Summary
Vi presenterer to forskjellige fargeprotokoller for NKG2D ligand (NKG2DL) deteksjon i humane primære akutte myeloid leukemi (AML) prøver. Den første tilnærmingen er basert på et fusjonsprotein, i stand til å gjenkjenne alle kjente og potensielt ukjente ligander, mens den andre protokollen er avhengig av tilsetning av flere anti-NKG2DL antistoffer.
Abstract
Innenfor samme pasient ble fravær av NKG2D ligander (NKG2DL) overflateuttrykk vist seg å skille leukemiske subpopulations med stamcelleegenskaper (såkalte leukemiske stamceller, LSC) fra mer differensierte motpart leukemiske celler som mangler sykdom initiering potensial selv om de bærer lignende leukemi spesifikke genetiske mutasjoner. NKG2DL er biokjemisk svært varierte MHC klasse I-lignende selvmolekyler. Friske celler i homeostatiske forhold uttrykker vanligvis ikke NKG2DL på celleoverflaten. I stedet blir uttrykk for disse ligandene indusert ved eksponering for cellulær stress (f.eks. onkogen transformasjon eller smittsomme stimuli) for å utløse eliminering av skadede celler via lysis gjennom NKG2D-reseptor-uttrykkende immunceller som naturlige morderceller (NK). Interessant nok er NKG2DL overflateuttrykk selektivt undertrykt i LSC-subpopulasjoner, slik at disse cellene kan unngå NKG2D-mediert immunovervåking. Her presenterer vi en side-ved-side-analyse av to forskjellige strømningscytometrimetoder som gjør det mulig å undersøke NKG2DL overflateuttrykk på kreftceller, det vil si en metode som involverer pan-ligandgjenkjenning og en metode som involverer farging med flere antistoffer mot enkeltligander. Disse metodene kan brukes til å skille levedyktige NKG2DL negative cellulære subpopulasjoner med putative kreft stamcelleegenskaper fra NKG2DL positiv ikke-LSC.
Introduction
NK-celler er viktige effektorer av det medfødte immunsystemet som kan gjenkjenne og eliminere ondartede celler eller stressede friske celler (f.eks. ved en virusinfeksjon) uten tidligere antigenstimulering1. Denne prosessen reguleres tett via et komplekst repertoar av aktiverende reseptorer – for eksempel naturlige cytotoksisitetsreseptorer (NCRs), NKG2D og CD16 – og hemmende reseptorer som i stor grad er representert av killer immunoglobulin-lignende reseptorer (KIRs)2. Binding av KIRs til humant leukocyttantigen (HLA) klasse I-molekyler på somatiske celler sikrer selvgjenkjenning og formidler NK-celletoleranse. På den annen side utløser fravær av selvgjenkjenning og økt binding av aktiverende reseptorer til deres ligander på målcellene frigjøring av cytotoksiske granulater som fører til NK-cellemediert cytotoksisitet1. Til slutt kan NK-celler utøve antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) ved å binde den aktiverende reseptoren CD16 til mål som uttrykker Fc-delen av Ig (FcR)2. Bortsett fra direkte cytotoksisitet, kan NK-celler også utløse cytokinfrigjøring som bygger bro over det medfødte med det adaptive immunsystemet3.
NKG2D er en stor aktiveringsreseptor uttrykt på NK, NKT, γδ T og naive CD8+ T-celler4 som gjør det mulig for slike cytotoksiske immunceller å gjenkjenne og lyse NKG2D ligand (NKG2DL) som uttrykker målceller. Friske celler uttrykker vanligvis ikke NKG2DL. I stedet er NKG2DL-uttrykket oppregulert på ondartede eller virusinfiserte celler for å gjøre disse mottagelige for immunclearance5.
Den menneskelige NKG2DL-familien består av åtte kjente molekyler blant hvilke de to MHC I kjederelaterte molekylene A og B (MICA og MICB6) og cytomegaloviruset UL16-bindende proteiner 1-6 (ULBP1-67). Uttrykket NKG2DL er regulert på transkripsjons-, posttranskripsjons- og postoversettelsesnivåene8. Som sådan, mens NKG2DL-uttrykk vanligvis ikke kan påvises på overflaten av sunne celler, ble NKG2DL mRNA9 og intracellulært proteinuttrykk rapportert i sunt vev. Den funksjonelle relevansen av et slikt uttrykk og mekanismene som ligger til grunn for slike diskrete uttrykksmønstre, gjenstår å definere10.
