Summary
نقدم اثنين من بروتوكولات تلطيخ مختلفة للكشف عن NKG2D ligand (NKG2DL) في عينات سرطان الدم النخاعي الحاد الأولي البشري (AML). ويستند النهج الأول على بروتين الانصهار، وقادرة على التعرف على جميع ligands المعروفة والتي يحتمل أن تكون غير معروفة حتى الآن، في حين أن البروتوكول الثاني يعتمد على إضافة الأجسام المضادة المضادة متعددة NKG2DL.
Abstract
داخل نفس المريض ، تبين أن غياب التعبير السطحي NKG2D ligands (NKG2DL) يميز السكان الفرعيين لللوكيميا مع خصائص الخلايا الجذعية (ما يسمى بالخلايا الجذعية اللوكيمية ، LSCs) من الخلايا اللوكيمية النظيرة الأكثر تميزا التي تفتقر إلى إمكانية بدء المرض على الرغم من أنها تحمل طفرات جينية محددة مماثلة لسرطان الدم. NKG2DL هي كيميائيا عالية التنوع MHC فئة أنا مثل الجزيئات الذاتية. الخلايا السليمة في ظروف الهوساتيكي عموما لا تعبر NKG2DL على سطح الخلية. بدلا من ذلك ، يتم حث التعبير عن هذه الليجاند عند التعرض للإجهاد الخلوي (على سبيل المثال ، التحول أو المحفزات المعدية) لتحفيز القضاء على الخلايا التالفة عن طريق التحلل من خلال الخلايا المناعية المعبرة عن مستقبلات NKG2D مثل خلايا القاتل الطبيعي (NK). ومن المثير للاهتمام، يتم قمع التعبير السطحي NKG2DL بشكل انتقائي في الخلايا الفرعية LSC، مما يسمح لهذه الخلايا للتهرب من المراقبة المناعية بوساطة NKG2D. هنا، نقدم تحليلا جنبا إلى جنب لطريقتين مختلفتين لقياس التدفق الخلوي تسمح بالتحقيق في التعبير السطحي NKG2DL على الخلايا السرطانية، أي طريقة تنطوي على التعرف على عموم ليغاند وطريقة تنطوي على تلطيخ مع الأجسام المضادة متعددة ضد ليغاندس واحد. ويمكن استخدام هذه الأساليب لفصل NKG2DL قابلة للحياة السلبية الخلايا الفرعية مع خصائص الخلايا الجذعية السرطان المفترض من NKG2DL إيجابية غير LSC.
Introduction
خلايا NK هي من المحفزات الهامة للجهاز المناعي الفطري الذي يمكنه التعرف على الخلايا الخبيثة أو الخلايا السليمة المجهدة والقضاء عليها (على سبيل المثال ، عن طريق العدوى الفيروسية) دون تحفيز مستضد سابق1. يتم تنظيم هذه العملية بإحكام من خلال ذخيرة معقدة من مستقبلات تنشيط — مثل مستقبلات السمية الخلوية الطبيعية (NCRs), NKG2D و CD16 — والمستقبلات المثبطة التي يتم تمثيلها إلى حد كبير من قبل مستقبلات قاتلة مثل الغلوبولين المناعي (KIRs)2. ربط KIRs لمضاد الكريات البيض البشري (HLA) جزيئات الفئة الأولى على الخلايا الجسدية يضمن الاعتراف الذاتي وينقل التسامح NK الخلية. من ناحية أخرى، فإن غياب الاعتراف الذاتي وزيادة ربط تنشيط المستقبلات إلى ليغاندس على الخلايا المستهدفة يؤدي إلى إطلاق حبيبات سامة للخلايا مما يؤدي إلى السمية الخلوية بوساطة الخلية NK1. وأخيرا، يمكن للخلايا NK ممارسة السمية الخلوية تعتمد على الأجسام المضادة (ADCC) عن طريق ربط CD16 مستقبلات تنشيط لأهداف التعبير عن الجزء Fc من Ig (FcR)2. وبصرف النظر عن السمية الخلوية المباشرة، يمكن أن تؤدي خلايا NK أيضا إلى إطلاق السيتوكين الذي يسد الفطرية مع الجهاز المناعي التكيفي3.
NKG2D هو مستقبلات تنشيط رئيسية أعرب عنها على NK, NKT, γδ T, والسذاجة CD8 + T الخلايا4 التي تمكن هذه الخلايا المناعية السامة للخلايا للتعرف على وlyse NKG2D ligand (NKG2DL) التعبير عن الخلايا المستهدفة. الخلايا السليمة عادة لا تعبر عن NKG2DL. بدلا من ذلك ، يتم تنظيم التعبير NKG2DL على الخلايا الخبيثة أو المصابة بالفيروس لجعل هذه قابلة للتطهير المناعي5.
