Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

التسلخ المُساعد للتنقية في مراحل محددة من دورة الظهارة الظهارية شبه المائلة للماوس لتحليلات المناعة المصبية

Published: October 7, 2020 doi: 10.3791/61800
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 3,4, 1,2, 3,4, 1, 1
1Institute of Biomedicine, Integrative Physiology and Pharmacology Unit, University of Turku, Turku, Finland, 2Department of Pediatrics, Turku University Hospital, Turku, Finland, 3Centre for Reproductive Health, Hudson Institute of Medical Research, Melbourne, VIC 3168, Australia, 4Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, Melbourne, VIC 3800, Australia

Summary

يصف هذا البروتوكول ميكروديستيون بمساعدة الترانويلومي من أجزاء من الأنابيب الماوس الكبار شبهiferous التي تمثل مراحل محددة من دورة الظهارة شبه المائلة، وأنواع الخلايا فيها، والمناعة اللاحقة من الاستعدادات الاسكواش وقطاعات الأنابيب سليمة.

Abstract

الحيوانات المنوية هي عملية تمايز فريدة من نوعها التي تؤدي في نهاية المطاف إلى واحد من أنواع الخلايا الأكثر تميزا في الجسم، والحيوانات المنوية. تمايز الخلايا الجرثومية يحدث في جيوب السيتوبلازمية من خلايا Sertoli الجسدية التي تستضيف 4 إلى 5 أجيال من الخلايا الجرثومية في وقت واحد وتنسيق وتزامن تطورها. ولذلك ، فإن تكوين أنواع الخلايا الجرثومية داخل المقطع المقطعي ثابت ، وتعرف هذه الارتباطات الخلوية أيضًا باسم المراحل (I-XII) من الدورة الظهارية شبه المائلة. الأهم من ذلك، يمكن أيضا أن تكون مراحل تحديد من الأنابيب شبهiferous سليمة على أساس خصائصها امتصاص الضوء التفريقي / مبعثر كشفت عن طريق transillumination، وحقيقة أن المراحل تتبع بعضها البعض على طول أنبوب في ترتيب عددي. توضح هذه المقالة طريقة microdissection بمساعدة transillumination لعزل شرائح أنبوبية seminiferous تمثل مراحل محددة من دورة الظهارية الظهارية الماوس شبه. يتم فحص نمط امتصاص الضوء من الأنابيب شبهiferous أولا تحت مجهر تشريح، ومن ثم يتم قطع شرائح أنبوب التي تمثل مراحل محددة واستخدامها في التطبيقات المصب. هنا نصف بروتوكولات المناعة لإعدادات الاسكواش الخاصة بالمرحلة ولأجزاء الأنابيب السليمة. هذه الطريقة تسمح للباحث بالتركيز على الأحداث البيولوجية التي تحدث في مراحل محددة من تكوين الحيوانات المنوية ، وبالتالي توفير أداة فريدة للدراسات التنموية والسمية ، والسيولوجية من الحيوانات المنوية والآليات الجزيئية الكامنة.

Introduction

تمايز الخلايا الجرثومية الذكور من الحيوانات المنوية diploid إلى الحيوانات المنوية هابلويد ناضجة، أي، الحيوانات المنوية، هو عملية معقدة التي تجري في ظهارة من الأنابيب شبهiferous في الخصيتين للفرد ناضجة جنسيا1. أحفاد Mitotic من الحيوانات المنوية A1 تقسيم أول خمس مرات لتوسيع السكان ملتزمة التمايز، ثم أدخل meiosis كما spermatocytes التي تؤدي في نهاية المطاف إلى الحيوانات المنوية haploid. التمايز بين الحيوانات المنوية المستديرة في الحيوانات المنوية، أي،تكوين الحيوانات المنوية، ينطوي على تغييرات معقدة في مورفولوجيا الخلايا، بما في ذلك الضغط النووي وبناء الهياكل الخاصة بالحيوانات المنوية مثل المضاداتبوم و flagellum. في الماوس ، تستغرق عملية تكوين الحيوانات المنوية 35 يومًا لإكمال2،3.

في أي لغة معينة، يستضيف الظهارة شبه المنيفيرة ما يصل إلى خمسة أفواج من الخلايا الجرثومية المميّزة بالإضافة إلى الخلايا الجذعية/السلفة والجراثيمية وخلايا سيرتولي الجسدية1. تميز الخلايا الجرثومية تشكل طبقات متحدة المركز تكوين الذي يمكن التنبؤ بها، وخلايا haploid في خطوة معينة من التنمية دائما المنتسبين مع أنواع معينة من الحيوانات المنوية والحيوانات المنوية4،5. ولذلك، فإن أي مقطع مُنَطَمِي من أنبوب يستضيف أفواج من الخلايا الجرثومية ذات التركيب الثابت. وتعرف هذه الجمعيات الخلية المحددة على أنها مراحل ظهارة شبهiferous. مراحل في حد ذاته لا تقدم راكدة نقطة الاختيار مثل الدول ولكن تتطور باستمرار كما التمايز من الأفواج الخلية الجرثومية يتقدم في متزامن1,2,6. في الفئران ، هناك 12 مرحلة (I-XII)2 التي يتم ترتيبها بطريقة مجزأة على طول المحور الطولي من أنبوب سينيفيروي ، ويتبعون بعضهم البعض في ترتيب منطقي وبالتالي تشكيل موجة من ظهارة شبه مفطورة ، أو موجة الحيوانات المنوية7،8،9 ( الشكل1). الانتهاء من الحيوانات المنوية يأخذ أربع دورات، والطبقات الهرمية أو أفواج من الخلايا الجرثومية التمييز داخل أي المقطع المقطع عرضية أنبوب شبهي هي مؤقتا دورة واحدة شبهية وبصرف النظر عن بعضها البعض. طول الدورة تعتمد على الأنواع وفي الماوس كل دورة يأخذ 8.6 أيام10.

ويمكن تحديد المراحل على أساس التكوين الخلوي وتنظيم الظهارة شبهiferous على الخصيتين الهَنَسيَّةأقسام 5 (الشكل 1 والشكل 2). ومع ذلك، التحليل النسيجي شاقة، تستغرق وقتا طويلا ويتطلب تحديد وتلطيخ، وبالتالي لا يمكن تطبيقها على الأنسجة الحية. الأهم من ذلك، يمكن أيضا أن يكون تنظيم على الأنسجة الحية تحت مجهر تشريح من خلال الاستفادة من أنماط امتصاص الضوء /مبعثر متميزة التي تظهرها مراحل مختلفة من الدورة(الشكل 2). قدرة كل مرحلة على امتصاص وتشتت الضوء هو نسبة إلى مستوى التكثيف كروماتين من الحيوانات المنوية في وقت متأخر بعد الظهارية أن أي مرحلة معينة تستضيف وتعبئة هذه الخلايا في حزم7,11. تمايز الحيوانات المنوية، أيتكوين الحيوانات المنوية، وينقسم إلى 16 خطوة تنموية، بما في ذلك 8 خطوات من الحيوانات المنوية المستديرة (الخطوة 1-8) و8 خطوات من الحيوانات المنوية الممدود (الخطوات 9-16) التمايز(الشكل 1). الخطوة 9-11 ممدود الحيوانات المنوية (المرحلة التاسعة الحادية عشرة) عرض مستوى منخفض فقط من التكثيف الكروماتين مما أدى إلى كمية منخفضة من الضوء يجري امتصاصها. يبدأ تكثيف كروماتين في الخطوة 11 spermatids (المرحلة الحادية عشرة)، والخطوة 15-16 ممدود الحيوانات المنوية (المرحلة الرابعة-الثامنة) تحتوي على الكروماتين المكثفة بالكامل، وبالتالي يحمل امتصاص الضوء الأقصى(الشكل 3). الكروماتين يحتاج إلى أن يكون مكثفا من أجل أن تكون معبأة بإحكام في رأس الحيوانات المنوية. العوامل الإضافية التي تسهم في نمط امتصاص الضوء هي موقع الحيوانات المنوية الممدود داخل الظهارة (القاعدية مقابل apical) وتجميع الحيوانات المنوية الممدود (وضوحا في المراحل الثانية- V)11 (الشكل 3). وينظر إلى حزم والبقع في منتصف الأنابيب والمشارب على حواف تحت مجهر تشريح وأكثر مكثف الكروماتين، قتامة بقعة / شريط11.