Den mekanistiske reguleringen av NKG2DL-uttrykket i kreftcellene er et fascinerende undersøkelsesområde. Veier som er kjent for å være involvert i enten cellulært stress, for eksempel varmesjokkspenningsveien9, eller DNA-skaderelaterte veier, for eksempel ataksi telangiectasia mutert (ATM) og Rad3-relatert (ATR) sti11, samt virus- eller bakterieinfeksjoner har vært direkte knyttet til induksjonen av NKG2DL-uttrykk12. Men selv om overflateuttrykket til NKG2DL har blitt effektivt indusert, kan dette uttrykket gå tapt igjen gjennom proteolytisk mediert shedding, en mekanisme forbundet med immunflukt og dårlig klinisk prognose i noen kreftformer13.
Fraværet av celleoverflate NKG2DL kan også spille viktige roller hos pasienter med AML. Her induserer behandling med intensiv kjemoterapi ofte remisjon, men tilbakefall oppstår ofte fra leukemiske stamceller (LSC), som selektivt overlever kjemoterapi og unngår immunrespons. Som vi nylig viste, unnslipper LSC-er for eksempel NK-cellelys ved å undertrykke NKG2DL overflateuttrykk14.
Omvendt kan fraværet av overflate NKG2DL-uttrykk brukes som en metode for å identifisere og dyktig isolere putative stammelignende subpopulasjoner av celler fra bulk motpart leukemiske subpopulasjoner. Her presenterer vi to strømningscytometriske tilnærminger som kan brukes til å oppdage NKG2DL overflateuttrykk og dermed identifisere NKG2DL negative stamceller i leukemi og kanskje også i andre kreftformer: En metode for pan-ligand overflategjenkjenning og en metode som involverer farging med enkelt- eller samlede antistoffer som gjenkjenner individuelle kjente NKG2DL-proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pasientprøver ble samlet inn etter godkjenning fra Etikkutvalget ved Universitetssykehusene Basel og Tuebingen.
1. Biotinylering av NKG2D fusjonsprotein
MERK: Dette trinnet utføres med et biotinyleringssett (se Materialliste) i henhold til produsentens anvisninger. Dette trinnet i protokollen må utføres minst 24 timer før fargingen. Det biotinylerte NKG2D fusjonsproteinet skal oppbevares ved -20 °C.
- Tine både biotinet og NKG2D fusjonsproteinrørene ved romtemperatur (RT).
MERK: Hvis cellene må være sterile for videre eksperimentell bruk (injeksjon hos mus, kolonidannende enhetsanalyser, etc.), rekonstituer fusjonsproteinet under en laminær strømningshette for å unngå forurensning. Ellers kan hvert trinn utføres på en benk. - Spinn raskt ned 50μg lyofilisert NKG2D fusjonsprotein. Tilsett 500 μL fosfatbufret saltvann (PBS) for å rekonstituere pulveret og bland grundig ved hjelp av en P1000 mikropipette.
- Tilsett 100 μL NKG2DL fusjonsprotein i et biotinrør for å oppnå en endelig lagerkonsentrasjon på 100 μg/ml.
- Bland oppløsningen grundig ved kontinuerlig resuspending med en P100 mikropipette.
- Inkuber fusjonsproteinet/biotinoppløsningen ved en kontrollert RT i 24 timer. Fusjonsproteinet er nå klart til bruk.
2. Opptining av primære AML-celler
MERK: Omtrent 5000 000 frosne leukemiceller per pasient lagret i flytende nitrogen ble tint og deretter brukt til analysene med en gang. Leukemiske celler ble oppnådd og frosset som tidligere beskrevet15. Kort sagt ble perifere blodprøver samlet inn fra pasienter med AML og høye eksplosjonscelleprosenter (>90% av eksplosjonene blant mononukleære celler) behandlet med en tetthetsgradientseparasjon for å oppnå mononukleære celler og deretter frosset i fosterkalvservum (FCS) som inneholder 10% dimetylsulfoksidoppløsning (DMSO). Celletallene varierte sterkt mellom pasienter i avhengighet av leukocytkonsentrasjonen hos pasienten (område: 1000 000 til 30 000 000 leukemiske celler per ml blod).
