Summary
Burada, sabit fare yumurtalık dokularının doğru folikül sayımı için iki farklı tekniği açıklıyor, karşılaştırıyor ve karşılaştırıyoruz.
Abstract
Cinsel olarak üreyen dişi memeliler, ömür boyu oosit tedariki ile doğarlar. Olgunlaşmamış, sessiz oositler, dişi mikrop hattının depolama birimi olan ilkel foliküllerde bulunur. Yenilenemezler, bu nedenle doğumdaki sayıları ve sonraki kayıp oranları büyük ölçüde kadın doğurganlık ömrünü belirler. Kadınlarda ve hayvanlarda ilkel folikül sayılarının doğru ölçülmesi, ilaçların ve toksikantların yumurtalık rezervi üzerindeki etkisini belirlemek için gereklidir. Mevcut ve gelişmekte olan doğurganlık koruma tekniklerine duyulan ihtiyacı ve başarısını değerlendirmek için de gereklidir. Şu anda, kadınlarda yumurtalık rezervini oluşturan ilkel foliküllerin sayısını doğru bir şekilde ölçmek için herhangi bir yöntem bulunmamaktadır. Ayrıca, deney için büyük hayvanlardan veya nesli tükenmekte olan türlerden yumurtalık dokusu elde etmek genellikle mümkün değildir. Bu nedenle, fareler bu tür çalışmalar için önemli bir model haline gelmiştir ve tüm fare yumurtalıklarındaki ilkel folikül sayılarını değerlendirme yeteneği kritik bir araçtır. Bununla birlikte, literatürde fare yumurtalıklarındaki mutlak folikül sayıları raporları oldukça değişkendir, bu da verilerin karşılaştırılmasını ve/veya çoğaltılmasını zorlaştırır. Bunun nedeni, zorlanma, yaş, tedavi grupları gibi bir dizi faktörün yanı sıra kullanılan sayım yöntemlerindeki teknik farklılıklardır. Bu yazıda, histolojik bölümlerin hazırlanması ve fare yumurtalıklarındaki ilkel foliküllerin sayılması için iki farklı yöntem kullanarak adım adım bir öğretim kılavuzu sunuyoruz: [1] fraksiyonör / optik distör tekniğine dayanan stereoloji; ve [2] doğrudan sayım tekniği. Her yöntemin bazı temel avantajları ve dezavantajları vurgulanacak, böylece sahada tekrarlanabilirlik geliştirilebilir ve araştırmacıların çalışmaları için en uygun yöntemi seçmelerini sağlayacaktır.
Introduction
Yumurtalıktaki ilkel foliküller içinde depolanan olgunlaşmamış, meiyotik olarak tutuklanmış oositler, kadın germline için depolama birimidir ve bireyin yaşam boyu yumurtalık rezervini oluşturur. İlkel folikül sayıları1yaşla birlikte doğal olarak azalır veya alternatif olarak, hava, gıda ve sudaki bazı farmasötikler ve çevresel toksik maddeler de dahil olmak üzere ekzojen kimyasallara maruz kaldıktan sonra erken tükenebilir2. İlkel folikül sayısının sınırlı olduğu göz önüne alındığında, yumurtalıkta bulunan foliküllerin miktarı ve kalitesi büyük ölçüde kadın doğurganlığını ve yavru sağlığını belirler. Bu nedenle, kadınlarda ilkel folikül sayısının doğru ölçülmesi, eksojen hakaretlerin yumurtalık rezervi üzerindeki hedef dışı etkilerini değerlendirmek için gereklidir.
Kadınlarda, tüm yumurtalığın analizi genellikle mümkün değildir, bu nedenle yumurtalık rezervinin invaziv olmayan taşıyıcı önlemleri klinik bir ortamda kullanılmalıdır. Anti-Mϋllerian hormonu (AMH) klinik olarak en yaygın kullanılan taşıyıcı biyobelirteçtir3. Serum AMH düzeyleri genellikle ileri anne çağındaki kadınlarda veya kemoterapi gibi kanser tedavisinden önce ve sonra ölçülür. Bununla birlikte, AMH ilkel foliküller tarafından değil, büyüyen foliküller tarafından üretilir ve bu nedenle serum seviyeleri mutlak ilkel folikül sayısı hakkında bilgi vermemektedir.
Kadınlarda ilkel folikül sayısını doğru bir şekilde belirlemek için yöntemlerin bulunmaması ile in situ, kemirgenler gibi küçük hayvan modellerinde yumurtalık köklerini saymak, eksojen hakaretlerin ilkel foliküller ve dolayısıyla doğurganlık üzerindeki etkisini değerlendirmek için gerekli bir araştırma aracı olmaya devam etmektedir. Ne yazık ki, kemirgen modellerinde ilkel folikül sayılarının literatürü boyunca raporlar oldukça değişkendir4. Bunun önemli bir nedeni, kullanılan sayım yöntemindeki teknik farklılıklar yaygın olarak bildirilmektedir. Ağırlıklı olarak, literatürde farelerde ilkel foliküllerin numaralandırması için açıklanan iki farklı teknik vardır. Bunlar, fraksiyonatör optik disektör yöntemini kullanan stereoloji ve doğrudan folikül sayılarını içerir.