توضح هذه المقالة استخدام طريقة microdissection بمساعدة transillumination لعزل شرائح أنبوبية شبهiferous تمثل مراحل محددة من دورة الظهارية seminiferous. مرة واحدة معزولة، يمكن أن تخضع قطاعات أنبوبي مراحل لمختلف التحليلات المصب، بما في ذلك الحمض النووي الحيوي وتحليلات البروتين12،13،14،15، تدفق cytometry16، السابقين فيفو tubule الثقافة17 والمناعة18. هنا نقدم أيضا بروتوكولات مفصلة المصب لإعداد أحادية الطبقات المسحقة من شرائح الأنابيب مراحل لتحليل الخلايا الحية والمناعة اللاحقة، فضلا عن مناعة كاملة جبل من شرائح tubule. سير العمل في باختصار في وصفها في الشكل 4.

تسمح طريقة التشخيص المجهري بمساعدة الترانسيلومين بالتعريف الدقيق وعزل الخلايا الجرثومية في خطوات محددة من التمايز بفضل التركيب الخلوي المتزامن للمراحل. الأهم من ذلك، فإنه يتيح أيضا دراسة الأحداث التي تعتمد على مرحلة خلال تكوين الحيوانات المنوية على الأنسجة الحية. ونظرا لعدم وجود نماذج قابلة للتطوير في المختبر لـ spermatogenesis، وهذا الأسلوب أيضا ميزة فريدة من نوعها للسماح المستهدفة دراسات النمو والسمية على مراحل المرحلة محددة الأنابيب قطاعات السابقين vivo12،17. بينما نحن وصف الأسلوب هنا للفأر، يمكن تطبيق نفس الإجراء على أي أنواع الثدييات مع ترتيب طولي وجزئي من المراحل الظهارية شبه المائلة، مثل الفئران4،7،15،19،20.

Protocol

تمت صيانة فئران المختبرات وجميع التجارب على الحيوانات وفقًا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة لرعاية واستخدام المختبرات في جامعة توركو.

1. إعداد الأنابيب seminiferous للميكروفيسيكشن

  1. التضحية الماوس الذكور الكبار (≥8 أسابيع من العمر, الخصية 80-120 ملغ اعتمادا على سلالة والعمر) عن طريق CO2 الاختناق تليها خلع عنق الرحم.
    ملاحظة: يجب أن يكون الماوس ناضجًا جنسيًا ، ويفضل أن يكون عمره 8 أسابيع على الأقل. يختلف نمط الترانسيليومين للفئران اليافعة عن البالغين لأن موجة الظهارة شبه المنيفيرة لم يتم إنشاؤها بالكامل بعد ، وتوقيت الموجة الأولى من تكوين الحيوانات المنوية متميز21،22. عدم وجود الحيوانات المنوية الممدود في < 4 أسابيع من الفئران الذكور يمنع استخدامها لmicrodissection بمساعدة transillumination. يمكن استخدام جميع سلالات الماوس التي تحتوي على تكوين الحيوانات المنوية الطبيعي.
  2. رش البطن البطني مع 70٪ الإيثانول. فتح تجويف abdominopelvic باستخدام مقص معقمة، مما يجعل فتح على شكل حرف V.
  3. سحب على وسادة الدهون epididymal مع ملقط العقيمة، وتحديد موقع الخصيات، وتشريح لهم باستخدام مقص ووضعها على طبق بيتري عقيمة 100 مم التي تحتوي على برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: للحفاظ على العقم، تأكد من أن جميع أدوات اللبوت والأدوات الجراحية معقمة.
  4. باستخدام مقص ناعم الرؤوس قطع الخصيات عن طريق قطع شق في albuginea tunica، ورقة ليفية سميكة تغليف الخصية. ثم المسيل للدموع tunica فتح باستخدام زوج من ملقط. قوة الأنابيب من خلال الضغط مع ملقط والتخلص من tunica.
    ملاحظة: أثناء التخلص من التونيكا، قد يكون من المفيد لبعض التطبيقات المصب أن تتم إزالة الخصية الشريانية جنبا إلى جنب مع tunica. تجنب إتلاف الأنابيب شبهiferous.
  5. نقل الأنابيب seminiferous إلى طبق بيتري جديد وصب ما يكفي من برنامج تلفزيوني عقيم لتغطية الجزء السفلي من طبق بيتري. بعد ذلك، اسحب الأنابيب بعيدًا عن بعضها البعض بلطف ولكن تجنب إتلاف الأنابيب.
    ملاحظة: سوف يؤثر الكثير من الإجهاد الميكانيكي على نمط الترانسيلومين ويؤثر على صلاحية الأنسجة وهندستها الخلوية. ويمكن أيضا أن تكون معالجة الأنابيب لكامل جبل المنادونات من هذه النقطة دون التدريج (3B). في بعض الأحيان يكفي لتحديد المرحلة بأثر رجعي عن طريق تضمين الأجسام المضادة ضد البروتينات التي أعرب عنها في تمييز الحيوانات المنوية، مثل SALL4، ج-كيت وDNMT3A18،23. كثافة الحيوانات المنوية هو مؤشر المرحلة موثوق نسبيا (الشكل 2).

