Summary
이 프로토콜은 반열성 상피 주기의 특정 단계를 나타내는 성인 마우스 반열혈구의 세그먼트의 과균 보조 미세 절부, 그리고 그 안에 있는 세포 모형, 그리고 스쿼시 제제 및 그대로 관 세그먼트의 후속 면역 염색을 설명합니다.
Abstract
정자 발생은 궁극적으로 신체의 가장 뚜렷한 세포 유형 중 하나, 정자를 초래하는 독특한 분화 과정입니다. 세균 세포의 분화는 4~5세대의 세균 세포를 동시에 숙주하고 그들의 발달을 조정하고 동기화하는 체세포 세톨리 세포의 세포질 주머니에서 일어난다. 따라서, 단면 내의 세균 세포 유형의 조성은 일정하며, 이들 세포 협회는 반열상피 주기의 단계(I-XII)라고도 한다. 중요한 것은, 단계는 또한 과자 빛 흡수/산란 특성에 기초하여 온전한 반열구관으로부터 확인할 수 있고, 스테이지가 수치 순서로 관을 따라 서로 를 따라 다르다는 사실. 이 문서에서는 마우스 반열성 상피 주기의 특정 단계를 나타내는 반열관 세그먼트의 분리를 위한 일시적인 보조 미세 절제 방법을 설명합니다. 반열구의 광 흡수 패턴은 먼저 해부 현미경으로 검사된 다음 특정 단계를 나타내는 튜블러 세그먼트를 절단하고 다운스트림 응용 제품에 사용됩니다. 여기서는 단계별 스쿼시 제제와 그대로 튜블러 세그먼트를 위한 면역스테인팅 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 연구원이 정자 발생의 특정 단계에서 일어나는 생물학 사건에 집중할 수 있게 해주며, 따라서 정자 발생 및 근본적인 분자 메커니즘의 발달, 독성 및 세포학 연구를 위한 독특한 도구를 제공합니다.
Introduction
디플로이드 정자에서 성숙한 haploid spermatozoa, 즉,정자 발생에 이르기까지 남성 세균 세포의 분화는 성적으로 성숙한 개인의 고환에서 반열구의 상피에서 일어나는 복잡한 과정이다1. A1 정자의 미토틱 후손은 먼저 분화 최선을 다하고 인구를 확장하기 위해 다섯 번 분할한 다음, 궁극적으로 haploid 정자를 초래하는 정자 세포로 메이오시스를 입력합니다. 둥근 정자를 정자로 분화하여 정자, 즉정자 발생은 핵 다짐및 곡어및 기조와 같은 정자 특정 구조의 건설을 포함하여 세포 형태학의 복잡한 변화를 수반합니다. 마우스에서, 정자 발생의 전체 과정은2,3을완료하는 데 35 일이 걸립니다.
어떤 주어진 된 로케일에서, 반열성 상피는 발아 세포와 세균줄기/선조 세포 및 체세포 세르톨리 세포의 최대 5개의 코호트를호스트합니다. 발아 세포를 분화하는 것은 동심층을 형성하여 예측 가능한 조성물을 형성하고, 주어진 발달 단계에서 haploid 세포는 항상 특정 유형의 정자 세포 및 정자와 연관된다4,5. 따라서, 튜블의 모든 단면은 일정한 조성물의 세균 세포의 집단을 호스트한다. 이러한 특정 세포 협회는 반열성 상피의 단계로 정의된다. se 당 단계는 정체된 체크 포인트와 같은 상태를 제시하지 않지만 생식 세포 코호트의 분화가 동기화된 1,2,6에서진행됨에 따라 지속적으로 개발됩니다. 마우스에서는, 반열혈관의 세로축을 따라 세그먼트 방식으로 배열되는 12단계(I-XII)2가 있으며, 따라서 반열성 상피, 또는 정자성파7,8,9(도 1)의물결을 형성하는 논리적 순서로 서로를 따른다. 정자 발생의 완성은 4 주기를 소요하고, 어떤 반열성 관 단면 내의 분화 배아 세포의 계층적 층 또는 코호트는 서로 떨어져 일시적으로 하나의 반열성 주기입니다. 사이클의 길이는 종에 따라 다르며 마우스에서 각 주기마다 8.6 일이10일 소요된다.
단계는 조직학적 고환 섹션5(도 1 및 도 2)에대한 반열성 상피의 세포 조성 및 조직에 기초하여규명될 수 있다. 그러나, 조직학적 분석은 힘들고 시간이 많이 걸리며 고정 및 염색이 필요하며, 따라서 살아있는 조직에 적용할 수 없습니다. 중요한 것은, 또한 주기의 상이한 단계에 의해 전시된 뚜렷한 광 흡수/산란 패턴을 이용하여 해부 현미경하에서 살아있는 조직에 대해서도 수행될 수있다(도 2). 빛을 흡수하고 분산시키는 각 단계의 능력은 주어진 단계 호스트및 번들7,11에서이들 세포의 포장을 하는 후기 메이오틱 후 정자의 크로마틴 응축 수준에 상대적이다. 정자 분화, 즉,정자 발생은 둥근 정자(1-8단계) 및 정자(9-16단계) 분화(도1)의8단계 와 8단계를 포함하여 16개의 발달 단계로 더 나뉜다. 단계 9-11 긴 정자 (단계 IX-XI) 디스플레이 는 낮은 수준의 크로마틴 응축만 표시하여 낮은 양의 빛이 흡수됩니다. 크로마틴 응축은 11단계에서 시작되며(단계 XI), 및 15-16단계 긴 정자(단계 IV-VIII)는 완전히 응축된 크로마틴을 함유하고 있으며, 따라서 최대빛흡수(도 3)를나타낸다. 크로마틴은 정자 머리에 단단히 포장하기 위해 응축 될 필요가있다. 빛 흡수 패턴에 기여하는 추가 요인은 상피 (기저 대 apical) 내에서 정자를 길게하는 위치와 긴 정자의 번들 (단계 II-V단계에서 발음)11 (그림 3). 번들은 튜룰의 중간에 반점으로 볼 수 있으며 해부 현미경 아래 가장자리에 줄무늬로 볼 수 있으며 크로마틴을 더 응축할수록스팟/스트라이프(11)가어두워질수록 더 어두워질 수 있다.
이 문서에서는 반열성 상피 주기의 특정 단계를 나타내는 반열성 관 세그먼트의 분리를 위한 경유 방지 보조 미세 절제 방법의 사용을 설명합니다. 일단 단단된, 단계적 튜블러 세그먼트는 생화학 RNA 및 단백질 분석12,13,14,15,유동 세포측정16, 전 생체외관 배양(17) 및 면역스테인닝18을포함한 다양한 다운스트림 분석의 대상이 될 수 있다. 여기에서 우리는 또한 살아있는 세포 형태학 분석 및 후속 면역 염색을 위한 단계적인 tubule 세그먼트의 분쇄된 단층뿐만 아니라 tubule 세그먼트의 전체 마운트 면역 스테인링을 준비하는 상세한 다운스트림 프로토콜을 제공합니다. 그림 4에설명된 간단히 설명된 워크플로우입니다.
상기 측량 보조 마이크로절 방법은 단계의 동기화된 세포 조성덕분에 분화의 특정 단계에서 세균 세포의 정확한 식별 및 격리를 가능하게 한다. 중요 한 것은, 그것은 또한 살아있는 조직에 정자 발생 하는 동안 단계 의존 적 사건의 연구를 수 있습니다. 정자 발생에 대 한 확장 가능한 시험 관 모델의 부족을 감안할 때, 이 방법은 또한 단계 별 tubule 세그먼트 ex vivo에 표적 단기 개발 및 독성 연구를 허용의 독특한 장점이 있다12,17. 여기서 마우스에 대한 방법을 설명하는 동안, 쥐4,7,15,19,20과같은 반열상피 단계의 종과 세그먼트 배열을 가진 모든 포유류 종에 동일한 절차를 적용할 수 있다.
Protocol
실험실 마우스의 유지 보수및 모든 동물 실험은 투르쿠 대학에서 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다.
1. 미세 절제에 대한 반열관 의 준비
- 성인 남성 마우스를 희생 (≥8 주, 고환 80-120 긴장과 나이에 따라 mg)CO를 통해 질식 다음 자궁 경부 탈구.
참고 : 마우스는 성적으로 성숙해야하며, 바람직하게는 적어도 8 주 오래된 것입니다. 반열성 상피의 물결이 아직 완전히 확립되지 않았기 때문에 청소년 마우스의 경유 패턴은 성인과 다르며, 정자 발생의 첫 번째 물결의 타이밍은구별21,22. 4주 된 남성 마우스에서 정자를 길게 하는 부족은 경유 보조 미세 절에 대한 사용을 배제합니다. 일반적인 정자 발생이 있는 모든 마우스 긴장은 이용될 수 있습니다. - 복부복부를 70%에탄올로 스프레이하세요. 멸균 가위를 사용하여 복부 골반 구멍을 열어 V 자형 개구부를 만듭니다.
- 멸균 집게로 부피성 지방 패드를 당기고, 고환을 찾고, 가위를 사용하여 해부하고 PBS가 함유 된 멸균 된 100mm 페트리 접시에 놓습니다.
참고: 멸균을 유지하려면 모든 실험실기와 수술 도구가 멸균되었는지 확인하십시오. - 미세 기울어진 가위를 사용하여 고환을 캡슐화하는 두꺼운 섬유시트인 튜니카 알부진아의슬릿을 절단하여 고환을 캡슐화합니다. 그런 다음 한 쌍의 집게를 사용하여 튜니카를 엽니 다. 집게로 눌러 튜블러를 강제로 꺼내튜니카를 버리십시오.
참고: 튜니카를 폐기하는 동안, 아티리아 고환이 튜니카와 함께 제거되는 일부 다운스트림 응용 프로그램에 도움이 될 수 있습니다. 반열관에 손상을 입히지 마십시오. - 반열구를 새로운 페트리 접시로 옮기고 페트리 접시의 바닥을 덮을 수 있을 만큼 멸균 된 PBS를 붓습니다. 다음으로, 튜틀을 부드럽게 당기지만 튜블러를 손상시키지 마십시오.
참고: 너무 많은 기계적 스트레스는 일시적인 패턴에 영향을 미치고 조직과 세포 구조의 생존가능성에 영향을 미칩니다. 튜블러는 또한 스테이징(3B)없이 이 시점부터 전체 마운트 면역스테인링을 위해 처리될 수 있다. 때로는 SALL4, c-KIT 및 DNMT3A18,23과같은 분화 된 정자에 대한 항체를 포함하는 것으로 간주하는 것으로충분합니다. 정자의 밀도는 비교적 신뢰할 수 있는 단계 표시기(도2)이다.
2. 트랜스액미네이션 보조 미세 절제
- 페트리 접시를 단계에 테이프로 테이프로 단단히 해부 현미경 아래에 놓습니다.
참고: 페트리 접시를 테이프로 테이프로 사용하여 수집된 반열구 세그먼트가 혼합될 수 있는 움직임을 방지하는 것이 중요합니다. - 초점 아래 반열구관의 광 흡수 패턴을 공개하려면, 샘플이 아래에서 조명되고 빛이 샘플을 통과했는지 확인하십시오, 즉,,그것은 환광된다.
참고 : 흡수 / 산란 빛의 양은 긴 정자와 반열관 내부의 그들의 번들에서 크로마틴 응축의 수준에 비해 : 더 응축, 더 많은 빛이 흡수, 즉,,어두운 나타납니다. - 도 2, 도 5A 및 도 S1에 설명된 것과 같이 다른 단계의 광 흡수 패턴에 익숙해지면 미세한 집게를 사용하여 튜블러의 번들을 조심스럽게 움직입니다.
참고: 단계는 항상 논리적 순서로 서로를 따라가며 반열성 상피의 물결을 형성합니다. 그러나, 정자파의 방향이 때때로 반전한 다음 다시 되돌아간다는 것을 아는 것이 중요합니다(변조4,9라고도함), 때로는 절차를 복잡하게 만듭니다. 또한 각 단계의 길이는 튜블러의 MM 의 수면에서 상당히 다양합니다. - 후크 팁이 있는 집게를 사용하여 관심 있는 튜블러를 조심스럽게 들어 올린 다음 미세 절 가위를 사용하여 적절한 길이의 세그먼트를 잘라냅니다(보충 비디오 1참조). 집게 끝에 있는 후크는 튜블러를 들어 올리고 들고 있어 짜는 것을 피하는 데 도움이 됩니다.
참고: 절단할 세그먼트의 길이는 다운스트림 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 단백질 또는 RNA 분석을 위한 특정 단계의 풀튜블 조각의 수집을위해,12(II-V, VII-VIII 및 IX-XI, 도 5B)길이는 전형적으로 2-5mm이다. 표준 페놀 클로로폼 추출을 사용하면 약 200 ng의 RNA가 1mm의 튜블러에서 파생될 수 있습니다. 스테이지 튜블러 세그먼트의 전체 마운트 염색의 경우 세그먼트의 길이는 >5mm여야 합니다. 스쿼시 제제의 경우 세그먼트 의 중간에 있는 세포가 너무 길면 종료하지 못할 수 있기 때문에 세그먼트의 길이가 1-2mm를 초과해서는 안됩니다. 페트리 접시 아래에 mm 스케일을 사용하여 튜블러 길이를 정확하게 측정하십시오.
3. 다른 준비의 면역 염색
- 스쿼시 준비: 단계 검증 및 면역 염색
참고: 단계별 관은 위상 대조 현미경 검사법과 후속 면역 스테인닝에 의해 살아있는 세포의 형태학적 분석을 수행하기 위해 커버 유리와 현미경 슬라이드에 분쇄 될 수있다. 초보자는 이 방법을 사용하여 과용 보조 미세 절제 방법에 익숙해질 때 단계를 확인하는 것이 좋습니다.- 파이펫을 사용하여 10 μL의 부피로 세그먼트를 수집하고 현미경 슬라이드로 이동합니다.
- 뚜껑(20mm x 20mm)을 튜블러에 조심스럽게 배치하여 튜블러를 스쿼시합니다. 그 결과, 세포는 튜블러를 흘러나와 살아있는 세포 단층층을 형성합니다. 세포의 확산을 용이하게 하기 위해 커버 글래스 가장자리에 필터 용지를 놓습니다. 세포를 너무 많이 찌그러지 않도록 하여 살아 있게 하십시오.
- 현미경으로 퍼지는 세포를 모니터링합니다. 40x 목표에서 위상 대비 현미경을 사용하여 존재하는 세포 유형을 검사하여 단계 인식을 검증한다(도2, 도 S2).
- 세포가 튜브의 양쪽 끝에서 둥근 단층층을 형성하기 위해 퍼지면 슬라이드를 액체 질소를 포함하는 용기에 찍어 포셉으로 붙들게하십시오. 10s에 잠수하십시오. 또는 동결을 위해 드라이 아이스 플레이트에 슬라이드를 놓습니다.
- 메스를 사용하여 덮는 유리를 제거합니다.
- 지체 없이 고정을 진행하고 2-5 분 동안 90 %의 에탄올로 용기에 슬라이드를 신속하게 놓습니다.
참고: 90%에탄올에 넣기 전에 스쿼시 준비가 해동되지 않았는지 확인하십시오. 아세톤과 같은 다른 고정제도 10분 동안 사용할 수 있습니다. - 공기 건조 및 실온 (RT) (최대 일) 또는 -80 °C (장기)에서 저장합니다.
- 면역 염색을 위해 RT에서 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 샘플을 수정하십시오.
- PBS에서 헹구고 PBS에서 0.1% 트리톤 X-100으로 5분 간 투약합니다.
- PBS에서 헹구고 각 스쿼시 샘플 주위에 그리스 링을 그립니다.
- 50-100 μL10% BSA(소 세럼 알부민)를 PBS(PBST)의 0.1% 트웬에 넣고 RT에서 30분 동안 샘플을 차단합니다.
- BSA 용액을 제거하고 RT에서 1 h에 대한 PBST에서 10 % BSA에서 희석 된 1 차적인 항체로 배양하십시오.
- PBST로 3배 3배 3분 동안 3분 동안 씻으시면 됩니다.
- PBST에서 10% BSA로 희석된 이차 항체를 배양한다.
참고: 곡예를 더하기 위해, 샘플은 특정 1차 및 이차 항체 대신RT(도 S3)에서1h에 대한 PBST에서 10% BSA에서 로다민 라벨땅콩 아글루티닌 항체(PNA, 1:1000)로 배양될 수 있다. - PBST로 각각 3배 씩 씻고, PBS로 헹구고, DAPI가 들어 있는 마운트제로 마운트합니다.
- 반열구의 전산 면역염색
참고: 아래 프로토콜은 스테이지(2.4단계에서) 튜블러 세그먼트에 대한 전체 마운트 염색을 설명합니다. 연구원이 준비없이 전체 마운트 염색을 수행하고자하는 경우 (단계 1.5에서), 노트에주의를 기울이면 3.2.1 과 3.2.7.- 파이펫을 사용하여 얼음차가운 PBS의 튜블러 세그먼트(2.4단계에서)를 15mL 원추형 튜브로 옮기고 얼음 에 침전할 수 있도록 합니다.
참고: 1.5.에서 무대가 없는 튜블러를 사용하는 경우, 페트리 접시에 튜블러를 여러 번 배팅하여 분리합니다. 컷 팁이 있는 1mL 파이펫을 사용하십시오. 이 단계는 조직의 구조를 열기위한 것입니다. 그러나 튜벌레가 손상될 수 있으므로 너무 많은 파이펫팅을 피하십시오. 튜블러의 퇴적물은 수십 초 정도 걸릴 것입니다. 작은 관 조각, 간질 세포 및 세포 파편은 상체에 머물러 있습니다. - 피펫팅또는 흡구로 상체(SN)를 조심스럽게 제거합니다. 얼음 차가운 PBS 10mL를 넣고 반전으로 섞습니다.
- 퇴적물을 허용한 다음 이전과 마찬가지로 SN을 제거합니다.
- 4% PFA의 5mL를 추가하고 +4°C에서 회전 테이블(20-30 rpm)에서 5h로 수정합니다.
참고: 고정 시간은 관심 있는 단백질과 세포전 소세포화에 달려 있습니다. 핵 및 세포질 단백질의 경우, 2h 고정은 전형적으로 충분하지만, GFRα1(GDNF 패밀리 수용체 알파 1)와 같은 멤브레인 마커; 그림 6A,B) 는 최대 6시간까지 더 긴 고정의 이점을 누릴 수 있습니다. - 퇴적물을 허용하고, 이전과 마찬가지로 SN(PFA)을 제거하고, PBS의 10mL를 추가하고 튜브를 반전시킴으로써 잠시 헹구십시오.
- 퇴적물을 허용하고, 이전과 같이 SN을 제거하고, PBS 세척 단계를 +4°C에서 회전 테이블에 각각 10분 이상 3회 반복하고 +4°C에서 염색또는 저장을 진행한다.
참고: 작업 조건이 멸균되고 청소하는 경우 샘플을 적어도 몇 주 동안 저장하고 사용할 수 있습니다. 또는, 2% 스톡 솔루션에서 0.02%(w/v)의 최종 농도에 아지드 나트륨을 추가하여 +4°C로 저장하기 전에 튜블을 보존할 수 있도록 도와줍니다. - 1mL 파이펫을 사용하여 10-20 개의 고정 튜블러 세그먼트를 2mL 라운드 하단 튜브로 이동합니다. 퇴적물을 허용하고 SN을 제거합니다.
참고: 준비되지 않은 긴 튜블러로 작업하는 경우, 페트리 접시에 튜블러를 붓고 미세 절 가위와 집게절단 세그먼트를 약 5-20mm로 드세요. 너무 긴 세그먼트는 염색 절차 중에 엉키지만 너무 짧은 세그먼트는 쉽게 손실됩니다. - PBS(PBSX)에서 0.3% 트리톤 X-100에 2% BSA + 10% FBS(태아소 혈청) 1mL를 추가합니다. RT에서 회전 테이블(20-30rpm)에서 1시간 이상 차단합니다.
- PBSX 1mL로 헹구고, 파이펫팅으로 SN을 제거하고 PBSX에서 1% BSA로 희석된 1차 항체의 250 μL을 추가합니다(1:100-1:2000 희석). 회전 테이블 (20-30 rpm)에 +4 °C에서 RT 또는 하룻밤에서 2 시간 동안 배양하십시오.
- 위와 같이 PBSX의 1mL로 튜튜브를 피펫팅하여 항체 용액을 제거합니다. RT에서 회전 테이블 (20-30 rpm)에 PBSX에서 1 시간 동안 세 번 세척하십시오.
참고: 이 첫 번째 세척 후 필요한 경우 샘플을 +4°C로 하룻밤 동안 방치할 수 있습니다. - SN을 제거하고 PBSX에서 1% BSA에서 희석된 이차 항체의 250 μL을 추가합니다(일반적으로 형광 표지 항체의 1:500 희석). 호일로 덮고 1시간 동안 RT의 회전 테이블(20-30rpm)에서 배양합니다.
- 3.2.10을 반복합니다.
- 마지막으로 SN을 제거하고 현미경 슬라이드에 튜룰을 부어. 젤 로딩 팁을 사용하여 튜블러를 선형 스트립에 부드럽게 분리하고 정렬합니다. 과도한 버퍼를 빼내고 마운팅 매체와 커버슬립을 추가합니다.
참고 : 튜블을 배치하는 동안 튜브의 건조를 피하십시오. DAPI를 가진 핵의 반염색은 대부분의 경우에 필요하지 않습니다. 샘플 건조 및 열화를 방지하기 위해 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하십시오. 슬라이드는 이미징 전에 +4°C에서 1-2주 동안 저장할 수 있습니다.
- 파이펫을 사용하여 얼음차가운 PBS의 튜블러 세그먼트(2.4단계에서)를 15mL 원추형 튜브로 옮기고 얼음 에 침전할 수 있도록 합니다.
Representative Results
마우스 반열구의 성공적인 경부 보조 스테이징 및 미세 절은 주로 적절한 조명 조건과 적절한 해부 현미경을 찾는 데 달려 있으며 각 단계를 특징짓는 특정 기능을 인식하는 능력에 달려 있습니다. 단계 VII-VIII는 상피의 정면에서 정렬되는 완전히 응축된 긴 정자의 높은 수를 포함하기 때문에 균질적으로 어둡게 나타납니다(도 5A 및 도 S1). 성숙한 정자가 정자에 있는 루멘으로 풀어 놓인 후에, 관은 상피에 응축된 긴 정자의 부재 때문에 단계 IX-XI에서 아주 창백한 나타납니다. 비조명 튜블러에서 식별하는 가장 쉬운 기능은 정자의 지점입니다 (도 5A 및 도 S1의별표), 즉 어두운 영역 (VII-VIII)에서 창백한 영역 (IX-XI)으로 의 갑작스런 전환이다. 창백한 영역다음에는 약점 영역(XII-I)이 뒤따릅니다. 얼룩 외관은 번들에 응축 된 크로마틴과 정자 를 길게하는 조직에서 비롯됩니다. 번들은 다음과 같은 강력한 스팟 존(II-V)에서 매우 두드러집니다. 더욱이, 정자 번들은 기저 라미나 가까이에 위치한 세르톨리 세포 핵을 향해 이동하며, 이는 비환화시 단계 II-V 튜블러의 줄무늬 모양으로 반사된다(도2, 도 5A, B 및 도면 S1). 번들은 마침내 무대 VI에 분산되고 응축 길쭉한 정자는 무대 VIII의 상피에서 방출될 루멘 에 가깝게 움직입니다.
관세그먼트의 정확한 단계는 스쿼시 제제의 위상 대비 현미경 검사법(도2 및 도 S2)에의해 정확하게 검증될 수 있다. 스쿼시 제제의 특정 단계는 단계 1-8 라운드 정자의 곡예 발달, 긴 정자에서 크로마티닌 응축의 상태, 정자번들(16)의 존재에 기초하여 인식된다(도3 및 도S2). 더욱이, 타입 B 정자와 렙토텐 또는 zygotene 정자 세포와 같은 초기 세포 모형의 존재는, 그들의 형태학적 특징에 기초하여 인식될 수 있는, 단계 인식을 지원하기 위하여 이용될 수 있다. pachytene 정자 핵의 크기는 단계 VI 의 주위에 크기가 증가하며, 이는 또한 준비에 추가적인 도움을 줄 수 있습니다.
준비된 스쿼시 제제는 면역염색을 사용하여 반열성 상피에 대한 관심있는 단백질의 발현 및 국소화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 각 단계에서 잘 정의된 세포 조성 때문에 세포 모형 특정 표현의 아주 정확한 분석을 허용합니다. 단계별 발현은 둥근 정자 분화의 뚜렷한 단계의 시각화를 가능하게 하는 곡어(예를들어,PNA)의 공동 염색에 의해 더욱 증강될 수 있다. 다양한 단계에서 PNA 염색 곡예의 대표적인 이미지가 그림 S3에제공됩니다. 곡예 얼룩은 또한 회고적으로 무대를 정의하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 트랜직 보조 스테이징은 우연한 방식으로 미스테이지 조각을 사용하는 것보다 원하는 스테이지를 찾는 것이 상당히 쉽고 빠릅니다.
반열구 관 전체 마운트 염색은 전형적으로 관 측 (정자, preleptotene 정자 세포 및 Sertoli 세포에 있는 반열성 상피의 지하 막과 접촉하는 세포 모형을 연구하기 위하여 이용됩니다; 도 6A,B)또는 간질 측(심근 성 세포 및 관관 대식세포; 도 6C 및 도면 S4A)24. 그러나, 상기 방법은 또한 혈액 고환 장벽(Espin, Figure S4B),또는 후meiotic 세균 세포(곡예 마커 PNA, 도면 S4C)와같은 상피에서 더 깊은 곳에 위치한 세포 또는 구조를 연구하는 데 사용될 수 있다. 미단계 튜블러 세그먼트를 사용하는 경우, 정자를 분화하는 단백질에 대하여 항체를 사용하여 소급하여 주어진 단계를 추정할 수 있다(A1, A2, A3, A4, In 및 B; 집단Adiff)(그림 2). 그런 다음 스테이징은 정자 분화1의첫 번째 주기 동안 6개의 미토아 분열을 겪는 syncytial Adiff의 밀도에 의존하여, 따라서 각 부문1,25후에 동기화성에서 Adiff spermatogonia의 수를 두 배로 한다. 그러나, 회고적 스테이징은 Adiff 밀도의 뚜렷한 세대에 대한 특정 마커가 없기 때문에 일시적인 보조 스테이징보다 덜 정확하지않으며, A diff 밀도의 평가는 오류가 발생하기 쉽습니다.
그림 1: 마우스 정자 발생의 준비를 위한 반열성 상피 주기 지도. 수직 기둥은 반열상피 주기의 다른 단계에서 세포 협회를 보여줍니다 (로마 숫자 I-XII로 표시). 가장 미숙한 세균 세포는 맨 아래에 있는 반면, 가장 분화된 세포는 맨 위에 있습니다. 세균 세포 분화의 진행 상황을 따르려면 왼쪽에서 오른쪽으로, 아래에서 위로 이동해야합니다. 반열성 상피의 주기는 숫자 순서로 서로를 따르는 단계의 완전한 시리즈입니다. Un,미분화 된 정자; A1-4, 유형 A1-A4 정자고니아; 에서, 중간 정자고니아; B, B형 정자학; Pl, preleptotene 정자 세포; L, 렙토텐 정자 세포; Z, zygotene 정자 세포; P, 파시텐 정자 세포; D, 디플롯렌 정자 세포; 2°, 이차 정자 세포 플러스 메이오틱 분열. 아랍어 숫자 1-16 은 메이오틱 후 정자 성숙의 단계를 참조 (정자 발생). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 마우스 반열성 상피 주기의 단계에서 세포 협회. 반열성 상피 주기의 단계는 논리적 순서로 서로를 따라, 따라서 반열관의 세로 축을 따라 정자 성 파를 형성한다. 상단 패널은 다른 단계에서 세균 세포 협회를 설명하고, 반열성 상피에서 세르톨리 세포의 세포질 주머니 (밝은 회색) 내의 세포 유형의 위치. 반열관의 그림은 창백한, 약한 반점, 강한 반점 및 어두운 영역의 정자 성 파및 특정 transillumination 패턴을 시각화합니다. 각 표시된 단계에서, 스쿼시 제제및 주기적인 산-쉬프(PAS)-스테인드 고환 단면의 대표적인 살아있는 세포 상 대비 이미지가 표시됩니다. 하단 2 패널은 과연화 후 반열구 관의 세그먼트를 보여줍니다 (상단) 또는 SALL4에 대한 항체 (아래체)로 염색 (빨간색, 범정자 마커) 및 DNMT3A (녹색,디프 마커). 단계 IX-XI, XII 및 VI단계의 트랜직 패턴은 박스형 영역으로 강조 표시됩니다. 빛 흡수 패턴(top)과 DNMT3A 양성 분화 정자(bottom)의 밀도는 반열성 사이클의 (근사) 단계를 정의하는 데 사용될 수 있다. Adiff의 연속된 세대는 타입 A1-A4, 중간 (In) 및 타입 B 정자고니아로 불립니다. 각 의 분할은 정자 세포 밀도의 두 배로 초래한다. 반열성 상피의 지하 막에 가장 높은 세포 밀도는 메이오틱 preleptotene 정자 세포 (Pl)가 관찰될 때 단계 VI-VIII에서 볼 수 있습니다. 스케일 바: 스쿼시 준비. 10 μm, 다른 50μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 정자 발생의 단계. 정자 발생의 다른 단계에서 정자의 독특한 기능. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 이 연구의 워크플로우입니다. 트랜스유미네이션 패턴은 성인(>8주 된) 마우스로 완전히 확립되었습니다. 마우스를 희생하고 지체없이 고환 해부 및 캡슐화를 진행합니다. 페트리 접시에 튜룰을 부드럽게 당깁니다. 튜블러를 전체 마운트 염색에 대 고 치거나 일시적인 진행. Transillumination 1) 스쿼시 제제 (품질 관리 또는 면역 스테인닝을위한) 또는 2) RNA 및 proteomics 분석, 조직 배양 또는 전체 마운트 얼룩에 대한 무대 풀을 수집하기 위해 더 긴 세그먼트를 잘라 특정 단계의 짧은 tubule 세그먼트를 잘라. 짧은 튜블러 세그먼트를 PBS의 10 μL 부피로 현미경 슬라이드로 옮기. 세포를 강제로 만들고 살아있는 셀 단층층을 형성하기 위해 세그먼트에 커버 슬립을 놓습니다. 현미경의 밑에 세포 모형을 관찰하고, 그 때 고치고 얼룩. WMS, 전체 마운트 염색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 과균 현미경 검사법에서 볼 수 있는 성인 마우스의 반열관. (A)반열성 상피의 물결을 나타내는 과기율하에서 볼 수 있듯이 반열관의 긴 세그먼트. 4개의 뚜렷한 영역은 정자의 크로마틴 다짐과 상피 내에서의 국소화를 기반으로 식별할 수 있습니다: 다크 존(단계 VII-VIII), 창백한 영역(단계 IX-XI), 약점 영역(단계 XII-I), 강한 스팟 영역(단계 II-VI). 별표, 정자 포인트. 화살표는 튜블러의 기계적 응력으로 인해 창백한 외관을 가진 약한 지점 영역 내의 두 개의 짧은 세그먼트를 나타냅니다. 스케일 바: 500 μm. Inset 1-5는 선택한 튜룰 세그먼트에서 배율이 높습니다. (B) 스테이지 II-V(강한 스팟 존), VII-VIII(다크 존) 및 IX-XI(창백한 영역)를 나타내는 반열성 튜블러의 풀 세그먼트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 정자, 세르톨리 세포 및 관류 대식세포 마커를 사용하여 전체 마운트 면역 스테인링. (A)GFRα1(빨간색), SALL4(녹색) 및 DNMT3B(파란색)에 대한 항체를 가진 단계 XI-II를 나타내는 세그먼트에 대한 전산 염색. 염색은 정자의 3개의 명백한 인구를 제시합니다: singly 절연(S)또는 쌍 (Apr)미분화 줄기 정자 (GFRα1+/SALL4+/DNMT3B-; 백색 점선 지역), 짧은 syncytial (여기 4 정렬 된 세포; Aal4)전구정자 정자고니아 (GFRα1-/SALL4+/DNMT3B-; 노란색 점선 영역) 및 분화 정자 (GFRα1-/SALL4+/ DNMT3B+). SALL4+/DNMT3B+ 세포는 유형 A3-A4 정자고니아입니다. (B)GFRα1(빨간색), USF1(녹색) 및 SOX9(파란색)에 대한 항체로 전산 반열구 관염색. GFRα1은 정자고니아의 줄기 부분 집합을 얼룩지게 합니다. USF1은 정자와 SOX9+ 세르톨리 세포 모두에 의해 표현된다. (C)성인 마우스의 Peritubular 대식세포는 F4/80(빨간색) 및 MHCII(파란색)모두에 대해 양성이다. DAPI 는 DNA (녹색)를 얼룩지게합니다. 밝은 큰 핵은 구피성 골수성 세포 핵이다. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S1: 반열성 상피의 물결을 표시하는 과기유화 하에서 볼 수 있듯이 반열관의 긴 세그먼트. 4개의 뚜렷한 영역은 정자의 크로마틴 다짐과 상피 내에서의 국소화를 기반으로 식별할 수 있습니다: 약한 반점 영역(단계 XII-I), 강한 스팟 존(단계 II-VI), 다크 존(단계 VII-VIII), 창백한 영역(단계 IX-XI). 정자 점(별표)은 암흑 지대가 갑자기 창백한 영역으로 이동함에 따라 인식될 수 있다. 스케일 바: 500 μm. Inset 1-4는 선택한 튜룰 세그먼트에서 더 높은 배율입니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
도 S2: 반열상피 주기의 상반되는 단계의 살아있는 세포 단층의 위상 대비 현미경 검사. (A)1단계 정자는 여전히 곡예 구조가 부족합니다. 그(것)들은 특유한 단 하나 염색체 (백색 화살표)를 가진 작은 둥근 핵 (빨간 원)에 의해 특징입니다. 크로마토이드 바디는 핵막 (파란색 화살표)과 가까운 접촉에 있는 어두운 과립으로 세포질에서 보입니다. 세톨리 세포 핵 (백색 원)에는 두 개의 위성 염색체가있는 큰 핵이 세 가지 어두운 foci가 포함되어 있습니다. 세르톨리 세포는 스쿼시 제제에서 흔히 볼 수 없지만 때때로 세균 세포와 함께 튜블러에서 흘러 나오기도 합니다. (B)단계 II-IV. 4단계에서는 곡사체 구조(적색 화살표)가 핵 봉투에 부착된 흰색 약간 평평한 소포로 나타납니다. 긴 정자 는 번들을 형성하고 이미 두꺼운 깃발 (흰색 화살표)정자 꼬리의 중간 조각에 미토콘드리아 칼집의 존재를 나타내는. 파키텐 정자 세포 (PSpc)의 핵은 둥근 정자의 약 두 배 큰 핵을 통해 분포 된 어두운 크로마틴 영역을 특징으로한다. (C)스테이지 V-VI. 단계 5-6 둥근 정자 (빨간 원)에서, 곡어는 더 평평하고 핵 (빨간 화살표)을 통해 퍼짐. 곡어를 향한 핵 봉투의 영역은 곡예막과 핵막 사이에 단백질이 풍부한 접시인 아크로크락소메의 존재로 인해 어두워 보입니다. 긴 정자는 번들 (흰색 화살표)에서 방출됩니다. Pachytene 정자 세포 (PSpc)는 상피에서 자주 관찰됩니다. (D)단계 VII-VIII. 흰색 그림자가 있는 핵 봉투에 어두운 안감이 있는 곡사(빨간 화살표)는 완전히 확장되어 7-8라운드 정자(빨간 원)의 거의 모든 액티칼 면을 덮습니다. 이 단계는 스쿼시 준비의 많은 부분에 풍부 할 수있는 성숙한 정자 (흰색 화살표)가 특징입니다. 파키텐 정자 세포 (PSpc)의 핵은 개발 도중 크기에서 성장하고 이전 단계에서 보다는 단계 VII-VIII에서 더 큰 나타납니다. 파키텐 정자 세포 (PSpc)의 핵 내부어두운 크로마틴 영역은 높은 전사 활동과 메이오틱 이벤트로 인해 퍼지 나타납니다. (E)단계 X. 단계 10 정자 핵 (흰 화살표)은 신장을 시작했지만 크로마틴은 아직 응축되지 않았습니다. 아크로솜은 핵 팁(빨간색 화살표)에서 후크를 형성하기 시작합니다. pachytene 정자 세포 (PSpc)의 핵은 메이오틱 분열을 준비하는 동안 매우 큰 나타납니다. (F)무대 XII. 단계 XII는 메이오틱 메타위상 플레이트(흰색 파선 원)의 존재를 특징으로 한다. 전형적인 응축 된 크로마틴 패턴을 가진 작은 둥근 세포는 지고틴 정자 세포 (ZSpc)이며, 자매 염색체가 시냅톤 복합 형성을 시작하기 위해 정렬됩니다. 스케일 바: 10 μm. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S3: 곡예 및 핵 염색을 기준으로 반열성 상피 주기의 단계를 식별합니다. 아세톤 고정 스쿼시 제제는 로다민 접합 PNA와 DAPI로 염색되었다. 단계 I: 1단계 정자에 아무 곡예도 존재하지 않지만 완전히 발달된 곡예는 긴 정자에서 검출될 수 있습니다. 단계 II-IV: 아크로소말 발달은 둥근 정자에 있는 대두엽/곡자 과립의 외관으로 시작됩니다. 핵 표면에 곡예 소포는 단계 3 정자까지 둥글게 나타나고, 그 후 단계 4 정자에서 평평하게. 단계 V: 곡사에 의해 종속된 각도는 40도에서 최대 95°까지 확장됩니다. 단계 VI-VII: 곡예에 의해 미묘한 각도는 95도에서 120도까지 확장됩니다. 단계 VIII-IX: 곡사는 완전히 단계 8 정자 (단계 VIII)에서 확장되고, 핵은 혈장 막과 접촉하는 세포의 정압 측에 편광 (도시되지 않음). 단계 IX에 의해 정자 핵이 변형된다; 등및 복부 표면이 처음 보입니다. 단계 X-XI: 정자는 등색 각도를 보여줍니다. 무대 XII : 이 단계는 가장 메이틱 분열의 모양을 특징으로한다; 메타위상 플레이트는 흰색 화살표로 표시됩니다. 그들의 곡사와 함께 정자를 길게 하는 것도 볼 수 있습니다. 스케일 바: 10μm. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
도S4: 비전통적인 마커를 위한 전체 마운트 염색. (A) 알파 스무스 근육 액틴(aSMA)은 심부골 미로이드 세포에 의해 발현된다. (B) 에스핀은 세르톨리 세포의 단단한 접합에 국소화하고 혈액 고환 장벽에 기여합니다. (C) PNA는 정자의 곡어로 국한합니다. 스케일 바: 50μm. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보조 비디오 1: 무대 VII-VIII를 나타내는 반열관의 짧은 세그먼트를 절단. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
우리가 위에서 설명한 측량 보조 미세 절방법은 정자 발생의 연구를 위한 단계 지향적 접근을 가능하게 합니다. 정자 발생은 고도로 동기화된 과정이며, 정자 분화 중 모든 주요 단계는 분화 약정(단계VII-VIII), 메이오시스(VII-VIII), 메이오시스(VII-VIII), 메이오틱 분열(XII), 정자 연신(VIII) 및 정자(VIII)27,정자 의 개시와 같은 단계 의존적 방식으로 조절및 실행된다. 단계 지향 분석은 정자 발생의 특정 단계로 제한되고 그러므로 반열성 상피 주기의 정의된 단계에서만 발견되는 이러한 특정 사건을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다. 이 방법을 마스터하는 것은 몇 가지 연습과 좋은 품질의 해부 현미경과 적절한 조명 조건의 사용이 성공의 열쇠입니다. 일상적인 도구 키트의 일환으로이 방법을 구현하는 것은 크게 정자 발생 동안 분자 이벤트의 보다 정확한 해부를 허용하여 남성 생식 기능에 대한 연구의 영향과 생물학적 관련성을 향상시킬 수있는 능력을 갖는다.
우리가 연구한 모든 WT 마우스 균주는 유사한 과동 패턴을 표시하고 반열성 상피 주기의 단계에서 보존된 세포 협회를 전시합니다. 세균 세포의 정자 분화가 WT 마우스와 크게 다르지 않다는 조건하에, 우리가 연구한 모든 녹아웃 마우스 모델에도 동일하게 적용됩니다. 더욱이, 반열상피주기7의단계의 세로적 세그먼트 배열을 나타내는 다른 종에 적용될 수 있다. 그러나 비세그먼트 단계(예: 인간)를 사용하는 종은 사용할 수 없습니다. 일시적인 패턴을 정의하는 정자를 길게 하는 크로마틴 응축의 필수적인 역할을 감안할 때, 이 과정의 잘못된 규제는 필연적으로 이 방법의 구현에 영향을 미칠 것이 분명합니다. 청소년 마우스와 젊은 성인 (5-6 주)에서 과기 모양패턴은 아직 완전히 확립되지 않았으며, 따라서 8 주 이상 쥐만 사용해야합니다. 또한 반열성 상피 내에서 세포 아키텍처를 왜곡하기 때문에 튜블러를 압박하고 당기는 것이 불가피하게 일시적인 패턴에 영향을 미칠 것이라는 점을 명심하는 것이 중요합니다.
고립 된 반열관 세그먼트는 또한 meiosis를 포함하여 정자 발생 결합 프로세스의 ex vivo 관측 그리고 조작을 가능하게 하는 배양될 수 있습니다. 조직의 생존가능성을 보장하고 RNA 및 단백질 분해를 방지하기 위해 마우스를 희생한 후 2시간 이상 샘플을 수집하고 처리해야 합니다. 반열구의 전 생체 문화의 경우 희생에서 문화의 발병까지의 시간이 1 시간을 초과해서는 안됩니다. 튜블러 조각의 무결성은 일반적으로 제대로 수확하는 경우 시험관에서 최대 72 시간까지 유지 될 수 있습니다.
반열상피 주기의 단계는 스쿼시제제(16)의위상 대비 현미경을 사용하여 더욱 정확하게 정의할 수 있다. 현미경 검사는 분석에 추가 차원을 제공하고 정자발생28,29,30의특정 단계에서 세포 또는 세포 운동의 관찰을 허용하는 살아있는 세포에서 수행됩니다. 위상-콘트라스트 현미경 검사는 후속 면역 스테인링을 위한 정확한 스테이징을 제공하며, 이는 단계별 변화를 포함하여 정자 발생 시 단백질 발현 및 국소화 역학에 대한 매우 상세한 분석을 가능하게 합니다.
세포는 스쿼시 제제의 상피 문맥에서 방출되는 반면, 튜블러 세그먼트의 전체 마운트 면역 스테인링은 생리 환경에서 정자 세포 연구를 가능하게합니다. 따라서, 전산 제제는 횡단면에 면역스테인링보다 반열성 관 건축 및 세포간 접촉의 더 나은 시각화를 제공할 수 있다. 중요한 것은, 면역 스테인닝 전에 튜룰 세그먼트의 transillumination 지원 스테이징은 주어진 세그먼트의 특정 단계에 대한 정보를 포함시킴으로써 접근 방식을 더욱 강력하게 만듭니다. 전산 염색은 주변 골수 세포, 관류 대식세포 및 정자와 같은 반열구 관의 주변에서 세포를 연구하는 데 특히 유용한 도구이지만, 또한 메이오틱 및 후meiotic 세균 세포에 대한 연구에 대한 새로운 통찰력을 열 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 핀란드 아카데미 [315948, 314387에서 N.K.]의 보조금에 의해 지원되었다; 시그리드 주셀리우스 재단 [N.K., J.T.]; 에밀 알토넨 재단 [J.-A.M., T.L.]; 분자 의학투르쿠 박사 프로그램 [S.C.-M., O.O.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
| cover glass 20x20 mm | Menzel Gläser | 11961988 | |
| Falcon conical tube 15-ml | Sarstedt | 62.554.502 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
| grease pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | |
| microscope slide Superfrost Plus | Thermo Scientific | 22-037-246 | |
| Parafolmaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Petri dish (100-mm) | Greiner | 664160 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 11503387 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36962 | |
| rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 |
References
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