | Olympus | #BX50 | Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3) |
| Olympus immersion oil type-F | Olympus | #IMMOIL-F30CC | |
| Olympus TH4-200 light source | Olympus | #TH4-200 | |
| Paraffin wax | Sigma-Aldrich | #03987 | |
| Periodic acid | Trajan | #PERI1% | Periodic acid 1% |
| Rotary Microtome CUT 4060 | MicroTec | #4060R/F | Used to cut paraffin sections |
| Schiff’s reagent | Trajan | #SCHF | |
| Scott's tap water | Amber Scientific | #SCOT | Potassium carbonate, magnesium sulphate, water |
| StereoInvestigator Stereological System | MBF Bioscience | Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick | |
| Superfrost microscope slides | Thermo Scientific | #MENSF41296SP | 1 mm, 72 pcs |
| Technovit 7100 Plastic embedding system | Emgrid Australia | #64709003 | 500 mL/5 x 1 g/40 mL |
| Technovit 3040 yellow | Emgrid Australia | #64708805 | 100 g/80 mL |
References
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