2- الميكرويسيرات بمساعدة الترانسيلومين

  1. ضع طبق بيتري تحت مجهر تشريح بقوة عن طريق تسجيله على المسرح.
    ملاحظة: من المهم أن الشريط طبق بيتري جيدا لمنع حركتها التي يمكن أن تسبب خلط شرائح الأنابيب seminiferous نظمت.
  2. للكشف عن نمط امتصاص الضوء من الأنابيب شبهiferous تحت التركيز، تأكد من أن يتم مضيئة العينة من أسفل والضوء يمر من خلال العينة، أي،هو transilluminated.
    ملاحظة: كمية الضوء الممتص / المبعثرة هي نسبة إلى مستوى التكثيف الكروماتين في المطيّع الحيوانات المنوية وتجميعها داخل أنبوب شبهي: كلما كان أكثر تكثيفًا، كلما تم امتصاص المزيد من الضوء، أي،يظهر أكثر قتامة.
  3. التعرف على نمط امتصاص الضوء من مراحل مختلفة كما هو موضح في الشكل 2، الشكل 5A والشكل S1 عن طريق نقل حزم بعناية من الأنابيب باستخدام ملقط غرامة.
    ملاحظة: المراحل دائما تتبع بعضها البعض في ترتيب منطقي، وتشكيل موجة من ظهارة شبهiferous. ومع ذلك، من المهم أن نعرف أن اتجاه موجة spermatogenic أحيانا عكس ثم يعود مرة أخرى (المعروف أيضا باسم التشكيلات4،9)، تعقيد أحيانا الإجراء. كما أن طول كل مرحلة، من حيث عدد مم من الأنابيب، يختلف اختلافا كبيرا.
  4. رفع بعناية أنبوب الفائدة باستخدام ملقط مع طرف مدمن مخدرات، ثم قطع قطعة من طول مناسب باستخدام مقص microdissection (انظر فيديو التكميلية 1). ربط في غيض من ملقط يجعل رفع وعقد أنبوب أسهل ويساعد على تجنب الضغط عليه.
    ملاحظة: طول القطع التي سيتم قص يعتمد على التطبيقات المتلقين للمعلومات. لجمع قطع الأنابيب المجمعة من مرحلة محددة لتحليل البروتين أو الحمض النووي الريبي12،13 (الثاني - الخامس ، VII - VIII و التاسعة الحادية عشرة ، الشكل 5B)الطول عادة 2-5 ملم. عندما يتم استخدام استخراج الفينول الكلوروفورم القياسي، يمكن أن تستمد حوالي 200 نانوغرام من الحمض النووي الريبي من 1 مم من أنبوب. بالنسبة لتلوين كامل من أجزاء أنبوبية مرحلية، يجب أن يكون طول الأجزاء > 5 مم. بالنسبة لتحضيرات الاسكواش، يجب ألا يتجاوز طول الأجزاء 1-2 مم لأن الخلايا في منتصف الجزء قد تفشل في الخروج إذا كانت طويلة جداً. استخدم مقياس مم تحت طبق بيتري لقياس دقيق لطول الأنبوب.

3- الكبت المناعي لمختلف الاستعدادات

  1. إعداد الاسكواش: التحقق من المرحلة واحتواء المناعة
    ملاحظة: يمكن سحق قطع الأنابيب الخاصة بالمرحلة على شريحة مجهرية مع غطاء زجاجي لإجراء التحليل المورفولوجي للخلايا الحية عن طريق المجهر على النقيض من المرحلة ومناعة المناعة اللاحقة. ويوصى مبتدئا لاستخدام هذا النهج للتحقق من المراحل عند التعرف على طريقة microdissection بمساعدة transillumination.
    1. جمع الجزء في حجم 10 ميكرولتر باستخدام ماصة ونقلها على شريحة المجهر.
    2. الاسكواش أنبوب عن طريق وضع غطاء الزجاج (20 مم × 20 مم) بعناية على أنبوب. ونتيجة لذلك، سوف تتدفق الخلايا خارج الأنبوب وتشكل أحادية الخلية الحية. ضع ورقة تصفية على حافة غطاء الزجاج لتسهيل انتشار الخلايا. تجنب سحق الخلايا أكثر من اللازم للحفاظ على قيد الحياة.
    3. مراقبة الخلايا المنتشرة تحت المجهر. استخدام المجهر على النقيض من المرحلة في الهدف 40x للتحقق من التعرف على المرحلة من خلال فحص أنواع الخلايا الموجودة(الشكل 2، الشكل S2).
    4. مرة واحدة قد انتشرت الخلايا لتشكيل أحادية مستديرة من طرفي الأنبوب، تراجع الشريحة في حاوية تحتوي على النيتروجين السائل في حين عقد مع ملقط. يبقيه مغمورة لمدة 10 s. بدلا من ذلك وضع الشريحة على لوحة الجليد الجاف لتجميد.
    5. إزالة غطاء الزجاج عن طريق التقليب تشغيله باستخدام مشرط.
    6. دون تأخير، والمضي قدما في التثبيت ووضع الشريحة بسرعة في وعاء مع 90٪ الإيثانول لمدة 2-5 دقيقة.
      ملاحظة: تأكد من أن إعداد الاسكواش لا يذوب قبل وضعه على 90٪ الإيثانول. ويمكن أيضا أن تكون غيرها من المثبتات المستخدمة، مثل الأسيتون، لمدة 10 دقيقة.
    7. الهواء الجاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT) (حتى بعض الأيام) أو في -80 درجة مئوية (على المدى الطويل).
    8. بالنسبة للمناعة، بعد إصلاح العينات في 4٪ شبه شكلي (PFA) لمدة 10 دقائق في RT.
    9. شطف في برنامج تلفزيوني و permeabilize مع 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    10. شطف في برنامج تلفزيوني ورسم حلقة الشحوم حول كل عينة الاسكواش.
    11. إضافة 50-100 μL من 10٪ BSA (بولين المصل البوم) في 0.1٪ توين في PBS (PBST) داخل حلقة الشحوم وعينات كتلة لمدة 30 دقيقة في RT.
    12. إزالة حل BSA واحتضان مع جسم مضاد الأولية المخفف في 10٪ BSA في PBST لمدة 1 ساعة في RT.
    13. غسل 3x لمدة 5 دقائق مع PBST.
    14. احتضان مع جسم مضاد ثانوي مخفف في 10٪ BSA في PBST.
      ملاحظة: لطخة acrosomes، يمكن أن تكون حضنت العينات مع رودامين المسمى agglutinin الأجسام المضادة (السلطة الوطنية الفلسطينية، 1:1000) في 10٪ BSA في PBST لمدة 1 ساعة في RT(الشكل S3)بدلا من الأجسام المضادة الأولية والثانوية محددة.
    15. غسل 3x لمدة 5 دقائق كل مع PBST، شطف مع برنامج تلفزيوني وجبل مع mountant تحتوي على DAPI.
  2. كامل جبل من مناعة الأنابيب شبهiferous
    ملاحظة: يصف البروتوكول أدناه تلوين كامل التحميل لشرائح الأنبوبة المرحلية (من الخطوة 2.4). إذا كان الباحث يريد أن يؤدي تلطيخ كامل دون التدريج (من الخطوة 1.5) ، وإيلاء الاهتمام للملاحظات في 3.2.1 و 3.2.7.
    1. باستخدام ماصة، نقل شرائح الأنابيب (من الخطوة 2.4) في PBS الجليد البارد إلى أنبوب مخروطي 15 مل والسماح لهم إلى الرواسب على الجليد.
      ملاحظة: إذا كان استخدام الأنابيب غيرstageed من 1.5.، فصل الأنابيب في طبق بيتري عن طريق الأنابيب صعودا والعودة إلى طبق مائلة عدة مرات. استخدام ماصة 1 مل مع تلميح قطع. وتهدف هذه الخطوة لفتح هيكل الأنسجة. ومع ذلك، تجنب الكثير من الأنابيب لأنها قد تضر الأنابيب. سوف ترسب الأنابيب يستغرق بضع عشرات من الثواني. تبقى شظايا الأنبوب الصغيرة والخلايا الخلالية ومخلفات الخلايا في المُنطَع.
    2. إزالة بعناية عظمى (SN) عن طريق الأنابيب أو مع pirator. إضافة 10 مل من الجليد البارد برنامج تلفزيوني ومزيج من الانقلاب.
    3. السماح للرواسب ثم إزالة SN كما كان من قبل.
    4. أضف 5 مل من 4٪ PFA، ثم قم بإصلاح 5 ساعات على طاولة دوارة (20-30 دورة في الدقيقة) عند +4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يعتمد وقت التثبيت على البروتينات ذات الاهتمام وتوطينها دون الخلوي. بالنسبة للبروتينات النووية والسيكتوبلازمية، يكون التثبيت 2 ح كافياً عادة، ومع ذلك، علامات الغشاء، مثل GFRα1 (مستقبلات الأسرة GDNF ألفا 1؛ الشكل 6A, B),الاستفادة من تثبيت أطول, تصل إلى 6 ح.
    5. السماح للرواسب، وإزالة SN (PFA) كما كان من قبل، وشطف لفترة وجيزة عن طريق إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني وعكس الأنبوب.
    6. السماح للرواسب، وإزالة SN كما كان من قبل، وتكرار خطوة غسل برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة على الأقل كل على طاولة دوارة في +4 درجة مئوية والمضي قدما مع تلطيخ أو تخزين في +4 درجة مئوية.
      ملاحظة: إذا كانت ظروف العمل معقمة وتنظيف العينات يمكن تخزينها واستخدامها على الأقل بعض الأسابيع. بدلا من ذلك، إضافة الصوديوم Azide إلى تركيز النهائي من 0.02٪ (ث / الخامس) من محلول الأسهم 2٪ للمساعدة في الحفاظ على الأنابيب قبل تخزينها في +4 درجة مئوية.
    7. باستخدام ماصة 1 مل، نقل 10-20 شرائح أنبوب ثابت إلى أنبوب 2-مل الجولة القاع. السماح للرواسب وإزالة SN.
      ملاحظة: إذا كان العمل مع أنابيب طويلة التي لم يتم تنظيمها، صب الأنابيب على طبق بيتري واستخدام مقص microdissection وقطع ملقط شرائح من حوالي 5-20 ملم. سوف تشابك شرائح طويلة جدا خلال عملية تلطيخ، في حين يتم فقدان أجزاء قصيرة جدا بسهولة.
    8. إضافة 1 مل من 2٪ BSA + 10٪ FBS (مصل الأبقار الجنين) في 0.3٪ تريتون X-100 في PBS (PBSX). كتلة لمدة 1 ساعة على الأقل على طاولة الدورية (20-30 دورة في الدقيقة) في RT.
    9. شطف مع 1 مل من PBSX، وإزالة SN عن طريق الأنابيب وإضافة 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في 1٪ BSA في PBSX (1:100-1:2000 تخفيف). احتضان لمدة 2 ساعة في RT أو بين عشية وضحاها في +4 درجة مئوية على طاولة الدورية (20-30 دورة في الدقيقة).
    10. إزالة حل الأجسام المضادة عن طريق pipetting وشطف الأنابيب مع 1 مل من برنامج تلفزيوني على النحو الوارد أعلاه. اغسل ثلاث مرات لمدة 1 ساعة في PBSX على طاولة دوارة (20-30 دورة في الدقيقة) في RT.
      ملاحظة: بعد هذا أول غسل يمكن ترك العينة بين عشية وضحاها في +4 درجة مئوية إذا لزم الأمر.
    11. إزالة SN وإضافة 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 1٪ BSA في PBSX (عادة 1:500 تخفيف الأجسام المضادة الفلورية المسمى). يُغطّى المزيج في رقائق ورقائق على طاولة دوارة (20-30 لفة في الدقيقة) في RT لمدة ساعة.
    12. كرر 3.2.10.
    13. وأخيرا إزالة SN وصب الأنابيب إلى شريحة المجهر. فصل بلطف وترتيب الأنابيب في شرائط خطية باستخدام نصائح هلام التحميل. استنزاف قبالة العازلة الزائدة وإضافة متوسطة التركيب و coverlip.
      ملاحظة: تجنب تجفيف الأنابيب أثناء ترتيبها. إن مضادة تلطيخ النوى مع DAPI ليس ضروريًا في معظم الحالات. اغلق حافة الغطاء بتلميع الأظافر لمنع تجفيف العينات وتدهورها. يمكن تخزين الشرائح لمدة 1-2 أسابيع في +4 درجة مئوية قبل التصوير.

