Summary
İnsan primer akut miyeloid lösemi (AML) örneklerinde NKG2D ligand (NKG2DL) tespiti için iki farklı boyama protokolü sunuyoruz. İlk yaklaşım, bilinen ve potansiyel olarak henüz bilinmeyen tüm ligandları tanıyabilen bir füzyon proteinine dayanırken, ikinci protokol birden fazla anti-NKG2DL antikorunun eklenmesine dayanır.
Abstract
Aynı hastada, NKG2D ligandlarının (NKG2DL) yüzey ekspresyonunun yokluğunun, benzer lösemi spesifik genetik mutasyonlar taşımalarına rağmen hastalık başlatma potansiyeli olmayan daha farklılaştırılmış muadil lösemi hücrelerinden kök hücre özelliklerine (lökemik kök hücreler, LSC'ler olarak adlandırılır) sahip lösemik subpopulasyonları ayırt ettiği gösterilmiştir. NKG2DL biyokimyasal olarak çok çeşitli MHC sınıfı I benzeri öz moleküllerdir. Homeostatik koşullardaki sağlıklı hücreler genellikle hücre yüzeyinde NKG2DL'i ifade etmez. Bunun yerine, bu ligandların ekspresyasyonu, doğal öldürücü (NK) hücreler gibi NKG2D reseptör ifade eden bağışıklık hücreleri aracılığıyla lizis yoluyla hasarlı hücrelerin ortadan kaldırılmasını tetiklemek için hücresel strese (örneğin onkojenik dönüşüm veya enfeksiyöz uyaranlar) maruz kalma üzerine indüklenmiştir. İlginçtir ki, NKG2DL yüzey ekspresyözü LSC alt nüfuslarında seçici olarak bastırılır ve bu hücrelerin NKG2D aracılı bağışıklık gözetiminden kaçınmasına izin verir. Burada, kanser hücreleri üzerinde NKG2DL yüzey ekspresyonunun araştırılmasına izin veren iki farklı akış sitometri yönteminin yan yana analizini sunuyoruz, yani pan-ligand tanımayı içeren bir yöntem ve tek ligandlara karşı birden fazla antikor ile boyama içeren bir yöntem. Bu yöntemler, putatif kanser kök hücre özelliklerine sahip canlı NKG2DL negatif hücresel alt nüfusları NKG2DL pozitif LSC olmayanlardan ayırmak için kullanılabilir.
Introduction
NK hücreleri, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin kötü huylu hücreleri veya stresli sağlıklı hücreleri (örneğin, viral bir enfeksiyonla) önceden antijen stimülasyonu olmadan tanıyabilen ve ortadan kaldırabilen önemli etkileridir1. Bu işlem, doğal sitotoksisite reseptörleri (NCR), NKG2D ve CD16 gibi aktif reseptörler ve büyük ölçüde öldürücü immünoglobulin benzeri reseptörler (KIR)2ile temsil edilen inhibitör reseptörleri ile sıkı bir şekilde düzenlenir. KIR'lerin somatik hücreler üzerinde insan lökosit antijen (HLA) sınıfı I moleküllerine bağlanması, kendini tanımayı sağlar ve NK hücre toleransını iletir. Öte yandan, kendini tanımanın olmaması ve reseptörlerin hedef hücrelerdeki ligandlarına aktive etmenin artan bağlanması, NK hücre aracılı sitotoksikliğe yol açan sitotoksik granüllerin salınımını tetikler1. Son olarak, NK hücreleri, aktive edici reseptör CD16'yı Ig (FcR)2'ninFc kısmını ifade eden hedeflere bağlayarak antikora bağımlı hücresel sitotoksiklik (ADCC) uygulayabilir. Doğrudan sitotoksikliğin yanı sıra, NK hücreleri de doğuştan gelenleri adaptif bağışıklık sistemi ile köprüleyen sitokin salınımını tetikleyebilir3.
NKG2D, NK, NKT, φδ T ve naif CD8+ T hücreleri4'te ifade edilen ve bu tür sitotoksik bağışıklık hücrelerinin hedef hücreleri ifade eden NKG2D ligand 'ı (NKG2DL) tanımasını ve 2.zıdamasını sağlayan önemli bir aktive edici reseptördür. Sağlıklı hücreler genellikle NKG2DL'i ifade etmez. Bunun yerine, NKG2DL ekspresyözü kötü huylu veya virüs bulaşmış hücrelerde, bunları bağışıklık açıklığı5'euygun hale getirmek için yükseltilir.