عائلة NKG2DL البشرية تضم ثمانية جزيئات معروفة من بينها اثنين من الجزيئات MHC I ذات الصلة بالسلسلة A و B (MICA و MICB6)والبروتينات المرتبطة بالفيروس المضخم للخلايا UL16 1-6 (ULBP1-67). وينظم التعبير عن NKG2DL على النسخ، ما بعد النسخ وكذلك مستويات ما بعد الترجمة8. على هذا النحو، في حين أن التعبير NKG2DL عادة لا يمكن الكشف عنها على سطح الخلايا السليمة، تم الإبلاغ NKG2DL ميرنا9 والتعبير البروتين داخل الخلايا في الأنسجة السليمة. ولا يزال يتعين تحديد الصلة الوظيفية لهذا التعبير والآليات الكامنة وراء أنماط التعبير غير المتكررةهذه 10.
التنظيم الآلي للتعبير NKG2DL في الخلايا السرطانية هو مجال رائع للتحقيق. المسارات المعروفة أن تشارك في الإجهاد الخلوي، على سبيل المثال، مسار الإجهاد الصدمة الحرارية9،أو المسارات المرتبطة تلف الحمض النووي، مثل تترنح telangiectasia تحور (أجهزة الصراف الآلي) وRad3 ذات الصلة (ATR) المسار11،فضلا عن العدوى الفيروسية أو البكتيرية وقد تم ربط مباشرة إلى تحريض التعبير NKG2DL12. ومع ذلك ، حتى لو تم التعبير السطحي عن NKG2DL بشكل فعال ، يمكن فقدان هذا التعبير مرة أخرى من خلال سفك البروتيوليك بوساطة ، وهي آلية مرتبطة بالهروب المناعي والتشخيص السريري الضعيف في بعض أنواع السرطان13.
قد يؤدي غياب سطح الخلية NKG2DL أيضا أدوارا مهمة في المرضى الذين يعانون من مكافحة غسل الأموال. هنا، غالبا ما يحفز العلاج بالعلاج الكيميائي المكثف مغفرة، ولكن الانتكاس غالبا ما يحدث من الخلايا الجذعية اللوكيمية (LSC)، التي تنجو بشكل انتقائي من العلاج الكيميائي وتهرب من الاستجابة المناعية. كما أظهرنا مؤخرا، LSCs، على سبيل المثال، الهروب تحلل الخلية NK عن طريق قمع التعبير سطح NKG2DL14.
عكسيا، يمكن استخدام غياب التعبير NKG2DL السطح كوسيلة لتحديد وعزل السكان الفرعيين المفترضة مثل الجذعية من الخلايا من الخلايا الفرعية اللوكيميا النظير السائبة. هنا، نقدم نهجين تدفق القياسات الخلوية التي يمكن استخدامها للكشف عن التعبير سطح NKG2DL وبالتالي تحديد الخلايا الجذعية السلبية NKG2DL في سرطان الدم وربما أيضا في أنواع السرطان الأخرى: طريقة للتعرف على سطح عموم ليغاند وطريقة تنطوي على تلطيخ مع الأجسام المضادة واحد أو مجمعة التعرف على البروتينات NKG2DL الفردية المعروفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتم جمع عينات المرضى بعد موافقة مجلس استعراض الأخلاقيات في مستشفيي بازل وتوبينغن الجامعيين.
1. البيوتينيليشن من بروتين الانصهار NKG2D
ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة مع مجموعة البيوتينيليشن (انظر جدول المواد)وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يجب تنفيذ هذه الخطوة من البروتوكول على الأقل 24 ساعة قبل تلطيخ. يجب تخزين بروتين الاندماج NKG2D البيوتيني في -20 درجة مئوية.
- إذابة كل من البيوتين، فضلا عن أنابيب البروتين الانصهار NKG2D في درجة حرارة الغرفة (RT).
ملاحظة: إذا كانت الخلايا تحتاج إلى أن تكون عقيمة لمزيد من الاستخدام التجريبي (الحقن في الفئران، مستعمرة تشكيل وحدة المقايسات، الخ)، وإعادة تشكيل البروتين الانصهار تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح لتجنب التلوث. خلاف ذلك، يمكن تنفيذ كل خطوة على مقاعد البدلاء. - تدور بسرعة أسفل 50μg من بروتين الانصهار NKG2D الليوفيلي. إضافة 500 ميكرولتر من المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) لإعادة تشكيل المسحوق ومزيج تماما باستخدام ميببيت P1000.
- إضافة 100 ميكرولتر من بروتين الانصهار NKG2DL إلى أنبوب البيوتين للحصول على تركيز المخزون النهائي من 100 ميكروغرام / مل.
- امزج الحل جيدا عن طريق إعادة تعليق مستمرة مع P100 ميكروبايت.