Representative Results

نجاح التدريج بمساعدة transillumination وmicrodissection من الأنابيب الماوس seminiferous يعتمد في المقام الأول على إيجاد ظروف الإضاءة المناسبة والمجهر تشريح مناسبة، والقدرة على التعرف على الميزات المحددة التي تميز كل مرحلة. تظهر المراحل السابعة والثامنة داكنة بشكل متجانس لأنها تحتوي على عدد كبير من الحيوانات المنوية الممدودة المكثفة بالكامل التي تتماشى مع السطح الزاوي للظهارة (الشكل 5A والشكل S1). بعد أن يتم إطلاق الحيوانات المنوية الناضجة في تجويف في الحيوانات المنوية، يبدو أن tubule شاحب جدا في المراحل التاسعة الحادية عشرة بسبب عدم وجود الحيوانات المنوية الممدود مكثف في ظهارة. أسهل ميزة لتحديد على الأنابيب عبر أنابيب هو نقطة من الحيوانات المنوية (النجمة في الشكل 5A والشكل S1)، وهذا هو الانتقال المفاجئ من المنطقة المظلمة (السابع- الثامن) إلى المنطقة شاحب (التاسعة الحادية عشرة). متبوعة المنطقة شاحبة من قبل منطقة ضعف بقعة (الثاني عشر-I). المظهر متقطع ينشأ من تنظيم الحيوانات المنوية الممدود مع الكروماتين المكثف في حزم. حزم تصبح بارزة جدا في منطقة بقعة قوية التالية (الثاني الخامس). وعلاوة على ذلك، حزم الحيوانات المنوية تهاجر نحو نواة الخلية سيرتولي التي تقع بالقرب من لامينا القاعدية، والتي تنعكس كمظهر مخطط من المرحلة الثانية-الخامس tubule عندما transilluminated(الشكل 2، الشكل 5A، B والشكل S1). حزم تفريق أخيرا في المرحلة السادسة وتكثيف الحيوانات المنوية الممدود تتحرك على مقربة من التجويف ليتم الافراج عنهم من ظهارة في المرحلة الثامنة.

يمكن التحقق بدقة من المرحلة الدقيقة من الجزء tubule عن طريق المجهر على النقيض من مرحلة من التحضيرات الاسكواش(الشكل 2 والشكل S2). يتم التعرف على مراحل محددة في تحضيرات الاسكواش على أساس التطور الأكروزوم للخطوة 1-8 جولة الحيوانات المنوية، وحالة التكثيف الكروماتين في الحيوانات المنوية الممدود، ووجود حزم الحيوانات المنوية16 (الشكل 3 و S2 الشكل). وعلاوة على ذلك، فإن وجود أنواع الخلايا في وقت سابق، مثل نوع B الحيوانات المنوية واللبيتوتين أو zygotene الحيوانات المنوية، التي يمكن التعرف عليها على أساس ميزاتها المورفولوجية، يمكن استخدامها لدعم الاعتراف المرحلة. يزيد حجم نيوية الحيوانات المنوية الباتيني في الحجم في حوالي المرحلة السادسة ، والتي قد توفر أيضًا مساعدة إضافية في التدريج.