- Forvarm RPMI medium som inneholder 10% av FCS ved 37 °C ved hjelp av et vannbad. For hvert hetteglass med AML-celler (opptil 30 000 000 celler i 1 ml FCS + 10 % DMSO) tilsettes 10 ml forvarmet medium til et 15 ml reaksjonsrør.
- Fjern kryo toårig som inneholder primær AML fra lagring av flytende nitrogen og tin umiddelbart cellene ved hjelp av et 37 °C vannbad. Beveg røret forsiktig frem og tilbake i vannet, slik at innholdet i hetteglasset kan tine til det bare er en liten iskrystall igjen.
- Overfør straks de tinte cellene til det middels inneholdende røret og skyll hetteglasset med 1 ml medium.
- Sentrifuger cellene på 300 x g i 10 minutter og kast supernatanten uten å forstyrre pelletsen.
- Vask cellene med 5 ml RPMI medium som inneholder 10% av FCS og sentrifuger ved 300 x g i 10 minutter.
3. Celletelling
- Resuspend cellepellet i et kjent volum av RPMI medium som inneholder 10% av FCS.
- Overfør et lite volum av cellefjæringen til et 1,5 ml mikrosenterrør og fortynn med et kjent forhold med trypanblått eller noe annet alternativt fargestoff som tillater live celle / død cellediskriminering.
- Bruk en hvilken som helst enhet til å telle cellene.
- Sentrifuger cellene på 300 x g i 10 minutter og kast supernatanten uten å forstyrre pelletsen.
4. Farging av primære AML-celler ved bruk av det biotinylerte NKG2D fusjonsproteinet
- Forbered fargingsbufferen ved å supplere 500 ml PBS med bovint serumalbumin (BSA) og Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) til en endelig konsentrasjon på henholdsvis 0,07 mM og 2 mM. Juster pH (7.2-7.4) om nødvendig.
- Resuspend cellepellet med farging buffer til en endelig konsentrasjon på 0,5 x 107 celler / ml.
MERK: Eventuelt, før farging, kan cellene inkuberes med et blokkeringsmiddel (f.eks. hIgG (1μg/ml) i 30 minutter ved RT eller FcR-blokkerende middel).. - Overfør 100 μL av celleopphenget til en cellekultur 96-brønns U-bunnplate og sentrifuger platen på 300 x g i 10 minutter. Kast supernatanten uten å forstyrre pelletsen.
- Forbered en masterblanding av biotinylert NKG2D fusjonsprotein slik at cellene resuspenderes i et sluttvolum på 50 μL per brønn med en endelig konsentrasjon på 10 μg /ml per brønn.
- Tilsett hovedblandingen som er fremstilt i trinn 4.4 ved hjelp av en 100 μL pipette og resuspend cellepellets med en 300 μL flerkanals pipette.
MERK: Skaler ned det endelige volumet i henhold til antall celler for å redusere mengden fusjonsprotein som er nødvendig for fargingen. - Inkuber cellefjæringen i 25 min ved RT eller 50 min ved 4 °C.
- Vask cellene ved å tilsette 200 μL fargebuffer per brønn med en 300 μL flerkanals pipette.
- Sentrifuger platen på 300 x g i 10 minutter og kast supernatanten uten å forstyrre pelletsen.
- Gjenta trinn 4.7 og 4.8.
MERK: Fargingen som er beskrevet her, utføres i en cellekultur 96-brønns U-bunnplate. Derfor utføres vasketrinn to ganger på grunn av den lille volumkapasiteten til slike plater. Fargingen kan også utføres i andre rør, og vasketrinn kan da bare utføres én gang med et større volum. - Forbered en hovedblanding ved hjelp av Streptavidin-PE (se tabell 1 for fortynning) slik at cellene brukes på nytt i et endelig volum på 50 μL.
MERK: Legg til seleksjonsantistoffer for celletypen din som for eksempel CD33, CD34.... for AML. - Tilsett hovedblandingen som er fremstilt i trinn 4.10 ved hjelp av en 100 μL pipette og resuspend cellepellets med en 300 μL flerkanals pipette.
- Inkuber cellesuspensjonene i 15 min ved RT eller 30 min ved 4 °C i mørket.
- Vask cellene ved å tilsette 200 μL fargebuffer per brønn med en 300 μL flerkanals pipette.
- Sentrifuger platen på 300 x g i 10 minutter og kast supernatanten uten å forstyrre pelletsen.
- Gjenta trinn 4.13 og 4.14.
- Forbered en løsning av farging buffer inkludert 7-AAD (7-Aminoactinomycin D, 1:1000) eller noe reagens for å skille mellom levende og døde celler.
- Resuspendcellepellets i 200 μL fargebuffer + 7-AAD utarbeidet i trinn 4.16 ved bruk av en 300 μL flerkanals mikropipette.
- Analyser cellene ved hjelp av en strømningscytometrienhet.
5. Farging av enkelt- eller samlet enkelt anti-NKG2DL antistoffer
- Bruk samme celleoppheng som i trinn 4.2.
- Overfør 100 μL av celleopphenget til en cellekultur 96-brønns U-bunnplate ved hjelp av en 300 μL flerkanals pipette og sentrifuger platen ved 300 x g i 10 minutter. Kast supernatanten uten å forstyrre pelletsen.
- Forbered en antistoffmasterblanding for hvert primært antistoff eller samlede antistoffer (se tabell 2 for fortynning) slik at cellene resuspenderes i et endelig volum på 50 μL.
- Tilsett hovedblandingen som er fremstilt i trinn 5.3 ved hjelp av en 100 μL pipette og resuspend cellepellets med en 300 μL flerkanals pipette.
- Inkuber cellene i 25 min på RT.
- Vask cellene ved å tilsette 200 μL fargebuffer per brønn ved hjelp av en 300 μL flerkanals pipette.
- Sentrifuger cellekulturen 96-brønns U-bunnplate på 300 x g i 10 minutter og kast supernatanten uten å forstyrre pelletsen.
- Gjenta trinn 5.6 og 5.7.
- Forbered en antistoffmasterblanding ved å tilsette det sekundære antistoffet (se tabell 2 for fortynning) slik at cellene resuspenderes i et endelig volum på 50 μL per brønn.
- Tilsett hovedblandingen som er fremstilt i trinn 5.9 ved hjelp av en 100 μL pipette og resuspend cellepellets med en 300 μL flerkanals pipette.
- Inkuber i 15 min ved RT eller 30 min ved 4 °C i mørket.
- Vask ved å tilsette 200 μL fargebuffer per brønn ved hjelp av en 300 μL flerkanals pipette.
- Sentrifuger cellefjæringen ved 300 x g i 10 minutter og kast supernatanten uten å forstyrre pelletsen.
- Gjenta trinn 5.12 og 5.13.
- Resuspendcellepellets i 200 μL fargebuffer som inneholder 7-AAD utarbeidet i trinn 4.16.
- Analyser cellene ved hjelp av en strømningscytometrienhet som beskrevet i trinn 6.
6. Datainnsamling
MERK: Kontroller at ukentlige kvalitetskontroller av strømningscytometeret utføres for å sikre at laserne fungerer som de skal. For protokollen som presenteres her, utføres en ukentlig Cytometer and Tracking (CTS) prosess med relative perler for å sjekke laserytelser på alle kanaler. Etter CTS registreres 10 000 hendelser ved hjelp av de 8-topp perlene som internkontroll. Alle topper skal være i samme posisjon inne i portene og godt skilt fra hverandre.
- Opprett matrisekompensasjonen for å trekke fra spektraloverlapping mellom detektorer med perler eller med cellene16.
- Registrer 10 000 hendelser for de uoppdagede cellene og de enkeltfargede perlene. For fluorescens minus én (FMO)-kontroller registrerer du 50 000 hendelser og registrerer opptil 100 000 hendelser for fullfargede prøver.
MERK: Alternativt kan enkeltfargede prøver utføres på cellene. I så fall må du sørge for at cellene har et positivt signal for ønsket markør. - Skaff deg en enkelt farget celle eller perleprøve for hver fluorofor som brukes i eksperimentet for å avsløre mengden spektral overlapping. Bruk kompensasjonsskaperen for flowcytometrienheten til å beregne smitteverdier og bruke kompensasjonsmatrisen på alle de målte prøvene.
MERK: Sekundære antistoffer kan ikke brukes til kompensasjonsoppretting ved hjelp av perler hvis kompensasjonen beregnes med perler. Avhengig av typen kompensasjonsperler, kan sekundære antistoffer ikke brukes til kompensasjon med perler. - For FMO-kontrollene og de fulle fargede prøvene med fusjonsproteinet, velg for det første cellene basert på deres fremoverspredning (FSC) og sidespredning (SSC). Etter utelukkelse av dobler, gate cellene basert på deres negativitet for 7-AAD (PercP-Cy5.5) signal for å utelukke de døde cellene (se trinn 5.15). Det endelige plottet viser uttrykket av CD34 (Y-akse) og NKG2DL (X-akse) på levende singlets.
- For de enkle anti-NKG2DL-antistoffene, bruk den samme strategien på prøvene, men vær oppmerksom på at ligand positivitet ligger i Alexa Fluor 488 og ikke PE-kanalen.
- Juster portene i henhold til FMO-kontrollene for gatingstrategi fra trinn 6.4 og 6.5 (se tabell 3) for passende FMO-kontroller som skal utføres for dette eksperimentet: I analyseprogramvaren tegner du en port på den negative brøkdelen. Mens du registrerer den fullfargede prøven, er cellene over den tidligere opprettede porten positive for den analyserte markøren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Begge protokollene som presenteres her tillater berikelse av AML LSC ved strømningscytometriske analyser ved hjelp av CD34, en kjent markør for LSC17, i kombinasjon med NKG2DL overflateuttrykk ved enten å bruke pan-ligand anerkjennelse eller farging med samlede antistoffer mot individuelle ligander. I figur 1viser vi at de analyserte AML-prøvene er positive for CD34 og NKG2DL, men det finnes også negative delpopulasjoner, som vises ved tilstedeværelsen av fire forskjellige populasjoner totalt. Våre data viser den typiske gating strategien for en slik farging, starter med valg av hovedpopulasjonen av celler via deres FSC og SSC. Doble og døde celler utelates i nedstrømsanalysen (Figur 1A). Portene justeres ved hjelp av FMO-kontroller for å sikre riktig identifisering av positive celler (figur 1B).
I figur 1Cfremhever vi fluorescensintensitetene til celler som er positive for CD34 (APC, Y-akse) vs NKG2DL (PE, X-aksen). AML-celler som er positive for CD34, viser et lavere overflateuttrykk for NKG2DL (figur 1C), som er i tråd med tidligere funn fra laboratoriet vårt, som viser at NKG2DL-uttrykk er forbundet med mangel på stemness14.
Figur 2 indikerer robustheten til begge NKG2DL-fargingsmetodene. I figur 2Aundersøker vi tre primære AML-prøver side ved side som viser 19,8, henholdsvis 49,8 og 89,4 %, av positive hendelser for fusjonsproteinfarging vs. 20,4, 50,4 og 90,6 % for den samlede anti-NKG2DL antistofffargingen (samlet antistoff mot henholdsvis MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 og ULBP3). På den annen side viser enkeltliga (mot enten MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 eller ULBP3) farging en rekke positive hendelser opp til 92% (Figur 2B). Denne prosentandelen varierer avhengig av liganden selv og pasienten, for eksempel ULBP3 (figur 2B). Vær oppmerksom på at en enkelt celle kan uttrykke flere NKG2DL.
Når flere anti-NKG2DL antistoffer samles og kombineres i ett enkelt rør, er prosentandelen positive celler sammenlignbar med prosentandelen av fusjonsproteinet (figur 2A). Som sådan fungerer begge protokollene bra og kan gi lignende resultater angående NKG2DL-uttrykk på primære AML-celler. I noen AML kan fusjonsproteinmetoden tillate høyere følsomhet siden det kan tillate anerkjennelse av ytterligere NKG2DL-proteiner.