Stereology yaygın olarak kullanılan altın standart sistematik tekdüze rastgele örnekleme5, bütün fare veya sıçan yumurtalıkları4,6,7ilkel folikül sayısını ölçmenin en doğru yöntemidir. Stereology, ilgi çekici nesnenin üç boyutlu yapısını oluşturduğu için tarafsızdır8. Optik bir disektör/fraksiyonatör yöntemi kullanılarak, toplam fare yumurtalığının bilinen bir fraksiyonu içinde kalın doku bölümleri (örneğin, 20 μm) kullanılarak ilkel folikülleri ölçmek için üç örnekleme seviyesi uygulanır. İlk olarak, örnekleme aralığı rastgele bir başlangıçta (örneğin, her 3rd bölümde) seçilir (örnekleme fraksiyonu 1, f1)4. Bölümler daha sonra bu noktadan tüm yumurtalık boyunca sistematik, düzgün bir şekilde örneklenir. Daha sonra, tarafsız bir sayım çerçevesi yumurtalık bölümünün üzerine bindirilir ve tanımlı, randomize bir sayım ızgarası boyunca aşamalı olarak hareket ettirilir (örnekleme fraksiyonu 2, f2)8. Son olarak, kesit kalınlığının bilinen bir kısmı optik olarak örneklenir (örneğin, 10 μm) ve bu alandaki foliküller sayılır (örnekleme fraksiyonu 3, f3)4. Ham folikül sayısı, nihai değeri elde etmek için bu örnekleme fraksiyonlarının tersi ile çarpılır. Bu yöntem, stereolojik yazılım tarafından tahrik edilen motorlu bir aşamaya sahip bir mikroskop da dahil olmak üzere uzman eğitimi ve ekipmanı gerektirir. Dokular özel bir Bouin fiksatifinde korunmalı ve cam bıçaklı glikolmethakrilat reçine mikrotom kullanılarak kalın doku bölümlerinin kesilmesini sağlamak için glikolmethakrilat reçinesine gömülmelidir. Bu yöntem, yumurtalık ve foliküllerin üç boyutlu morfolojik yapısını en iyi şekilde korumak için doku büzülme ve deformasyonunu hesaba katmak için tasarlanmıştır9.
Doğrudan folikül sayımı, folikülleri saymak için en sık kullanılan yöntemdir10. Daha yaygın fiksatifler (formalin) kullanılabilir, ardından parafin balmumu gömme ve 4-6 μm arasında bir kalınlıkta standart bir mikrotom kullanılarak kapsamlı seri kesitler kullanılabilir. Foliküller tüm doku bölümünde tanımlanmış bir aralıkta sistematik olarak sayılır ve daha sonra toplam folikül tahminini elde etmek için örnekleme aralığının tersi ile çarpılır. Bu yöntem hızlı, kolaydır, arşivlenmiş dokular kullanılarak yapılabilir ve standart histolojik teknikler kullanılarak hazırlanabilir. Standart görüntüleme yeteneklerine sahip sadece bir ışık mikroskobu gerektirir. Bununla birlikte, bu avantajlara rağmen, doğrudan folikül sayımı, stereolojinin doğruluğundan ve katı sayım parametrelerinden yoksun olduğundan, araştırmacı önyargısına daha yatkın hale getirir. Ek olarak, dokular işlem sırasında büzülme ve deformasyona uğrayabilir, yumurtalığın bütünlüğünü ve morfolojisini bozabilir ve böylece folikül sınıflandırmasını ve nicelleştirmeyi zorlaştırabilir.
Bu makalenin amacı, fare yumurtalıklarındaki ilkel folikül sayısını nicel olarak değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan iki yöntemi açıklamaktır: stereoloji ve doğrudan folikül sayımı. Alanımızda tekrarlanabilirliği artırmak ve araştırmacıların çalışmaları için en uygun sayım yöntemi hakkında bilinçli bir karar vermelerini sağlamak için bu iki yöntem için ayrıntılı protokoller sağlayacağız ve bazı güçlü ve zayıf yönlerini vurgulayacağız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yumurtalıklar dişi C57BL6J farelerinden toplanarak elde edildi. Tüm hayvan prosedürleri ve deneyleri NHMRC Avustralya Hayvanların Bakımı ve Kullanımı Uygulama Kuralları'na uygun olarak gerçekleştirilmesi ve Monash Hayvan Araştırma Platformu Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanması.
NOT: Bu raporda, aynı hayvandaki iki sayım yöntemini karşılaştırmak için stereoloji 11 ve doğrudansayımlar 12 ,13kullanılarak belirlenen ilkel folikül oositlerini tükendiğini gösteren bir kemoterapi ajanı kullanılmıştır. Kadın, 8 haftalık (genç yetişkin) fareler, siklofosfaminit veya tuzlu araç kontrolünün (n=5/grup) 75 mg/kg/vücut ağırlığına sahip tek bir intraperitoneal enjeksiyondan önce tartıldı. Bu dozun ilkel foliküllerin yaklaşık% 50 tükenmesine neden olduğu gösterilmiştir, ancak farelerde morbidite veya mortaliteye neden olduğubildirilmemiştir 14. Yumurtalıklar tedaviden 48 saat sonra hasat edildi. Her hayvandan bir yumurtalık 24 saat boyunca% 10 (v / v) nötr tamponlu formalin çözeltisinde, diğeri ise Bouin'in çözeltisinde 24 saat boyunca sabitlendi. Doku daha sonra glikolmethakrilat reçinesine gömüldü ve seri olarak 20 μm'de veya parafin ve seri olarak 5 μm'de bölümlere yerleştirildi. Tüm dokular periyodik asit Schiff ve hematoksilin ile boyandı.
1. Histolojik hazırlık: sabitleme, işleme, gömme ve fare yumurtalıklarını bölümleme
- Yumurtalığın kendisine zarar vermeden veya kesmeden, yumurtalığı ve çevresindeki tüm yağı keserek fare yumurtalıklarını parçalara ayrıştırın. Gerekirse, bu adım için bir diseksiyon mikroskobu ve ince bıçak kullanın (Şekil 1A).