يمكن استخدام تحضيرات الاسكواش المرحلية لدراسة التعبير عن وتوطين البروتينات ذات الاهتمام في ظهارة شبهية باستخدام المناعة. وهذا يسمح بتحليل دقيق جداً لعبارة نوع الخلية بسبب التكوين الخلوي المحدد جيداً في كل مرحلة. يمكن زيادة التعبير الخاص بالمرحلة بزيادة تلوين المُكرّس(مثلالسلطة الوطنية الفلسطينية) الذي يمكّن من رؤية خطوات متميزة من التمايز الدائري للحيوانات المنوية. يتم توفير صور تمثيلية من acrosomes ملطخة PNA في مراحل مختلفة في الشكل S3. ويمكن أيضا أن تستخدم تلطيخ acrosomal لتحديد المرحلة بأثر رجعي. ومع ذلك، التدريج بمساعدة transillumination هو طريقة أسهل وأسرع بكثير للعثور على المرحلة المطلوبة من استخدام شظايا غير مرحل بطريقة عشوائية.

وعادة ما يستخدم سيمينيرول أنبوب كامل جبل تلطيخ لدراسة أنواع الخلايا التي هي على اتصال مع غشاء الطابق السفلي من ظهارة سينيفيروس, إما على الجانب أنبوبي (spermatogonia, الحيوانات المنوية قبل اللبداتين وخلايا سيرتولي; الشكل 6A, B) أو الجانب الخلالي (الخلايا العضلية المتزنة و الضامة المتينة؛ الشكل 6C والشكل S4A)24. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم طريقة لدراسة الخلايا أو الهياكل التي تقع أعمق في ظهارة، مثل حاجز الخصية الدم (إسبين، الشكل S4B)،أو الخلايا الجرثومية بعد ذلك (Acrosome علامة السلطة الوطنية الفلسطينية، الشكل S4C). إذا كان استخدام شرائح الأنبوب غير المراحل، فمن الممكن لتقدير مرحلة معينة بأثر رجعي باستخدام جسم مضاد ضد البروتين الذي يعبر عنه في تمييز spermatogonia (A1، A2، A3، A4، في وباء؛ مجتمعة Adiff) (الشكل 2). التدريج ثم يعتمد على كثافة التزامنيةأ فرق التي تخضع لستة الانقسامات mitotic بطريقة المرحلة تعتمد خلال الدورة الأولى من التمايز spermatogenic1, وبالتالي مضاعفة عدد من الحيوانات المنويةمختلفة في تزامن بعد كل شعبة1,25. ومع ذلك، التدريج بأثر رجعي أقل دقة من التدريج بمساعدة transillumination لأنه لا توجد علامات محددة لأجيال متميزة منفرق وتقييم كثافةمختلفة قد تكون عرضة للخطأ.