İnsan NKG2DL ailesi, aralarında MHC I zincirine bağlı iki molekül A ve B (MICA ve MICB6)ve sitomegalovirüs UL16 bağlayıcı proteinlerin 1–6 (ULBP1-67)bulunduğu bilinen sekiz molekülden oluşur. NKG2DL'nin ifadesi transkripsiyon, transkripsiyon sonrası ve çeviri sonrası düzeyler üzerinde düzenlenir8. Bu nedenle sağlıklı dokularda NKG2DL ekspresyözü sağlıklı hücrelerin yüzeyinde yaygın olarak saptanamazken, NKG2DL mRNA9 ve hücre içi protein ekspresyözü bildirilmiştir. Bu tür ifadenin işlevsel ilgisi ve bu tür gizli ifade desenlerinin altında kalan mekanizmalar tanımlanmaya devam eder10.
Kanser hücrelerinde NKG2DL ekspresyonunun mekanistik düzenlemesi büyüleyici bir araştırma alanıdır. Hücresel streste yer aldığı bilinen yollar, örneğin ısı şoku stres yolu9veya ATAKSI TELANGIEKTEKTAZI mutasyona uğramış (ATM) ve Rad3 ile ilgili (ATR) yol11gibi DNA hasarı ile ilişkili yollar ve viral veya bakteriyel enfeksiyonlar doğrudan NKG2DL ekspresyonunun indüksiyonu ile bağlantılıdır12. Bununla birlikte, NKG2DL'nin yüzey ekspresyonu etkili bir şekilde indüklenmiş olsa bile, bu ifade, bazı kanserlerde bağışıklık kaçışı ve zayıf klinik prognoz ile ilişkili bir mekanizma olan proteolitik aracılı dökülme yoluyla tekrar kaybolabilir13.
Hücre yüzeyi NKG2DL'nin yokluğu da AML'li hastalarda önemli roller oynayabilir. Burada, yoğun kemoterapi ile tedavi genellikle remisyona neden olur, ancak nüks genellikle kemoterapilerden seçici olarak kurtulan ve bağışıklık tepkisinden kaçan lösemik kök hücrelerden (LSC) ortaya çıkar. Son zamanlarda gösterdiğimiz gibi, LSC'ler, örneğin, NKG2DL yüzey ifadesini bastırarak NK hücre lizizinden kaçar14.
Tersine, yüzey NKG2DL ekspresyonunun yokluğu, hücrelerin putatif kök benzeri alt nüfuslarını toplu muadil lösemik alt nüfuslardan tanımlamak ve canlı bir şekilde izole etmek için bir yöntem olarak kullanılabilir. Burada, NKG2DL yüzey ekspresyonünü tespit etmek ve böylece lösemide ve belki de diğer kanserlerde NKG2DL negatif kök hücrelerini tanımlamak için kullanılabilecek iki akış sitometrik yaklaşımı sunuyoruz: Pan-ligand yüzey tanıma için bir yöntem ve bilinen NKG2DL proteinlerini tanıyan tek veya havuzlu antikorlarla boyama içeren bir yöntem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Basel ve Tuebingen Üniversite Hastaneleri Etik İnceleme Kurulu'nun onayı sonrasında hasta örnekleri alındı.
1. NKG2D füzyon proteininin biyotinilasyonu
NOT: Bu adım, üreticinin talimatına göre bir biyotinilasyon kiti (bkz. Malzeme Tablosu)ile gerçekleştirilir. Protokolün bu adımı lekelenmeden en az 24 saat önce yapılmalıdır. Biyotinillenmiş NKG2D füzyon proteini -20 °C'de saklanmalıdır.
- Hem biotin hem de NKG2D füzyon protein tüplerini oda sıcaklığında (RT) çözün.
NOT: Hücrelerin daha fazla deneysel kullanım için steril olması gerekiyorsa (farelerde enjeksiyon, koloni şekillendirme ünitesi tahlilleri, vb.), kirlenmeyi önlemek için füzyon proteinini bir laminer akış başlığı altında yeniden oluşturun. Aksi takdirde, her adım bir tezgahta gerçekleştirilebilir. - 50μg'lik lyophilized NKG2D füzyon proteinini hızla aşağı çevirin. Tozu yeniden inşa etmek ve bir P1000 mikropipette kullanarak iyice karıştırmak için 500 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
- 100 μg/mL'lik son stok konsantrasyonunu elde etmek için bir biotin tüpüne 100 μL NKG2DL füzyon proteini ekleyin.
