Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

बड़े पैमाने पर एक त्रि-आयामी पुनर्निर्मित मानव एपिडर्मिस की खेती करना

Published: May 28, 2021 doi: 10.3791/61802
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 3,4, 1, 2
1Adolphe Merkle Institute, University of Fribourg, 2Dow Silicones Belgium SRL, 3Department of Biomedical and Specialist Surgical Sciences, University of Ferrara, 4Department of Animal Sciences, Plants for Human Health Institute, North Carolina State University

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रजनन योग्य और मजबूत तरीके से त्रि-आयामी पुनर्गठित मानव एपिडर्मिस की खेती करने के लिए एक सीधी विधि का वर्णन करता है। इसके अतिरिक्त, यह एपिडर्मल बैरियर मॉडल के संरचना-कार्य संबंध की विशेषता है। प्रोइनफ्लेमेटरी उत्तेजनाओं पर पुनर्गठित मानव एपिडर्मिस की जैविक प्रतिक्रियाएं भी प्रस्तुत की जाती हैं।

Abstract

नवजात प्राथमिक केराटिनोसाइट्स से पुनर्निर्मित एक त्रि-आयामी मानव एपिडर्मिस मॉडल प्रस्तुत किया गया है। इसके साथ ही, खेती की प्रक्रिया और मॉडल के लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। नवजात प्राथमिक केराटिनोसाइट्स पारम पॉलीकार्बोनेट आवेषण पर जलमग्न हो जाते हैं और सीडिंग के तीन दिन बाद एयर-लिक्विड इंटरफेस में उठा ले जाते हैं । उच्च कैल्शियम संस्कृति माध्यम में परिभाषित विकास कारकों और एस्कॉर्बिक एसिड के साथ उत्तेजना के चौदह दिनों के बाद, मॉडल पूरी तरह से अलग है। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने एक पूरी तरह से स्तरीकृत एपिडर्मिस का खुलासा किया, जो देशी मानव त्वचा की आकृति विज्ञान की नकल करता है। मॉडल और उसके बाधा कार्यों की विशेषता के लिए, प्रोटीन का स्तर और स्थानीयकरण प्रारंभिक चरण के लिए केराटिनोसिटे भेदभाव (यानी, केराटिन 10), देर से चरण भेदभाव (यानी, इनवोलुक्रिन, लोरिक्रिन, और फिलाग्रिन) और ऊतक आसंजन (यानी, डेस्मोग्लेइन 1) का आकलन इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किया गया था। ऊतक बाधा अखंडता आगे ट्रांसेपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया गया था । आरएक्स्ट्रक्टेड ह्यूमन एपिडर्मिस प्रोइनफ्लेमेटरी उत्तेजनाओं (यानी, लिपोपोलीसैकराइड और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा) के लिए उत्तरदायी था, जिससे साइटोकिन रिलीज (यानी, इंटरल्यूकिन 1 अल्फा और इंटरल्यूकिन 8) बढ़ गया था। यह प्रोटोकॉल पर्यावरणीय प्रभावों और त्वचा से संबंधित अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला का आकलन करने के लिए एक उपकरण के रूप में पुनर्निर्मित मानव एपिडर्मिस की खेती करने के लिए एक सीधी और प्रजनन योग्य इन विट्रो विधि का प्रतिनिधित्व करता है।

Introduction

एपिडर्मिस मानव शरीर और बाहरी वातावरण के बीच सीधे इंटरफेस पर त्वचा की सबसे बाहरी परत है। इसका मुख्य कार्य सुरक्षा और जलयोजन प्रदान करनाहै 1. एपिडर्मिस बाहरी एजेंटों के खिलाफ एक प्रभावी शारीरिक बाधा के रूप में कार्य करता है और शरीर से अत्यधिक पानी की हानि को रोकता है। ये त्वचा कार्य मुख्य रूप से त्वचा की सबसे बाहरी परतों, संरचना और इंटरसेलुलर लिपिड2के संगठन में सेलुलर व्यवस्था पर निर्भर करते हैं। एपिडर्मिस मुख्य रूप से केराटिनोसाइट्स से बना है जो ऊतक के बाहरी हिस्से में ऊपर की ओर प्रवास करता है और भेदभाव से गुजरता है। 4-5 एपिडर्मल परतें हैं जो उनके भेदभाव के चरण की विशेषता हैं। अंदर से बाहर तक एपिडर्मल लेयर व्यवहार्य एपिडर्मिस यानी स्ट्रेटम बेसले (एसबी), स्ट्रैटम स्पिनोसम (एसएस) और स्ट्रैटम ग्रैनुलोसम (एसजी) से शुरू होकर गैर-व्यवहार्य ऊपरी परत यानी स्ट्रैटम कॉर्नियम (एससी)3से होती है । बेसल परत मुख्य रूप से केराटिन-समृद्ध केराटिनोसाइट्स से बनी है, जो एसएस के माध्यम से भेदभाव4पर माइग्रेट होती है। केराटिनोसिट परिपक्वता के दौरान, प्रोटीन अभिव्यक्ति और संरचना में विभिन्न परिवर्तन होते हैं। केराटिनोसाइट्स डेस्मोसोमल जंक्शनों 5 केगठनके माध्यम से पालन करते हैं । एसजी में लैलूंगा निकायों की पीढ़ी शुरू की जाती है। इनमें लिपिड अग्रदूत और एंजाइम होते हैं जो त्वचा बाधा कार्य के गठन के लिए महत्वपूर्ण हैं6. एसजी भी केराटिनोसाइट्स के साइटोप्लाज्म में केराटोयालिन कणिकाओं की उपस्थिति की विशेषता है। अनुसूचित जाति के साथ इंटरफेस पर, लैमलर निकायों की सामग्री को अंतरकोशिकीय रिक्त स्थान में निकाला जाता है और सेरामाइड्स, कोलेस्ट्रॉल और मुफ्त फैटी एसिड जैसे गैर-ध्रुवीय लिपिड बाह्य लैमेलर लिपिड बिलियर्स में बाह्य लिपिड मैट्रिक्स7बनाने के लिए व्यवस्थित होते हैं। अनुसूचित जाति में, कोशिकाएं एंजाइमैदार गिरावट प्रक्रियाओं के कारण नाभिक सहित सभी सेलुलर ऑर्गेनेल्स खो देती हैं और एक चपटी आकृति विज्ञान को अपनाती हैं। वे क्रॉस-लिंक्ड प्रोटीन परतों से बने एक कॉर्निफाइड लिफाफे से घिरे हुए हैं, और उन्हें कॉर्नियोसाइट्स8, 9के रूप में जानाजाताहै। डेस्मोसोमल घटक कॉर्नियोडोसोम्स बनाने के लिए कॉर्निफाइड लिफाफे से क्रॉस-लिंक होते हैं और कॉर्नियोसाइट्स को एक साथ बांधते हैं। परिणामस्वरूप एपिथेलियम लगातार स्टेम सेल से नवीनीकृत किया जाता है, लगभग 5-6 सप्ताह10के कारोबार के समय के साथ । केराटिनोसाइट्स की भेदभाव प्रक्रिया, जिसके परिणामस्वरूप पूरी तरह से स्तरीकृत एपिडर्मिस होता है, त्वचा11के बाधा कार्य के गठन के लिए महत्वपूर्ण है।

घायल और सूजन के दौरान, केराटिनोसाइट्स आसंजन अणुओं और सतह रिसेप्टर्स में परिवर्तन को प्रेरित करते हैं और साइटोकिन्स, केमोकिंस और एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स12के स्राव के माध्यम से प्रोइनफ्लेमेटरी प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करते हैं। त्वचा न केवल बहिर्जात पदार्थों के खिलाफ एक शारीरिक बाधा है; यह रोगजनकों के संपर्क में आने पर एक प्रतिरक्षा सेंसर के रूप में भी कार्य करता है। इसके अलावा, यह अपनी परतों में कई पदार्थों के प्रसार को नियंत्रित करता है, जैसे कि मानव शरीर को निर्जलीकरण से बचाने के लिए पानी की मात्रा। त्वचा विटामिन डी के संश्लेषण में भी शामिल है और इसमें विभिन्न अन्य मेटाबॉलिक कार्यहैं 3,13,14.

बहिर्जात पदार्थों के प्रतिकूल प्रभावों का आकलन करने के लिए विष विज्ञानियों ने पशु परीक्षण पर दशकों से भरोसा किया है, लेकिन आजकल यह पसंदीदा दृष्टिकोण नहीं है । मानव विषाक्तता के लिए सीमित भविष्य कहनेवाला क्षमता होने के अलावा, पशु मॉडल कई नैतिक मुद्दों को शामिल । कॉस्मेटिक उद्योग में पशु परीक्षण पर प्रतिबंध और अनुसंधान में 3आर सिद्धांत (यानी, प्रतिस्थापन, कमी और शोधन) का पालन करने की सिफारिश के कारण इन विट्रो दृष्टिकोण15के आधार पर वैकल्पिक परीक्षण विधियों का विकास हुआ है। 90 के 90 के में पहले इन विट्रो त्वचा सेल मॉडल का वर्णन पहले ही किया जा चुका है, और सरल मानव केराटिनोसाइट मोनो-संस्कृतियों से पूरी तरह से विभेदित एपिडर्मिस और पूर्ण मोटाई मॉडल के लिए एक प्रभावशाली विकास16हासिल किया गया है। आजकल, त्वचा ऊतक इंजीनियरिंग दोनों दवा और डर्माटो कॉस्मेटिक क्षेत्रों में महत्व प्राप्त किया है । पिछले दो दशकों में, कई कंपनियों ने त्रि-आयामी (3 डी) का व्यावसायीकरण किया है जो मानव एपिडर्मिस (आरएचई) का पुनर्निर्माण करता है जो त्वचा से संबंधित अध्ययनों के लिए मानकीकृत और प्रजनन योग्य उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्वचा की जलन17, 18(यानी, परीक्षण दिशानिर्देश 43919) और त्वचा जंग20 (यानी, परीक्षण दिशानिर्देश 43121)के परीक्षण के लिए ओईसीडी दिशानिर्देशों के अनुसार रसायनों के इन विट्रो त्वचा परीक्षण के लिए कई वाणिज्यिक आरएचई मॉडल स्वीकार किए जाते हैं। त्वचा संवेदीकरण के लिए इन विट्रो परीक्षण22 (यानी, सेंस-आईएस परख) वर्तमान में अनुमोदन ट्रैक में है और पीयर-रिव्यू23के तहत है । फोटोटॉक्सिसिटी24का मूल्यांकन करने, दवा योगों का परीक्षण करने के लिए, कॉस्मेटिक फॉर्मूलेशन25,कॉस्मेटिक फॉर्मूलेशन और सक्रिय अवयवों26का परीक्षण करने के लिए, त्वचा बाधा समारोह का अध्ययन करने और पर्यावरणीय तनावों के लिए जैविक प्रतिक्रिया का परीक्षण करने के लिए28,29, 30,31।

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 3डी त्वचा मॉडलों के अलावा, कई शोध समूहों ने अपने स्वयं के आरएचईएस32, 33,34,35,36,37विकसित किए हैं। इन-हाउस आरएचईएस अध्ययन के उद्देश्य के अनुसार संस्कृति की स्थितियों को नियंत्रित करने के लिए लाभ प्रदान करते हैं। विशेष रूप से, शोधकर्ता अपने 3 डी एपिडर्मल मॉडल (यानी, प्राथमिक बनाम अमर, नवजात बनाम वृद्ध, एकल बनाम पूल्ड यादृच्छिक दानदाताओं, लिंग, जातीयता, धूम्रपान, आदि जैसे व्यक्तिगत रहने की आदतों) के पुनर्गठन के लिए उपयोग किए जाने वाले केराटिनोसाइट्स के प्रकार और स्रोत का चयन कर सकते हैं। उनके पास संस्कृति माध्यम की संरचना में भिन्नता और विकास कारकों, विटामिन, या अन्य यौगिकों को शामिल करने की संभावना है जो लक्षित प्रोटीन या लिपिड की अभिव्यक्ति को संशोधित कर सकते हैं। इन-हाउस आरएचईएस के साथ, शोधकर्ता 3 डी मॉडल के विभेदन स्थिति के एक समारोह के रूप में जैविक प्रतिक्रियाओं और बायोमैकेनिकल गुणों की भी जांच कर सकते हैं। उन सहज मापदंडों के अलावा, 3डी त्वचा मॉडल की जटिलता को बढ़ाने और उन्हें अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक बनाने के लिए निरंतर प्रयास किए जा रहे हैं, उदाहरण के लिए अन्य एपिडर्मल सेल प्रकारों (जैसे मेलानोसाइट्स और प्रतिरक्षाकोशिकाओं)38,39को जोड़कर, फाइब्रोब्लास्ट आबादी वाले कोलेजन मैट्रिक्स40, 41, 42केशीर्ष पर केराटिनोसाइट्स को जोड़कर और संवहनी नेटवर्क43,44, 45के घटकों को शामिल करके।

हालांकि विशिष्ट जरूरतों के अनुसार संस्कृति की स्थिति को ट्यून करना संभव है, ऐसे पैरामीटर हैं जिन्हें आरएचई की गुणवत्ता और प्रासंगिकता दोनों की गारंटी देने के लिए सम्मानित किया जाना चाहिए। आरएचई ऊतकों की खेती करने के लिए, सामान्य मानव एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स (एनएचईके) को विशिष्ट पारगम्य संस्कृति आवेषण में वरीयता प्राप्त किया जाता है जिसकी असुरक्षित सिंथेटिक झिल्ली कुओं को दो डिब्बों में अलग करती है, यानी, एपिकल और बेसोटेरल डिब्बे। झिल्ली की छिद्रता (यानी, 0.4 माइक्रोन का एक पोर आकार) ऐसा है कि यह बेसल डालने पक्ष में कोशिकाओं के प्रवास के साथ एपिकल डिब्बे में सेल मोनोलेयर के गठन की अनुमति देता है, और बेसल डालने के माध्यम से आवश्यक पोषक तत्वों के साथ केराटिनोसाइट्स की फीडिंग करता है। पुनर्गठन प्रक्रिया की शुरुआत में, NHEKs कुछ दिनों के लिए जलमग्न परिस्थितियों में सुसंस्कृत करने के लिए झिल्ली पर उनके आसंजन की अनुमति है । दोनों डिब्बों में कैल्शियम का स्तर एनएचईके की 2डी संस्कृति के लिए उपयोग की जाने वाली कैल्शियम एकाग्रता की तुलना में बढ़ा है ताकि कोशिकाओं के प्रसार को धीमा किया जा सके और उनके भेदभावको बढ़ावादिया जा सके । बाधा बनने और होयोस्टेसिस47 , 48को विनियमित करने के लिए एपिडर्मल कैल्शियम ढाल आवश्यक है । उच्च कैल्शियम का स्तर (यानी, 1.5 m m तक) इंटरसेलुलर जंक्शनों के गठन को बढ़ावा देता है और टर्मिनल भेदभाव49के दौरान कॉर्निफाइड लिफाफे के गठन को संशोधित करता है। एक बार जब केराटिनोसाइट्स सहायक झिल्ली पर एक निरंतर और कसकर अनुयायी मोनोलेयर बनाते हैं, तो एपिकल डिब्बे से माध्यम को हटा दिया जाता है और स्तरीकरण को प्रोत्साहित करने और एक एपिडर्मल बैरियर50, 51 स्थापितकरने के लिए वायु-तरल इंटरफ़ेस (अली) पर संस्कृति प्रक्रिया जारी रहती है। पूरी तरह से स्तरीकृत एपिथेलियम36प्राप्त करने के लिए विशिष्ट संस्कृति की स्थिति महत्वपूर्ण है । अली में पुनर्गठन प्रक्रिया के दौरान, बेसोलेटरल डिब्बे में माध्यम को केराटिनसाइट ग्रोथ फैक्टर (केजीएफ), इंसुलिन, कैल्शियम और एस्कॉर्बिक एसिड के साथ पूरक किया जाता है। एस्कॉर्बिक एसिड एक उपयुक्त अनुसूचित जाति लिपिड बाधा के गठन में एक प्रमुख भूमिका निभाता है, जो देशी मानव त्वचा52से निकटता से मिलता-जुलता है। एस्कॉर्बिक एसिड-पूरक माध्यम में उगाए जाने वाले केराटिनोसाइट्स एक विभेदित फेनोटाइप प्रदर्शित करते हैं, जिसमें केराटोयालिन कणिकाओं की बढ़ी हुई संख्या के साथ-साथ कॉर्नियोसाइट्स52के इंटरस्टिस में इंटरसेलुलर लिपिड लैमेले का आयोजन किया जाता है। कॉर्निफाइड लिफाफा सामग्री में वृद्धि करके और हाइड्रोफिलिक एंटीऑक्सीडेंट स्टोर53,54की कमी से बचने के लिए एपिडर्मल बैरियर कार्य में सुधार करने के लिए इस तरह की पूरकता आवश्यक है । केजीएफ, एपिडर्मल प्रसार और भेदभाव का एक महत्वपूर्ण पैराक्राइन मध्यस्थ, एनएचईके55को प्रोत्साहित करने के लिए उपयोग किया जाता है।

इन-हाउस आरएचईएस के मुख्य डाउनसाइड्स में अनुसंधान संस्थानों के बीच मानकीकरण का नुकसान और श्रम तीव्रता और समय की खपत में वृद्धि (तैयार-टू-उपयोग वाणिज्यिक मॉडलों की तुलना में 3 सप्ताह तक) शामिल है। वर्तमान पत्र का उद्देश्य इन कमियों को दूर करना है, जो बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए आधार निर्धारित करते हैं । इन-हाउस आरएचईएस के उपर्युक्त लाभों के अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य ऊतकों के बीच अंतर-और अंतर-परिवर्तनशीलता को कम करना, संदूषण जोखिमों को कम करना और खेती की प्रक्रिया को कारगर बनाना है।

वर्तमान प्रोटोकॉल नवजात एनएचईके का उपयोग करके RhEs की खेती करने के लिए एक प्रजनन योग्य और मजबूत विधि का वर्णन करता है। इसके अलावा, यह आरएचईएस आकृति विज्ञान, बाधा अखंडता और प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लक्षण वर्णन के प्रतिनिधि परिणामों को दर्शाता है जो एपिडर्मल भेदभाव के लिए विशिष्ट हैं। हेमेटॉक्सीलिन और ईओसिन (एचएंडई) स्टेनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग करके आरएचईएस रूपात्मक संरचना की जांच की गई थी। बाधा अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए, ट्रांसपेडरमल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर) और ट्राइटन एक्स-100 के एक्सपोजर समय को ऊतक व्यवहार्यता (ईटी50)के 50% को कम करने के लिए मापा गया था। केराटिनोसिटे आसंजन का मूल्यांकन करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) द्वारा डेस्मोसोमल जंक्शनों (यानी, डेस्मोग्लेन 1) के गठन का विश्लेषण किया गया था। एपिडर्मल स्ट्रक्चरल प्रोटीन (यानी, इनोलूक्राइन, लोरिक्रिन और फिलाग्रिन) के गठन का मूल्यांकन किया गया और आईएफ के साथ इसका पता लगाया गया। ये प्रोटीन अत्यधिक क्रॉस-लिंक्ड प्रोटीन लिफाफे के गठन में शामिल होते हैं जो एससी कॉर्नियोसाइट्स को घेरे हुए हैं और परिणामस्वरूप देर से चरण के एपिडर्मल भेदभाव56,57के लिए महत्वपूर्ण मार्कर हैं। इसके अतिरिक्त, यदि का उपयोग केराटिन 10 का विश्लेषण करने के लिए किया गया था, जो एसएस58 में प्रारंभिक चरण की विभेदित कोशिकाओं में प्रेरित प्रोटीन है और सभी विभेदित परतों के अंदर पाया जाता है। अंत में, प्रोइनफ्लेमेटरी उत्तेजनाओं (यानी, लिपोपोलीसैकराइड और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा) के लिए आरएचई की प्रतिक्रिया की जांच की गई। एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) का उपयोग करके सेल कल्चर मीडिया में इंटरल्यूकिन 1 अल्फा (आईएल-1α) और इंटरल्यूकिन 8 (आईएल-8) के स्तर को मापा गया था।

Protocol

इस प्रोटोकॉल से जुड़ी किसी भी शोध गतिविधि की योजना बनाने और निष्पादित करने से पहले मानव ऊतकों या कोशिकाओं के उपयोग से संबंधित राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय नैतिक विचारों और स्थितियों की समीक्षा और पालन करें।
नोट: इस प्रोटोकॉल के सभी कदम aseptic परिस्थितियों में किया जाना चाहिए । बायोसेफ्टी लेवल 2 प्रथाएं आरएचई की खेती के लिए न्यूनतम आवश्यकता हैं। इस प्रोटोकॉल में वर्णित रसायनों/अभिकर्णों को संभालते समय सभी आवश्यक सुरक्षा सावधानियां बरती जानी चाहिए ।

1. सेल कल्चर मीडिया की तैयारी

नोट: आरएचई (तालिका 1) की खेती के लिए तीन अलग-अलग प्रकार के सीरम-मुक्त संस्कृति मीडिया का उपयोग किया जाता है: (i) कम कैल्शियम स्तर (60 माइक्रोन सीए2 +)के साथ बेसल माध्यम एनएचईके की 2डी संस्कृति के लिए उपयोग किया जाता है; (ii) उच्च कैल्शियम स्तर (1.5 एमएम सीए2 +)के साथ जलमग्न माध्यम सेल कल्चर डालने प्रणाली में एनएचईके की सीडिंग के लिए उपयोग किया जाता है; और (iii) उच्च कैल्शियम स्तर (1.5 m Ca2+),एस्कॉर्बिक एसिड, और केराटिनसाइट ग्रोथ फैक्टर (केजीएफ) के साथ एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) माध्यम।

मध्यम मध्यम जानकारी आवश्यक मात्रा
बेसल मीडियम केराटिनोसिटे विकास माध्यम 36 एमएल/24 कुएं
+ 1% [v/v] HKGS
+ 1% [v/v] 100x एंटीबायोटिक-एंटीमाइकॉटिक
जलमग्न माध्यम केराटिनोसिटे विकास माध्यम 36 एमएल/24 कुएं
+ 1% [v/v] HKGS
+ 1% [v/v] 100x एंटीबायोटिक-एंटीमाइकॉटिक
+ 1.5 mM Ca2+
एयर-लिक्विड इंटरफेस माध्यम केराटिनोसिटे विकास माध्यम 216 एमएल/24 कुएं
+ 1% [v/v] HKGS
+ 1% [v/v] 100x एंटीबायोटिक-एंटीमाइकॉटिक
+ 1.5 mM Ca2+
+ 50 μg/mL ascorbic एसिड
+ 10 एनजी/एमएल केराटिनोसिटे ग्रोथ फैक्टर

तालिका 1. विभिन्न संस्कृति मीडिया की सारांश तालिका RhEs खेती करने के लिए इस्तेमाल किया। पूरक के साथ विभिन्न संस्कृति मीडिया की सूची।

  1. बेसल मीडियम तैयार करें।
    1. 0.2% की अंतिम सांद्रता तक पहुंचने के लिए मानव केराटिनसाइट ग्रोथ सप्लीमेंट (एचकेएसएस) के 5 एमएल के साथ केराटिनोसाइट ग्रोथ मीडियम(मैटेरियल्सकी टेबल) के 500 एमएल की बोतल को सप्लीमेंट करें। पीयूष निकालने (BPE), 0.2 एनजी/एमएल मानव recombinant एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (EGF), 0.18 μg/mL हाइड्रोकॉर्टिसोन, 5 μg/mL गोजातीय ट्रांसफरिन, और 0.01 μg/mL के पुनर्संयोजन मानव इंसुलिन की तरह विकास कारक-I (IGF-I) ।
    2. 100x एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान के 5 एमएल जोड़ें जिसमें पेनिसिलिन की १०,० इकाइयां/एमएल, स्ट्रेप्टोमाइसिन की १०,० माइक्रोग्राम/एमएल और एम्फोटेरिसिन बी की 25 माइक्रोग्राम/एमएल शामिल हैं ।
  2. डूबे हुए माध्यम को तैयार करें।
    1. 0.2% की अंतिम सांद्रता तक पहुंचने के लिए एचकेएसएस के 5 एमएल के साथ केराटिनोसिटे विकास माध्यम(सामग्रीकी तालिका) की 500 मिली की बोतल को पूरक करें, 0.2 एनजी/एमएल ह्यूमन रिकॉम्बिनेंट ईजीएफ, 0.18 माइक्रोग्राम/एमएल हाइड्रोकॉर्टिसोन, 5 माइक्रोग्राम/एमएल गोजातीय ट्रांसफरिन, और 0.01 माइक्रोग्राम/एमएल ऑफ ह्यूमन रिकॉम्बिनेंट आईजीएफ-1।
    2. 100x एंटीबायोटिक-एंटीमायकोटिक समाधान के 5 एमएल जोड़ें।
    3. 1.5 m Ca2+ की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 0.144 एम सीएसीएल 2 (कैल्शियम क्लोराइड) स्टॉक समाधान के5एमएल जोड़ें।
      नोट: केराटिनोसाइट्स के भेदभाव को प्रोत्साहित करने और स्तरीकरण प्रक्रिया49शुरू करने के लिए जलमग्न चरण के दौरान कैल्शियम एकाग्रता पहले से ही बढ़ जाती है।
  3. एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) माध्यम तैयार करें।
    1. 0.2% की अंतिम सांद्रता तक पहुंचने के लिए एचकेएसएस के 5 एमएल के साथ केराटिनोसिटे ग्रोथ मीडियम(मैटेरियल्सकी टेबल) की 500 मिलीलन की एक बोतल को सप्लीमेंट करें, 0.2 एनजी/एमएल ह्यूमन रिकॉम्बिनेंट ईजीएफ, 0.18 माइक्रोग्राम/एमएल हाइड्रोकॉर्टिसोन, 5 माइक्रोग्राम/एमएल गोजातीय ट्रांसफरिन, और 0.01 माइक्रोग्राम/एमएल ऑफ ह्यूमन रिकॉम्बिनेंट आईजीएफ-1।
    2. 100x एंटीबायोटिक-एंटीमायकोटिक समाधान के 5 एमएल जोड़ें।
    3. 1.5 m Ca2+ की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 0.144 एम सीएसीएल 2 स्टॉक समाधान का5एमएल जोड़ें।
    4. 50 μg/ml एस्कॉर्बिक एसिड एसिड की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 25 मिलीग्राम/एमएल एस्कॉर्बिक एसिड स्टॉक समाधान का 1 एमएल जोड़ें।
    5. 10 एनजी/एमएल केजीएफ की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) स्टॉक समाधान में 1% [w/v] गोजातीय सीरम एल्बुमिन में 100 μg/mL KGF के ५० μL जोड़ें ।
      नोट: चूंकि एस्कॉर्बिक एसिड ऑक्सीकरण के प्रति संवेदनशील है, इसलिए एक स्थिर एस्कॉर्बिक एसिड-डेरिवेटिव का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जैसे मैग्नीशियम एल-एस्कॉर्बिल-2-फॉस्फेट59 या एल-एस्कॉर्बिक एसिड 2-फॉस्फेट सेस्क्विमेग्नेस्मेस्नियम60। यदि एस्कॉर्बिक एसिड का उपयोग किया जाता है, तो प्रत्येक ताज़ा से पहले एस्कॉर्बिक एसिड के साथ अली माध्यम को ताजा पूरक करने की सिफारिश की जाती है।

2. एनएचईके की संस्कृति

नोट: चूंकि प्राथमिक मानव केराटिनोसाइट्स अपने चौथे या पांचवें मार्ग61पर प्रसारित रहते हैं, इसलिए उनके तीसरे मार्ग में एनएचईके का उपयोग आरएचईएस की खेती के लिए किया जाता है। प्राथमिक केराटिनोसाइट्स को उनकी उच्च संवेदनशीलता के कारण बहुत सावधानी से संभाला जाना चाहिए। कोशिकाओं की स्थिति को परेशान न करने के लिए, किसी भी समय सेल निलंबन का सावधान और धीमा पिपिंग बहुत महत्वपूर्ण है।

  1. 1 x 106 क्रायोप्रीवित एनएचईके के साथ एक शीशी को पानी में शीशी के हिस्से को जलमग्न करके 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में पिघलाएं। पानी के स्नान में 1-2 मिनट के लिए शीशी को इनक्यूबेट करें, जब तक कि केवल बर्फ का एक छोटा सा ज़ुल्फ़ दिखाई न दे।
    सावधानी: प्रदूषण से बचने के लिए पानी के स्नान में पूरी शीशी को न डूबें। 2 मिनट से अधिक समय तक कोशिकाओं को गल न लें; यह कोशिका व्यवहार्यता को कम कर सकता है। लेमिनार हुड में ट्यूब स्थानांतरित करने से पहले 70% इथेनॉल समाधान के साथ शीशी को मिटा दें।
  2. कोशिकाओं को बहुत सावधानी से पुनर्सुकृत करें, 2-3 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके। सेल निलंबन को दो T75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें पूर्व-गर्म विगलन माध्यम के कुल 15 एमएल होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप 6.7 x 104 कोशिकाओं/सेमी2का बीज घनत्व होता है।
    नोट: पहले दो मार्ग और क्रायोप्रीवित एनएचईके के विगलन के लिए, आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों के अनुसार सेल संस्कृति माध्यम का उपयोग किया जाता है।
  3. फ्लास्क को सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,और 95% सापेक्ष आर्द्रता (आरएच) में रखें।
  4. लगभग 24 घंटे के बाद, केराटिनसाइट फ्रीजिंग समाधान से डाइमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) को हटाने के लिए बेसल माध्यम द्वारा विगलन माध्यम को प्रतिस्थापित करें।
  5. बेसल मीडियम को हर दो दिन में रिफ्रेश करें।
  6. खेती के 4-6 दिनों के बाद, कोशिकाओं को लगभग 80% कॉन्फ्ल्यूंट होना चाहिए और आरएचईएस की खेती के लिए आवेषण में सीडिंग के लिए तैयार होना चाहिए।
    नोट: केराटिनोसाइट्स को उनकी प्रजनन क्षमता62को बनाए रखने के लिए अधिकतम 80% संगम तक उगाया जाना चाहिए। गल जाने वाली कोशिकाओं की संख्या को कई मापदंडों को ध्यान में रखना चाहिए, जैसे सेल पैसेज नंबर, विगलन पर सेल व्यवहार्यता, सीडिंग दक्षता के साथ-साथ दोहरीकरण समय।

3. एनएचईके की सीडिंग

नोट: यह प्रोटोकॉल 24-अच्छी वाहक प्लेट प्रारूप के भीतर उपयोग के लिए डिज़ाइन किया गया है। यदि अन्य प्लेट प्रारूपों की आवश्यकता है (उदाहरण के लिए, 12-वेल या 6-वेल प्रारूप), सीडिंग घनत्व और मध्यम मात्रा में अनुकूलन पर विचार किया जाना चाहिए। चित्रा 1 आरएचई खेती के लिए एक प्रस्तावित समय रेखा का सारांश देता है और खेती की स्थिति को दर्शाता है।

Figure 1
चित्रा 1:पुनर्गठन प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध समय रेखा। आरएचई मॉडल तैयारी, खेती प्रक्रिया और आवेदन (रासायनिक पदार्थ के संपर्क में) की प्रस्तुति। इस योजना में प्रत्येक चरण के लिए उपयुक्त सेल संस्कृति मीडिया प्रकार शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. जलमग्न माध्यम के 1.5 एमएल के साथ 24-अच्छी प्लेटों को प्री-फिल करें, आदर्श रूप से एक डिस्पेंसर पिपेट का उपयोग करके।
  2. एनएचईके की संस्कृति के लिए उपयोग किए जाने वाले T75 फ्लैक्स से बेसल माध्यम निकालें।
  3. प्रत्येक T75 फ्लास्क में पूर्व-गर्म पीबीएस के 5 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को कुल्ला करें।
  4. फ्लास्क से पीबीएस निकालें।
    नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है, क्योंकि माध्यम में प्रोटीन और कैल्शियम होता है जो ट्राइप्सिन गतिविधि को बाधित करेगा।
  5. प्रत्येक T75 फ्लास्क में पूर्व-गर्म 0.05% [v/v] ट्राइप्सिन/एथिलीन डायामाइन टेट्रा एसिटिक एसिड (EDTA) का 2-3 एमएल जोड़ें। सुनिश्चित करें कि ट्राइप्सिन समाधान समान रूप से फ्लास्क के सेल संस्कृति क्षेत्र पर वितरित किया जाता है।
    सावधानी: 2 मिलील मात्रा ऊपर उल्लिखित 80% संगम पर आधारित है। उच्च स्तर के साथ फ्लास्क के लिए 3 एमएल का उपयोग करें।
  6. सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,और 95% आरएच) में 4 मिनट के लिए फ्लास्क रखें। जांच करें कि कोशिकाओं को एक 10x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अलग । फ्लास्क की सतह से कोशिकाओं को छोड़ने में मदद करने के लिए हाथ की हथेली के खिलाफ फ्लास्क को रैप करें। ट्रिप्सिन समाधान में तैरती गोलाम कोशिकाओं के रूप में अलग कोशिकाओं को देखा जा सकता है।
    सावधानी: 6 मिनट से अधिक समय तक ट्रिप्पसिन में कोशिकाओं को न इनक्यूबेट न करें। ओवर-ट्राइप्सिनाइजेशन कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है और उनके पालन63को कम कर सकता है।
  7. एक बार जब सभी कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, प्रत्येक T75 फ्लास्क के लिए पूर्व गर्म ट्रिप्सिन अवरोधक के बराबर मात्रा (यानी, 2-3 एमएल) जोड़ें ।
  8. कोशिका निलंबन को फ्लास्क से एक सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  9. पूर्व-गर्म पीबीएस के 5 एमएल के साथ फ्लैक्स कुल्ला करें और इसे सेल निलंबन युक्त अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि अधिकांश कोशिकाओं को माइक्रोस्कोप के नीचे फ्लास्क में अवशिष्ट कोशिकाओं की संख्या की जांच करके एकत्र किया जाता है। फ्लास्क की सतह 95% खाली होनी चाहिए। यदि यह मामला नहीं है तो ट्राइपसिनाइजेशन चरण (3.3-3.9) को दोहराना संभव है। हालांकि ध्यान दें कि फिर से ट्राइपसिनाइजेशन से बचना चाहिए।
  10. 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर काटी गई कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें।
  11. ध्यान से अधिकांश सुपरनैंट को त्यागें, ट्यूब में लगभग 100-200 माइक्रोन छोड़ दें।
    चेतावनी: इस प्रक्रिया के दौरान गोली को एस्पिरेट न करें। 
  12. धीरे से जलमग्न माध्यम की एक कम मात्रा में कोशिकाओं की गोली resuspend, ऊपर और नीचे 5-10 बार एक समान सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए । सेल समुच्चय के गठन से बचने के लिए कम मात्रा (यानी, 500 माइक्रोन) से शुरू करें और कुल प्रति प्रारंभिक T75 फ्लास्क में डूबे हुए माध्यम के 1 मिलियन तक जोड़ें।
    नोट: धीरे-धीरे उंगलियों के साथ ट्यूब झटका ध्यान से सुपरनैंट में सेल गोली का एक हिस्सा भंग करने के लिए।
  13. ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन विधि का उपयोग करके निलंबन में कोशिकाओं की गणना करें।
    1. पतला 0.4% [v/v] ट्राइपैन ब्लू दाग और सेल सस्पेंशन 1:1 अनुपात में सेल सस्पेंशन, 0.4% के 10 माइक्रोन जोड़कर [v/v] ट्राइपैन ब्लू दाग को सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोन में जोड़कर। एक गिनती स्लाइड करने के लिए समाधान के 10 μL जोड़ें। ट्राइपैन ब्लू के साथ सेल सस्पेंशन को मिलाने के तुरंत बाद सेल काउंट को मापें, क्योंकि ट्राइपैन ब्लू 1 मिनट65से अधिक समय तक एक्सपोजर के बाद सेल व्यवहार्यता को कम करना शुरू कर देता है।
      सावधानी: ट्राइपैन ब्लू को एक संभावित म्यूटाजेन, कार्सिनोजन और टेराटोजेन64दिखाया गया था। देखभाल के साथ डाई संभाल और स्थानीय प्रयोगशाला नियमों के अनुसार सुरक्षित रूप से कचरे का निपटान ।
      नोट: ट्राइपैन ब्लू के उपयोग के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण गैर खतरनाक डाई एरिथ्रोसिन बी66है।
  14. अतिरिक्त जलमग्न माध्यम के साथ सेल निलंबन पतला 3.525 x 105 कोशिकाओं की एकाग्रता तक पहुंचने के लिए/
    Equation 1
    C1 = 3.12 में प्राप्त सेल निलंबन में गिना सेल एकाग्रता (कोशिकाओं/
    V1 = मात्रा 3.12 (एमएल) में कोशिकाओं के गोली को फिर से खर्च करने के लिए इस्तेमाल किया
    C2 = निलंबन में लक्षित सेल एकाग्रता (यानी, 3.525 x 105 कोशिकाएं/
    वी2 = मात्रा लक्षित सेल एकाग्रता (एमएल) तक पहुंचने के लिए जोड़ा जाएगा
    नोट: अनुशंसित संस्कृति सम्मिलित करने का सतह क्षेत्र 0.47 सेमी2है ; इसलिए, इसी सीडिंग घनत्व 3.75 x 105 कोशिकाओं /
  15. चरण3.14में प्राप्त पतला समाधान का दूसरा सेल काउंट (सी 3) करें। संस्कृति सम्मिलित में वरीयता प्राप्त होने के लिए सेल सस्पेंशन वॉल्यूम (वी4)की गणना करने के लिए समीकरण 2 का उपयोग करें:
    Equation 2
    C3 = निलंबन में लक्षित सेल एकाग्रता (यानी, 3.525 x 105 कोशिकाएं/
    V3 = सेल निलंबन की लक्षित मात्रा संस्कृति डालने में वरीयता प्राप्त करने के लिए (यानी, 0.5 एमएल)
    C4 = 3.14 में प्राप्त पतला निलंबन में गिना सेल एकाग्रता (कोशिकाओं/
    V4 = सेल निलंबन की वास्तविक मात्रा संस्कृति डालने में वरीयता प्राप्त करने के लिए (एमएल)
  16. अनुशंसित वाहक प्लेट के उच्चतम स्थान में 24 सेल संस्कृति आवेषण लटकाएं और वाहक प्लेट को जलमग्न माध्यम (सीएफ 3.1) से पहले से भरे 24-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें।
    सावधानी: वाहक प्लेट को बहु-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करते समय, यह सुनिश्चित करें कि बेसल डिब्बे से डालने झिल्ली और जलमग्न माध्यम के बीच कोई हवा के बुलबुले फंस नहीं रहे हैं, क्योंकि यह कोशिकाओं की खिला को प्रभावित करेगा और अंततः आरएचई व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान से समझौता करेगा।
  17. प्रत्येक डालने के लिए सेल निलंबन के निर्धारित मात्रा V4 (समीकरण 2 से) जोड़ें।
    नोट: संस्कृति आवेषण के लिए सेल निलंबन को सही ढंग से वितरित करने के लिए रिवर्स पिपटिंग तकनीक का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    सावधानी: संस्कृति सम्मिलित में सेल निलंबन वितरित करते समय झिल्ली को नुकसान न पहुंचाएं। एक एहतियात झिल्ली की सतह को छूने के बिना डालने प्रणाली की दीवार के साथ सेल निलंबन बांटना है।
  18. सीडिंग के बाद, एक किनारे प्रभाव (यानी, सभी कुओं67के बीच गैर-समान तापमान वितरण) को दूर करने के लिए, कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए 24-अच्छी प्लेटों को इनक्यूबेट करें। इस दौरान प्लेट्स को मूव न करें।
  19. प्लेटों को सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2और 95% आरएच) में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को तीन दिनों तक जलमग्न परिस्थितियों में बनाए रखा जाता है ।
    नोट: ऊतक परिवर्तनशीलता से बचने के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक डालने को गर्मी की समान मात्रा प्राप्त होती है, सीडिंग के बाद इनक्यूबेटर में प्लेटों को ढेर न करें। तीन दिनों के बाद (यानी, अली खेती के दौरान), प्लेटों की स्टैकिंग संभव है।

4. एयर-लिक्विड इंटरफेस पर खेती

  1. सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,और 95% आरएच) में तीन दिन की इनक्यूबेशन के बाद, उन कोशिकाओं को बेनकाब करें जिन्होंने एप्लिक डिब्बे से डूबे हुए माध्यम को हटाकर अली को झिल्ली की सतह का पालन किया है अधिमानतः आकांक्षा प्रणाली और ग्लास पेस्टर पिपेट का उपयोग करके।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एपिकल डिब्बे से डूबे माध्यम को मैनुअल माइक्रोपिपेट के साथ हटाया जा सकता है।
  2. ताजा पूर्व गरम अली माध्यम के १.५ एमएल के साथ नई 24 अच्छी प्लेटों को भरने और नई बहु अच्छी तरह से प्लेटों के लिए संस्कृति आवेषण के साथ वाहक प्लेटों हस्तांतरण ।
  3. मल्टी-वेल प्लेटों को सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,और 95% आरएच) में वापस स्थानांतरित करें।
  4. अली माध्यम को हर 2-3 दिन में 14 दिनों तक ताज़ा करें।
  5. दो चरणों में ताज़ा करें: 1) एक नई प्लेट तैयार करें जिसमें 1.5 एमएल/ ताजा पूर्व-गर्म अली माध्यम और 2 का अच्छा) वाहक प्लेट को नई प्लेट में स्थानांतरित करें।
    सावधानी: संपूर्ण पुनर्गठन प्रक्रिया के दौरान संभावित संदूषण से संरक्षित आरएचई को रखने के लिए वाहक प्लेट को कवर करने वाले ढक्कन को हटाना सबसे अच्छा नहीं है।
    नोट: अली कदम एक स्तरीकृत एपिडर्मल मॉडल के विकास के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह केराटिनोसाइट्स68के टर्मिनल भेदभाव की अनुमति देता है। अली में जाने के बाद, आवेषण के एक दृश्य नियंत्रण की आवश्यकता होती है, यह जांचने के लिए कि क्या 'टपका हुआ ऊतक' हैं: बसोलेटरल डिब्बे से आने वाले ऊतक सतह पर मध्यम बूंदें। यदि रिसाव अली दिन 3 में होता है, तो धीरे-धीरे ऊतक की सतह को छूने के बिना संस्कृति डालने से माध्यम को हटा दें। यदि रिसाव बना रहता है, तो लीक ऊतकों को त्यागने की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह एक संकेत है कि आरएचई मॉडल में कोई सही बाधा गठन नहीं है।
  6. पुनर्गठन प्रक्रिया के अंत में, ऊतकों को उदाहरण के लिए ऑक्सीडेटिव तनाव या सूजन के लिए प्रेरित करने के लिए विभिन्न तनावों से अवगत कराया जा सकता है। समानांतर में, उन्हें रासायनिक यौगिकों या कॉस्मेटिक अवयवों के साथ इलाज किया जा सकता है। नोट: एक्सपोजर/उपचार के दौरान, ऊतकों को आमतौर पर अली D14 से शुरू होने वाले जलमग्न माध्यम में बनाए रखा जाता है । जब ऊतकों के लंबे समय तक (यानी, 48-72 घंटे) के लिए उजागर/उपचार की उम्मीद की जाती है, तो यह सिफारिश की जाती है (i) अली खेती की प्रक्रिया में पहले एक्सपोजर/उपचार शुरू करने के लिए, जैसे D7-D9, व्यवहार्य परतों की पतली और अनुसूचित जाति के मोटा होने से बचने के लिए, और (ii) अली माध्यम में ऊतकों को इनक्यूबेट करने के लिए, सेल प्रसार को उत्तेजित करने के लिए ।
  7. आरएचई संचयन के लिए, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, व्यवहार्यता परख, प्रोटीन/आरएनए निष्कर्षण, और एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) के लिए ब्याज के समय बिंदु पर ऊतकों और सेल संस्कृति माध्यम को इकट्ठा करें।

Representative Results

एनएचईके्स को 2डी में सुसंस्कृत एक पारंपरिक आकृति विज्ञान प्रदर्शित करता है जिसमें एक सुसंगत बहुभुज आकार(चित्रा 2 ए)। जैसा कि ऊपर वर्णित है, एनएचईके को लगभग 80% की एक सम्मिलता तक पहुंचने के बाद संस्कृति आवेषण में वरीयता प्राप्त है। एचएंडई स्टेनिंग और TEM का उपयोग करके आरएचईएस की आकृति विज्ञान का विश्लेषण किया गया था। अली में 15 दिनों के बाद, एक पूरी तरह से स्तरीकृत ऊतक प्राप्त किया जाता है जैसा कि इसके चार मुख्य एपिडर्मल परतों द्वारा इंगित किया जाता है: एसबी, एसएस, एसजी, और अनुसूचित जाति(चित्रा 2B)। एसबी लेयर में कोशिकाओं का आकार स्तंभीय होता है। आरएचई की ऊपरी परतों की ओर दूसरी परत से, एनएचईके कोशिका आकृति विज्ञान में परिवर्तन (एसबी परत में एक स्तंभीय आकार से, एसएस परत में एक स्पिनस आकार की ओर) द्वारा मनाए गए अंतर के रूप में अंतर करते हैं। एसजी लेयर में कोशिकाओं में अधिक चपटा आकार होता है और केराटोयालिन कणिकाओं (केजी) को प्रदर्शित किया जाता है जो साइटोप्लाज्म में बैंगनी बिंदुओं के रूप में दर्शाया जाता है। उनकी विशेषता दौर और तारकीय आकार एच एंड ई छवि(चित्रा 2C)पर सफेद तीर द्वारा प्रकाश डाला गया है । अनुसूचित जाति में कोशिकाओं, मरणासन्न विभेदित कर रहे है और पूरी तरह से चपटा और एक सेल नाभिक की कमी है । स्तरीकृत RhEs 84.3 ± 2.4 माइक्रोन की एक समग्र मोटाई है और उनके अनुसूचित जाति 3.2 माइक्रोन(चित्रा 2D)± 19.6 की मोटाई है। ये मान देशी मानव त्वचा के लिए सूचित किए गए लोगों के बराबर हैं, यानी, क्रमशः 60-120 माइक्रोन और 10-20 माइक्रोन, क्रमशः69। व्यवहार्य परतों की संख्या 6-7 है, जो देशी मानव त्वचा की तुलना में कम है, लगभग 7-1470है। पुनर्गठन प्रोटोकॉल (यानी, 7, 10, 13 और 15 दिनों) में विभिन्न समय बिंदुओं पर आरएचईएस का अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण समय के साथ कॉर्नियोसाइट परतों की बढ़ी हुई संख्या के साथ आरएचईएस की कॉर्निफिकेशन प्रक्रिया का पताचलता है (चित्रा 2E)। अली में 15 दिनों के बाद, आरएचई ऊतक का एससी लगभग 15-25 परतों से बना है, जो देशी मानव त्वचा (यानी, 15-20 परतों)69के लिए सूचित मूल्य के बराबर है।

Figure 2
चित्र 2:प्राथमिक केराटिनोसाइट्स और मानव एपिडर्मिस को खंगाला गया।(ए)आवेषण पर सीडिंग से पहले प्राथमिक केराटिनोसाइट्स की चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी छवि। स्केल बार आरएचई की 50 माइक्रोन(बी-सी)एचएंडई ब्राइट फील्ड माइक्रोस्कोपी इमेज है। स्केल बार 50 माइक्रोन(बी)और 25 माइक्रोन(सी)है। (घ)आरएचई और अनुसूचित जाति की मोटाई का मात्राकरण (मतलब ± एसईएम, एन = 3)। (ई)अली में 7, 10, 13 और 15 दिनों के बाद आरएचई क्रॉस-सेक्शन की ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियां । स्केल बार 4 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

उनके भेदभाव चरण के अनुसार, 3 डी में बढ़ रहे NHEKs उनके भेदभाव चरण के अनुसार विभिन्न प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल दिखाते हैं । प्रारंभिक चरण केरैटिनोसाइट भेदभाव (यानी, केराटिन 10), देर से चरण केराटिनोसाइट विभेदन (यानी, इनोलूक्राइन, लोरिक्रिन और फिलैग्रिन) के लिए विशिष्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति, और आरएचईएस में केराटिनोसाइट आसंजन (यानी, डिमोग्लेइन 1) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। इनवोलुक्रिन अभिव्यक्ति मुख्य रूप से एसजी परत में स्थित दिखाई देती है क्योंकि इसकी अभिव्यक्ति पहले भेदभाव प्रक्रिया(चित्रा 3 डी)के दौरान शुरू की जाती है, जबकि फिलाग्रिन और लोरिक्रिन को ऊपरी परतों(चित्रा 3B-C)में व्यक्त किया जाता है। केराटिन 10 अभिव्यक्ति एसबी लेयर(चित्रा 3E)को छोड़कर सभी व्यवहार्य परतों में पाई गई। आरएचईएस कार्यात्मक डेस्मोसोमल जंक्शनों को प्रदर्शित करता है, जैसा कि व्यवहार्य एपिडर्मल परतों(चित्रा 3F)के अंतरकोशिकीय अंतरिक्ष में डेस्मोग्लेइन 1 की अभिव्यक्ति द्वारा इंगित किया गया है। समाप्त करने के लिए, सभी पांच मार्कर व्यक्त किए जाते हैं और उपयुक्त एपिडर्मल परतों में स्थित होते हैं और एक स्वस्थ एपिडर्मल भेदभाव प्रक्रिया में अनुवाद करते हैं।

Figure 3
चित्र 3:एपिडर्मल विभेदन, ऊतक आसंजन, और पुनर्निर्मित मानव एपिडर्मिस की ऊतक अखंडता। (ए)एचएंडई ब्राइट फील्ड माइक्रोस्कोपी इमेज ऑफ आरएचई। कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियां(बी)फिलाग्रिन (एफएलजी),(सी)लोरिक्रिन (LOR),(डी)इनोलूक्राइन (आईएनवी),(ई)केराटिन 10 (K10), और (एफ) डेस्मोग्लेइन 1 (डीएसजी-1) मजेंटा में प्रतिनिधित्व करती हैं। नाभिक धुंधला (DAPI) नीले रंग में प्रतिनिधित्व किया है। स्केल बार 25 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

आरएचई मॉडल के बैरियर गुणों की जांच ऊतक व्यवहार्यता और अखंडता दोनों का आकलन करके की गई थी । ऊतक अखंडता एक voltohmmmeter का उपयोग कर TEER मापने के द्वारा 15 दिनों के बाद निर्धारित किया गया था । 2567 ± 415 Ω.सेमी2 मूल्य आरएचईएस के लिए दर्ज एक सतत बाधा(चित्रा 4A)के गठन का अनुवाद करते हैं। वे मूल्य आरएचई मॉडल 71 ,72, 73,74के लिए सूचित किए गए लोगों के साथ हैं । इसके अतिरिक्त, एक साइटोटॉक्सिक संदर्भ रसायन (यानी, ट्राइटन एक्स-100) के लिए आवश्यक जोखिम समय ऊतक व्यवहार्यता को 50% (ईटी50)तक कम करने के लिए एक थियाजोल ब्लू टेट्राजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) परख के साथ निर्धारित किया गया था। ईटी५० मूल्य RhE के लिए मापा २.१ घंटे था । यह मूल्य अन्य 3 डी एपिडर्मल मॉडल की स्वीकृति सीमा के भीतर आता है जो जलन वर्गीकरण (ओईसीडी दिशानिर्देश 439)19की विश्वसनीय भविष्यवाणी के लिए योग्य हैं।

Figure 4
चित्रा 4:पुनर्निर्मित मानव एपिडर्मिस के बैरियर गुण। (ए)ऊतक अखंडता ट्रांसेपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध के साथ मापा (मतलब ± SEM, n = 6) । (ख)ईटी50 ऊतक व्यवहार्यता (यानी, एमटीटी परख) को मापने के द्वारा निर्धारित 1% ट्राइटन एक्स-100 (मतलब ± एसईएम, एन = 3) के सामयिक जोखिम पर।

ज्ञात प्रोइनफ्लेमरी उत्तेजनाओं पर आरएचईएस की जवाबदेही की जांच की गई थी। RhEs प्रणालीबद्ध व्यवहार किया गया, यानी, बेसोलेटरल डिब्बे के माध्यम में उत्तेजनाओं के अलावा, १०० μg/mL Escherichia कोलाई lipopolysaccharide (एलपीएस) और ४० एनजी/एमएल ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNF-α) का उपयोग कर । 24 घंटे की उत्तेजनाओं के बाद सेल कल्चर मीडियम को इकट्ठा किया गया। साइटोटॉक्सीसिटी को लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) परख का उपयोग करके मापा गया था और एक ज्ञात झिल्ली विघटनकारी, ट्राइटन एक्स-100 डिटर्जेंट(चित्रा 5)के मूल्यों की तुलना में मापा गया था। एक महत्वपूर्ण वृद्धि (पी < ०.०५, एक तरह से ANOVA, डननेट के कई तुलना परीक्षण) RhEs में LDH गतिविधि में दिखाया गया था Triton X-१०० के साथ इलाज किया । एलपीएस और टीएनएफ-α उपचार दोनों साइटोटॉक्सिक नहीं दिखाया ।

Figure 5
चित्र 5:साइटोटॉक्सीसिटी को लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज़ (एलडीएच) परख के माध्यम से मापा जाता है। डेटा को नियंत्रण, अनुपचारित ऊतकों (सीटीआरएल) के सापेक्ष मूल्यों के रूप में प्रस्तुत किया जाता है; मतलब ± SEM, n = 9 (ट्राइटन एक्स-100), एन = 8 (एलपीएस), एन = 3 (टीएनएफ-α)। महत्व एक तरह से ANOVA, डंनेट के कई तुलना परीक्षण के साथ परीक्षण किया गया था । एस्टरिस्क सीटीआरएल की तुलना में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाता है, ****पी < 0.0001)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

आरएचई माध्यम में इंटरल्यूकिन 1 अल्फा (आईएल-1α) और इंटरल्यूकिन 8 (आईएल-8) की रिहाई को ELISAs का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। चित्रा 6 एलपीएस और टीएनएफ-α के साथ चुनौती पर RhEs द्वारा मात्रात्मक और सापेक्ष आईएल-1α और आईएल-8 रिलीज दोनों से पता चलता है । एलपीएस उपचार के परिणामस्वरूप सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण (पी < 0.05, अकीदतित छात्र का टी-टेस्ट) आईएल-8 (9.6 ± 1.0 गुना वृद्धि) और आईएल-1α (2.7 ± 1.3 गुना वृद्धि) की रिहाई के लिए प्रेरित किया गया। टीएनएफ-α ने आईएल-8 रिलीज को काफी प्रेरित नहीं किया, भले ही आईएल-8 के स्तर में वृद्धि की प्रवृत्ति देखी गई (2.3 ± 0.8 गुना वृद्धि)। हालांकि, टीएनएफ-α ने काफी किया (पी < 0.05, अकीदतित छात्र का टी-टेस्ट) ट्रिगर आईएल-1α रिलीज (1.8 ± 0.5 गुना वृद्धि)।

Figure 6
चित्र 6:पुनर्निर्मित मानव एपिडर्मिस में प्रोइनफ्लेमेय प्रतिक्रियाएं। एलपीएस(ए)और टीएनएफ-α(बी)के साथ 24 घंटे की चुनौती पर आरएचई द्वारा आईएल-8 रिलीज की सांद्रता। डेटा को मतलब ± एसईएम, एन = 8 (एलपीएस), एन = 3 (टीएनएफ-α) के रूप में दर्शाया गया है। (ग)डेटा को नियंत्रण, अनुपचारित ऊतकों (सीटीआरएल) ± एसईएम, एन = 8 (एलपीएस), एन = 3 (टीएनएफ-α) की तुलना में सापेक्ष मूल्य के मतलब के रूप में दर्शाया जाता है। एलपीएस(डी)और टीएनएफ-α(ई)के साथ 24 घंटे की चुनौती पर आरएचई की आईएल-1α रिलीज की एकाग्रता। डेटा को मतलब ± एसईएम, एन = 8 (एलपीएस), एन = 3 (टीएनएफ-α) के रूप में दर्शाया गया है। (एफ)डेटा सीटीआरएल ± एसईएम, एन = 4 (एलपीएस), एन = 3 (टीएनएफ-α) की तुलना में सापेक्ष मूल्य के मतलब के रूप में दर्शाया गया है। महत्व एक अकीदतित छात्र के टी परीक्षण द्वारा परीक्षण किया गया था । एस्टरिस्क सीटीआरएल की तुलना में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण मतभेदों को दर्शाता है, * पी < 0.05, **p < 0.0001)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

आरएचई का व्यापक रूप से फार्मास्यूटिकल और डर्माटो-कॉस्मेटिक क्षेत्रों में स्क्रीनिंग टूल के रूप में उपयोग किया जाता है36,75,76,77,78. हालांकि कई कंपनियों ने इस तरह के RhEs व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कराया है, वे महंगे रहते है और नए अनुसंधान सवालों को संबोधित करने के लिए आवश्यक के रूप में खेती मापदंडों भिंन करने की संभावना को सीमित । यह पत्र इन-हाउस आरएचईएस की उत्पादन प्रक्रिया को एक मजबूत और विश्वसनीय तरीके से बताता है और पशु परीक्षण के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में मॉडल की प्रासंगिकता की पुष्टि करने के लिए प्राप्त ऊतकों का विस्तृत लक्षण वर्णन प्रदान करता है।

प्रोटोकॉल में कुछ कदम उचित keratinocyte भेदभाव और RhE प्रजनन को आश्वस्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । यह इष्टतम कोशिकाओं, मध्यम प्रकार (एस) और खेती की स्थिति का उपयोग करके किया जा सकता है। प्रस्तावित आरएचई मॉडल में, वयस्क एनएचईके की तुलना में एंटीजेनिक एक्सपोजर की कमी के लिए नवजात एनएचईके का चयन किया गया था। इसके अलावा, केराटिनोसाइट्स अंतर-प्रजातियों परिवर्तनशीलता से बचने के लिए कोकेशियान जातीयता तक सीमित थे। प्राथमिक केराटिनोसाइट्स का उपयोग आमतौर पर अंतर करने और स्तरीकरण करने की उनकी क्षमता के लिए किया जाता है79. वे व्यावसायिक रूप से या वयस्क त्वचा से घर में अलगाव द्वारा प्राप्त किया जा सकता है80. पॉलीकार्बोनेट झिल्ली पर एक सेल लाइन (यानी, HaCaT) की खेती ने भेदभाव को विफल करने के लिए दिखाया है और बाधा गठन के लिए आवश्यक लिपिड को संश्लेषित करने के लिए एक बिगड़ा क्षमता का प्रदर्शन किया है81. हालांकि, विभिन्न संस्कृति मैट्रिस के शामिल होने, जैसे हाइड्रोगेल, कोलेजन, फाइब्रिन, और गोलाकार संस्कृतियों, 3 डी त्वचा मॉडल के सफल विकास के परिणामस्वरूप78,82,83,84,85,86. अमर सेल लाइनों, N/TERT, RhEs के विकास के लिए उपयुक्त दिखाया गया है35. प्राथमिक केराटिनोसाइट्स अपने चौथे या पांचवें मार्ग पर प्रसारित रहते हैं61, इसलिए वर्तमान प्रोटोकॉल में उनके तीसरे मार्ग में केराटिनोसाइट्स का उपयोग शामिल है। डी Vuyst एट अल ने दिखा दिया है कि सेल सीडिंग घनत्व महत्व का है और पर्याप्त होने की जरूरत है (यानी, ≥ 2.5x105 कोशिकाएं/सेमी2) यह सुनिश्चित करने के लिए कि बसोटेरल डिब्बे से माध्यम एपिकल डिब्बे तक फैलाना नहीं है। एक अपर्याप्त सीडिंग घनत्व (यानी, < 2.5x105 कोशिकाएं/सेमी2) एक उचित बाधा बनाने में असमर्थता में परिणाम कर सकते हैं, जो बेसोलाटरल से एपिकल कंपार्टमेंट तक माध्यम के प्रसार से संकेत मिलता है, जिसके परिणामस्वरूप अली संस्कृति की स्थिति के बजाय जलमग्न हो जाता है62. सीरम मुक्त keratinocyte विकास माध्यम (देखें सामग्री की तालिका) प्रजनन प्रयोजनों के लिए पसंद किया गया था, क्योंकि यह एक रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम के साथ काम करने का लाभ प्रदान करता है और संदूषण के जोखिम को कम कर देता है। इस माध्यम में कैल्शियम एकाग्रता कम होती है (यानी, 60 माइक्रोन) और इसलिए केराटिनोसाइट्स के प्रसार को उत्तेजित करता है87. आरएचई खेती के पहले चरण से कैल्शियम एकाग्रता (यानी, 1.5 mM) में वृद्धि, केराटिनोसाइट भेदभाव और त्वचा बाधा गठन और हो्योस्टेसिस के पक्ष में है49. इसके अलावा, अली माध्यम को एस्कॉर्बिक एसिड के साथ पूरक किया जाता है, जो अनुसूचित जाति लिपिड के गठन और भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है52,53,54. अली माध्यम में केजीएफ भी होता है, जो फाइब्रोब्लास्ट द्वारा स्रावित एक विकास कारक है जो केराटिनोसाइट ट्रांसमेम्ब्रान रिसेप्टर्स को बांध सकता है और सक्रियण पर भेदभाव और घाव की मरम्मत में दोहरी भूमिका होती है55,88. आरएचई को ताजा पोषक तत्वों की निरंतर आपूर्ति प्रदान करने के लिए, विशिष्ट समय अंतराल पर अली माध्यम को ताज़ा करना महत्वपूर्ण है। एक वाहक प्लेट प्रणाली का उपयोग बड़े पैमाने पर आरएचई खेती के लिए महत्वपूर्ण है (यानी, 24 आवेषण/प्लेट)। यह समय की बचत का लाभ प्रदान करता है, संदूषण के जोखिम को कम करने, और मानव त्रुटियों की शुरूआत के लिए कम जगह छोड़ देता है । यह मीडिया की उच्च मात्रा (यानी, 1.5 एमएल) में संस्कृति आरएचई को भी संभावना प्रदान करता है, जो अली माध्यम के ताज़ा होने की आवश्यक संख्या को कम करता है। इसके अतिरिक्त, यह ताजा माध्यम के साथ एक प्लेट में आवेषण की एक पूरी प्लेट स्थानांतरित करने की संभावना प्रदान करता है, व्यक्तिगत रूप से आवेषण के साथ संपर्क से बचने या प्लेट ढक्कन को उजागर करता है।

आरएचई मॉडल की कई सीमाएं हैं जिन्हें नोट किया जाना चाहिए। देशी मानव त्वचा में बेसल परत में केराटिनोसाइट्स के प्रसार और अनुसूचित जाति में कॉर्नियोसाइट्स की टुकड़ी (यानी, डेक्वेमेशन) के बीच एक संतुलन है89. हालांकि, इन विट्रो, डेस्क्वेशन नहीं होता है। इसलिए, कॉर्नियोसाइट्स आरएचई से जुड़े रहते हैं और एक मोटी अनुसूचित जाति बनाते हैं जो कम शारीरिक रूप से प्रासंगिक है। इसलिए, आरएचईएस की एक सीमित खेती समय-समय पर है। इसके अलावा, यह आरएचई मॉडल सरल और सीधा है, क्योंकि इसमें एक विलक्षण सेल प्रकार होता है, यानी केराटिनोसिट, जो एपिडर्मिस का सबसे प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार है। हालांकि, एपिडर्मिस में अन्य सेल प्रकार के निवासी हैं, जैसे मेलानोसाइट्स, डेंड्रिटिक कोशिकाएं (यानी, लैंगरहंस कोशिकाएं), टी कोशिकाएं (जैसे, सीडी 8+ कोशिकाओं), और मर्केल कोशिकाओं13. त्वचा मॉडल की शारीरिक प्रासंगिकता को बढ़ाने के लिए, शोधकर्ताओं ने मेलानोसाइट्स जोड़कर त्वचा मॉडल को और अधिक जटिल बना दिया है38 , प्रतिरक्षा कोशिकाएं39, या रोगी से व्युत्पन्न कोशिकाएं90. एक ध्यान में रखना चाहिए कि मानव त्वचा मॉडल के बाधा गुण देशी मानव त्वचा की तुलना में अलग हैं, विशेष रूप से एक अलग अनुसूचित जाति लिपिड संरचना और एक उच्च बाधा पारमशीलता के कारण 91,92,93,94,95. हालांकि, कई अध्ययनों हाइपोक्सिया के तहत खेती द्वारा मानव त्वचा मॉडल के बाधा गुणों में परिवर्तन की सूचना दी है96 या सापेक्ष आर्द्रता में कमी97, चिटोसन के साथ डर्मल मैट्रिक्स का मॉडुलन98, और संस्कृति माध्यम में मुक्त फैटी एसिड में परिवर्तन99. इसके अलावा, सरल और अधिक जटिल आरएचई दोनों में, संस्कृति की स्थिति और मध्यम संरचना को पैथोलॉजिकल सुविधाओं की नकल करने के लिए संग्राहक किया जा सकता है। साइटोकिन्स के साथ मॉडल को चुनौती देकर, एक असामान्य आकृति विज्ञान100 और जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन स्थापित किया जा सकता है जो आम तौर पर आम त्वचा विकारों में मनाया जाता है, जैसे एटोपिक डर्मेटाइटिस और सोरायसिस35,101,102,103,104,105. 3 डी मॉडल की पुनर्गठन प्रक्रिया शुरू करने से पहले केराटिनोसाइट्स में विशिष्ट जीन को मुंह से रखना त्वचा विकारों की विशेषताओं की नकल करने और नए चिकित्सीय समाधानों की जांच करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक और दृष्टिकोण है106,107. केवल एक एपिडर्मल परत मॉडलिंग के अलावा, एक डर्मल डिब्बे को मॉडल में शामिल किया जा सकता है (यानी, मानव त्वचा समकक्ष या पूर्ण मोटाई मॉडल का नाम) आरएचई पुनर्गठन से पहले कोलेजन मैट्रिक्स में फाइब्रोब्लास्ट एम्बेड करके, जिससे यह अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक और उम्र बढ़ने और घाव भरने से संबंधित अध्ययनों के लिए उपयुक्त हो जाता है108,109,110. इसके अतिरिक्त, मेलानोमा प्रगति का अध्ययन करने के लिए मानव त्वचा समकक्ष में ट्यूमर स्फेरॉइड जोड़े गए हैं111,112. स्किन मॉडल के क्षेत्र में नवीनतम प्रगति बायो-प्रिंटिंग और स्किन-ऑन-ए-चिप हैं। कई अनुसंधान समूहों (perfusable) जैव मुद्रित त्वचा समकक्ष के विकास में हाल ही में सफल रहे है45,113,114. प्रस्तावित प्रोटोकॉल एक 24 अच्छी तरह से प्रारूप और एक वाहक प्लेट का लाभ लेता है, आवेषण से परहेज करने के लिए व्यक्तिगत रूप से संभाला जाएगा । हालांकि, अध्ययन पैमाने अभी भी काफी सीमित है और स्वचालन का अभाव है । जैव-मुद्रण या त्वचा-ऑन-ए-चिप के उपयोग को लागू करके, छोटे त्वचा मॉडल का उपयोग अधिक स्वचालित प्रक्रियाओं और बड़े पैमाने पर किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित आरएचई में पहले से विकसित और अच्छी तरह से विशेषता वाले वाणिज्यिक एपिडर्मल मॉडल में कई समानताएं हैं। रूपात्मक विश्लेषण ने दिखा दिया है कि हालांकि प्रस्तावित आरएचई मॉडल में व्यवहार्य परतों की संख्या देशी मानव त्वचा (यानी, 7-14 की तुलना में 6-7) की तुलना में कम है, यह एपिडर्म आरएचई मॉडल (यानी, 8-12)70के बराबर है। इसी तरह एपिडर्म, एपिस्किन और स्किनएथिक मॉडल के लिए, ऊपरी आरएचई परत घनी पैक कॉर्नियोसाइट परतों28के बास्केट-बुनाई पैटर्न को दर्शाती है। इसके अलावा, TEM विश्लेषण से पता चला है कि प्रस्तावित RhE मॉडल (यानी, 15-25) में अनुसूचित जाति परतों की संख्या EpiDerm (यानी, 16-25)७०के बराबर है । कुल मिलाकर, प्रस्तावित आरएचई मॉडल अन्य व्यावसायीकृत एपिडर्मल मॉडल के समान संरचना को दर्शाता है, जो देशी मानव एपिडर्मिस की नकल करता है। टीईईआर द्वारा मापी गई ऊतक अखंडता वाणिज्यिक आरएचई मॉडल (यानी, 3000-5600 Ω.सेमी2)71, 72,73 और अन्य इन-हाउस आरएचईएस (यानी लगभग 5000 Ω.सेमी2)74,115के बीच है। प्रस्तावित आरएचई मॉडल को अच्छी तरह से विभेदित दिखाया गया है, जैसा कि भेदभाव और ऊतक आसंजन मार्कर की उपस्थिति और सही स्थानीयकरण द्वारा इंगित किया गया है। इसके अलावा, प्रस्तावित आरएचई मॉडल प्रोइनफ्लेमेटरी उत्तेजनाओं (यानी एलपीएस और टीएनएफ-α) के लिए उत्तरदायी होने के लिए उत्तरदायी होने का पता चलता है।

समाप्त करने के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे एक विश्वसनीय तरीके से RhEs का उत्पादन करने के लिए और एक अपेक्षाकृत बड़े पैमाने पर दोनों अकादमिक और निजी संस्थानों में शोधकर्ताओं की जरूरतों को पूरा करने के लिए । प्रस्तावित आरएचई मॉडल में अन्य मौजूदा वाणिज्यिक मॉडलों के लिए समान आकृति विज्ञान, एपिडर्मल भेदभाव और जैविक जवाबदेही दिखाई गई है। यह दोनों दवा और डर्माटो कॉस्मेटिक क्षेत्र के लिए एक वैकल्पिक उपकरण प्रदान करता है जब एक प्रासंगिक त्वचा मॉडल के लिए उपयोग की आवश्यकता है ।

Disclosures

मार्क ईमैन और बेनेडेटा पेट्राक्का डाउ सिलिकॉन बेल्जियम के कर्मचारी हैं । अन्य सभी लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है ।

Acknowledgments

यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम मैरी Skłodowska-क्यूरी अनुदान के तहत अनुदान समझौते के साथ नहीं 765602 इस काम वित्त पोषित । सभी लेखकों एडॉल्फे Merkle फाउंडेशन और फेरारा विश्वविद्यालय के समर्थन को पहचानते है और कृतज्ञता से डो सिलिकॉन बेल्जियम स्वीकार करते हैं । डॉ मिगुएल स्पुच-कलवर को आरएचई खेती प्रक्रिया की चित्रमय छवियों को तैयार करने के लिए स्वीकार किया जाता है। लेखक डॉ बारबरा ड्रेसलर, डॉ फ्रैंको सेरवेलाटी और डॉ एग्नेस टेसियर को उनके तकनीकी समर्थन और चर्चाओं के लिए धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma Aldrich A6283 Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.
Antibiotic-antimycotic (100x) Thermo Fisher Scientific (Gibco) 15240062
Aqueous Eosin Y solution Sigma Aldrich HT110280 Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich or Merck C8106 or 1.02378.0500 Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 °C.  It is recommended to prepare new aliquots every 6 months.
DAPI Roche 10236276001 Prepare a stock at 100 μg/mL and store aliquots at -20 °C. Working conditon is 1 μg/mL.
Entellan mounting medium Merck 1.07960.0500 Mounting medium for H&E staining.
EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium) Thermo Fisher Scientific (Gibco) MEPI500CA Contains 0.06 mM of Ca2+.
Ethanol absolute Any supplier N/A
Formalin 10% Leica Biosystems 3800770
Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x) Thermo Fisher Scientific (Gibco) S0015 To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 μg/mL hydrocortisone,5 μg/mL bovine transferrin, and 0.01 µg/mL human recombinant insulin-like growth factor-I.
Isopropanol Biosolve B.V. 0016264102BS
Kaiser's glycerol gelatine, phenol-free Merck 1.08635.0100 Mounting medium for IF staining.
Keratinocyte growth factor (KGF) R&D Systems 251-KG-050 Reconstitute KGF protein at 100 μg/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20°C. 
Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit Roche 4744926001
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate  Sigma-Aldrich A8960 Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20°C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark.
Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5 Sigma-Aldrich L4524 Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 °C. Working concentration is 100 μg/mL. 
Mayer’s Haematoxylin Sigma-Aldrich MHS80
Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) Lonza 00192906 Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors.
Phosphate-buffered saline Thermo Fisher Scientific (Gibco) 10010056 or 10010-015 Reference numbers can vary between countries.
Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-α) ImmunoTools 11344483 Prepare a stock of 100 μg/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL
Sterile ultrapure water Any supplier N/A
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma-Aldrich M5655 Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL.
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93426
Trypan blue (0.4% [v/v]) Any supplier N/A
Trypsin inhibitor Thermo Fisher Scientific (Gibco) R007100
Trypsin/EDTA (0.05% [v/v]) Thermo Fisher Scientific (Gibco) 25300054
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam Ab150113
Tri-sodium citrate dihydrate Merck 1.06448.0500 For antigen retrieval buffer for IF staining. 
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Dylight 488) Agrisera AS09 633
Filaggrin Mouse antibody BioTechne (Novus Biologicals) NBP2-53243
Involucrin Rabbit antibody BioTechne (Novus Biologicals) NBP2-33742
Keratin 10 Mouse antibody BioTechne (Novus Biologicals) NBP2-32962
Desmoglein-1 Mouse antibody  BioTechne (Novus Biologicals) MAB944
Loricrin Rabbit antibody BioTechne (Novus Biologicals) NBP1-33610

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Antioxidants & Redox Signaling. , (2002).
  2. Pouillot, A., Dayan, N., Polla, A. S., Polla, L. L., Polla, B. S. The stratum corneum: a double paradox. Journal of Cosmetic Dermatology. 7 (2), 143-148 (2008).
  3. Moore, K. L., Dalley, A. F. Clinically Orientated Anatomy. , (2010).
  4. Barthel, R., Aberdam, D. Epidermal stem cells. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 19 (4), 405-413 (2005).
  5. Green, K. J., Simpson, C. L. Desmosomes: new perspectives on a classic. Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2499-2515 (2007).
  6. Feingold, K. R. Lamellar bodies: the key to cutaneous barrier function. Journal of Investigative Dermatology. 132 (8), 1951-1953 (2012).
  7. Elias, M. P., Feingold, K. R., Fartasch, M. The epidermal lamellar body as a multifunctional secretory organelle. Skin Barrier. , 261-272 (2006).
  8. Tobin, D. J. Biochemistry of human skin-our brain on the outside. Chemical society reviews. 35 (1), 52-67 (2006).
  9. Bouwstra, J. A., Ponec, M. The skin barrier in healthy and diseased state. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1758 (12), 2080-2095 (2006).
  10. Weinstein, G. D., McCullough, J. L., Ross, P. Cell proliferation in normal epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 623-628 (1984).
  11. Madison, K. C. Barrier function of the skin: "la raison d'être" of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
  12. Suter, M. M., et al. The keratinocyte in epidermal renewal and defence. Veterinary Dermatology. 20 (5-6), 515-532 (2009).
  13. McLafferty, E., Hendry, C. The integumentary system: anatomy, physiology and function of skin. Nursing Standard. 27 (7), 35-43 (2012).
  14. Monteiro-Riviere, N. A. Toxicology of the skin. , (2010).
  15. Dellambra, E., Odorisio, T., D'Arcangelo, D., Failla, C. M., Facchiano, A. Non-animal models in dermatological research. ALTEX. 36 (2), 177-202 (2019).
  16. Gordon, S., et al. Non-animal models of epithelial barriers (skin, intestine and lung) in research, industrial applications and regulatory toxicology. Altex. 32 (4), 327-378 (2015).
  17. Kandárová, H., et al. The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests - An assessment of the performance of the optimised test. Alternatives to laboratory animals : ATLA. 33 (4), 351-367 (2005).
  18. Kandárová, H., et al. Assessment of the skin irritation potential of chemicals by using the SkinEthic reconstructed human epidermal model and the common skin irritation protocol evaluated in the ECVAM skin irritation validation study. Alternatives to laboratory animals : ATLA. 34 (4), 393-406 (2006).
  19. OECD. Test No. 439: In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. , (2019).
  20. Alépée, N., Grandidier, M. H., Cotovio, J. Sub-categorisation of skin corrosive chemicals by the EpiSkinTM reconstructed human epidermis skin corrosion test method according to UN GHS: Revision of OECD Test Guideline 431. Toxicology in Vitro. 28 (2), 131-145 (2014).
  21. OECD. Test No. 431: In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. , (2019).
  22. Mehling, A., et al. In vitro RHE skin sensitisation assays: applicability to challenging substances. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 108, 104473 (2019).
  23. SENS-IS | EURL ECVAM - TSAR. , Available from: https://tsar.jrc.ec.europa.eu/test-method/tm2011-11 (2020).
  24. Lelièvre, D., et al. The episkin phototoxicity assay (EPA): development of an in vitro tiered strategy using 17 reference chemicals to predict phototoxic potency. Toxicology in Vitro. 21 (6), 977-995 (2007).
  25. Flaten, G. E., et al. In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).
  26. Pellevoisin, C., Bouez, C., Cotovio, J. Cosmetic industry requirements regarding skin models for cosmetic testing. Skin Tissue Models. , 3-37 (2018).
  27. Niehues, H., et al. 3D skin models for 3R research: the potential of 3D reconstructed skin models to study skin barrier function. Experimental Dermatology. 27 (5), 501-511 (2018).
  28. Netzlaff, F., Lehr, C. -M., Wertz, P. W., Schaefer, U. F. The human epidermis models EpiSkin®, SkinEthic® and EpiDerm®: An evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy, corrosivity, and substance transport. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 167-178 (2005).
  29. Prieux, R., Eeman, M., Rothen-Rutishauser, B., Valacchi, G. Mimicking cigarette smoke exposure to assess cutaneous toxicity. Toxicology in Vitro. 62, 104664 (2020).
  30. Petracca, B., Rothen-Rutishauser, B., Valacchi, G., Eeman, M. Bench approaches to study the detrimental cutaneous impact of troposperic ozone. Journal of Exposure Science and Environmental Epidemiology. 31, 137-148 (2021).
  31. Dijkhoff, I. M., et al. Impact of airborne particulate matter on skin: a systematic review from epidemiology to in vitro studies. Particle and fibre toxicology. 17 (1), 35 (2020).
  32. El Ghalbzouri, A., Siamari, R., Willemze, R., Ponec, M. Leiden reconstructed human epidermal model as a tool for the evaluation of the skin corrosion and irritation potential according to the ECVAM guidelines. Toxicology in Vitro. 22 (5), 1311-1320 (2008).
  33. Chacón, M., et al. Development of an in-house reconstructed human epidermis model as an alternative method in skin corrosion assessment. Toxicology in Vitro. 65, 104779 (2020).
  34. Pedrosa, T. doN., et al. A new reconstructed human epidermis for in vitro skin irritation testing. Toxicology in Vitro. 42, 31-37 (2017).
  35. Smits, J. P. H., et al. Immortalized N/TERT keratinocytes as an alternative cell source in 3D human epidermal models. Scientific Reports. 7 (1), 11838 (2017).
  36. Poumay, Y., Coquette, A. Modelling the human epidermis in vitro: tools for basic and applied research. Archives of dermatological research. 298 (8), 361-369 (2007).
  37. Rikken, G., Niehues, H., van den Bogaard, E. H. Organotypic 3D skin models: human epidermal equivalent cultures from primary keratinocytes and immortalized keratinocyte cell lines. Methods in Molecular Biology. 2154, 45-61 (2020).
  38. Duval, C., et al. Human skin model containing melanocytes: essential role of keratinocyte growth factor for constitutive pigmentation-functional response to α-melanocyte stimulating hormone and forskolin. Tissue engineering. Part C, Methods. 18 (12), 947-957 (2012).
  39. Hutter, V., Kirton, S. B., Chau, D. Y. S. Immunocompetent human in vitro skin models. Skin Tissue Models. , 353-373 (2018).
  40. Kinsner, A., Lesiak-Cyganowska, E., Śladowski, D. In vitro reconstruction of full thickness human skin on a composite collagen material. Cell and Tissue Banking. 2 (3), 165-171 (2001).
  41. Black, A. F., Bouez, C., Perrier, E., Schlotmann, K., Chapuis, F., Damour, O. Optimization and characterization of an engineered human skin equivalent. Tissue Engineering. 11 (5-6), 723-733 (2005).
  42. Reijnders, C. M. A., et al. Development of a full-thickness human skin equivalent in vitro model derived from TERT-immortalized keratinocytes and fibroblasts. Tissue Engineering. Part A. 21 (17-18), 2448-2459 (2015).
  43. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 352-366 (2011).
  44. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).
  45. Kim, B. S., Gao, G., Kim, J. Y., Cho, D. 3D cell printing of perfusable vascularized human skin equivalent composed of epidermis, dermis, and hypodermis for better structural recapitulation of native skin. Advanced Healthcare Materials. 8 (7), 1801019 (2019).
  46. Pittelkow, M. R., Scott, R. E. New techniques for the in vitro culture of human skin keratinocytes and perspectives on their use for grafting of patients with extensive burns. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 771-777 (1986).
  47. Elias, P. M., Ahn, S. K., Brown, B. E., Crumrine, D., Feingold, K. R. Origin of the epidermal calcium gradient: regulation by barrier status and role of active vs passive mechanisms. Journal of Investigative Dermatology. 119 (6), 1269-1274 (2002).
  48. Elias, P. M., et al. Modulations in epidermal calcium regulate the expression of differentiation-specific markers. Journal of Investigative Dermatology. 119 (5), 1128-1136 (2002).
  49. Lee, S. E., Lee, S. H. Skin barrier and calcium. Annals of Dermatology. 30 (3), 265-275 (2018).
  50. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
  51. Poumay, Y., et al. A simple reconstructed human epidermis: preparation of the culture model and utilization in in vitro studies. Archives of Dermatological Research. 296 (5), 203-211 (2004).
  52. Ponec, M., et al. The formation of competent barrier lipids in reconstructed human epidermis requires the presence of vitamin C. Journal of Investigative Dermatology. 109 (3), 348-355 (1997).
  53. Savini, I., et al. Characterization of keratinocyte differentiation induced by ascorbic acid: Protein kinase C involvement and vitamin C homeostasis. Journal of Investigative Dermatology. 118 (2), 372-379 (2002).
  54. Pasonen-Seppänen, S., et al. Vitamin C enhances differentiation of a continuous keratinocyte cell line (REK) into epidermis with normal stratum corneum ultrastructure and functional permeability barrier. Histochemistry and Cell Biology. 116 (4), 287-297 (2001).
  55. Beer, H. D., et al. Expression and function of keratinocyte growth factor and activin in skin morphogenesis and cutaneous wound repair. Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. 5 (1), 34-39 (2000).
  56. Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin--two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of structural biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
  57. Rice, R. H., Thacher, S. M. Involucrin: a constituent of cross-linked envelopes and marker of squamous maturation. Biology of the Integument. , 752-761 (1986).
  58. Elias, P. M., Barrier Feingold, K. R. Skin Barrier. , (2011).
  59. Marionnet, C., et al. Morphogenesis of dermal-epidermal junction in a model of reconstructed skin: beneficial effects of vitamin C. Experimental Dermatology. 15 (8), 625-633 (2006).
  60. Frikke-Schmidt, H., Lykkesfeldt, J. Keeping the intracellular vitamin C at a physiologically relevant level in endothelial cell culture. Analytical Biochemistry. 397 (1), 135-137 (2010).
  61. Castro-Muñozledo, F., Hernández-Quintero, M., Marsch-Moreno, M., Kuri-Harcuch, W. Cultivation, serial transfer, and differentiation of epidermal keratinocytes in serum-free medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 236 (1), 167-172 (1997).
  62. De Vuyst, E., et al. Reconstruction of normal and pathological human epidermis on polycarbonate filter. Epidermal Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. , 191-201 (2013).
  63. Chen, R. H., Zhu, J., Zhang, R. Z., Wang, S. Y., Li, Y. The tolerance of human epidermal cells to trypsinization in vitro. Cell and Tissue Banking. 21 (2), 257-264 (2020).
  64. Pohanish, R. P. Sittig's Handbook of Toxic and Hazardous Chemicals and Carcinogens. 2, (2012).
  65. Tsaousis, K. T., et al. Time-dependent morphological alterations and viability of cultured human trabecular cells after exposure to Trypan blue. Clinical and Experimental Ophthalmology. 41 (5), 484-490 (2013).
  66. Kim, S. I., et al. Application of a non-hazardous vital dye for cell counting with automated cell counters. Analytical Biochemistry. 492, 8-12 (2016).
  67. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  68. Fartasch, M., Ponec, M. Improved barrier structure formation in air-exposed human keratinocyte culture systems. Journal of Investigative Dermatology. 102 (3), 366-374 (1994).
  69. Bouwstra, J. A., Honeywell-Nguyen, P. L., Gooris, G. S., Ponec, M. Structure of the skin barrier and its modulation by vesicular formulations. Progress in Lipid Research. 42 (1), 1-36 (2003).
  70. Ponec, M., Boelsma, E., Gibbs, S., Mommaas, M. Characterization of reconstructed skin models. Skin Pharmacology and Physiology. 15 (1), 4-17 (2002).
  71. Hubaux, R., Wauters, A., Chrétien, A., Poumay, Y., Salmon, M. Reconstructed human epidermis response to urban particulate matter activates multiple stress-related pathways and impacts the skin barrier function. 23th IFSCC Conference. , 125-134 (2017).
  72. Lin, Y. -C., et al. Testing method development and validation for in vitro skin irritation testing (SIT) by using reconstructed human epidermis (RhE) skin equivalent - EPiTRI®. Alternatives to Animal Testing. , 8-19 (2019).
  73. Alexander, F. A., Eggert, S., Wiest, J. Skin-on-a-chip: Transepithelial electrical resistance and extracellular acidification measurements through an automated air-liquid interface. Genes. 9 (2), 114 (2018).
  74. van den Bogaard, E., et al. Perspective and consensus opinion: good practices for using organotypic skin and epidermal equivalents in experimental dermatology research. Journal of Investigative Dermatology. 141 (1), 203-205 (2021).
  75. Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Sheasgreen, J. An in vitro skin irritation test (SIT) using the EpiDerm reconstructed human epidermal (RHE) model. Journal of Visualized Experiments. (29), e1366 (2009).
  76. Abd, E., et al. Skin models for the testing of transdermal drugs. Clinical pharmacology advances and applications. 8, 163-176 (2016).
  77. De Wever, B., Kurdykowski, S., Descargues, P. Human skin models for research applications in pharmacology and toxicology: introducing nativeSkin, the "missing link" bridging cell culture and/or reconstructed skin models and human clinical testing. Applied In Vitro Toxicology. 1 (1), 26-32 (2015).
  78. Klicks, J., von Molitor, E., Ertongur-Fauth, T., Rudolf, R., Hafner, M. In vitro skin three-dimensional models and their applications. Journal of Cellular Biotechnology. 3 (1), 21-39 (2017).
  79. Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 22 (12), 695-705 (1986).
  80. Johansen, C. Generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Journal of Visualized Experiments. (130), e56863 (2017).
  81. Boelsma, E., Verhoeven, M. C. H., Ponec, M. Reconstruction of a human skin equivalent using a spontaneously transformed keratinocyte cell line (HaCaT). Journal of Investigative Dermatology. 112 (4), 489-498 (1999).
  82. Zhao, X., et al. Photocrosslinkable gelatin hydrogel for epidermal tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (1), 108-118 (2016).
  83. Peura, M., et al. Paracrine factors from fibroblast aggregates in a fibrin-matrix carrier enhance keratinocyte viability and migration. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (2), 658-664 (2010).
  84. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCat keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. Journal of Investigative Dermatology. 112 (3), 343-353 (1999).
  85. Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue engineering. Part C, Methods. 20 (6), 473-484 (2014).
  86. Alameda, J. P., et al. IKKα regulates the stratification and differentiation of the epidermis: Implications for skin cancer development. Oncotarget. 7 (47), 76779-76792 (2016).
  87. Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology and Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
  88. Staiano-Coico, L., et al. Human keratinocyte growth factor effects in a porcine model of epidermal wound healing. Journal of Experimental Medicine. 178 (3), 865-878 (1993).
  89. Egelrud, T. Desquamation in the stratum corneum. Acta Dermato-Venereologica. 80, Supp 208 44-45 (2000).
  90. Jean, J., Lapointe, M., Soucy, J., Pouliot, R. Development of an in vitro psoriatic skin model by tissue engineering. Journal of Dermatological Science. 53 (1), 19-25 (2009).
  91. Lotte, C., Patouillet, C., Zanini, M., Messager, A., Roguet, R. Permeation and skin absorption: reproducibility of various industrial reconstructed human skin models. Skin Pharmacology and Applied Skin Physiology. 15, Suppl 1 18-30 (2002).
  92. Ponec, M., Weerheim, A., Lankhorst, P., Wertz, P. New acylceramide in native and reconstructed epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 581-588 (2003).
  93. Thakoersing, V. S., et al. Unraveling barrier properties of three different in-house human skin equivalents. Tissue engineering. Part C, Methods. 18 (1), 1-11 (2012).
  94. Thakoersing, V. S., et al. presence of monounsaturated fatty acids in the stratum corneum of human skin equivalents. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 59-67 (2013).
  95. Van Smeden, J., et al. Combined LC/MS-platform for analysis of all major stratum corneum lipids, and the profiling of skin substitutes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (1), 70-79 (2014).
  96. Mieremet, A., et al. Human skin equivalents cultured under hypoxia display enhanced epidermal morphogenesis and lipid barrier formation. Scientific Reports. 9 (1), 7811 (2019).
  97. Mieremet, A., et al. Unravelling effects of relative humidity on lipid barrier formation in human skin equivalents. Archives of Dermatological Research. 311 (9), 679-689 (2019).
  98. Mieremet, A., Rietveld, M., Absalah, S., Van Smeden, J., Bouwstra, J. A., El Ghalbzouri, A. Improved epidermal barrier formation in human skin models by Chitosan modulated dermal matrices. PLoS ONE. 12 (3), 0174478 (2017).
  99. Mieremet, A., et al. Contribution of palmitic acid to epidermal morphogenesis and lipid barrier formation in human skin equivalents. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 6069 (2019).
  100. Boniface, K., et al. IL-22 inhibits epidermal fifferentiation and induces proinflammatory gene expression and migration of human keratinocytes. The Journal of Immunology. 174 (6), 3695-3702 (2005).
  101. De Vuyst, E., Salmon, M., Evrard, C., Lambert de Rouvroit, C., Poumay, Y. Atopic dermatitis studies through in vitro models. Frontiers in Medicine. 4, 119 (2017).
  102. Danso, M. O., et al. TNF-α and Th2 cytokines induce atopic dermatitis-like features on epidermal differentiation proteins and stratum corneum lipids in human skin equivalents. Journal of Investigative Dermatology. 134 (7), 1941-1950 (2014).
  103. Soboleva, A. G., Mezentsev, A., Zolotorenko, A., Bruskin, S., Pirusian, E. Three-dimensional skin models of psoriasis. Cells Tissues Organs. 199 (5-6), 301-310 (2014).
  104. Desmet, E., Ramadhas, A., Lambert, J., Gele, M. Van In vitro psoriasis models with focus on reconstructed skin models as promising tools in psoriasis research. Experimental Biology and Medicine. 242 (11), 1158-1169 (2017).
  105. Niehues, H., van den Bogaard, E. H. Past, present and future of in vitro 3D reconstructed inflammatory skin models to study psoriasis. Experimental Dermatology. 27 (5), 512-519 (2018).
  106. Pendaries, V., et al. Knockdown of filaggrin in a three-dimensional reconstructed human epidermis impairs keratinocyte differentiation. Journal of Investigative Dermatology. 134 (12), 2938-2946 (2014).
  107. Niehues, H., et al. Epidermal equivalents of filaggrin null keratinocytes do not show impaired skin barrier function. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (6), 1979-1981 (2017).
  108. Reuter, C., Walles, H., Groeber, F. Preparation of a three-dimensional full thickness skin equivalent. Methods in Molecular Biology. 1612, 191-198 (2017).
  109. Bataillon, M., et al. Characterization of a new reconstructed full thickness skin model, t-skinTM, and its application for investigations of anti-aging compounds. International Journal of Molecular Sciences. 20 (9), 2240 (2019).
  110. Rossi, A., Appelt-Menzel, A., Kurdyn, S., Walles, H., Groeber, F. Generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent and automated wounding. Journal of Visualized Experiments. (96), e52576 (2015).
  111. Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression. Journal of Visualized Experiments. (54), e2937 (2011).
  112. Müller, I., Kulms, D. A 3D organotypic melanoma spheroid skin model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57500 (2018).
  113. Wei, Z., et al. Two-dimensional cellular and three-dimensional bio-printed skin models to screen topical-use compounds for irritation potential. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 109 (2020).
  114. Derr, K., et al. Fully three-dimensional bioprinted skin equivalent constructs with validated morphology and barrier function. Tissue Engineering - Part C: Methods. 25 (6), 334-343 (2019).
  115. Frankart, A., et al. Epidermal morphogenesis during progressive in vitro 3D reconstruction at the air-liquid interface. Experimental Dermatology. 21 (11), 871-875 (2012).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 171 मानव एपिडर्मिस मानव एपिडर्मल समकक्ष प्राथमिक केराटिनोसाइट्स एपिडर्मिस इन विट्रो अध्ययनों का पुनर्गठन किया गया।
बड़े पैमाने पर एक त्रि-आयामी पुनर्निर्मित मानव एपिडर्मिस की खेती करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dijkhoff, I. M., Petracca, B.,… More

Dijkhoff, I. M., Petracca, B., Prieux, R., Valacchi, G., Rothen-Rutishauser, B., Eeman, M. Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale. J. Vis. Exp. (171), e61802, doi:10.3791/61802 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter