Summary
Vi presenterar två olika färgning protokoll för NKG2D ligand (NKG2DL) upptäckt i mänskliga primära akut myeloisk leukemi (AML) prover. Det första tillvägagångssättet är baserat på ett fusionsprotein, som kan känna igen alla kända och potentiellt ännu okända ligands, medan det andra protokollet förlitar sig på tillsats av flera anti-NKG2DL-antikroppar.
Abstract
Inom samma patient visades avsaknad av NKG2D ligands (NKG2DL) ytuttryck skilja leukemic subpopulations med stamcellsegenskaper (så kallade leukemic stamceller, LSCs) från mer differentierade motsvarighet leukemic celler som saknar sjukdom inledande potential även om de bär liknande leukemi specifika genetiska mutationer. NKG2DL är biokemiskt mycket olika MHC klass I-liknande självmolekyler. Friska celler i homeostatiska förhållanden uttrycker i allmänhet inte NKG2DL på cellytan. Istället induceras uttryck för dessa ligands vid exponering för cellulär stress (t.ex. onkogen omvandling eller infektiös stimuli) för att utlösa eliminering av skadade celler via lys genom NKG2D-receptor-uttrycker immunceller som naturliga mördarceller (NK). Intressant nog undertrycks NKG2DL ytuttryck selektivt i LSC-subpopulationer, vilket gör att dessa celler kan undvika NKG2D-medierad immunövervakning. Här presenterar vi en sida vid sida analys av två olika flöde cytometri metoder som möjliggör undersökningen av NKG2DL ytuttryck på cancerceller dvs en metod som omfattar pan-ligand erkännande och en metod som innebär färgning med flera antikroppar mot enskilda ligands. Dessa metoder kan användas för att separera livskraftiga NKG2DL negativa cellulära subpopulationer med förmodade cancer stamcellsegenskaper från NKG2DL positiva icke-LSC.
Introduction
NK-celler är viktiga effektorer av det medfödda immunsystemet som kan känna igen och eliminera maligna celler eller stressade friska celler (t.ex. genom en virusinfektion) utan tidigare antigenstimulering1. Denna process regleras hårt via en komplex repertoar av aktiverande receptorer – såsom naturliga cytotoxicitetsreceptorer (NCR), NKG2D och CD16 – och hämmande receptorer som till stor del representeras av mördarimglobulinliknande receptorer (KIR)2. Bindning av KIR till humant leukocytantigen (HLA) klass I-molekyler på somatiska celler säkerställer självigenkänning och förmedlar NK-celltolerans. Å andra sidan utlöser frånvaro av självigenkänning och ökad bindning av aktiverande receptorer till sina ligands på målcellerna frisättningen av cytotoxiska granuler som leder till NK-cellmedierad cytotoxicitet1. Slutligen kan NK-celler utöva antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet (ADCC) genom att binda den aktiverande receptorn CD16 till mål som uttrycker Fc-delen av Ig (FcR)2. Förutom direkt cytotoxicitet kan NK-celler också utlösa cytokinfrisättning som överbryggar medfödda med det adaptiva immunsystemet3.
NKG2D är en stor aktiverande receptor uttryckt på NK, NKT, γδ T och naiva CD8 +T-celler 4 som gör det möjligt för sådana cytotoxiska immunceller att känna igen och lysa NKG2D ligand (NKG2DL) som uttrycker målceller. Friska celler uttrycker vanligtvis inte NKG2DL. Istället är NKG2DL uttryck uppreglerat på maligna eller virusinfekterade celler för att göra dessa mottagliga för immun clearance5.
Den mänskliga NKG2DL-familjen består av åtta kända molekyler bland vilka de två MHC I-kedjerelaterade molekylerna A och B (MICA och MICB6) och cytomegaloviruset UL16-bindande proteiner 1–6 (ULBP1-67). Uttrycket av NKG2DL regleras på transkriptions-, post-transkriptions- och post-translationella nivåer8. Som sådan, medan NKG2DL uttryck är vanligtvis inte detekterbara på ytan av friska celler, NKG2DL mRNA9 och intracellulära protein uttryck rapporterades i friska vävnader. Den funktionella relevansen av ett sådant uttryck och de mekanismer som ligger till grund för sådana diskreta uttrycksmönster återstår att definiera10.
Den mekanistiska regleringen av NKG2DL-uttrycket i cancercellerna är ett fascinerande undersökningsområde. Vägar som är kända för att vara inblandade i antingen cellulär stress, t.ex. Men även om ytuttryck av NKG2DL har inducerats effektivt, kan detta uttryck gå förlorat igen genom proteolytisk-medierad utsöndring, en mekanism som är associerad med immunflykt och dålig klinisk prognos i vissa cancerformer13.
Avsaknaden av cellytan NKG2DL kan också spela viktiga roller hos patienter med AML. Här inducerar behandling med intensiv kemoterapi ofta eftergift, men återfall uppstår ofta från leukemiska stamceller (LSC), som selektivt överlever kemoterapier och undviker immunsvar. Som vi nyligen visade, LSCs, till exempel fly NK cell lysis genom att undertrycka NKG2DL ytuttryck14.
Omvänt kan frånvaron av ytan NKG2DL uttryck användas som en metod för att identifiera och livskraftigt isolera förmodade stam-liknande subpopulationer av celler från bulk motsvarighet leukemic subpopulationer. Här presenterar vi två flödescytometriska metoder som kan användas för att upptäcka NKG2DL ytuttryck och därmed identifiera NKG2DL negativa stamceller i leukemi och kanske även i andra cancerformer: En metod för pan-ligand ytigenkänning och en metod som innebär färgning med enstaka eller poolade antikroppar som känner igen enskilda kända NKG2DL proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Patientprover samlades in efter godkännande från Etikprövningsnämnden vid universitetssjukhusen i Basel och Tuebingen.
1. Biotinylering av fusionsproteinet NKG2D
OBS: Detta steg utförs med ett biotinyleringskit (se Materialförteckningen)enligt tillverkarens anvisningar. Detta steg i protokollet måste utföras minst 24 timmar före färgningen. Det biotinylerade NKG2D-fusionsproteinet ska förvaras vid -20 °C.
- Tina både biotin, liksom NKG2D fusion proteinrör vid rumstemperatur (RT).
OBS: Om cellerna behöver steriliseras för ytterligare experimentell användning (injektion hos möss, kolonibildande enhetsanalyser osv.) ska fusionsproteinet rekonstitueras under en laminär flödeshuv för att undvika kontaminering. Annars kan varje steg utföras på en bänk. - Snurra snabbt ner 50μg lyofiliiserat NKG2D fusionsprotein. Tillsätt 500 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att rekonstruera pulvret och blanda noggrant med en P1000-mikropipett.
- Tillsätt 100 μL av fusionsproteinet NKG2DL i ett biotinrör för att erhålla en slutlig lagerkoncentration på 100 μg/ml.
- Blanda lösningen noggrant genom kontinuerlig återsuspending med en P100-mikropipett.
- Inkubera fusionsproteinet/biotinlösningen vid en kontrollerad RT i 24 timmar. Fusionsproteinet är nu klart att användas.
2. Upptining av primära AML-celler
OBS: Cirka 5 000 000 frysta leukemiceller per patient lagrad i flytande kväve tinades upp och användes sedan för analyserna direkt. Leukemic celler erhölls och frystes som tidigarebeskrivits 15. Kortvarigt behandlades perifera blodprover som samlats in från patienter med AML och hög blastcellsprocent (>90% av sprängningarna bland mononukleära celler) med en densitetsgradientseparation för att erhålla mononukleära celler och därefter frysta i fetala kalvserum (FCS) som innehåller 10% dimetylsulfoxidlösning (DMSO). Antalet celler varierade mycket mellan patienter som var beroende av leukocytkoncentrationen hos patienten (intervall: 1 000 000 till 30 000 000 leukemicceller per ml blod).
- Förvärmt RPMI-medium som innehåller 10 % fcs vid 37 °C med hjälp av ett vattenbad. För varje injektionsflaska med AML-celler (upp till 30 000 000 celler i 1 ml FCS + 10% DMSO), tillsätt 10 ml förvärmt medium till ett 15 ml reaktionsrör.
- Ta bort kryovialen som innehåller primär AML från vätskekvävelagringen och tina omedelbart cellerna med ett vattenbad på 37 °C. Flytta försiktigt röret fram och tillbaka i vattnet, så att innehållet i injektionsflaskan kan tina tills det bara finns en liten iskristall kvar.
- Överför omedelbart de tinade cellerna till det medelinnehållande röret och skölj injektionsflaskan med 1 ml medium.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 10 min och kassera supernatanten utan att störa pelleten.
- Tvätta cellerna med 5 ml RPMI-medium som innehåller 10% FCS och centrifugera vid 300 x g i 10 min.
3. Cellräkning
- Återanvänd cellpelleten i en känd volym RPMI-medium som innehåller 10% av FCS.
- Överför en liten volym av cellfjädringen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och späd vid ett känt förhållande med trypanblått eller något annat alternativt färgämne som tillåter levande cell/död celldiskriminering.
- Använd valfri enhet för att räkna cellerna.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 10 min och kassera supernatanten utan att störa pelleten.
4. Färgning av primära AML-celler med hjälp av det biotinylerade NKG2D-fusionsproteinet
- Förbered färgningsbufferten genom att komplettera 500 ml PBS med bovint serumalbumin (BSA) och etylendiaminetetraacetsyra (EDTA) till en slutlig koncentration på 0, 07 mM respektive 2 mM. Justera pH(7,2–7,4) om det behövs.
- Återanvänd cellpelleten med färgbuffert till en slutlig koncentration på 0, 5 x 107 celler/ml.
OBS: Eventuellt kan cellerna, före färgning, inkuberas med ett blockerande medel (t.ex. hIgG (1 μg/ml) i 30 minuter vid RT- eller FcR-blockerande medel).. - Överför 100 μL av cellupphängningen till en cellkultur 96-brunns U-bottenplatta och centrifugera plattan vid 300 x g i 10 min. Kassera supernaten utan att störa pelleten.
- Förbered en masterblandning av biotinylerat NKG2D-fusionsprotein så att cellerna återanvänds i en slutlig volym på 50 μL per brunn med en slutlig koncentration på 10 μg/ml per brunn.
- Tillsätt huvudmixen beredd i steg 4.4 med en 100 μL-pipett och återanvänd cellpelletsen med en 300 μL flerkanalspipett.
OBS: Skala ner den slutliga volymen beroende på antalet celler för att minska mängden fusionsprotein som är nödvändigt för färgningen. - Inkubera cellfjädringen i 25 minuter vid RT eller 50 min vid 4 °C.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 200 μL färgbuffert per brunn med en 300 μL flerkanalspipett.
- Centrifugera plattan vid 300 x g i 10 min och kassera supernatanten utan att störa pelleten.
- Upprepa steg 4.7 och 4.8.
OBS: Färgningen som beskrivs här utförs i en cellkultur 96-brunn U-bottenplatta. Därför utförs tvättsteg två gånger på grund av den lilla volymkapaciteten hos sådana plattor. Färgningen kan också utföras i andra rör och tvättsteg kan sedan endast utföras en gång med en större volym. - Förbered en huvudblandning med Streptavidin-PE (se tabell 1 för utspädningar) så att cellerna återanvänds i en slutlig volym på 50 μL.
OBS: Lägg till urvalsantikroppar för din celltyp av intresse som t.ex. CD33, CD34.... för AML. - Tillsätt huvudmixen beredd i steg 4.10 med en 100 μL-pipett och återanvänd cellpelletsen med en 300 μL flerkanalspipett.
- Inkubera cellupphängningen i 15 minuter vid RT eller 30 min vid 4 °C i mörker.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 200 μL färgbuffert per brunn med en 300 μL flerkanalspipett.
- Centrifugera plattan vid 300 x g i 10 min och kassera supernatanten utan att störa pelleten.
- Upprepa steg 4.13 och 4.14.
- Förbered en lösning av färgningsbuffert inklusive 7-AAD (7-Aminoactinomycin D, 1:1000) eller något reagens för att skilja mellan levande och döda celler.
- Återanvänd cellpellets i 200 μL färgningsbuffert + 7-AAD beredd i steg 4.16 med en 300 μL flerkanalsmikropipett.
- Analysera cellerna med hjälp av en flödescytometriapparat.