- P100 mikropipette ile sürekli canlandırma ile çözeltiyi iyice karıştırın.
- Füzyon proteini/biotin çözeltisini kontrollü bir RT'de 24 saat kuluçkaya yatırın. Füzyon proteini kullanıma hazır.
2. Birincil AML hücrelerinin çözülmesi
NOT: Sıvı azot içinde depolanan hasta başına yaklaşık 5.000.000 dondurulmuş lösemik hücre çözülmüş ve daha sonra tahliller için hemen kullanılmıştır. Lösemik hücreler elde edildi ve daha önce açıklandığı gibi donduruldu15. Kısaca, AML ve yüksek patlama hücresi yüzdesi olan hastalardan toplanan periferik kan örnekleri (mononükleer hücreler arasındaki patlamaların% >90'ı) mononükleer hücreler elde etmek için yoğunluk gradyan ayrımı ile işlendi ve daha sonra% 10 dimetil süloksit çözeltisi (DMSO) içeren fetal baldır serumunda (FCS) donduruldu. Hücre sayıları, hastadaki lökosit konsantrasyonuna bağımlılıkta hastalar arasında oldukça çeşitlidir (aralık: mL kan başına 1.000.000 ila 30.000.000 lösemik hücre).
- Bir su banyosu kullanarak 37 °C'de FCS'nin% 10'unu içeren önceden ılık RPMI ortamı. Her bir AML hücresi şişesi için (1 mL FCS + % 10 DMSO'da 30.000.000 hücreye kadar), 15 mL reaksiyon tüpüne 10 mL önceden ısıtılmış ortam ekleyin.
- Birincil AML içeren cryovial'ı sıvı azot deposundan çıkarın ve hücreleri 37 °C su banyosu kullanarak hemen çözün. Tüpü suda hafifçe ileri geri hareket ettirerek şişenin içeriğinin sadece küçük bir buz kristali kalana kadar çözülmesini sağlar.
- Çözülen hücreleri hemen orta içeren tüpe aktarın ve şişeyi 1 mL orta kullanarak durulayın.
- Hücreleri 300 x g'da 10 dakika santrifüj edin ve peletin rahatsız etmeden süpernatantı atın.
- Hücreleri 5 mL FCS'nin %10'unu içeren RPMI ortamı ve 300 x g'da santrifüj ile 10 dakika yıkayın.
3. Hücre sayımı
- Hücre peletini FCS'nin %10'unu içeren bilinen bir RPMI ortamı hacminde yeniden kullanın.
- Hücre süspansiyonunun küçük bir hacmini 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve trypan mavisi veya canlı hücre / ölü hücre ayrımcılığına izin veren başka bir alternatif boya ile bilinen bir oranda seyreltin.
- Hücreleri saymak için herhangi bir cihazı kullanın.
- Hücreleri 300 x g'da 10 dakika santrifüj edin ve peletin rahatsız etmeden süpernatantı atın.
4. Biyotinillenmiş NKG2D füzyon proteini kullanılarak birincil AML hücrelerinin boyanması
- 500 mL PBS'yi sığır serum albümini (BSA) ve Etilenediaminetetraasetik asit (EDTA) ile sırasıyla 0,07 mM ve 2 mM'lik son konsantrasyona takviye ederek boyama tamponu hazırlayın. Gerekirse pH'ı (7,2–7,4) ayarlayın.
- Hücre peletini boyama tamponu ile 0,5 x 107 hücre/mL'lik son konsantrasyona yeniden biriktirin.
NOT: İsteğe bağlı olarak, boyamadan önce, hücreler bir engelleme maddesiyle (örneğin RT veya FcR engelleyici maddede 30 dakika boyunca hIgG (1μg/ml) ) inkübe edilebilir). - Hücre süspansiyonunun 100 μL'lik kısmını 96 kuyulu U-alt plakaya aktarın ve plakayı 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin. Peletin rahatsız etmeden süpernatant atın.
- Biyotinillenmiş NKG2D füzyon proteininin ana karışımını hazırlayın, böylece hücreler kuyu başına 50 μL'lik son bir hacimde, kuyu başına 10 μg / mL'lik son konsantrasyonda yeniden kullanılır.