- Dokuları% 70 etanol içine aktarmadan önce, Bouin'in fiksatif (stereolojisi) veya formalin fiksatif (doğrudan sayımları) içeren küçük bir etiketli tüpe 24 saat boyunca(Şekil 1B)yerleştirerek dokuları hemen düzeltin.
NOT: Folikül morfolojisi en iyi Bouin'in glikolmethakrilat reçinesine gömülü sabit yumurtalık dokusunda korunur (Şekil 2). - Tüm sabit yumurtalıkları işleyin ve daha sonra standart bir histolojik protokol kullanarak doğrudan sayımlar için glikolmethakrilat reçinesine(Ek Dosya 1) veya parafin balmumuna gömün.
DİkKAT: Reçine toksiktir, bu nedenle tüm doku işleme adımlarının duman kaputunda gerçekleştirilmesini ve eldivenlerin her zaman giyilmesini sağlayın. - Kalın glikolmethakrilat reçine bölümlerini (örneğin, 20 μm) kapsamlı bir şekilde kesmek için cam bıçakla (Şekil 1D) donatılmış özel bir reçine methakrilat mikrotom ( Şekil1C) kullanın. Bölümleri düzenli aralıklarla (örneğin, her 3rd bölümde) stereoloji için cam mikroskop slaytları üzerine toplayın.
- İnce parafin bölümlerini kesmek için standart bir mikrotom kullanın (örneğin, 4-6 μm). Doku bölümlerini düzenli aralıklarla (örneğin, her9. bölümde bir) doğrudan folikül sayısı için cam mikroskop kaydırağından toplayın.
- Slaytları periyodik asit Schiff ve hematoksilin ile lekeleyin (Ek Dosya 2).
- Parafin bölümleri için standart DPX veya glikolmethakrilat reçine bölümleri için kalın DPX ile kapak (Şekil 1E).
DİkKAT: Glikolmethakrilat reçine DPX tehlikelidir, bu nedenle bu adımı davlumbaz dumanlamak için gerçekleştirin.
NOT: Glikolmethakrilat reçine DPX son derece viskozdur. Cam kapak, DPX'in eşit ve ince bir şekilde dağıldığından ve kapak kılıfı altında hava kabarcıkları olmadığından emin olmak için bir spatula ile bastırılarak sıkıca tutturılmalıdır (Şekil 1F).
2. Optik fraksiyonatör kullanılarak ilkel folikül sayısının stereolojik tahmini
- Bilgisayarı, çoklu kontrol ünitesini, kamerayı ve stereoloji kurulumundaki ışık kaynağını açın ve mikroskop hedefini düşük büyütmeye (örn. 10x) ayarlayın.
- Stereology yazılımını açın.
- İlk slaytı mikroskop aşamasına güvenli bir şekilde koyun.
- Kamera Ayarları panelinde Pozlama altında Otomatik'i kontrol derek ışık pozlamasını ayarlayın(Tamamlayıcı Şekil 1A). Alternatif olarak, ışığa maruz kalmayı manuel olarak ayarlayın.
- İlk doku örneğini bulmak ve numuneyi odak noktasına getirmek için joystick'i kullanın.
- Beyaz dengesini, Diğer Ayarlar'a tıklayarak (Kamera Ayarları panelinin sağ alt kısmında bulunur) ve ardından Beyaz Dengesi'ne tıklayın ve Otomatik (Tamamlayıcı Şekil 1B)'e tıklayın. Alternatif olarak, bölümde beyaz bir alan seçerek beyaz dengesini el ile ayarlamak için Diğer Ayarlar düğmesinin (veya Diğer Ayarlar'da Alan Seç) bitişik Beyaz Dengesi düğmesini tıklatın.
- Problar açılır menüsüne gidin ve Optik Kesirleyici İş Akışı'nı tıklatın. Ardından Yeni Projeyi Başlat'ı ve Tamam'ı tıklatın.
- Varolan bir örnekleme yapılandırması kaydedilmişse, Örnekleme Parametreleri'nin altında Evet | ... ve istediğiniz örnekleme yapılandırmasını seçin.
- Değilse, Hayır'ı tıklatın ve seri bölüm bilgilerini (Tamamlayıcı Şekil 1C)el ile girin ve 2.13.
- İleri'ye tıklayın, mikroskobu Düşük Büyütme olarak ayarlayın ve açılır menüden 10x büyütmeyi seçin.
- İleri'ye tıklayın ve sonra tüm yumurtalık bölümünün etrafını takip edin - bölümün etrafına sol tıklayarak başlayın ve sonunda sağ tıklatın ve Kontur Kapat'ı seçin.
- İleri'ye tıklayın, mikroskobu Yüksek Büyütme olarak ayarlayın ve açılır menüden 100x Yağ büyütmeyi seçin.
- Slayttaki doku bölümüne bir damla yağ yerleştirin ve mikroskop hedefini 100x büyütmeye taşıyın.
- Işığa pozlamayı ayarlayın (adım 2.4'te olduğu gibi) ve İleri 'yitıklatın.
- Prob yapılandırmasını tanımlamak için Örnekleme Parametrelerini ayarlayın. Burada, sayım çerçevesi 47,5 μm x 47,5 μm (2,256,25 μm2)olarak ayarlanmış ve adım uzunluğu 100 μm x 100 μm (10.000 μm2) ( Ek Şekil 2 ) olarakayarlanmıştır. Örnekleme parametreleri oluşturulduktan sonra şablonu kaydedin ve 2.7.
- Saymaya Başla 'ya tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 1D). Örneğin en üstüne odaklanın, Tamam'ı tıklatın ve saymaya başlayın.
- 10 μm örnekleme derinliğinde hareket etmek ve oosit çekirdeği odak noktasına gelen ilkel kökleri saymak için odaklama düğmesini kullanın. Sonraki alana geçmek için İleri'yi tıklatın.