5. Färgning av enstaka eller poolade enstaka anti-NKG2DL-antikroppar
- Använd samma cellupphängning som i steg 4.2.
- Överför 100 μL av cellfjädringen till en cellkultur 96-brunns U-bottenplatta med en 300 μL flerkanalspipett och centrifugera plattan vid 300 x g i 10 min. Kassera supernaten utan att störa pelleten.
- Bered en antikroppsblandning för varje primär antikropp eller poolade antikroppar (se tabell 2 för utspädningar) så att cellerna återanvänds i en slutlig volym på 50 μL.
- Tillsätt huvudmixen i steg 5.3 med en 100 μL-pipett och återanvänd cellpelletsen med en 300 μL flerkanalspipett.
- Inkubera cellerna i 25 minuter på RT.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 200 μL färgbuffert per brunn med en 300 μL flerkanalspipett.
- Centrifugera cellkulturen 96-brunns U-bottenplatta vid 300 x g i 10 min och kassera supernatanten utan att störa pelleten.
- Upprepa steg 5.6 och 5.7.
- Förbered en antikroppsblandning genom att tillsätta den sekundära antikroppen (se tabell 2 för utspädningar) så att cellerna återanvänds i en slutlig volym på 50 μL per brunn.
- Tillsätt huvudmixen beredd i steg 5.9 med en 100 μL pipett och återanvänd cellpelletsen med en 300 μL flerkanalspipett.
- Inkubera i 15 min vid RT eller 30 min vid 4 °C i mörker.
- Tvätta genom att tillsätta 200 μL färgbuffert per brunn med en 300 μL flerkanalspipett.
- Centrifugera cellfjädringen vid 300 x g i 10 min och kassera supernatanten utan att störa pelleten.
- Upprepa steg 5.12 och 5.13.
- Återanvänd cellpellets i 200 μL färgbuffert innehållande 7-AAD beredd i steg 4.16.
- Analysera cellerna med hjälp av en flödescytometriapparat enligt beskrivningen i steg 6.
6. Datainsamling
OBS: Se till att veckovisa kvalitetskontroller av flödescytometern utförs för att säkerställa att lasrarna fungerar korrekt. För protokollet som presenteras här utförs en veckovis Cytometer and Tracking (CTS) process med relativa pärlor för att kontrollera laserprestanda på alla kanaler. Efter CTS registreras 10 000 händelser med 8-topppärlor som intern kontroll. Alla toppar bör vara i samma position innanför sina portar och väl åtskilda från varandra.
- Skapa matriskompensationen för att subtrahera spektral överlappning mellan detektorer med pärlor eller med celler16.
- Spela in 10 000 händelser för de ofläckade cellerna och de enda färgade pärlorna. För fluorescens minus en (FMO) kontroller, registrera 50 000 händelser och för de fullfärgade proverna registrera upp till 100 000 händelser.
OBS: Alternativt kan enstaka färgade prover utföras på cellerna. Om så är möjligt, se till att cellerna har en positiv signal för önskad markör. - Skaffa ett enda färgat cell- eller pärlprov för varje fluorfor som används i försöket för att avslöja mängden spektral överlappning. Använd kompensationsskaparen av flödescytometrienheten för att beräkna spill-over-värden och applicera kompensationsmatrisen på alla uppmätta prover.
OBS: Sekundära antikroppar kan inte användas för att skapa ersättningar med hjälp av pärlor om ersättningen beräknas med pärlor. Beroende på typen av kompensationspärlor kan sekundära antikroppar inte användas för ersättning med pärlor. - För FMO-kontrollerna och de fullständiga färgade proverna med fusionsproteinet väljer du först cellerna baserat på deras främre spridning (FSC) och sidospridning (SSC). Efter uteslutning av dubblettar, porta cellerna baserat på deras negativitet för 7-AAD (PercP-Cy5.5) signal för att utesluta de döda cellerna (se steg 5.15). Det sista plott visar uttrycket av CD34 (Y-axel) och NKG2DL (X-axel) på levande singlar.
- För de enda anti-NKG2DL-antikropparna, tillämpa samma strategi på proverna men observera att ligand positivitet ligger i Alexa Fluor 488 och inte PE-kanalen.
- Justera grindarna enligt FMO-kontrollerna för gatingstrategi från steg 6.4 och 6.5 (se tabell 3) för lämpliga FMO-kontroller att utföra för detta experiment: Rita en grind på den negativa fraktionen i analysprogramvaran. När du registrerar det fullfärgade provet är cellerna ovanför den tidigare skapade porten positiva för den analyserade markören.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Båda protokollen som presenteras här tillåter berikning av AML LSC genom flöde cytometriska analyser med CD34, en känd markör för LSC17, i kombination med NKG2DL ytuttryck genom att antingen använda pan-ligand erkännande eller färgning med poolade antikroppar mot enskilda ligander. I figur 1visar vi att de analyserade AML-proverna är positiva för CD34 och NKG2DL, men det finns också negativa delpopulationer, vilket framgår av närvaron av totalt fyra olika populationer. Våra data visar den typiska gating strategin för en sådan färgning, börjar med valet av den viktigaste populationen av celler via deras FSC och SSC. Dubblettar och döda celler ingår inte i analysen nedströms (figur 1A). Grindarna justeras med hjälp av FMO-kontroller för att säkerställa korrekt identifiering av positiva celler(figur 1B).
I figur 1Cframhärkar vi cellernas fluorescensintensiteter positivt för CD34 (APC, Y-axel) vs NKG2DL (PE, X-axel). AML-celler som är positiva för CD34 visar ett lägre ytuttryck av NKG2DL (Figur 1C), vilket är i linje med tidigare resultat från vårt laboratorium, som visar att NKG2DL-uttryck är förknippat med brist på stemness14.
Figur 2 anger robustheten hos båda NKG2DL-färgningsmetoderna. I figur 2Aundersöker vi tre primära AML-prover sida vid sida som visar 19,8, 49,8 respektive 89,4 %, av positiva händelser för fusionsproteinfärgningen jämfört med 20,4, 50,4 respektive 90,6 % för den poolade anti-NKG2DL-antikroppsfärgningen (poolade antikroppar mot MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 respektive ULBP3). Å andra sidan visar enkelligand (mot antingen MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 eller ULBP3) färgning en rad positiva händelser upp till 92%(figur 2B). Denna procentandel varierar beroende på ligand själv och patienten, till exempel ULBP3 (Figur 2B). Observera att en enda cell kan uttrycka flera NKG2DL.
När flera anti-NKG2DL-antikroppar slås samman och kombineras till ett enda rör är andelen positiva celler jämförbar med procentandelen fusionsprotein (figur 2A). Som sådan fungerar båda protokollen bra och kan ge liknande resultat när det gäller NKG2DL-uttryck på primära AML-celler. I viss AML kan fusionsproteinmetoden tillåta högre känslighet eftersom det kan tillåta erkännande av ytterligare NKG2DL-proteiner.
Figur 1: Typisk gatingstrategi för primära AML-prover. A)Cellerna är först gated baserat på deras storlek (X-axel) och komplexitet (t.ex. granularitet, Y-axel). Dubbletter utesluts sedan genom att rita höjden eller bredden mot området för framåtriktad spridning. Slutligen väljs levande celler baserat på deras storlek (X-axel) jämfört med deras negativitet för 7AAD (PerCP-Cy5.5, Y-axel). B)Kontroller av utländska direktor används för att sätta upp grindar som hjälper till att diskriminera mellan positiva och negativa populationer för angivna markörer. Gatingstrategin förblir identisk enligt figur 1A. (C) Flödescytometridiagram som visar positiva och negativa händelser för CD34 (APC, Y-axel) vs NKG2DL (PE eller AlexaFluor488, X-axel). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Jämförelse av färgningsprotokoll. A)Stapeldiagram som visar procentandelen positiva händelser för fusionsproteinet jämfört med de poolade anti-NKGD2L-antikropparna (n = 3 AML-prover) från gated single living cells. (B) Stapeldiagram som visar procentandelen positiva händelser för enkel ligandfärgning för alla kända anti-NKG2DL-antikroppar och poolade single ligands (se Materialförteckning för detaljerad antikroppsinformation). Gating utfördes igen på enstaka levande celler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Rörnamn | Antigen | Fluorofor | Utspädning/koncentration |
| Otillstrade celler | - | - | - |
| Enda fläck PE |
NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 för primärt steg 1:100 för sekundärt steg |
| Enda fläck 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
Live/Döda | 7AAD (på 7AAD) (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| Enda fläck APC |
CD34 (cd34) | APC | 1:25 |
| Fulla färgade celler | CD34 (cd34) | APC | 1:25 |
| NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 för primärt steg 1:100 för sekundärt steg | |
| Live/Döda | 7AAD (på 7AAD) (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tabell 1: Rör som krävs för att färga prover med NKG2D fusionsprotein. Den här tabellen visar de rör som krävs för att ställa in experimentet.
| Rörnamn | Antigen | Fluorofor | Utspädning/koncentration |
| Otillstrade celler | - | - | - |
| Enda fläck Alexa Fluor 488 (olika personer) |
ULBP-1 (ulbp-1) | Alexa Fluor 488 (olika personer) | 10 μg/ml för primärt steg 4 μg/ml för sekundärt steg |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| GLIMMER | |||
| MICB (MICB) | |||
| enda fläck 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
Live/Döda | 7AAD (på 7AAD) (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| Enda fläck APC |
CD34 (cd34) | APC | 1:25 |
| Fulla färgade celler | CD34 (cd34) | APC | 1:25 |
| NKG2DL (NKG2DL) | Alexa Fluor 488 (olika personer) | 10 μg/ml för primärt steg 4 μg/ml för sekundärt steg |
|
| Live/Döda | 7AAD (på 7AAD) (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tabell 2: Rör som krävs för att färga prover med anti-NKG2DL-antikropparna. Den här tabellen visar de rör som krävs för att ställa in experimentet.
| Rörnamn | Antigen | Fluorofor | Utspädning/koncentration |
| Otillstrade celler | - | - | - |
| FMO_APC | ULBP-1 (ulbp-1) | Alexa Fluor 488 (olika personer) | 10 μg/ml för primärt steg 4 μg/ml för sekundärt steg |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| GLIMMER | |||
| MICB (MICB) | |||
| NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 för primärt steg 1:100 för sekundärt steg |
|
| Live/Döda | 7AAD (på 7AAD) (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_PE | CD34 (cd34) | APC | 1:25 |
| ULBP-1 (ulbp-1) | Alexa Fluor 488 (olika personer) | 10 μg/ml för primärt steg 4 μg/ml för sekundärt steg |
|
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| GLIMMER | |||
| MICB (MICB) | |||
| Live/Döda | 7AAD (på 7AAD) (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_Alexa Fluor 488 | CD34 (cd34) | APC | 1:25 |
| NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 för primärt steg 1:100 för sekundärt steg |
|
| Live/Döda | 7AAD (på 7AAD) (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tabell 3: Rör krävs för att ställa in de nödvändiga kontrollerna. Den här tabellen visar de rör som krävs för att ställa in lämpliga FMO-, primär- och sekundära antikroppskontroller. Alla nödvändiga kontroller (FMO) måste läggas till av experimenteraren för att få giltiga resultat och tolkningsdata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi två flöde cytometriska metoder som kan upptäcka NKG2DL ytuttryck på mänskliga primära AML celler. Vi visar att båda detekteringsmetoderna kan användas tillsammans med andra antikroppsfärgningar (t.ex. detektering av CD34-uttryck). Liknande färgningar kan också utföras på andra primära celltyper och cellinjer.
Vi visade nyligen att avsaknaden av NKG2DL på ytan av AML patient blaster kan berika LSC14. I AML, NKG2DL negativa men inte NKG2DL positiva leukemic subpopulationer har clonogenic och in vivo leukemi-initiera kapacitet. Framtida forskning kommer att visa om frånvaro av NKG2DL ytuttryck också kan användas som ett verktyg för att berika stamceller i andra cancertyper.
CD34 har klassiskt visat sig markera LSCs i AML, men AML är en mycket heterogen sjukdom och inte alla AML patienter visar CD34 uttryck (dvs CD34 negativ AML18). Vi har tidigare visat att avsaknad av NKG2DL ytuttryck ger ett nytt verktyg för att identifiera LSC i denna undergrupp av CD34 negativ AML. Här fokuserar vi däremot på undergruppen cd34-positiva amls och visar att olika delpopulationer kan uppstå. Framtida forskning kommer att visa om samfärgning för NKG2DL tillsammans med sådana andra markörer (t.ex. CD34) mer effektivt kan berika LSC.
I flödescytometri är det viktigt att inkludera adekvata kontroller som FMO för att hjälpa experimenteraren att korrekt diskriminera mellan positiva och negativa händelser. Dessutom är positiva kontroller för varje använd antikropp nödvändiga för att säkerställa att frånvaron av färgning inte beror på en felaktig antikropp. Protokollet vi presenterar här använder endast ett begränsat antal ytmarkörer, som kan utökas enligt experimenterarens behov, till exempel genom tillägg av CD33 eller potentiella LSC-markörer19. Dessutom kan fluorforerna som används i detta protokoll anpassas. Viktigt är att sådana förändringar åtföljs av en antikroppstitrering för att bestämma den bästa utspädningen.
Ett kritiskt steg före färgningen är upptining av primära AML-celler. Förutom deras bräcklighet bevaras sådana prover i dimetylsulfoxid (DMSO), som i sig är giftigt för cellerna. Proverna bör därför hanteras varsamt och sköljas noggrant för att undvika långvarig exponering för DMSO. Även om våra prover bearbetades och frystes enligt ett tidigare etablerat protokoll15, är det viktigt att noggrant följa stegen som beskrivs i manuskriptet för att säkerställa en hög cellåterställning. Att arbeta med färska prover kommer att säkerställa förbättrad livskraft och rekommenderas därför. I de flesta fall är detta dock inte praktiskt genomförbart.
En annan faktor som påverkar den beskrivna metoden är provspecifik avvikelse som kan resultera i olika cellspridningsprofiler som observeras via flödescytometri. På grund av sjukdoms heterogenitet är detta oundvikligt men bör beaktas i analysen. Ytterligare variabilitet kan införas genom frysning/upptining eller andra mekaniska steg vid provbearbetning. I allmänhet är snabbhet nyckeln till att undvika celldöd. Ändå kan döende celler och skräp inte undvikas och måste beaktas och uteslutas i analysen. Gating baserat på FSC/SSC bör göras med noggrannhet och ett kritiskt öga eftersom det är det första steget i provanalys.
En stor fördel med fusionsproteinet är dess styrka att upptäcka alla kända och potentiellt okända NKG2DLs, medan specifika anti-NKG2DL-antikroppar (t.ex. MICA, MICB) introducerar en urvalsbias. Båda metoderna är lika genomförbara. För det analyserade begränsade antalet prover visade de också mycket jämförbara resultat. Att använda NKG2D fusion protein har några stora fördelar: Mindre tidskrävande, minskat reagens antal och antal färgningsprover samt en lägre sannolikhet för mänskliga misstag (dvs. pipetting misstag). Dessutom kan denna metod också vara effektivare för att fånga NKG2DL-uttryck i vissa prover, eftersom den också bör fånga uttryck för okända proteiner med NKG2DL-funktionen, som kan uttryckas i vissa AML-fall. Samtidigt som dessa metoder ger insikt i NKG2DL:s ytförekomst ger den inte information om de intracellulära nivåerna av NKG2DL, deras handel eller reglering, och andra analyser bör därför utföras för att få ytterligare kunskap om sådana frågor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från Swiss National Science Foundation (179239), Foundation for Fight Against Cancer (Zuerich), Wilhelm Sander Foundation till CL (2019.042.1) och Novartis Foundation for medical-biological research to C.L. Dessutom har detta projekt fått finansiering från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 inom ramen för Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtalet nr 765104. Vi tackar Flow Cytometry Facility i Basel för stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
References
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness. Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).
- Zingoni, A., et al. NKG2D and its ligands: "One for All, All for One". Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).
- Eagle, R. A., Trowsdale, J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).
- El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).
- Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D. Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).
- Long, E. O. Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm. Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).
- Hüe, S., et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).
- Gasser, S., Raulet, D. H. Activation and self-tolerance of natural killer cells. Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).
- Groh, V., et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).
- Maurer, S., et al. Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells. Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).
- Paczulla, A. M., et al. Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion. Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).
- Paczulla, A. M., et al. Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice. Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Taussig, D. C., et al. Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction. Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).
- Zhou, J., Chng, W. J. Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia. World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).