- 4.4. adımda hazırlanan ana karışımı 100 μL pipet kullanarak ekleyin ve hücre peletlerini 300 μL çok kanallı pipetle yeniden atın.
NOT: Boyama için gerekli füzyon proteini miktarını azaltmak için son hacmi hücre sayısına göre ölçeklendirin. - Hücre süspansiyonu RT'de 25 dakika veya 4 °C'de 50 dakika kuluçkaya yatırın.
- 300 μL çok kanallı pipetle kuyu başına 200 μL boyama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın.
- Plakayı 300 x g'da 10 dakika santrifüj edin ve peletin rahatsız etmeden süpernatantı atın.
- 4.7 ve 4.8.
NOT: Burada açıklanan lekeleme, hücre kültürü 96 kuyulu U-bottom plakada gerçekleştirilir. Bu nedenle, bu tür plakaların küçük hacim kapasitesi nedeniyle yıkama adımları iki kez gerçekleştirilir. Boyama diğer tüplerde de yapılabilir ve yıkama adımları daha büyük bir hacim kullanılarak yalnızca bir kez yapılabilir. - Streptavidin-PE kullanarak bir ana karışım hazırlayın (seyreltmeler için Tablo 1'e bakın) böylece hücreler 50 μL'lik son bir hacimde yeniden biriktirilir.
NOT: Hücrenizin ilgi alanı için CD33, CD34 gibi seçim antikorları ekleyin.... AML için. - 4.10. adımda hazırlanan ana karışımı 100 μL pipet kullanarak ekleyin ve hücre peletlerini 300 μL çok kanallı pipetle yeniden atın.
- Hücre süspansiyonlarını RT'de 15 dakika veya karanlıkta 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- 300 μL çok kanallı pipetle kuyu başına 200 μL boyama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın.
- Plakayı 300 x g'da 10 dakika santrifüj edin ve peletin rahatsız etmeden süpernatantı atın.
- 4.13 ve 4.14 adımlarını yineleyin.
- Canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için 7-AAD (7-Aminoactinomycin D, 1:1000) veya herhangi bir reaktif dahil olmak üzere bir lekelenme tamponu çözeltisi hazırlayın.
- 300 μL çok kanallı mikropipette kullanılarak 4.16 adımda hazırlanan 200 μL boyama tamponu + 7-AAD'de hücre peletlerini yeniden dirsindirin.
- Akış sitomemetrisi aygıtı kullanarak hücreleri analiz edin.
5. Tek veya havuza tek anti-NKG2DL antikorlarının lekelenerek boyanması
- 4.2. adımdakiyle aynı hücre süspansiyonu kullanın.
- Hücre süspansiyonunun 100 μL'lik kısmını 300 μL çok kanallı pipet kullanarak hücre kültürü 96 kuyulu U-alt plakaya aktarın ve plakayı 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin. Peletin rahatsız etmeden süpernatant atın.
- Her birincil antikor veya havuzalanmış antikor için bir antikor ana karışımı hazırlayın (seyreltmeler için Tablo 2'ye bakınız), böylece hücreler 50 μL'lik son bir hacimde yeniden canlanır.
- 5.3. adımda hazırlanan ana karışımı 100 μL pipet kullanarak ekleyin ve hücre peletlerini 300 μL çok kanallı pipetle yeniden atın.
- RT'de hücreleri 25 dakika kuluçkaya yatırın.
- 300 μL çok kanallı pipet kullanarak kuyu başına 200 μL boyama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın.
- Hücre kültürünü 10 dakika boyunca 300 x g'da 96 kuyulu U-alt plakayı santrifüj edin ve peletin rahatsız etmeden süpernatantı atın.
- 5.6 ve 5.7.
- İkincil antikoru ekleyerek bir antikor ana karışımı hazırlayın (seyreltmeler için Tablo 2'ye bakınız), böylece hücreler kuyu başına 50 μL'lik son bir hacimde yeniden atlanır.
- 100 μL pipet kullanarak 5.9 adımında hazırlanan ana karışımı ekleyin ve hücre peletlerini 300 μL çok kanallı pipetle yeniden atın.
- RT'de 15 dakika veya karanlıkta 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- 300 μL çok kanallı pipet kullanarak kuyu başına 200 μL boyama tamponu ekleyerek yıkayın.
- Hücre süspansiyonunu 300 x g'da 10 dakika santrifüj edin ve peletin rahatsız etmeden üstnatantı atın.
- 5.12 ve 5.13 adımlarını yineleyin.
- 4.16. adımda hazırlanan 7-AAD içeren 200 μL boyama tamponunda hücre peletlerini yeniden süsün.
- 6. adımda açıklandığı gibi bir akış sitometri aygıtı kullanarak hücreleri analiz edin.
6. Veri toplama
NOT: Lazerlerin düzgün çalıştığından emin olmak için akış sitometresinin haftalık kalite kontrollerinin yapıldığından emin olun. Burada sunulan protokol için, tüm kanallardaki lazer performanslarını kontrol etmek için göreli boncuklarla haftalık Sitometre ve İzleme (CTS) işlemi gerçekleştirilir. CTS'den sonra, 8 tepeli boncuklar dahili kontrol olarak kullanılarak 10.000 olay kaydedilir. Tüm zirveler kapılarının içinde aynı konumda olmalı ve birbirlerinden iyi ayrılmalıdır.
- Boncuklu veya16hücreli dedektörler arasındaki spektral çakışmayı çıkarmak için matris telafisini oluşturun.
- Lekelenmemiş hücreler ve tek lekeli boncuklar için 10.000 olay kaydedin. Floresan eksi bir (FMO) kontrolleri için 50.000 olay ve tam lekeli örnekler için 100.000 olaya kadar kayıt kaydedin.
NOT: Alternatif olarak, hücreler üzerinde tek lekeli numuneler yapılabilir. Öyleyse, hücrelerin istenen işaretleyici için pozitif bir sinyale sahip olduğundan emin olun. - Spektral çakışma miktarını ortaya çıkarmak için deneyde kullanılan her florofor için tek bir lekeli hücre veya boncuk örneği alın. Dökülme değerlerini hesaplamak ve ölçülen tüm örneklere kompanzasyon matrisini uygulamak için akış sitometri cihazının kompanzasyon oluşturucusunun kullanımını kullanın.
NOT: İkincil antikorlar, tazminat boncuklarla hesaplanırsa boncuk kullanılarak tazminat oluşturulması için kullanılamaz. Kompanzasyon boncuklarının türüne bağlı olarak, ikincil antikorlar boncuklarla tazminat için kullanılamaz. - FDO kontrolleri ve füzyon proteini ile tam lekeli numuneler için öncelikle hücreleri ileri saçılmalarına (FSC) ve yan dağılımlarına (SSC) göre seçin. Çiftlerin dışlanmasından sonra, ölü hücreleri dışlamak için 7-AAD (PercP-Cy5.5) sinyali için olumsuzluklarına dayanarak hücreleri kapıya tutun (bkz. adım 5.15). Son çizim, cd34 (Y ekseni) ve NKG2DL (X ekseni) ifadelerini canlı singlet'larda gösterir.
- Tek anti-NKG2DL antikorları için, örneklere aynı stratejiyi uygulayın, ancak ligand pozitifliğinin PE kanalında değil Alexa Fluor 488'de olduğunu unutmayın.
- Bu deneme için uygun FDO denetimleri için 6.4 ve 6.5 adımlarından gating stratejisi için FMO kontrollerine göre kapıları ayarlayın (bkz. Tablo 3): Analiz yazılımında, negatif kesir üzerine bir kapı çizin. Tam lekeli numune kayıt edilirken, daha önce oluşturulan kapının üzerindeki hücreler analiz edilen işaretleyici için pozitiftir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan protokollerin her ikisi de AML LSC'nin, LSC17'ninbilinen bir belirteci olan CD34 kullanılarak akış sitometrik analizleri ile zenginleştirilmesine izin verir, NKG2DL yüzey ekspresyonu ile birlikte pan-ligand tanıma veya bireysel ligandlara karşı havuzalanmış antikorlarla boyama. Şekil 1'de,analiz edilen AML örneklerinin CD34 ve NKG2DL için pozitif olduğunu, ancak toplamda dört farklı popülasyonun varlığıyla gösterilen negatif alt popülasyonların da mevcut olduğunu gösteriyoruz. Verilerimiz, FSC ve SSC aracılığıyla ana hücre popülasyonunun seçilmesinden başlayarak, böyle bir boyama için tipik gating stratejisini göstermektedir. Aşağı akış analizinde çiftler ve ölü hücreler hariç tutulur (Şekil 1A). Kapılar, pozitif hücrelerin doğru tanımlanmasını sağlamak için FDO kontrolleri kullanılarak ayarlanır (Şekil 1B).
Şekil 1C'de CD34 (APC, Y ekseni) vs NKG2DL (PE, X ekseni) için pozitif hücrelerin floresan yoğunluklarını vurguluyoruz. CD34 için pozitif olan AML hücreleri, laboratuvarımızdan gelen önceki bulgularla uyumlu olan NKG2DL'nin (Şekil 1C)daha düşük bir yüzey ekspresyonunun, NKG2DL ekspresyonunun sap eksikliği ile ilişkili olduğunu göstermektedir14.
Şekil 2, her iki NKG2DL boyama yönteminin sağlamlığını gösterir. Şekil 2A'da,19.8'i gösteren üç birincil AML örneğini yan yana araştırıyoruz, 49.8 ve%89.4, füzyon protein boyama için pozitif olaylar vs 20.4, 50.4 ve 90.6% havuza alınan anti-NKG2DL antikor boyama (MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 ve ULBP3'e karşı havuzlu antikorlar) için sırasıyla. Öte yandan, tek ligand (MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 veya ULBP3'e karşı) boyama% 92'ye kadar bir dizi olumlu olay gösterir(Şekil 2B). Bu yüzde ligandın kendisine ve hastaya bağlı olarak değişir, örneğin, ULBP3 (Şekil 2B). Not olarak, tek bir hücre birden fazla NKG2DL ifade edebilir.
Birden fazla anti-NKG2DL antikor bir araya toplandığında ve tek bir tüp halinde birleştirildiğinde, pozitif hücrelerin yüzdesi füzyon proteininin yüzdesiyle karşılaştırılabilir (Şekil 2A). Bu nedenle, her iki protokol de iyi çalışır ve birincil AML hücrelerinde NKG2DL ifadesiyle ilgili benzer sonuçlar sağlayabilir. Bazı AML'lerde, füzyon proteini yöntemi daha fazla NKG2DL proteininin tanınmasına izin verdiğinden daha yüksek hassasiyete izin verebilir.
Şekil 1: Birincil AML örneklerinin tipik gating stratejisi. (A) Hücreler ilk olarak boyutlarına (X ekseni) ve karmaşıklıklarına (örneğin, parçalılık, Y ekseni) göre kapılır. Çiftler daha sonra ileri saçılma için alana karşı yükseklik veya genişlik çizilerek hariç tutulur. Son olarak, canlı hücreler boyutlarına (X ekseni) ve 7AAD (PerCP-Cy5.5, Y ekseni) için olumsuzluklarına göre seçilir. (B) FDO kontrolleri, belirtilen belirteçler için pozitif ve negatif popülasyonlar arasında ayrım yapmaya yardımcı olan kapıları kurmak için kullanılır. Gating stratejisi Şekil 1A'dagösterildiği gibi aynı kalır. (C) CD34 (APC, Y ekseni) vs NKG2DL (PE veya AlexaFluor488, X ekseni) için pozitif ve negatif olayları gösteren akış sitometri grafiği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Boyama protokolleri karşılaştırması. (A) Füzyon proteini için pozitif olayların yüzdesini gösteren çubuk grafikler ve kapılı tek canlı hücrelerden havuza alınan anti-NKGD2L antikorları (n = 3 AML örnekleri). (B) Bilinen tüm anti-NKG2DL antikorları ve havuza alınan tek ligandlar için tek ligand boyama için pozitif olayların yüzdesini gösteren çubuk grafikler (ayrıntılı antikor bilgileri için Malzeme Tablosu'na bakın). Gating yine tek canlı hücrelerde yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Tüp adı | Antijen | Florofor | Seyreltme/konsantrasyon |
| Lekelenmemiş hücreler | - | - | - |
| Tek leke PE |
NKG2D-Füzyonprotein | PE | birincil adım için 1:10, ikincil adım için 1:100 |
| Tek leke 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
Canlı/Ölü | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| Tek leke APC |
CD34 | APC | 1:25 |
| Tam lekeli hücreler | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2D-Füzyonprotein | PE | birincil adım için 1:10, ikincil adım için 1:100 | |
| Canlı/Ölü | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tablo 1: Numuneleri NKG2D füzyon proteini ile boyamak için gerekli tüpler. Bu tabloda, denemeyi kurmak için gereken tüpler gösterilmiştir.
| Tüp adı | Antijen | Florofor | Seyreltme/konsantrasyon |
| Lekelenmemiş hücreler | - | - | - |
| Tek leke Alexa Flor 488 |
ULBP-1 | Alexa Flor 488 | Birincil adım için 10 μg/mL İkincil adım için 4 μg/ml |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| MİKA | |||
| MICB | |||
| tek leke 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
Canlı/Ölü | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| Tek leke APC |
CD34 | APC | 1:25 |
| Tam lekeli hücreler | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2DL | Alexa Flor 488 | Birincil adım için 10 μg/mL İkincil adım için 4 μg/ml |
|
| Canlı/Ölü | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tablo 2: Anti-NKG2DL antikorları ile örnekleri lekelamak için gerekli tüpler. Bu tabloda, denemeyi kurmak için gereken tüpler gösterilmiştir.
| Tüp adı | Antijen | Florofor | Seyreltme/konsantrasyon |
| Lekelenmemiş hücreler | - | - | - |
| FMO_APC | ULBP-1 | Alexa Flor 488 | Birincil adım için 10 μg/mL İkincil adım için 4 μg/mL |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| MİKA | |||
| MICB | |||
| NKG2D-Füzyonprotein | PE | Birincil adım için 1:10 İkincil adım için 1:100 |
|
| Canlı/Ölü | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_PE | CD34 | APC | 1:25 |
| ULBP-1 | Alexa Flor 488 | Birincil adım için 10 μg/mL İkincil adım için 4 μg/mL |
|
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| MİKA | |||
| MICB | |||
| Canlı/Ölü | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_Alexa Flor 488 | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2D-Füzyonprotein | PE | Birincil adım için 1:10 İkincil adım için 1:100 |
|
| Canlı/Ölü | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tablo 3: Temel kontrolleri kurmak için gerekli tüpler. Bu tablo, uygun FMO, birincil ve ikincil antikor kontrollerini kurmak için gereken tüpleri gösterir. Geçerli sonuçlar ve yorumlanabilir veriler elde etmek için gerekli tüm denetimler (FMO) deneyci tarafından eklenmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, insan birincil AML hücrelerinde NKG2DL yüzey ekspresyonünü tespit edebilecek iki akış sitometrik yöntemi sunuyoruz. Her iki algılama yönteminin de diğer antikor lekeleri ile birlikte kullanılabileceğini gösteriyoruz (örneğin CD34 ekspresyonun algılanmasını). Benzer boyamalar diğer birincil hücre tiplerinde ve hücre hatlarında da yapılabilir.
Son zamanlarda AML hasta patlamalarının yüzeyinde NKG2DL'nin bulunmamasının LSC14'izenginleştirebileceğini gösterdik. AML'de NKG2DL negatif ancak NKG2DL pozitif lösemi subpopulasyonları klonojenik ve in vivo lösemi başlatma kapasitelerine sahiptir. Gelecekteki araştırmalar, NKG2DL yüzey ekspresyonunun yokluğunun diğer kanser türlerinde kök hücreleri zenginleştirmek için bir araç olarak kullanılıp kullanılmayacağını gösterecektir.
CD34 klasik olarak AML'de LSC'leri işaretlemektedir, ancak AML oldukça heterojen bir hastalıktır ve tüm AML hastaları CD34 ekspresyöz ifadesi göstermez (yani, CD34 negatif AML18). Daha önce NKG2DL yüzey ifadesinin yokluğunun, CD34 negatif AML'nin bu alt grubunda LSC'yi tanımlamak için yeni bir araç sağladığını göstermiştik. Burada, buna karşılık, CD34 pozitif ACL'lerin alt grubuna odaklanıyoruz ve farklı alt nüfusların oluşabileceğini gösteriyoruz. Gelecekteki araştırmalar, NKG2DL için diğer işaretleyicilerle (örneğin CD34) birlikte lekelemenin LSC'yi daha etkili bir şekilde zenginleştirip zenginleştiremeyeceği konusunda gösterecektir.
Akış sitometrisinde, deneycinin olumlu ve olumsuz olaylar arasında doğru ayrım yapmasına yardımcı olmak için FMO gibi yeterli denetimlerin dahil edilmesi önemlidir. Ek olarak, lekelenme olmamasının arızalı bir antikordan kaynaklanmaması için kullanılan her antikor için pozitif kontroller gereklidir. Burada sunduğumuz protokol, örneğin CD33 veya potansiyel LSC işaretleyicileri19eklenerek deneycinin ihtiyacına göre genişletilebilen sınırlı sayıda yüzey işaretçisi kullanır. Ayrıca, bu protokolde kullanılan floroforlar uyarlanabilir. Daha da önemlisi, bu tür değişikliklere en iyi seyreltmeyi belirlemek için bir antikor titrasyonu eşlik etmelidir.
Lekelemeden önce kritik bir adım, birincil AML hücrelerinin çözülmesidir. Aslında, kırılganlıklarına ek olarak, bu tür örnekler hücreler için toksik olan dimetil süloksit (DMSO) ile korunur. Bu nedenle, numuneler özenle ele alınmalı ve DMSO'ya uzun süre maruz kalmamak için iyice durulanmalıdır. Numunelerimiz daha önce belirlenmiş bir protokole göre işlenerek dondurulmuş olsa da15, yüksek hücre iyileşmesini sağlamak için el yazmasında açıklanan adımları dikkatle takip etmek önemlidir. Taze numunelerle çalışmak daha iyi canlılık sağlayacaktır ve bu nedenle önerilir. Ancak, çoğu durumda bu uygulanabilir değildir.
Açıklanan yöntemi etkileyen bir diğer faktör, akış sitometrisi yoluyla gözlenen farklı hücre saçılma profillerine neden olabilecek örneğe özgü sapmadır. Hastalık heterojenliği nedeniyle, bu kaçınılmazdır, ancak analizde dikkate alınmalıdır. Numune işlemede donma/çözülme veya diğer mekanik adımlarla ek değişkenlik ortaya çıkabilir. Genel olarak, hızlılık hücre ölümünü önlemek için anahtardır. Ancak, ölen hücreler ve döküntüler önlenemez ve analizde dikkate alınması ve dışlanmaları gerekir. FSC/SSC tabanlı gating, numune analizinin ilk adımı olduğu için titizlik ve kritik bir gözle yapılmalıdır.
Füzyon proteininin en büyük avantajlarından biri bilinen ve potansiyel olarak bilinmeyen tüm NKG2DL'leri tespit etme gücüdür, spesifik anti-NKG2DL antikorları (örneğin, MICA, MICB) bir seçim önyargısı sunar. Her iki yöntem de eşit derecede uygulanabilir. Analiz edilen sınırlı sayıda numune için de çok karşılaştırılabilir sonuçlar gösterdiler. NKG2D füzyon proteininin kullanılmasının bazı önemli faydaları vardır: Daha az zaman alan, reaktif sayısının azalması ve boyama örneklerinin sayısının yanı sıra insan hatalarının daha düşük bir olasılığı (yani pipetleme hataları). Ayrıca, bu yöntem bazı örneklerde NKG2DL ekspresyonunu yakalamada da daha etkili olabilir, çünkü bazı AML vakalarında ifade edilebilen NKG2DL işlevi ile bilinmeyen proteinlerin ekspresyonunu da yakalamalıdır. NKG2DL'nin yüzey varlığı hakkında fikir verirken, bu yöntem NKG2DL'nin hücre içi seviyeleri, kaçakçılık veya düzenleme hakkında bilgi sağlamaz ve bu nedenle bu tür sorular hakkında daha fazla bilgi edinmek için diğer tahliller yapılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (179239), Kanserle Mücadele Vakfı (Zuerich), Wilhelm Sander Vakfı'ndan CL'ye (2019.042.1) ve Novartis Tıbbi-Biyolojik Araştırma Vakfı'ndan C.L.'ye verilen hibelerle desteklendi. Ayrıca, bu proje 765104 Numaralı Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon almıştır. Basel'deki Flow Cytometry Tesisi'ne destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
References
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness. Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).
- Zingoni, A., et al. NKG2D and its ligands: "One for All, All for One". Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).
- Eagle, R. A., Trowsdale, J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).
- El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).
- Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D. Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).
- Long, E. O. Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm. Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).
- Hüe, S., et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).
- Gasser, S., Raulet, D. H. Activation and self-tolerance of natural killer cells. Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).
- Groh, V., et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).
- Maurer, S., et al. Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells. Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).
- Paczulla, A. M., et al. Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion. Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).
- Paczulla, A. M., et al. Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice. Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Taussig, D. C., et al. Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction. Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).
- Zhou, J., Chng, W. J. Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia. World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).