- Oosit skuamöz (düzleştirilmiş) granüloza hücreleri ile çevriliyse, ancak küboidal granüloza hücreleri yoksa folikülleri ilkel olarak sınıflandırın (Şekil 2A).
NOT: İlkel foliküller, ağırlıklı olarak küboidal granüloza hücreleri ile çevrili olan küboidal ve skuamöz granüloza hücrelerinin(Şekil 2B)ve birincil foliküllerin birleşiminden oluşan ara/geçiş köklerinden farklıdır (Şekil 2C). Bu folikül sınıfları ayrı ayrı ölçülmelidir. - Sadece oosit çekirdeğinin görünür olduğu folikülleri sayın. Oosit çekirdeği sayım çerçevesinde görünmeli veya sayım çerçevesinin yeşil ekleme satırlarına dokunmalıdır(Tamamlayıcı Şekil 1E,F).
- Oosit çekirdeği sayım çerçevesinin dışına düşerse (Tamamlayıcı Şekil 1G) veya sayım çerçevesinin kırmızı dışlama çizgilerine dokunursa, bu folikülü saymayın.
- Eksojen bir kimyasala (örneğin kemoterapi) yanıt olarak ilkel folikül tükenmesini değerlendirirken, sayılan tüm foliküllerin sağlıklı olduğundan ve böylece normal morfolojiye sahip olduğundan emin olun (Şekil 2). Anormal veya atretic folikülleri ayrı ayrı sayın. Genellikle, folikül ölümü kemoterapi gibi hakaretlerle tetiklenmiştir ve atretic foliküllerin nicelliği, sadece sağlıklı foliküller yumurtalık rezervini oluşturduğundan, sağlıklı ve atretic folikülleri ayırt etmek için ayrı ayrı elde edilmelidir15.
- Oosit skuamöz (düzleştirilmiş) granüloza hücreleri ile çevriliyse, ancak küboidal granüloza hücreleri yoksa folikülleri ilkel olarak sınıflandırın (Şekil 2A).
- Bu bölümde sayım tamamlandıktan sonra aşağıdakilerden birini yapın:
- Yeni Bölüm Ekle 'yitıklatın ve sonraki bölümü sayım için ayarlamak üzere 2.3.
- Oturumu sonlandırmak için Sayımı Bitirdim'i tıklatın. Hedefi 10x'e döndürün, stereoloji yazılımından çıkın ve ışık kaynağını, kamerayı, çoklu kontrol birimini ve bilgisayarı kapatın.
- Tüm yumurtalıktan örneklenmiş her doku bölümünden toplam ham folikül numarasını (Q) alın, ardından bir elektronik tablo kullanarak, her çoğaltma hayvanından (N)4'tennihai değeri elde etmek için aşağıdaki denklemi kullanın.
nerede:
N = Yumurtalık içindeki toplam tahmini folikül sayısı.
S = Ham ilkel folikül sayısı.
f1 = Örnekleme aralığı. Her 3rd bölüm böylece
örneklenmiş.
f2 = Sayım çerçevesi (örnek alan) ve step arasındaki ilişki, olarak
hesaplanır. Numune alanı 2256 μm 2 (47,5μm x 47,5 μm) ve step alanı 10000 μm2 (100 μm x 100 μm), 
.
f3 = Yumurtalık kesiri örneklenmiş. 20 μm'lik bölümün 10 μm'si örneklendiklerinden,
.
Bu nedenle,
.
NOT: Bu protokol, yaygın olarak atıfta bulunulan bir stereoloji yazılımı kullanılarak bu stereolojik analizilkelerininnasıl uygulanacağını açıklar ( Malzeme Tablosu ); ancak, başka stereolojik yazılımlar mevcuttur. Yumurtalık köklerinin stereolojik analizleri sırasında uygulanan ilkeler, parametreleri ayarlamak için kullanılan yazılımdan bağımsız olarak aynıdır. Stereology en doğru 100 veya daha fazla nesne yetişkin bir fare yumurtalığında sayıldığında4, bu% 10'un altındaki tahmin için bir hata katsayısı verir16. Burada özetlenen örnekleme parametreleri, yetişkin vahşi tip C57BL6J yumurtalıklarının kontrol altında sayılabilmesi için en az 100 nesnenin (yani ilkel, geçiş ve birincil foliküller) sayılabilmesini sağlamak için optimize edilmiştir. Analiz edilecek bölümlerin aralığı ve sayısı ve örneklenen bölümlerdeki optik disissektör sayısı gibi en uygun örnekleme parametrelerini belirlemek için küçük bir örnekleme boyutu içeren bir pilot çalışma yapılabilir17.
nerede:
örneklenmiş.
hesaplanır. Numune alanı 2256 μm 2 (47,5μm x 47,5 μm) ve step alanı 10000 μm2 (100 μm x 100 μm), 
.
.
.3. İlkel folikül sayısının doğrudan yumurtalık folikül sayılarının tahmini
- Mikroskop kaydıramasını standart bir ışık mikroskobu altına güvenli bir şekilde yerleştirin ve ham ilkel folikül numarası elde etmek için doğrudan sayımlar gerçekleştirin.
- Oosit açıkça görünüyorsa ve skuamöz (düzleştirilmiş) granüloza hücreleri ile çevriliyse, ancak küboidal granüloza hücreleri yoksa folikülleri ilkel olarak sınıflandırın (Şekil 2D).