- احتضان محلول البروتين الانصهار / البيوتين في RT تسيطر عليها لمدة 24 ساعة. بروتين الانصهار جاهز الآن للاستخدام.
2. ذوبان الخلايا الأساسية AML
ملاحظة: تم إذابة ما يقرب من 5,000,000 خلية لوكيمية مجمدة لكل مريض مخزنة في النيتروجين السائل ثم استخدمت للمقاايسات على الفور. تم الحصول على خلايا اللوكيميا وتجميدها كما سبق وصفها15. باختصار، تمت معالجة عينات الدم المحيطية التي تم جمعها من المرضى الذين يعانون من مكافحة غسل الأموال والنسب المئوية العالية لخلايا الانفجار (>90٪ من الانفجارات بين الخلايا أحادية النووية) بفصل تدرج الكثافة للحصول على خلايا أحادية النووية وتم تجميدها بعد ذلك في مصل عجل الجنين (FCS) الذي يحتوي على محلول كبريتيد ثنائي ميثيل (DMSO) بنسبة 10٪). تباينت أعداد الخلايا بشكل كبير بين المرضى الذين ي اعتمادهم على تركيز الكريات البيض في المريض (النطاق: 1,000,000 إلى 30,000,000 خلية لوكيميا لكل مل من الدم).
- متوسط RPMI دافئ مسبقا يحتوي على 10٪ من FCS عند 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي. لكل قارورة من خلايا AML (ما يصل إلى 30,000,000 خلية في 1 مل FCS + 10٪ DMSO)، أضف 10 مل من المتوسطة الدافئة مسبقا إلى أنبوب تفاعل 15 مل.
- إزالة المبردة التي تحتوي على مكافحة غسل الأموال الأولية من تخزين النيتروجين السائل وعلى الفور إذابة الخلايا باستخدام حمام مائي 37 درجة مئوية. تحرك بلطف أنبوب ذهابا وإيابا في الماء، مما يسمح لمحتويات القارورة لتذوب حتى لا يكون هناك سوى الكريستال الجليد الصغيرة اليسار.
- نقل الخلايا المذابة فورا إلى أنبوب متوسطة تحتوي على وشطف القارورة باستخدام 1 مل من المتوسطة.
- الطرد المركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 10 دقيقة والتخلص من supernatant دون إزعاج بيليه.
- غسل الخلايا مع 5 مل من المتوسط RPMI تحتوي على 10٪ من FCS والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة.
3. عد الخلايا
- إعادة إنفاق بيليه الخلية في حجم معروف من المتوسط RPMI تحتوي على 10٪ من FCS.
- نقل حجم صغير من تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل وتمييع بنسبة معروفة مع الأزرق تريبان أو أي صبغة بديلة أخرى تسمح بالخلية الحية / التمييز الخلية الميتة.
- استخدم أي جهاز لحساب الخلايا.
- الطرد المركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 10 دقيقة والتخلص من supernatant دون إزعاج بيليه.
4. تلطيخ خلايا AML الأولية باستخدام بروتين الاندماج NKG2D البيوتينية
- إعداد العازلة تلطيخ عن طريق استكمال 500 مل برنامج تلفزيوني مع الألبومين مصل البقري (جيش تحرير الشعب) وحمض الإيثيلينديامينتتراستيك (EDTA) إلى تركيز النهائي من 0.07 mM و 2 MM, على التوالي. ضبط درجة الحموضة (7.2-7.4) إذا لزم الأمر.
- إعادة تمركز بيليه الخلية مع تلطيخ العازلة إلى تركيز النهائي من 0.5 × 107 خلايا / مل.
ملاحظة: اختياريا، قبل تلطيخ، يمكن احتضان الخلايا مع عامل حجب (على سبيل المثال hIgG (1μg/ml) لمدة 30 دقيقة في RT أو FcR-منع عامل).. - نقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى خلية الثقافة 96 جيدا U-أسفل لوحة والطرد المركزي لوحة في 300 × ز لمدة 10 دقيقة. تجاهل supernatant دون إزعاج بيليه.
- إعداد مزيج رئيسي من بروتين الاندماج NKG2D البيوتينية بحيث يتم إعادة إنفاق الخلايا في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر لكل بئر مع تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام / مل لكل بئر.
- إضافة مزيج رئيسي أعدت في الخطوة 4.4 باستخدام ماصة 100 ميكرولتر وإعادة إنفاق الكريات الخلية مع ماصة متعددة القنوات 300 ميكرولتر.
ملاحظة: خفض حجم النهائي وفقا لعدد من الخلايا للحد من كمية البروتين الانصهار اللازمة لتلطيخ. - احتضان تعليق الخلية لمدة 25 دقيقة في RT أو 50 دقيقة عند 4 درجة مئوية.