Figure 1
الشكل 1: خريطة دورة الظهارية شبه المائلة لالتدريج من الحيوانات المنوية الماوس. تُظهر الأعمدة العمودية اقترانات الخلايا في مراحل مختلفة من الدورة الظهارية شبه المائلة (مع وضع علامة على الأرقام الرومانية من الأول إلى الثاني عشر). الخلايا الجرثومية الأكثر غير ناضجة هي في القاع، في حين أن الأكثر تميزا هي في الجزء العلوي. لمتابعة التقدم في تمايز الخلايا الجرثومية ، يجب على المرء أن ينتقل من اليسار إلى اليمين ، ومن الأسفل إلى الأعلى. دورة من ظهارة شبهiferous هي سلسلة كاملة من المراحل التي تتبع بعضها البعض في ترتيب عددي. غيرمتمايزة, الحيوانات المنوية غير المتمايزة; A1-4, نوع A1- A4 الحيوانات المنوية; في, السائل المنوي وسيطة; B, نوع B spermatogonia; Pl, ما قبل اللببتين المنوية; L, اللبتوتين المنوية; Z, zygotene الحيوانات المنوية; P, pachytene الحيوانات المنوية; D, ثنائي الدمى الحيوانات المنوية; 2 درجة، والحيوانات المنوية الثانوية بالإضافة إلى الانقسامات الميوتيك. تشير الأرقام العربية 1-16 إلى خطوات نضج الحيوانات المنوية بعد الوميائية (تكوين الحيوانات المنوية). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: اقترانات الخلايا على مراحل دورة الظهارية الظهارية الفئية الماوس. مراحل دورة الظهارية شبه المائلة تتبع بعضها البعض في ترتيب منطقي، وبالتالي تشكل موجة الحيوانات المنوية على طول المحور الطولي من أنبوب شبهي. توضح اللوحة العليا روابط الخلايا الجرثومية في مراحل مختلفة ، وموقع أنواع الخلايا داخل جيوب السيتوبلازمية لخلايا سيرتولي (الرمادي الفاتح) في الظهارة شبهiferous. الرسم التوضيحي للحوض شبه المنيفير يتصوّر موجة الحيوانات المنوية وأنماط تنقان محددة من البقعة الشاحبة والضعيفة والبقعة القوية والمناطق المظلمة. من كل مرحلة المشار إليها، تظهر الممثلة الخلية الحية على النقيض من الاستعدادات الاسكواش والأحماض -شيف (PAS) الملون ال testis المقاطع العرضية. يعرض اللوحان السفليان أجزاء من أنبوب نصفي بعد الترانميلومي (أعلى) أو تلطيخ بالأجسام المضادة (أسفل) ضد SALL4 (أحمر، علامة لعموم الحيوانات المنوية) وDNMT3A (الأخضر، علامةفرق). يتم تسليط الضوء على أنماط الترانسيلوم للمراحل التاسعة إلى الحادية عشرة والثانية عشرة والسادسة مع مناطق محاصر. يمكن استخدام كل من نمط امتصاص الضوء (أعلى) وكثافة من الحيوانات المنوية (السفلي) التمييزية الإيجابية DNMT3A لتحديد المرحلة (التقريبية) من دورة شبهيفيروس. يشار إلى الأجيال المتعاقبة منفرق A كنوع A1- A4، وسيطة (في) ونوع B spermatogonia. تقسيم كل النتائج في مضاعفة كثافة الخلايا المنوية. أعلى كثافة الخلية على غشاء الطابق السفلي من ظهارة شبهiferous وينظر في المراحل السادسة والثامنة عندما لوحظت الحيوانات المنوية قبل اللبث (Pl). أشرطة مقياس: الاسكواش الإعدادية. 10 μm، والبعض الآخر 50μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: خطوات تكوين الحيوانات المنوية. ميزات مميزة من الحيوانات المنوية في خطوات مختلفة من تكوين الحيوانات المنوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: سير عمل هذه الدراسة. تم تأسيس نمط Transillumination بشكل كامل في الماوس الكبار (> 8 أسابيع) الماوس. التضحية بالماوس والمضي قدما مع تشريح الخصية وتفكك دون تأخير. سحب بلطف الأنابيب وبصرف النظر على طبق بيتري. إصلاح الأنابيب لتلوين كامل جبل أو المضي قدما مع transillumination. تحت transillumination 1) قطع شرائح أنبوب قصيرة من مرحلة محددة (ق) لإعدادات الاسكواش (مراقبة الجودة أو لمناعة) أو 2) قطع أطول شرائح لجمع برك المرحلة لتحليلات الحمض النووي الريبي والبروتوميات، واستزراع الأنسجة أو لتلوينات جبل كامل. نقل شرائح أنابيب قصيرة إلى شريحة المجهر في 10 ميكرولتر حجم برنامج تلفزيوني. ضع زلة غطاء على الجزء لإجبار الخلايا وتشكيل أحادية الخلية الحية. مراقبة أنواع الخلايا تحت المجهر، ثم إصلاح وصمة عار. WMS، تلطيخ كامل جبل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: أنبوب سيمنيروس من فأر بالغ كما هو موضح تحت المجهر الترانسيليمين. (A) جزء طويل من أنبوب أشباهي كما رأينا تحت الترانسيوملين عرض موجة من ظهارة seminiferous. يمكن تحديد أربع مناطق متميزة على أساس ضغط الكروماتين في الحيوانات المنوية وتوطينها داخل الظهارة: المنطقة المظلمة (المراحل من السابع إلى الثامن)، والمنطقة الشاحبة (المراحل التاسعة -الحادية عشرة)، ومنطقة البقعة الضعيفة (المراحل الثانية عشرة- الأولى)، ومنطقة البقعة القوية (المراحل الثانية إلى السادسة). النجمة، نقطة الحيوانات المنوية. تشير الأسهم إلى جزأين قصيرين داخل منطقة البقعة الضعيفة التي لها مظهر شاحب بسبب الإجهاد الميكانيكي على الأنبوب. شريط مقياس: 500 μm. Insets 1-5 هي تكبيرات أعلى من شرائح أنبوب مختارة. (ب) أجزاء مجمعة من أنبوب نصفي يمثل المراحل الثانية والخامسة (منطقة بقعة قوية)، من السابع إلى الثامن (المنطقة المظلمة) والتاسع -الحادي عشر (منطقة باهتة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: مناعة كاملة التركيب باستخدام الحيوانات المنوية، خلية سيرتولي وعلامات الضامة العضية. (A) تلطيخ كامل جبل لشريحة تمثل المرحلة الحادي عشر - الثاني مع الأجسام المضادة ضد GFRα1 (الأحمر) ، SALL4 (الأخضر) وDNMT3B (الأزرق). البقع يكشف عن ثلاثة مجموعات متميزة من spermatogonia: معزولة منفردة(ق)أو الاقتران (Aالعلاقات العامة)الحيوانات المنوية الجذعية غير المتمايزة (GFRα1+/ SALL4+/ DNMT3B-؛ المناطق البيضاء المنقطة), التزامني قصير (هنا 4 محاذاة الخلايا; a al4) سلف الحيوانات المنوية (GFRα1-/SALL4+/ DNMT3B-؛ المناطق الصفراء المنقطة) وتمييز الحيوانات المنوية (GFRα1-/ SALL4+/ DNMT3B+). SALL4+/DNMT3B+ الخلايا هي نوع A3 -A4 الحيوانات المنوية. (ب) أنبوب سيمنيفيروسي كامل جبل تلطيخ مع الأجسام المضادة ضد GFRα1 (الأحمر)، USF1 (الأخضر) وSSX9 (الأزرق). GFRα1 يلطخ مجموعة فرعية الجذعية من الحيوانات المنوية. USF1 هو التعبير عن كل من spermatogonia وSSX9+ Sertoli الخلايا. (C) الضامة الطرفية في الفئران الكبار إيجابية لكل من F4/80 (الأحمر) و MHCII (الأزرق). DAPI بقع الحمض النووي (الأخضر). النوى الكبيرة الساطعة هي نواة الخلية myoid peritubular. قضبان المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل S1: جزء طويل من أنبوب نصفي كما رأينا تحت الترانويلوميلين عرض موجة من ظهارة seminiferous. يمكن تحديد أربع مناطق متميزة على أساس ضغط الكروماتين في الحيوانات المنوية وتوطينها داخل الظهارة: منطقة بقعة ضعيفة (المراحل الثانية عشرة- الأولى)، منطقة بقعة قوية (المراحل الثانية إلى السادسة)، المنطقة المظلمة (المراحل السابعة إلى الثامنة)، والمنطقة الشاحبة (المراحل التاسعة -الحادية عشرة). يمكن التعرف على نقطة الحيوانات المنوية (العلامة النجمية) حيث أن المنطقة المظلمة تنتقل فجأة إلى المنطقة الشاحبة. شريط مقياس: 500 μm. Insets 1-4 هي تكبير أعلى من شرائح أنبوب مختارة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل S2: المجهر على النقيض من المرحلة من أحادية الخلية الحية من مراحل مختلفة من دورة الظهارية شبه المائلة. (أ)المرحلة الأولى. الخطوة 1 جولة الحيوانات المنوية لا تزال تفتقر إلى هيكل acrosomal. وهي تتميز نواة مستديرة صغيرة (دوائر حمراء) مع chromocenter واحد مميز (السهام البيضاء). الجسم الكروماتويد مرئي في السيتوبلازم كحبيبة داكنة في اتصال وثيق مع الغشاء النووي (السهام الزرقاء). نواة خلية سيرتولي (دائرة بيضاء) تحتوي على ثلاث بؤر داكنة: نواة كبيرة مع اثنين من chromocenters الأقمار الصناعية. يتم رؤية خلايا سيرتولي في تحضيرات الاسكواش ولكنها تتدفق أحيانًا من الأنبوب مع الخلايا الجرثومية. (ب) المرحلة الثانية - الرابعة. في الخطوة 4 جولة الحيوانات المنوية (الدوائر الحمراء)، والبنية acrosomal (السهام الحمراء) يظهر كهياء أبيض بالارض قليلا تعلق على المغلف النووي. تُشكل الحيوانات المنوية الممدود حزمًا ولها بالفعل علام سميك (أسهم بيضاء) تشير إلى وجود مغمد الميتوكوندريا في منتصف قطعة ذيل الحيوانات المنوية. نواة من الحيوانات المنوية pachytene (PSpc) هي تقريبا ضعف تلك الحيوانات المنوية جولة وتتميز مناطق الكروماتين الظلام موزعة في جميع أنحاء النواة. (C) المرحلة V-VI. في الخطوة 5-6 جولة الحيوانات المنوية (دائرة حمراء)، هو مزيد من بالارض acrosome وينتشر على النواة (السهام الحمراء). وتبدو منطقة الغلاف النووي التي تواجه الأكركسوم مظلمة بسبب وجود الأكروبلاككوم، وهي لوحة غنية بالبروتين بين الغشاء الأكروزوم والغشاء النووي. يتم تحرير الحيوانات المنوية الممدود من حزم (السهام البيضاء). وكثيرا ما لوحظت الحيوانات المنوية Pachytene (PSpc) في ظهارة. (د)المرحلة السابعة إلى الثامنة. و acrosome (السهام الحمراء) ، وبطانة داكنة على المغلف النووي مع الظلال البيضاء ، وتمديدها بالكامل ويغطي تقريبا الجانب الكامل من المنوية الخطوة 7-8 جولة (الدوائر الحمراء). تتميز هذه المرحلة بالحيوانات المنوية الناضجة (السهام البيضاء) التي قد تكون وفيرة على أجزاء كثيرة من إعداد الاسكواش. نواة الحيوانات المنوية pachytene (PSpc) ينمو في الحجم أثناء التنمية وتظهر أكبر في المرحلة السابعة والثامنة مما كانت عليه في المراحل السابقة. المناطق الكروماتين الظلام داخل نواة الحيوانات المنوية pachytene (PSpc) تظهر غامض بسبب نشاط النسخ العالي والأحداث meiotic. (E)المرحلة X. الخطوة 10 النوى المنوية (السهام البيضاء) قد بدأت استطالة ولكن لم يكدح الكروماتين بعد. Acrosomes بدء تشكيل هوك في الطرف النووي (السهم الأحمر). نواة من الحيوانات المنوية pachytene (PSpc) تبدو كبيرة جدا لأنها تستعد للانقسامات meiotic. (واو)المرحلة الثانية عشرة. تتميز المرحلة الثانية عشرة بوجود ألواح ميتايوتيك (دوائر بيضاء متقطعة). الخلايا المستديرة الصغيرة ذات نمط الكروماتين المكثف النموذجي هي zygotene spermatocytes (ZSpc) ، حيث محاذاة الكروموسومات الشقيقة لبدء تشكيل معقد متشابك. قضبان مقياس: 10 μm. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل S3: تحديد مرحلة الدورة الظهارية شبه المائلة على أساس التلطيخ الأكروزومية والنووية. كانت تحضيرات الاسكواش الثابتة الأسيتون ملطخة مع رودامين مترافق السلطة الوطنية الفلسطينية وDAPI. المرحلة الأولى: في حين لا يوجد acrosome في الخطوة 1 جولة spermatids يمكن الكشف عن أكروبسوم متطورة بالكامل في الحيوانات المنوية الممدود. المراحل الثانية -الرابعة: يبدأ التطور الأرسومومي بظهور حبيبات البروسومات في الحيوانات المنوية المستديرة. الحويسوس على السطح النووي يظهر جولة حتى الخطوة 3 spermatids، ومن ثم يسطح في الخطوة 4 spermatids. المرحلة الخامسة: الزاوية التي تُدرجها الأكرونة تمتد من 40 درجة إلى 95 درجة كحد أقصى. المراحل السادسة - السابعة: الزاوية التي يُدرجها الأكرونة تمتد من 95 درجة إلى 120 درجة. مراحل الثامن التاسع: يتم تمديد تماما في acrosome الخطوة 8 الحيوانات المنوية (المرحلة الثامنة)، واستقطاب نوى على الجانب apical من الخلية مما يجعل الاتصال مع غشاء البلازما (لا يظهر). من قبل المرحلة التاسعة تصبح نواة الحيوانات المنوية مشوهة. وينظر لأول مرة السطوح الظهرية والبطينية. المراحل X-الحادي عشر: تظهر الحيوانات المنوية الزاوية الظهرية. المرحلة الثانية عشرة: تتميز هذه المرحلة على أفضل نحو بظهور الانقسامات الويمية؛ يشار إلى لوحات metaphase مع السهام البيضاء. كما ينظر إلى الحيوانات المنوية الممدود مع أكروبسومات. قضبان مقياس: 10μm. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل S4: تلطيخ كامل للعلامات غير التقليدية. (أ) ألفا العضلات الملساء actin (aSMA) هو التعبير عن طريق الخلايا myoid peritubular. (ب) إسبين يُترجم إلى الوصلات الضيقة لخلية سيرتولي ويساهم في حاجز الخصية الدموية. (ج) السلطة الوطنية الفلسطينية تعريب إلى acrosomes من الحيوانات المنوية. مقياس القضبان: 50μm. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