NOT: İlkel foliküller, ağırlıklı olarak küboidal granüloza hücreleri ile çevrili olan küboidal ve skuamöz granüloza hücrelerinin(Şekil 2E)ve birincil foliküllerin bir kombinasyonunu içeren ara/geçiş köklerinden farklıdır (Şekil 2F). Bu folikül sınıfları ayrı ayrı ölçülmelidir. - Sayılan tüm foliküllerin sağlıklı olduğundan ve böylece normal morfolojiye sahip olduğundan emin olun (Şekil 2). Sadece sağlıklı foliküller yumurtalık rezervini oluşturduğundan, anormal veya atretic folikülleri ayrı ayrı sayın.
- Oosit açıkça görünüyorsa ve skuamöz (düzleştirilmiş) granüloza hücreleri ile çevriliyse, ancak küboidal granüloza hücreleri yoksa folikülleri ilkel olarak sınıflandırın (Şekil 2D).
- Alternatif olarak, görüntü dosyalarını açarak sayımları gerçekleştirmek için tüm yumurtalık dokusu bölümünün birden fazla veya dikişli yüksek güçlü (örneğin, 20x) fotomikrograflarını alın. Bu, el ile veya otomatik slayt tarayıcısı kullanılarak yapılabilir.
- Önceden belirlenmiş aralıkta tüm yumurtalıktan örneklenen her doku bölümünden toplam ham folikül sayısını (Q) alın. Aşağıdaki denklemi kullanarak her çoğaltma hayvanının (N) son değerini elde etmek için bu sayıyı örnekleme kesirinin tersiyle çarpın.
nerede:
N = Yumurtalık içindeki toplam tahmini folikül sayısı.
S = Ham folikül sayısı (her bir türün ayrı ayrı hesaplanmıştır).
f1 = Örnekleme aralığı. Her9. bölümden böylece örneklenmiş.
Bu nedenle,
.
nerede:
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genç yetişkin dişi farelere tek doz siklofosfaminid kemoterapisi veya salin araç kontrolü (n=5/grup) uygulandığı ve her iki yumurtalığın 48 saat sonra her hayvandan toplandığı iyi karakterize edilmiş bir folikül tükenme modeli kullanılmıştır. İki yöntemin her biri için Adım 1'de açıklandığı gibi hayvan başına bir yumurtalık hazırlandı: stereoloji veya doğrudan sayımlar. Her hayvanın sol ve sağ yumurtalığı her gruba rastgele atandı. Bu veriler, stereoloji kullanırken, kemoterapi tedavisinden sonra (387 ± 11 folikül) kontrole karşı (1043 ± 149; p=0.0024) fare ilkel foliküllerinde önemli bir tükenme tespit edilebileceğini göstermektedir (Şekil 3). Buna karşılık, aynı hayvanlardan gelen kontrallateral yumurtalıkları kullanarak, doğrudan folikül sayıları kemoterapiden sonra yumurtalık rezervinde önemli bir azalma tespit edemedi (490 ± 40), kontrol ile karşılaştırıldığında (752 ± 139; p=0.1063) (Şekil 3). Not olarak, genç yetişkin vahşi tip hayvanlarda ilkel folikül sayısının değişken olduğu açıktır, çünkü salinle tedavi edilen hayvanların dağılımı, stereoloji kullanılarak sayımlar yapılsa bile siklofosfamid gruplarına kıyasla daha geniştir(Şekil 3).
Şekil 1: Bouin'in sabit, glikolmethakrilat reçine gömülü yumurtalıklarının histolojik analizi için stereolojik analiz için hazırlanması. A) Yetişkin bir fare yumurtalığı (daire, ok) tüy bıçağı kullanılarak fare yumurtalığı ve fare yumurtalığı ile yakından kesilmiştir. B)Aynı kadın yetişkinden kontrallateral fare yumurtalıkları (daire, ok) parçalandı, kesildi, daha sonra stereoloji için Bouin'in fiksatifine (solda) veya doğrudan sayımlar için formalin'e (sağda) sabitlendi. C) Cam mikroskop slaytlar üzerine toplanan glikolmethakrilat reçine bloklarını 20 μm bölüme ayrıntılı bir şekilde kesmek için cam bıçak (ok) ile donatılmış özel bir reçine methakrilat mikrotom D)kullanılmıştır. E)Cam mikroskop slaytları (oklar) üzerindeki periyodik asit Schiff lekeli yumurtalık dokusu bölümleri duman kaputunda taze histolene (yeşil kap) batırılmış, daha sonra GMA DPX damlalarının üzerine cam bir kapak ucu eklenmiştir. Fazla DPX ve hava kabarcıklarını gidermek için bir spatula kullanıldı. Slaytlar bir gecede duman kaputunda havayla kurutuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İlkel folikül sınıflandırması. Glikolmethakrilat reçine gömülü (A-C) ve parafin gömülü (D-F) yumurtalık bölümlerindeki ilkel, geçişsel ve birincil foliküllerin temsili görüntüleri. A: Skuamöz granüloza hücreleri (ok) ile çevrili ilkel folikül. Bar = 10 μm. B: Hem skuamöz (ok) hem de küboidal (ok ucu) granüloza hücreleri ile çevrili geçiş folikülleri. Bar = 10 μm. C: Küboidal (ok ucu) granüloza hücreleri ile çevrili birincil folikül. Bar = 25 μm. D: Skuamöz granüloza hücreleri (ok) ile çevrili ilkel folikül. Bar = 10 μm. E: Hem skuamöz (ok) hem de küboidal (ok ucu) granüloza hücreleri ile çevrili geçiş folikülleri. Bar = 10 μm. F: Küboidal (ok ucu) granüloza hücreleri ile çevrili birincil folikül. Bar = 25 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fare ilkel foliküllerini değerlendirmek için optik fraksiyonatör ve doğrudan sayım yöntemlerinin karşılaştırılması. 8 haftalık dişi C57BL6J farelerinin intraperitoneal olarak salin veya kemoterapötik, siklofosfamid (n=6/grup) 75 mg/kg/vücut ağırlığı dozunda tedavi edildiği bir model olarak köklü bir folikül tükenme modeli kullanılmıştır. Bu, yumurtalık rezervdeki değişiklikleri tespit etmek için iki folikül sayma yönteminin karşılaştırılmasını sağladı. Aynı hayvan kohortunda, toplam folikül tahminleri, yumurtalık rezervinin daha büyük ve önemli bir tükenmesini tespit eden stereolojinin aksine, önemli miktarda folikül tükenmesini tespit edemedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Güçlü | Zayıf | |
| STEREOLOGY | Folikülleri tahmin etmenin en doğru yolu | Zaman alıcı ve maliyetli |
| İstatistiksel olarak sağlam hale getiren birkaç örnekleme parametresi kullanır | Uzman ekipman ve yazılım gerektirir | |
| Son derece hassastır, ilkel folikül sayılarındaki daha küçük değişiklikleri algılayabilir | Örnekler belirli, özel histolojik teknikler kullanılarak hazırlanmalıdır. | |
| Folikül yapısı doku işleme sırasında daha iyi korunur | ||
| Farklı araştırmacılar tarafından uygulanabilecek tek tip kurallar, böylece önyargıyı azaltır | ||
| DOĞRUDAN SAYıMLAR | Zaman ve uygun maliyetli | Stereology'den daha az doğru ve hassas |
| Hafif mikroskop gibi standart laboratuvar ekipmanları gerektirir | Kullanılan tek bir örnekleme parametresi, folikül sayılarındaki küçük değişiklikleri tespit etmede daha az etkili hale getirir | |
| İmmünohistokimyasal veya diğer analizler için kullanılabilecek yumurtalık bölümlerinin tutulması | Doku, işlem sırasında hacim ve folikül yapısındaki değişikliklere karşı daha hassastır | |
| Uygulanabilecek tekdüze kurallar kümesi yok, bu nedenle araştırmacının önyargısına daha yatkın |
Tablo 1: Folikül sayma yöntemlerinin güçlü ve zayıf yönlerini karşılaştırma: stereoloji ve doğrudan sayımlar.
Ek Şekil 1: Stereology yazılım protokolünün ekran görüntüleri. A)Kamera Ayarları panelinde (beyaz kutu) Pozlama'nın altındaki Otomatik (kırmızı kutu) işaretleyerek pozlamayı ayarlayın. B) Önce Kamera Ayarları panelinde Diğer altındaki Diğer Ayarlar Simgesi'ni tıklatarak beyaz dengesini ayarlayın. Ardından, Beyaz Dengesi'ni seçin ve Otomatik (kırmızı kutu) öğesini tıklatın. C) Varolan bir örnekleme yapılandırması ayarlanmadıysa, Hayır 'ı (kırmızı kutu) tıklatın ve seri bölüm bilgilerini (yeşil kutu) girin. D) Saymaya başlamak için Saymaya Başla 'yı tıklatın (beyaz ok). E) Sayım çerçevesinde ilkel bir folikülünün çekirdeği görünüyorsa, bu folikül sayılır (beyaz noktalı daire). F) İlkel bir folikülün çekirdeği sayım çerçevesinin yeşil inklüzyon çizgilere dokunuyorsa, bu folikül de sayılır (beyaz noktalı daire). G) İlkel bir folikülün çekirdeği sayım çerçevesinde görünmüyorsa veya sayım çerçevesinin kırmızı dışlama çizgilere dokunuyorsa, bu folikül sayılmaz (beyaz noktalı daire). Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 2: Örnekleme Parametrelerini Ayarlama. Prob Yapılandırmasını tanımlamak için sol panelde sıralı adımları izleyin. A)Monte edilen kalınlığı ölçün. 'Her kılavuz sitesinde bölümün üstüne yeniden odakla' işaretsiz olduğundan emin olun (kırmızı kutu). 'Ortalama monte kalınlığı manuel olarak girin' (yeşil kutu) işaretleyin. Ortalama monte kalınlığı 20,00 μm (mavi kutu) olarak girin. B) Sayım çerçevesi boyutunu tanımlayın. Sayım Çerçevesi Ekranı'nın altında ,'Sayım çerçevesi ekranını kare olmaya zorla' ve 'Canlı görüntüde ortala' (kırmızı kutu) işaretini seçin. Sayım Çerçevesi Boyutu'nun altına X ve Y (yeşil kutu) için 47,5 μm girin. C) SRS kılavuz düzenini tanımlayın. Izgara boyutunu X ve Y (kırmızı kutu) için 110 olarak el ile girin. D) Distör seçeneklerini tanımlayın. Üst koruma bölgesi yüksekliği için 1,00 μm (kırmızı kutu) girin. Optik distör yüksekliği için 10 μm (yeşil kutu) girin. Odak Yöntemi'nin altında 'Manuel odak' (mavi kutu) seçeneğini belirleyin. E)Örnekleme parametrelerini kaydedin. Bu ayarları kaydetmek için bir Ad ve Yorum girin ve ardından 'Geçerli Ayarlarınızı Kaydet'i (beyaz ok) tıklatın. F) Geçerli Örnekleme Parametresi Ayarları altında, ayarlarınızın görüntülenenlerle eşleştiklerden emin olun. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Dosya 1. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Dosya 2. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, fare ilkel folikülleri, stereolojiyi ve daha yaygın olarak kullanılan doğrudan folikül sayma yöntemini numaralandırmak için altın standart tekniği için adım adım bir protokol sağlanmıştır. Kemoterapi tedavisi, sol ve sağ yumurtalık içinde bu iki farklı yöntemden elde edilen sonuçları aynı hayvandan karşılaştırmak ve karşılaştırmak için kullanılmıştır. Her iki yöntem de ilkel folikül sayılarında hayvanlar arası yüksek değişkenliği ortaya koydu. Yumurtalık rezervinde önemli bir tükenme stereoloji kullanılarak kaydedildi, ancak doğrudan sayım kemoterapi uygulanandan sonra kontrole karşı ilkel folikül sayısında önemli bir azalma tespit edemedi.
Özellikle, C57BL6J gibi doğuştan gelen bir fare türünde bile, genç yetişkin vahşi tip (kontrol) dişilerdeki yumurtalık rezervinin, insanlarda olduğu gibi yaygın olarak dağıtıldığı açıktır. Bunu etkileyen ve yumurtalık rezervinin kurulmasına katkıda bulunan faktörler araştırıla devam etmektedir18. Fare yumurtalık fonksiyonu çalışmaları arasında yüksek değişkenlik, alanın verileri karşılaştırması veya çoğaltması ve oosit sayısını ve kalitesini korumak için yeni terapötiklerin klinik çevirisini ilerletmek için çok sayıda zorluk teşkil eder4. Bu değişkenlik, sadece kullanılan sayım yöntemleri de dahil olmak üzere bir dizi faktörden değil, aynı zamanda hayvan suşu ve yaş arasındaki farklılıklar gibi ek faktörlerden kaynaklanmaktadır; doz ve zamanlama gibi tedavi rejimlerinin yanı sıra. Farklı çalışmalardan elde edilen veriler karşılaştırılırken bu faktörlerin tümü göz önünde bulundurulmalıdır. Ne olursa olsun, bu çalışmada kullanılan folikül tükenme modeli genel olarak stereoloji protokolünün doğru ve hassas doğasını vurgularken, yaygın olarak bildirilen doğrudan sayım yönteminin bilinen önemli bir ilkel folikül tükenmesini tespit edemediğini göstermektedir.
Bu makalede ayrıntılı olarak açıklanan her sayım yönteminin güçlü yönleri ve sınırlamaları vardır (Tablo 1). Stereoloji, çeşitli organlarda hücre sayısını belirlemek için kullanıldığında doğruluğu nedeniyle altın standart yöntem olarak kabul edilir5. Bununla birlikte, bu tekniğin dezavantajları, ilgili zaman ve maliyetin yanı sıra özel ekipman ve uzmanlık gereksinimini içerir. Birlikte, bu, en hassas verileri elde etmek için bu yordamın geniş kullanım kullanımını sınırlamıştır.
Buna karşılık, doğrudan sayım yöntemi hızlı, kolaydır, arşivlenmiş dokular kullanılarak yapılabilir ve standart histolojik teknikler kullanılarak hazırlanabilir. Standart görüntüleme yeteneklerine sahip sadece bir ışık mikroskobu gerektirir. Bununla birlikte, histolojik işlemden kaynaklanan ve yumurtalığın üç boyutlu yapısını bozabilecek hacim değişikliklerini hesaba katmaz. Sonuç olarak, folikül morfolojisi her zaman yeterince korunmaz, bu da özellikle deneyimsiz araştırmacılar için tanımlama ve sayım doğruluğunu zorlaştırır. Formalin bu çalışmada doğrudan sayımlar için kullanılan fiksatif olsa da, Bouin'in sabit dokuları parafin içine gömülebilir ve bu daha iyi morfoloji sağlayabilir ve araştırmacıların ilkel folikülleri daha kolay tanımlamasına yardımcı olabilir. Ayrıca, literatürde, doğrudan sayım yöntemi için örnekleme fraksiyonları, her 3rd'den her 10 th 5 μm parafin bölüm19'akadar değişmektedir , bu da çalışmalar arasındaki folikül sayılarında büyük tutarsızlıklara katkıda bulunabilir. Parafin balmumu bölümlerinin çok ince olduğu göz önüne alındığında, her9.
Bu kılavuzda özetlenmiş olmayan, ancak literatürde yaygın olarak bildirilen ek yöntemler, tüm yumurtalıktan sadece bir merkezi bölümde saymaktadır ve bunun tüm yumurtalığı veya folikül yoğunluğunu temsil ettiği düşünülmektedir. Bu ilk yöntem oldukça sorunludur, çünkü ilkel foliküller yumurtalıkta eşit olarak dağıtılmaz ve kümelerde bulunabilir. Bu, yumurtalığın tek, hatta birkaç bölümünün tüm organı temsil etmediği anlamına gelir, bu da sistematik örneklemeyi herhangi bir sayım yöntemi için önemli bir bileşen haline getirir. Folikül yoğunluğu, yumurtalık dokusu örneğindeki foliküllerin sayıp doku alanı başına sayıları ifade etmeyi içerir. Birincil insan dokusu elde etmenin sınırlamaları göz önüne alındığında, folikül yoğunluğu genellikle insan yumurtalığında mutlak folikül sayısı için bir taşıyıcı ölçü olarak kullanılır, ancak farelerdeki raporlar da yaygındır. Bununla birlikte, bu niceleme yöntemi, yumurtalık boyunca foliküllerin düzensiz dağılımını veya yumurtalık endokrin (luteal) döngüsü boyunca rutin olarak meydana gelen yumurtalık hacmindeki dalgalanmaları hesaba katmaz. Bu önemlidir, çünkü numuneler arasındaki yoğunluğun doğru bir ölçüsü korunmuş doku alanına dayanır. Ayrıca, bu yöntem genellikle insan dokularını analiz ederken sadece küçük bir biyopsi veya yumurtalığın fraksiyonunu örnekler, bu nedenle tüm yumurtalığı temsil etmez. Folikül yoğunluğu, stereoloji ile elde edilebilen doğrulukten yoksundir. Aynı tüm yumurtalığı kullanarak bile, folikül yoğunluğu ilesterolojik analizden sonra folikül nicelemenin karşılaştırmalı ölçüleri fare yumurtalıklarında karşılık gelmedi20.
En sık kullanılan deneysel hayvan olmasına rağmen, fare sadece bir model türüdür. Evcil hayvanlar veya insan olmayan primatlar da dahil olmak üzere daha büyük türlerden yumurtalık elde etmek mümkündür, bu nedenle tüm yumurtalık örneklerinden folikül sayıları değiştirilmiş birstereolojik protokol kullanılarak gerçekleştirilebilir21,22. Son olarak, tüm insan yumurtalıklarında folikül sayılarını analiz etme yeteneği gerçekten çok zor olsa da, yine de değiştirilmiş bir stereolojik protokol23 , 24,25kullanılarak örnekler mevcut olduğunda yapılabilir.
Sahadaki gelecekteki yönler, yeni tekniklerin genişlemesini ve alımını içerebilir. Örneğin, ilkel folikül oositleri için otomatik algılama ve sayma yeni bir metodolojisi açıklanmıştır26. Bu yöntem, etiketli veri kümeleri tarafından yönlendirilen konvolüsyonel sinir ağlarını ve test verilerini seçmek için kayan pencere algoritmasını kullanır. Bununla birlikte, bu algoritma sadece iki yumurtalık üzerinde test edildi ve yaygın alım belirlenmeye devam ediyor. Alternatif olarak, optik doku temizleme ve ışık tabakası mikroskopislerindeki son gelişmeler bozulmamış dokuların kapsamlı analizine izin verdi ve bazı çalışmalar fare yumurtalığında folikül numaralandırması için bunu araştırdı27,28.
Sonuç olarak, doğrudan folikül sayımı yumurtalık içindeki ilkel folikülleri numaralandırmak için kolay, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem olsa da, bu teknik hassasiyetten, doğruluktan yoksun ve araştırmacı önyargısına eğilimli olabilir. Bu nedenle, dezavantajlarına rağmen, stereology ilkel folikül sayılarını doğru ve tekrarlayıcı bir şekilde tanımlamak için mevcut en iyi teknik olmaya devam etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Victoria Eyalet Hükümeti Operasyonel Altyapı Desteği ve Avustralya Hükümeti NHMRC IRIISS aracılığıyla mümkün oldu ve Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (ALW #1120300) ve Avustralya Araştırma Konseyi 'nden (KJH #FT190100265) finanse edildi. Yazarlar Monash Hayvan Araştırma Platformu, Monash Histoloji Platformu ve Monash Mikro Görüntüleme tesisinin teknik desteğini kabul etmek istiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol (HPLC) | Fisher Chemical | #A383-1 | |
| Acid alcohol | Amber Scientific | #ACDL | |
| Bouin’s fixative | Sigma-Aldrich | #HT10132 | Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v) |
| Cyclophosphamide | Sigma-Aldrich | #C0768-5G | |
| Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX) | Sigma-Aldrich | #06522 | |
| Ethanol | Amber Scientific | #ETH | Ethanol 100% |
| Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle | Designs for Vision | #FEA-745-SR | Feather blade for dissections (seen in Figure 1) |
| Formalin fixative | Australian Biostain | #ANBFC | |
| Glass coverslip | Thermo Scientific | #MENCS22501GP | 22 mm x 50 mm |
| Glycomethacrylate resin RM2165 microtome | Leica Microsystems | #RM2165 | |
| Glycolmethacrylate DPX | *made in house | *Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks | |
| Histolene | Trajan | #11031 | |
| Mayer’s haematoxylin | Amber Scientific | #MH | |
| Olympus BX50 microscope | Olympus | #BX50 | Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3) |
| Olympus immersion oil type-F | Olympus | #IMMOIL-F30CC | |
| Olympus TH4-200 light source | Olympus | #TH4-200 | |
| Paraffin wax | Sigma-Aldrich | #03987 | |
| Periodic acid | Trajan | #PERI1% | Periodic acid 1% |
| Rotary Microtome CUT 4060 | MicroTec | #4060R/F | Used to cut paraffin sections |
| Schiff’s reagent | Trajan | #SCHF | |
| Scott's tap water | Amber Scientific | #SCOT | Potassium carbonate, magnesium sulphate, water |
| StereoInvestigator Stereological System | MBF Bioscience | Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick | |
| Superfrost microscope slides | Thermo Scientific | #MENSF41296SP | 1 mm, 72 pcs |
| Technovit 7100 Plastic embedding system | Emgrid Australia | #64709003 | 500 mL/5 x 1 g/40 mL |
| Technovit 3040 yellow | Emgrid Australia | #64708805 | 100 g/80 mL |
References
- Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. The capacity of oocytes for DNA repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
- Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications. Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- Ristic, N., et al. Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring. Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).
- Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary. International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).
- Brown, D. L. Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology. Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).
- Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design. Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Nguyen, Q. N., et al. Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility. Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).
- Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice. Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).
- Winship, A. L., et al. The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation. Human Reproduction. , (2020).
- Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool. Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).
- Nguyen, Q. N., et al. Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes. Molecular Human Reproduction. , (2019).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. Journal of Microscopy. 147, Pt 3 229-263 (1987).
- Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy. Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).
- Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
- Omari, S., et al. Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve. Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).
- Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age. Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary. Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age. Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).
- Charleston, J. S., et al. Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem. Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).
- Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system. Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).
- Hansen, K. R., et al. A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause. Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).
- Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
- McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
- Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