- غسل الخلايا بإضافة 200 ميكرولتر من العازلة تلطيخ لكل بئر مع ماصة متعددة القنوات 300 ميكرولتر.
- الطرد المركزي لوحة في 300 × ز لمدة 10 دقيقة والتخلص من supernatant دون إزعاج بيليه.
- كرر الخطوتين 4.7 و4.8.
ملاحظة: يتم تنفيذ تلطيخ الموصوفة هنا في خلية الثقافة 96 جيدا U-أسفل لوحة. لذلك، يتم تنفيذ خطوات الغسيل مرتين بسبب صغر حجم سعة هذه الصفائح. يمكن أيضا إجراء التلطيخ في أنابيب أخرى ويمكن بعد ذلك إجراء خطوات الغسيل مرة واحدة فقط باستخدام حجم أكبر. - إعداد مزيج رئيسي باستخدام Streptavidin-PE (انظر الجدول 1 لتخفيف) بحيث يتم إعادة إنفاق الخلايا في مجلد نهائي من 50 ميكرولتر.
ملاحظة: إضافة الأجسام المضادة التحديد لنوع الخلية من الفائدة على سبيل المثال CD33، CD34.... ل AML. - إضافة مزيج رئيسي أعدت في الخطوة 4.10 باستخدام ماصة 100 ميكرولتر وإعادة إنفاق الكريات الخلية مع ماصة متعددة القنوات 300 ميكرولتر.
- احتضان تعليق الخلية لمدة 15 دقيقة في RT أو 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
- غسل الخلايا بإضافة 200 ميكرولتر من العازلة تلطيخ لكل بئر مع ماصة متعددة القنوات 300 ميكرولتر.
- الطرد المركزي لوحة في 300 × ز لمدة 10 دقيقة والتخلص من supernatant دون إزعاج بيليه.
- كرر الخطوتين 4.13 و4.14.
- إعداد حل من العازلة تلطيخ بما في ذلك 7-AAD (7-Aminoactinomycin D, 1:1000) أو أي كاشف للتمييز بين الخلايا الحية والميتة.
- Resuspend الكريات الخلية في 200 ميكرولتر تلطيخ العازلة + 7-AAD أعدت في الخطوة 4.16 في استخدام ميكروبايت متعدد القنوات 300 ميكروسيلتر.
- تحليل الخلايا باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي.
5. تلطيخ واحد أو مجمعة واحدة المضادة NKG2DL الأجسام المضادة
- استخدم تعليق الخلية نفسه كما في الخطوة 4.2.
- نقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى خلية الثقافة 96 جيدا U-أسفل لوحة باستخدام ماصة متعددة القنوات 300 ميكرولتر والطرد المركزي لوحة في 300 × ز لمدة 10 دقيقة. تجاهل supernatant دون إزعاج بيليه.
- إعداد مزيج رئيسي للأجسام المضادة لكل جسم مضاد أولي أو أجسام مضادة مجمعة (انظر الجدول 2 لتخفيف) بحيث يتم إعادة إنفاق الخلايا في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر.
- إضافة مزيج رئيسي أعدت في الخطوة 5.3 باستخدام ماصة 100 ميكرولتر وإعادة إنفاق الكريات الخلية مع ماصة متعددة القنوات 300 ميكرولتر.
- احتضان الخلايا لمدة 25 دقيقة في RT.
- غسل الخلايا بإضافة 200 ميكرولتر من العازلة تلطيخ لكل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات 300 ميكرولتر.
- الطرد المركزي ثقافة الخلية 96 جيدا U-أسفل لوحة في 300 × ز لمدة 10 دقيقة والتخلص من supernatant دون إزعاج بيليه.
- كرر الخطوتين 5.6 و5.7.
- إعداد مزيج رئيسي للأجسام المضادة عن طريق إضافة الأجسام المضادة الثانوية (انظر الجدول 2 لتخفيف) بحيث يتم إعادة إنفاق الخلايا في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر لكل بئر.
- إضافة مزيج رئيسي أعدت في الخطوة 5.9 باستخدام ماصة 100 ميكرولتر وإعادة إنفاق الكريات الخلية مع ماصة متعددة القنوات 300 ميكرولتر.
- حضانة لمدة 15 دقيقة في RT أو 30 دقيقة في 4 درجة مئوية في الظلام.
- غسل بإضافة 200 ميكرولتر من العازلة تلطيخ لكل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات 300 ميكرولتر.
- الطرد المركزي تعليق الخلية في 300 × ز لمدة 10 دقيقة والتخلص من supernatant دون إزعاج بيليه.
- كرر الخطوتين 5.12 و5.13.
- Resuspend الكريات الخلية في 200 ميكرولتر تلطيخ العازلة التي تحتوي على 7-AAD أعدت في الخطوة 4.16.
- تحليل الخلايا باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي كما هو موضح في الخطوة 6.
6. الحصول على البيانات
ملاحظة: تأكد من أن ضوابط الجودة الأسبوعية من تدفق الخلايا يتم تنفيذها لضمان أن أشعة الليزر تعمل بشكل صحيح. للبروتوكول المعروض هنا، يتم تنفيذ عملية السيتومتر والتتبع الأسبوعية (CTS) مع الخرز النسبي للتحقق من أداء الليزر على جميع القنوات. بعد CTS، يتم تسجيل 10,000 الأحداث باستخدام الخرز 8 الذروة كعنصر تحكم داخلي. يجب أن تكون جميع القمم في نفس الوضع داخل بواباتها ومنفصلة بشكل جيد عن بعضها البعض.
- إنشاء تعويض المصفوفة لطرح التداخل الطيفي بين أجهزة الكشف مع الخرز أو مع الخلايا16.
- سجل 10,000 حدث للخلايا غير الملطخة والخرز الملون الوحيد. بالنسبة لضوابط الفلورسينس ناقص واحد (FMO)، سجل 50,000 حدث وسجل العينات الملطخة بالكامل ما يصل إلى 100,000 حدث.
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن إجراء عينات ملونة واحدة على الخلايا. إذا كان الأمر كذلك، تأكد من أن الخلايا لديها إشارة إيجابية لعلامة المطلوب. - الحصول على خلية ملونة واحدة أو عينة حبة لكل فلوفور المستخدمة في التجربة للكشف عن كمية التداخل الطيفي. استخدم منشئ التعويض لجهاز قياس التدفق الخلوي لحساب قيم الانسكاب وتطبيق مصفوفة التعويض على جميع العينات المقاسة.
ملاحظة: لا يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية لإنشاء التعويض باستخدام الخرز إذا تم حساب التعويض بالخرز. اعتمادا على نوع حبات التعويض ، لا يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية للتعويض مع الخرز. - بالنسبة لعناصر تحكم FMO والعينات الملطخة الكاملة مع بروتين الاندماج ، أولا ، حدد الخلايا استنادا إلى مبعثرها الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC). بعد استبعاد doublets، بوابة الخلايا على أساس سلبيتها ل7-AAD (PercP-Cy5.5) إشارة لاستبعاد الخلايا الميتة (انظر الخطوة 5.15). تظهر المؤامرة النهائية تعبير CD34 (المحور ص) و NKG2DL (المحور X) على المفردات الحية.
- بالنسبة للأجسام المضادة الوحيدة المضادة ل NKG2DL ، قم بتطبيق نفس الاستراتيجية على العينات ولكن لاحظ أن الإيجابية ليغاند تكمن في Alexa Fluor 488 وليس قناة PE.
- ضبط البوابات وفقا لضوابط FMO لاستراتيجية gating من الخطوة 6.4 و 6.5 (انظر الجدول 3)لضوابط FMO المناسبة لتنفيذ لهذه التجربة: في برنامج التحليل، رسم بوابة على الكسر السلبي. أثناء تسجيل العينة الملطخة بالكامل ، فإن الخلايا فوق البوابة التي تم إنشاؤها مسبقا إيجابية لعلامة التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يسمح كلا البروتوكولين المعروضين هنا بإثراء AML LSC من خلال التحليلات الخلوية التدفقية باستخدام CD34 ، وهي علامة معروفة ل LSC17، بالاقتران مع التعبير السطحي NKG2DL إما باستخدام التعرف على عموم ليغاند أو تلطيخ مع الأجسام المضادة المجمعة ضد الليجاندات الفردية. في الشكل 1، نظهر أن عينات AML التي تم تحليلها إيجابية ل CD34 و NKG2DL ، ولكن توجد أيضا مجموعات فرعية سلبية ، وهو ما يظهر من خلال وجود أربعة مجموعات مختلفة في المجموع. تظهر بياناتنا استراتيجية التلطيخ النموذجية لمثل هذه التلطيخ ، بدءا من اختيار السكان الرئيسيين للخلايا عبر FSC و SSC. يتم استبعاد doublets والخلايا الميتة في تحليل المصب(الشكل 1A). يتم تعديل البوابات باستخدام ضوابط FMO لضمان تحديد السليم للخلايا الإيجابية (الشكل 1B).
في الشكل 1C، نسلط الضوء على كثافة الفلورية للخلايا الإيجابية لCD34 (APC ، المحور Y) مقابل NKG2DL (PE ، المحور X). تظهر خلايا AML الإيجابية ل CD34 تعبيرا سطحيا أقل عن NKG2DL (الشكل 1C) ، والذي يتماشى مع النتائج السابقة من مختبرنا ، مما يدل على أن تعبير NKG2DL يرتبط بعدم وجود stemness14.
يشير الشكل 2 إلى متانة كل من أساليب تلطيخ NKG2DL. في الشكل 2A، ونحن التحقيق في ثلاث عينات مكافحة غسل الأموال الأولية جنبا إلى جنب تظهر 19.8 ، 49.8، و 89.4٪، على التوالي من الأحداث الإيجابية لتلطيخ البروتين الانصهار مقابل 20.4، 50.4، و 90.6٪ لتلطيخ الأجسام المضادة المضادة NKG2DL مجمعة (الأجسام المضادة المجمعة ضد MICA، MICB، ULBP1، ULBP2/5/6، وULBP3)، على التوالي. من ناحية أخرى، يظهر تلطيخ واحد (ضد MICA أو MICB أو ULBP1 أو ULBP2/5/6 أو ULBP3) مجموعة من الأحداث الإيجابية تصل إلى 92٪(الشكل 2B). تختلف هذه النسبة المئوية تبعا ليغاند نفسه والمريض، على سبيل المثال، ULBP3(الشكل 2B). ملاحظة، يمكن لخلية واحدة التعبير عن NKG2DL متعددة.
عندما يتم تجميع الأجسام المضادة متعددة المضادة NKG2DL ودمجها في أنبوب واحد واحد، والنسبة المئوية للخلايا الإيجابية مماثلة للنسبة المئوية للبروتين الانصهار(الشكل 2A). على هذا النحو، يعمل كلا البروتوكولين بشكل جيد وقد يوفر نتائج مشابهة فيما يتعلق بتعبير NKG2DL على خلايا AML الأساسية. في بعض مكافحة غسل الأموال، قد تسمح طريقة بروتين الانصهار بحساسية أعلى لأنها يمكن أن تسمح بالاعتراف بالمزيد من بروتينات NKG2DL.
الشكل 1: استراتيجية نموذجية لغانغ لعينات مكافحة غسل الأموال الأولية. (أ)يتم أولا مسور الخلايا على أساس حجمها (المحور العاشر) وتعقيد (على سبيل المثال، الحبيبية، ص المحور). ثم يتم استبعاد Doublets برسم الارتفاع أو العرض مقابل المنطقة للتشتت إلى الأمام. وأخيرا، يتم تحديد الخلايا الحية على أساس حجمها (المحور X) مقابل سلبيتها ل7AAD (PerCP-Cy5.5، محور Y). (ب) تستخدم ضوابط الكائنات الحية المحورة لإقامة البوابات للمساعدة على التمييز بين السكان الإيجابيين والسلبيين للعلامات المشار إليها. وتبقى استراتيجية الصياغة متطابقة كما هو مبين في الشكل 1A. (C) رسم قياس التدفق الخلوي الذي يظهر الأحداث الإيجابية والسلبية ل CD34 (APC، المحور Y) مقابل NKG2DL (PE أو AlexaFluor488، المحور X). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مقارنة بروتوكولات التلطيخ. (أ) رسوم بيانية شريطية تبين نسبة الأحداث الإيجابية للبروتين الانصهار مقابل الأجسام المضادة NKGD2L تجمع (ن = 3 عينات مكافحة غسل الأموال) من الخلايا الحية واحدة مسور. (ب) رسوم بيانية شريطية تعرض النسبة المئوية للأحداث الإيجابية لتلطيخ واحد ليغاند لجميع الأجسام المضادة المعروفة المضادة ل NKG2DL وليجاندات واحدة مجمعة (انظر جدول المواد للحصول على معلومات مفصلة عن الأجسام المضادة). تم إجراء غاتينغ مرة أخرى على خلايا حية واحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم الأنبوبة | مستضد | فلوروفور | التخفيف/ التركيز |
| خلايا غير ملطخة | - | - | - |
| وصمة عار واحدة PE |
NKG2D-فيوجنبروتين | PE | 1:10 للخطوة الأساسية 1:100 للخطوة الثانوية |
| وصمة عار واحدة 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
يعيش / الميت | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| وصمة عار واحدة APC |
CD34 | APC | 1:25 |
| خلايا ملطخة بالكامل | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2D-فيوجنبروتين | PE | 1:10 للخطوة الأساسية 1:100 للخطوة الثانوية | |
| يعيش / الميت | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
الجدول 1: الأنابيب المطلوبة لتلطيخ العينات ببروتين الاندماج NKG2D. يعرض هذا الجدول الأنابيب المطلوبة لإعداد التجربة.
| اسم الأنبوبة | مستضد | فلوروفور | التخفيف/ التركيز |
| خلايا غير ملطخة | - | - | - |
| وصمة عار واحدة أليكسا فلور 488 |
ULBP-1 | أليكسا فلور 488 | 10 ميكروغرام/مل للخطوة الأولية 4 ميكروغرام/مل للخطوة الثانوية |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| ميكا | |||
| هيئة التصنيع العسكري | |||
| وصمة عار واحدة 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
يعيش / الميت | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| وصمة عار واحدة APC |
CD34 | APC | 1:25 |
| خلايا ملطخة بالكامل | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2DL | أليكسا فلور 488 | 10 ميكروغرام/مل للخطوة الأولية 4 ميكروغرام/مل للخطوة الثانوية |
|
| يعيش / الميت | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
الجدول 2: الأنابيب المطلوبة لتلطيخ العينات بالأجسام المضادة ل NKG2DL. يعرض هذا الجدول الأنابيب المطلوبة لإعداد التجربة.
| اسم الأنبوبة | مستضد | فلوروفور | التخفيف/ التركيز |
| خلايا غير ملطخة | - | - | - |
| FMO_APC | ULBP-1 | أليكسا فلور 488 | 10 ميكروغرام/مل للخطوة الأولية 4 ميكروغرام/مل للخطوة الثانوية |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| ميكا | |||
| هيئة التصنيع العسكري | |||
| NKG2D-فيوجنبروتين | PE | 1:10 للخطوة الأساسية 1:100 للخطوة الثانوية |
|
| يعيش / الميت | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_PE | CD34 | APC | 1:25 |
| ULBP-1 | أليكسا فلور 488 | 10 ميكروغرام/مل للخطوة الأولية 4 ميكروغرام/مل للخطوة الثانوية |
|
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| ميكا | |||
| هيئة التصنيع العسكري | |||
| يعيش / الميت | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_Alexa فلور 488 | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2D-فيوجنبروتين | PE | 1:10 للخطوة الأساسية 1:100 للخطوة الثانوية |
|
| يعيش / الميت | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
الجدول 3: الأنابيب المطلوبة من أجل وضع الضوابط الأساسية. يعرض هذا الجدول الأنابيب المطلوبة لإعداد عناصر تحكم الأجسام المضادة المناسبة والعناصر الأساسية والثانوية. يجب إضافة كافة عناصر التحكم المطلوبة (FMO) من قبل المجرب للحصول على نتائج صحيحة وبيانات قابلة للتفسير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نقدم طريقتين تدفق القياسات الخلوية التي يمكن الكشف عن التعبير سطح NKG2DL على خلايا AML الأساسية البشرية. ونبين أن كلا من طرق الكشف يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع تلطيخ الأجسام المضادة الأخرى (على سبيل المثال، الكشف عن التعبير CD34). كما يمكن إجراء تلطيخات مماثلة على أنواع الخلايا الأساسية الأخرى وخطوط الخلايا.
أظهرنا مؤخرا أن غياب NKG2DL على سطح انفجارات المريض AML يمكن أن يثري LSC14. في مكافحة غسل الأموال، NKG2DL السلبية ولكن ليس NKG2DL السكان الفرعية اللوكيميا إيجابية تمتلك clonogenic وفي قدرات الجسم الحي الشروع في سرطان الدم. وسوف تظهر الأبحاث المستقبلية ما إذا كان غياب التعبير السطحي NKG2DL يمكن أن تستخدم أيضا كأداة لإثراء الخلايا الجذعية في أنواع السرطان الأخرى.
وقد ثبت CD34 كلاسيكيا للاحتفال LSCs في مكافحة غسل الأموال، ولكن مكافحة غسل الأموال هو مرض غير متجانس للغاية وليس كل مرضى مكافحة غسل الأموال تظهر التعبير CD34 (أي CD34 مكافحة غسل الأموالالسلبية 18). لقد أظهرنا سابقا أن غياب التعبير السطحي NKG2DL يوفر أداة جديدة لتحديد LSC في هذه المجموعة الفرعية من CD34 مكافحة غسل الأموال السلبية. هنا، في المقابل، نركز على المجموعة الفرعية من AMLs إيجابية CD34 وتبين أن المجموعات الفرعية المختلفة يمكن أن تحدث. سوف تظهر الأبحاث المستقبلية ما إذا كان التلطيخ المشترك ل NKG2DL بالتزامن مع مثل هذه العلامات الأخرى (على سبيل المثال ، CD34) يمكن أن يثري LSC بشكل أكثر فعالية.
في قياس التدفق الخلوي، من المهم تضمين عناصر تحكم كافية مثل FMO لمساعدة المجرب على التمييز بشكل صحيح بين الأحداث الإيجابية والسلبية. بالإضافة إلى ذلك ، من الضروري وضع ضوابط إيجابية لكل الأجسام المضادة المستخدمة لضمان عدم وجود تلطيخ بسبب خلل في الجسم المضاد. البروتوكول الذي نقدمه هنا يستخدم فقط عدد محدود من علامات السطح ، والتي يمكن تمديدها وفقا لحاجة المجرب ، على سبيل المثال ، عن طريق إضافة CD33 أو علامات LSCالمحتملة 19. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف الفلوروفوريس المستخدم في هذا البروتوكول. والأهم من ذلك، ينبغي أن تكون هذه التغييرات مصحوبة بتمليك الأجسام المضادة لتحديد أفضل تخفيف.
خطوة واحدة حاسمة قبل تلطيخ هو ذوبان الخلايا AML الأولية. في الواقع ، بالإضافة إلى هشاشتها ، يتم الحفاظ على هذه العينات في سلفسيد ثنائي ميثيل (DMSO) ، وهو في حد ذاتها سام للخلايا. لذلك ، يجب التعامل مع العينات بعناية وينبغي شطفها جيدا لتجنب التعرض لفترات طويلة ل DMSO. على الرغم من أن عيناتنا تمت معالجتها وتجميدها وفقا للبروتوكول15الذي تم إنشاؤه مسبقا ، إلا أنه من المهم اتباع الخطوات الموضحة في المخطوطة بعناية لضمان استرداد الخلايا بشكل كبير. العمل مع عينات جديدة سيضمن تحسين البقاء وبالتالي ينصح. ومع ذلك، في معظم الحالات هذا غير عملي.
وثمة عامل آخر يؤثر على الطريقة الموصوفة هو الانحراف الخاص بالعينة الذي يمكن أن يؤدي إلى تشكيلات جانبية مختلفة لتشتت الخلايا لوحظت عن طريق قياس التدفق الخلوي. بسبب عدم التجانس المرض، وهذا أمر لا مفر منه ولكن ينبغي النظر في التحليل. ويمكن إدخال تقلبات إضافية عن طريق التجميد/الذوبان أو خطوات ميكانيكية أخرى في معالجة العينات. بشكل عام، السرعة هي المفتاح لتجنب موت الخلايا. ومع ذلك، لا يمكن تجنب الخلايا والحطام المحتضرين، وينبغي أخذها في الاعتبار واستبعادها في التحليل. يجب أن يتم Gating على أساس FSC / SSC بدقة وعين ناقدة لأنها الخطوة الأولى لتحليل العينة.
ميزة رئيسية واحدة من البروتين الانصهار هو فعاليته للكشف عن جميع NKG2DLs المعروفة وغير معروفة، في حين أن الأجسام المضادة محددة المضادة NKG2DL (على سبيل المثال، MICA، MICB) إدخال التحيز الاختيار. كلا الأسلوبين قابلان للتنفيذ بنفس القدر. وبالنسبة للعدد المحدود من العينات التي تم تحليلها، فقد أظهرت أيضا نتائج قابلة للمقارنة للغاية. استخدام بروتين الاندماج NKG2D له بعض الفوائد الرئيسية: أقل مضيعة للوقت، وانخفاض عدد الكاشف، وعدد من عينات تلطيخ فضلا عن انخفاض احتمال الأخطاء البشرية (أي أخطاء الأنابيب). وعلاوة على ذلك، قد تكون هذه الطريقة أيضا أكثر فعالية في التقاط التعبير NKG2DL في بعض العينات، لأنه ينبغي أيضا التقاط التعبير عن البروتينات غير معروف مع وظيفة NKG2DL، والتي يمكن التعبير عنها في بعض الحالات AML. في حين توفر نظرة ثاقبة على الوجود السطحي لNKG2DL ، فإن هذه الطريقة لا توفر معلومات حول المستويات داخل الخلايا من NKG2DL ، والاتجار بها أو تنظيمها ، وبالتالي ينبغي إجراء فحوصات أخرى لاكتساب مزيد من المعرفة حول هذه الأسئلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (179239) ومؤسسة مكافحة السرطان (Zuerich) ومؤسسة فيلهلم ساندر إلى CL (2019.042.1) ومؤسسة نوفارتيس للأبحاث الطبية والبيولوجية إلى C.L. وعلاوة على ذلك، تلقى هذا المشروع تمويلا من برنامج الاتحاد الأوروبي للأبحاث والابتكار في أفق 2020 بموجب اتفاق منحة ماري سكلودوسكا كوري رقم 765104. نشكر مرفق قياس التدفق الخلوي في بازل على الدعم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
References
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness. Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).
- Zingoni, A., et al. NKG2D and its ligands: "One for All, All for One". Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).
- Eagle, R. A., Trowsdale, J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).
- El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).
- Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D. Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).
- Long, E. O. Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm. Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).
- Hüe, S., et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).
- Gasser, S., Raulet, D. H. Activation and self-tolerance of natural killer cells. Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).
- Groh, V., et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).
- Maurer, S., et al. Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells. Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).
- Paczulla, A. M., et al. Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion. Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).
- Paczulla, A. M., et al. Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice. Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Taussig, D. C., et al. Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction. Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).
- Zhou, J., Chng, W. J. Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia. World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).