فيديو تكميلي 1: قطع جزء قصير من أنبوب شبهيرول يمثل المرحلة السابعة والثامنة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.

Discussion

طريقة الميكرويسيرات بمساعدة الترانويلوميين التي وصفناها أعلاه تمكن من اتباع نهج موجه نحو المرحلة لدراسة تكوين الحيوانات المنوية. إنّ تكوين الحيوانات المنوية عملية متزامنة للغاية، وجميع الخطوات الرئيسية خلال التمايز المنوي تُنظَّم وتُنفَّذ بطريقة تعتمد على المرحلة، مثل التزام التمايز (في المراحل السابعة إلى الثامنة)، وبداية الداء (VII-VIII)، والتقسيمات الميوتيكية (XII)، وبداية استطالة النطاف المنوية (الثامن) والحيوانات المنوية (الثامن)1،26،27. يوفر التحليل الموجه نحو المرحلة أداة قوية لدراسة هذه الأحداث الخاصة التي تقتصر على خطوات محددة من تكوين الحيوانات المنوية وبالتالي لا توجد إلا في مراحل محددة من دورة الظهارية شبه المائلة. اتقان الأسلوب يأخذ بعض الممارسة واستخدام مجهر تشريح ذات نوعية جيدة والظروف المناسبة مضيئة هي مفتاح النجاح. تنفيذ هذه الطريقة كجزء من مجموعة أدوات اليومية لديه القدرة على تحسين كبير في تأثير وأهمية البيولوجية للبحوث على وظائف الإنجاب الذكور من خلال السماح تشريح أكثر دقة للأحداث الجزيئية أثناء تكوين الحيوانات المنوية.

جميع سلالات الماوس WT التي درسناها عرض نمط مماثل transillumination وعرض الجمعيات الخلوية المحفوظة في مراحل من دورة الظهارية seminiferous. على شرط أن التمايز spermiogenic من الخلايا الجرثومية لا يختلف اختلافا صارخا عن الفئران WT، وينطبق الشيء نفسه أيضا على جميع نماذج الماوس خروج المغلوب التي درسناها. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن تطبيقها على الأنواع الأخرى التي تظهر الترتيب القطاعي الطولي من مراحل دورة الظهارية شبه7. ومع ذلك، لا يمكن استخدام الأنواع ذات المراحل غير المجزأة (مثل الإنسان). نظرا للدور الأساسي للتكثيف الكروماتين في ممدود الحيوانات المنوية في تحديد نمط transillumination، فمن الواضح أن أي سوء تنظيم هذه العملية سوف تمس حتما على تنفيذ هذه الطريقة. في الفئران الشابة والشباب (5-6 أسابيع) لم يتم بعد تحديد نمط الترانسيليمين بشكل كامل ، وبالتالي ، يجب استخدام الفئران التي تزيد أعمارهم عن 8 أسابيع فقط. من المهم أيضا أن نضع في اعتبارنا أن الضغط وسحب الأنابيب سوف تؤثر حتما على نمط الترانسيلومين لأنه يشوه العمارة الخلوية داخل ظهارة شبهiferous.