Figur 1: Typisk gatingstrategi for primære AML-prøver. (A) Celler blir først inngjerdet basert på deres størrelse (X-akse) og kompleksitet (f.eks. detaljnivå, Y-akse). Dobletter utelates deretter ved å tegne høyden eller bredden mot området for fremoverspredning. Til slutt velges levende celler basert på deres størrelse (X-akse) vs deres negativitet for 7AAD (PerCP-Cy5.5, Y-akse). (B) FMO-kontroller brukes til å sette opp portene som bidrar til å diskriminere mellom positive og negative populasjoner for angitte markører. Gating-strategien forblir identisk som avbildet i figur 1A. (C) Flow cytometriplott som viser positive og negative hendelser for CD34 (APC, Y-akse) vs NKG2DL (PE eller AlexaFluor488, X-akse). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sammenligning av fargeprotokoller. (A) Bar grafer som viser prosentandelen av positive hendelser for fusjonsproteinet vs samlet anti-NKGD2L antistoffer (n = 3 AML-prøver) fra inngjerdede enkelt levende celler. (B) Stolpediagrammer som viser prosentandelen av positive hendelser for enkeltligandfarging for alle kjente anti-NKG2DL-antistoffer og sammenssamlet enkeltligander (se Tabell over materialer for detaljert antistoffinformasjon). Gating ble igjen utført på enkelt levende celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn på rør | Antigen | Fluorofor | Fortynning/konsentrasjon |
| Celler som ikke er inngrodd | - | - | - |
| Enkel flekk PE |
NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 for hovedtrinn 1:100 for sekundært trinn |
| Enkel flekk 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
Levende/døde | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| Enkel flekk APC |
CD34 | APC | 1:25 |
| Fulle fargede celler | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 for hovedtrinn 1:100 for sekundært trinn | |
| Levende/døde | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tabell 1: Rør som kreves for å flekke prøver med NKG2D fusjonsprotein. Denne tabellen viser rørene som kreves for å sette opp eksperimentet.
| Navn på rør | Antigen | Fluorofor | Fortynning/konsentrasjon |
| Celler som ikke er inngrodd | - | - | - |
| Enkel flekk Alexa Fluor 488 |
ULBP-1 | Alexa Fluor 488 | 10 μg/ml for primært trinn 4 μg/ml for sekundært trinn |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| GLIMMER | |||
| MICB | |||
| enkelt flekk 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
Levende/døde | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| Enkel flekk APC |
CD34 | APC | 1:25 |
| Fulle fargede celler | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2DL | Alexa Fluor 488 | 10 μg/ml for primært trinn 4 μg/ml for sekundært trinn |
|
| Levende/døde | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tabell 2: Rør som kreves for å flekke prøver med anti-NKG2DL antistoffer. Denne tabellen viser rørene som kreves for å sette opp eksperimentet.
| Navn på rør | Antigen | Fluorofor | Fortynning/konsentrasjon |
| Celler som ikke er inngrodd | - | - | - |
| FMO_APC | ULBP-1 | Alexa Fluor 488 | 10 μg/ml for primært trinn 4 μg/ml for sekundært trinn |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| GLIMMER | |||
| MICB | |||
| NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 for primært trinn 1:100 for sekundært trinn |
|
| Levende/døde | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_PE | CD34 | APC | 1:25 |
| ULBP-1 | Alexa Fluor 488 | 10 μg/ml for primært trinn 4 μg/ml for sekundært trinn |
|
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| GLIMMER | |||
| MICB | |||
| Levende/døde | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_Alexa Fluor 488 | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 for primært trinn 1:100 for sekundært trinn |
|
| Levende/døde | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tabell 3: Rør kreves for å sette opp de essensielle kontrollene. Denne tabellen viser rørene som kreves for å sette opp riktige FMO-, primære og sekundære antistoffkontroller. Alle nødvendige kontroller (FMO) må legges til av eksperimentet for å oppnå gyldige resultater og tolkedata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi to strømningscytometriske metoder som kan oppdage NKG2DL overflateuttrykk på humane primære AML-celler. Vi viser at begge deteksjonsmetodene kan brukes sammen med andre antistofffarginger (f.eks. oppdage CD34-uttrykk). Lignende flekker kan også utføres på andre primære celletyper og cellelinjer.
Vi viste nylig at fraværet av NKG2DL på overflaten av AML pasient eksplosjoner kan berike LSC14. I AML har NKG2DL-negative, men ikke NKG2DL positive leukemiske subpopulations clonogenic og in vivo leukemi-initierende kapasiteter. Fremtidig forskning vil vise om fravær av NKG2DL overflateuttrykk også kan brukes som et verktøy for å berike stamceller i andre krefttyper.
CD34 har blitt klassisk vist å markere LSC i AML, men AML er en svært heterogen sykdom, og ikke alle AML-pasienter viser CD34-uttrykk (dvs. CD34 negativ AML18). Vi har tidligere vist at fravær av NKG2DL overflateuttrykk gir et nytt verktøy for å identifisere LSC i denne undergruppen av CD34 negativ AML. Her fokuserer vi derimot på undergruppen av CD34-positive ACL-er og viser at forskjellige delbefolkninger kan forekomme. Fremtidig forskning vil vise om co-farging for NKG2DL i forbindelse med slike andre markører (f.eks. CD34) mer effektivt kan berike LSC.
I strømningscytometri er det viktig å inkludere tilstrekkelige kontroller som FMO for å hjelpe eksperimentatoren til å diskriminere riktig mellom positive og negative hendelser. I tillegg er positive kontroller for hvert brukt antistoff nødvendig for å sikre at fraværet av farging ikke skyldes et funksjonsfeil antistoff. Protokollen vi presenterer her bruker bare et begrenset antall overflatemarkører, som kan utvides i henhold til eksperimentets behov, for eksempel ved å legge til CD33 eller potensielle LSC-markører19. Videre kan fluoroforene som brukes i denne protokollen tilpasses. Viktigst, slike endringer bør ledsages av en antistofftitrering for å bestemme den beste fortynning.
Et kritisk skritt før fargingen er opptining av primære AML-celler. Faktisk, i tillegg til deres skjørhet, blir slike prøver bevart i dimetylsulfoksid (DMSO), som er per se giftig for cellene. Derfor bør prøvene håndteres med forsiktighet og bør skylls grundig for å unngå langvarig eksponering for DMSO. Selv om prøvene våre ble behandlet og frosset i henhold til en tidligere etablert protokoll15, er det viktig å nøye følge trinnene som er beskrevet i manuskriptet for å sikre en høy cellegjenoppretting. Arbeid med ferske prøver vil sikre bedre levedyktighet og anbefales dermed. Men i de fleste tilfeller er dette ikke praktisk mulig.
En annen faktor som påvirker den beskrevne metoden er utvalgsspesifikk avvik som kan resultere i forskjellige cellespredningsprofiler observert via strømningscytometri. På grunn av sykdom heterogenitet er dette uunngåelig, men bør vurderes i analysen. Ytterligere variasjon kan innføres ved frysing/opptining eller andre mekaniske trinn i prøvebehandling. Generelt er hurtighet nøkkelen for å unngå celledød. Likevel kan ikke døende celler og rusk unngås og må tas i betraktning og utelukkes i analysen. Gating basert på FSC / SSC bør gjøres med grundighet og et kritisk øye, da det er det første trinnet i prøveanalyse.
En stor fordel med fusjonsproteinet er dens styrke til å oppdage alle kjente og potensielt ukjente NKG2DLer, mens spesifikke anti-NKG2DL antistoffer (f.eks. MICA, MICB) introduserer en utvalgsbias. Begge metodene er like gjennomførbare. For det analyserte begrensede antallet prøver viste de også svært sammenlignbare resultater. Bruk av NKG2D-fusjonsproteinet har noen store fordeler: Mindre tidkrevende, redusert reagensnummer og antall fargeprøver samt lavere sannsynlighet for menneskelige feil (dvs. pipetteringsfeil). Videre kan denne metoden også være mer effektiv i å fange NKG2DL-uttrykk i noen prøver, siden den også bør fange uttrykk for ukjente proteiner med NKG2DL-funksjonen, som kan uttrykkes i noen AML-tilfeller. Selv om denne metoden gir innsikt i overflatetilstedeværelsen til NKG2DL, gir den ikke informasjon om de intracellulære nivåene av NKG2DL, deres menneskehandel eller regulering, og andre analyser bør derfor utføres for å få ytterligere kunnskap om slike spørsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra Swiss National Science Foundation (179239), Foundation for Fight Against Cancer (Zuerich), Wilhelm Sander Foundation to CL (2019.042.1) og Novartis Foundation for medisinsk-biologisk forskning til C.L. Videre har dette prosjektet fått støtte fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie-tilskuddsavtalen Nr. 765104. Vi takker Flow Cytometry Facility i Basel for støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
References
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness. Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).
- Zingoni, A., et al. NKG2D and its ligands: "One for All, All for One". Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).
- Eagle, R. A., Trowsdale, J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).
- El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).
- Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D. Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).
- Long, E. O. Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm. Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).
- Hüe, S., et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).
- Gasser, S., Raulet, D. H. Activation and self-tolerance of natural killer cells. Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).
- Groh, V., et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).
- Maurer, S., et al. Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells. Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).
- Paczulla, A. M., et al. Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion. Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).
- Paczulla, A. M., et al. Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice. Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Taussig, D. C., et al. Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction. Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).
- Zhou, J., Chng, W. J. Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia. World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).