ويمكن أيضا أن تكون شرائح الأنابيب seminiferous المعزولة المستزرعة تمكين مراقبة الجسم الحي السابق والتلاعب في العمليات المقترنة بالحيوانات المنوية، بما في ذلك الميوسيس. لضمان صلاحية الأنسجة ومنع تحلل الحمض النووي الريبي والبروتين، يجب جمع العينات ومعالجتها على ألا تزيد عن ساعتين بعد التضحية بالماوس. لثقافة vivo السابقين من الأنابيب seminiferous، وينبغي أن الوقت من التضحية إلى بداية الثقافة لا تتجاوز 1 ساعة. يمكن عادة الحفاظ على سلامة شظايا الأنابيب تصل إلى 72 ساعة في المختبر إذا تم حصادها بشكل صحيح.

يمكن التحقق من مرحلة دورة الظهارية شبه المائلة، بل وتحديدها بدقة أكبر باستخدام المجهر على النقيض من مرحلة من تحضيرات الاسكواش16. يتم إجراء المجهر على الخلايا الحية، والذي يوفر بعدا إضافيا في التحليل ويسمح بمراقبة حركات العضية أو الخلية في مراحل محددة من تكوين الحيوانات المنوية28،29،30. يوفر المجهر على النقيض من الطور التدريج الدقيق لـ مناعة لاحقة ، مما يتيح إجراء تحليل مفصل جدًا للتعبير البروتيني وديناميات التعريب أثناء تكوين الحيوانات المنوية ، بما في ذلك التغييرات الخاصة بالمرحلة.

في حين يتم تحرير الخلايا من السياق الظهارية في الاستعدادات الاسكواش، والمناعة كامل جبل من شرائح أنبوب تمكين دراسة الخلايا المنوية في بيئتها الفسيولوجية. لذلك ، قد توفر الاستعدادات الكاملة تصورًا أفضل لهندسة الأنابيب شبه المنيفيرة ومخالطها بين الخلايا من الاحتفاظ بالمناعة على المقاطع العرضية. والأهم من ذلك أن التدريج بمساعدة الترانسيلومين للأجزاء الأنبوبية قبل الكبت المناعي يجعل النهج أكثر قوة من خلال تضمين معلومات عن المرحلة المحددة لشريحة معينة. تلوين كامل جبل هو أداة مفيدة بشكل خاص لدراسة الخلايا في محيط الأنابيب شبهiferous، مثل الخلايا العضلية peritubular، الضامة المحيطة والحيوانات المنوية، ولكن قد تفتح أيضا رؤى جديدة في البحوث على الخلايا الجرثومية الميوخية وما بعد الميكونية.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل منح من أكاديمية فنلندا [315948، 314387 إلى ن.ك.]؛ مؤسسة سيغريد جوسليوس [إلى ن.ك.، ج.ت]؛ مؤسسة إميل آلتونن [إلى J.-A.M، T.L.]؛ برنامج توركو للدكتوراه في الطب الجزيئي [S.C-M., O.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bovine serum albumin (BSA) Sigma A9647
cover glass 20x20 mm Menzel Gläser 11961988
Falcon conical tube 15-ml Sarstedt 62.554.502
fetal bovine serum (FBS) Biowest S1810
grease pen (ImmEdge) Vector Laboratories H-4000
microscope slide Superfrost Plus Thermo Scientific 22-037-246
Parafolmaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15714
Petri dish (100-mm) Greiner 664160
phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 11503387
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher P36962
rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) Vector Laboratories RL-1072
Triton X-100 Sigma 93443
Tween-20 Sigma P2287

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mäkelä, J. A., Toppari, J. Testis Physiology: Seminiferous Cycle. Encyclopedia of Reproduction. , Elseiver. (2018).
  2. Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. The American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
  3. Clermont, Y. Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal. Physiological Reviews. 52 (1), 198-236 (1972).
  4. Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. The wave of the seminiferous epithelium in the rat. American Journal of Anatomy. 108 (1), 47-77 (1961).
  5. de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., França, L. Testis Physiology-Overview and Histology. Encyclopedia of Reproduction. , ELseiver. (2018).
  6. Leblond, C. P., Clermont, Y. Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat. Annals of the New York Academy of Sciences. 55 (4), 548-573 (1952).
  7. Parvinen, M. Regulation of the seminiferous epithelium. Endocrine Reviews. 3 (4), 404-417 (1982).
  8. Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
  9. Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice. Reproduction. 154 (5), Cambridge, England. 569-579 (2017).
  10. Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. Histological and histopathological evaluation of the testis. , Cache River Press. Clearwater, FL. (1990).
  11. Parvinen, M., Hecht, N. B. Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for "in situ" analyses of DNA polymerase activities. Histochemistry. 71 (4), 567-579 (1981).
  12. Ventelä, S., Mäkelä, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis. Stem Cells. 30 (5), Dayton, Ohio. 1008-1020 (2012).
  13. Faisal, I., et al. Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice. Endocrinology. 160 (5), 1119-1136 (2019).
  14. Wright, W. W., et al. Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules. Biology of Reproduction. 29 (1), 257-270 (1983).
  15. Johnston, D. S., et al. Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8315-8320 (2008).
  16. Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium. Cytometry. 9 (5), 456-462 (1988).
  17. Mäkelä, J. A., et al. Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis. Reproduction. 142 (5), Cambridge, England. 711-721 (2011).
  18. La, H. M., et al. Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline. Nature Communications. 9 (1), 04827 (2018).
  19. Toppari, J., Parvinen, M. In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis. Journal of Andrology. 6 (6), 334-343 (1985).
  20. Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat. The Anatomical Record. 174 (4), 435-449 (1972).
  21. Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. International Journal of Andrology. 5 (3), 282-294 (1982).
  22. Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), Cambridge, England. 1495-1505 (2006).
  23. Chan, A. L., et al. Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes. Stem Cell Reports. 9 (3), 956-971 (2017).
  24. Lokka, E., et al. Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis. Nat Commun. 11 (1), 4375 (2020).
  25. Mäkelä, J. A., Toppari, J. Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium. Encyclopedia of Reproduction. , Elseiver. (2018).
  26. Griswold, M. D. Spermatogenesis: The commitment to meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
  27. Mäkelä, J. A., Toppari, J. Spermatogenesis. Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. , 1-39 (2017).
  28. Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Molecular Biology of the Cell. 14 (7), 2768-2780 (2003).
  29. Parvinen, M., Parvinen, L. M. Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products. The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).
  30. Parvinen, M., Söderström, K. O. Chromosome rotation and formation of synapsis. Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).

Tags

علم الأحياء التنموي، الإصدار 164، الماوس، تكوين الحيوانات المنوية، ظهارة شبهiferous، مرحلة، transillumination، إعداد الاسكواش، تلطيخ جبل كامل، تكوين الحيوانات المنوية
التسلخ المُساعد للتنقية في مراحل محددة من دورة الظهارة الظهارية شبه المائلة للماوس لتحليلات المناعة المصبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mäkelä, J. A.,… More

Mäkelä, J. A., Cisneros-Montalvo, S., Lehtiniemi, T., Olotu, O., La, H. M., Toppari, J., Hobbs, R. M., Parvinen, M., Kotaja, N. Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses. J. Vis. Exp. (164), e61800, doi:10.3791/61800 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter