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Cancer Research

Usando análise de imagem baseada em computador para melhorar a quantificação da metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1

Published: October 2, 2020 doi: 10.3791/61805

Summary

Descrevemos um método mais consistente e rápido para quantificar a metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1 usando Fiji-ImageJ.

Abstract

O câncer de mama é uma malignidade devastadora, representando 40.000 mortes de mulheres e 30% de novos diagnósticos de câncer feminino nos Estados Unidos apenas em 2019. A principal causa de mortes relacionadas ao câncer de mama é a carga metastática. Portanto, modelos pré-clínicos para o câncer de mama precisam analisar a carga metastática para serem clinicamente relevantes. O modelo de câncer de mama 4T1 fornece um modelo de camundongos espontaneamente metástase e quantificável para o câncer de mama humano estágio IV. No entanto, a maioria dos protocolos 4T1 quantificam a carga metastática contando manualmente colônias manchadas em placas de cultura tecidual. Embora isso seja suficiente para tecidos com menor carga metastática, o erro humano na contagem manual causa resultados inconsistentes e variáveis quando as placas são confluentes e difíceis de contar. Este método oferece uma solução baseada em computador para erro de contagem humana. Aqui, avaliamos o protocolo usando o pulmão, um tecido altamente metastático no modelo 4T1. Imagens de placas manchadas de azul de metileno são adquiridas e enviadas para análise em Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ então determina a porcentagem da área selecionada da imagem que é azul, representando a porcentagem da placa com carga metastática. Esta abordagem baseada em computador oferece resultados mais consistentes e rápidos do que a contagem manual ou a avaliação histopatológica para tecidos altamente metastáticos. A consistência dos resultados do Fiji-ImageJ depende da qualidade da imagem. Pequenas variações nos resultados entre as imagens podem ocorrer, assim é recomendável que várias imagens sejam tiradas e os resultados sejam mediados. Apesar de suas limitações mínimas, este método é uma melhoria para quantificar a carga metastática no pulmão, oferecendo resultados consistentes e rápidos.

Introduction

Uma em cada oito mulheres será diagnosticada com câncer de mama em sua vida, e ainda apesar de múltiplas opções de tratamento, o câncer de mama é a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em mulheres americanas1. Essas mulheres não estão morrendo pelo tumor primário na mama. Em vez disso, a carga metastática é responsável pela mortalidade desta doença, pois comumente se espalha para o pulmão, osso, cérebro, fígado e linfonodos2. Por isso, os modelos de câncer de mama precisam avaliar a metástase para contribuir para conter a mortalidade dessa doença. O modelo de câncer de mama murine 4T1 é um excelente protocolo para conseguir isso. O método descrito aqui oferece uma melhoria para o modelo 4T1 usando Fiji-ImageJ para quantificar a metástase pulmonar, produzindo resultados consistentes e rápidos.

O modelo 4T1 é bem estabelecido, com a maioria dos laboratórios usando protocolos como os descritos por Pulaski e Ostrand-Rosenberg em 20013. A linha celular 4T1 é resistente à 6-Thioguanina (6TG) e representativa do estágio IV, câncer de mama triplo negativo3,4,5. É clinicamente relevante por ser um modelo ortotópico e metástase espontaneamente aos mesmos órgãos do câncer de mama humano3,4. As células 4T1 metástases espontaneamente a uma taxa previsível com base na quantidade de células injetadas3,4. É importante ressaltar que as diferenças genéticas entre os camundongos aqui utilizados causaram a variabilidade inter-individual esperada na carga metastática. Para avaliar a metástase, os tecidos são colhidos para coletar e quantificar células cancerígenas em locais distantes usando seleção de 6TG e coloração azul de metileno. O resultado é uma coleção de placas de cultura tecidual com pontos azuis representando colônias metastáticas. No entanto, o protocolo Pulaski e Ostrand-Rosenberg quantifica as colônias metastáticas contando-as manualmente, e, portanto, este tem sido o meio padrão de avaliar a metástase neste modelo. Embora isso seja fácil para tecidos com baixa carga metastática, tecidos como os pulmões são frequentemente carregados de metástases. Como as placas pulmonares podem ser altamente confluentes, quantificar com precisão e precisão colônias metastáticas por contagem manual é difícil e propenso a erros humanos. Para quantificar melhor a carga metastática, descrevemos o uso do Fiji-ImageJ para uma solução baseada em computador para erro de contagem humana. A análise histopatológica com hematoxilina e eosina (H&E) é outro meio de quantificar metástases pulmonares, e curiosamente também foi melhorada com o software Fiji-ImageJ6,7. No entanto, como a análise histopatológica observa uma única fatia do pulmão, pode ser imprecisa e não representativa. Isso porque o modelo 4T1 causa várias lesões metastáticas em todo o órgão que não são distribuídas uniformemente. Embora as tendências globais entre a análise histopatológica e a contagem manual possam sersemelhantes 8,os valores individuais podem diferir e, portanto, a análise histopatológica não deve ser usada como único meio de quantificação. Demonstramos o benefício em comparação com a análise histopatológica e as inconsistências na contagem manual entre diferentes contadores, ao mesmo tempo em que demonstramos a consistência do uso do Fiji-ImageJ. Além disso, mostramos que esse método pode reduzir o tempo de incubação de 10-14 dias para 5 dias, o que significa que os pesquisadores podem analisar dados de seu estudo muito mais cedo do que quando se baseia na contagem manual.

Este método é uma coleção de ajustes simples ao protocolo Pulaski e Ostrand-Rosenberg3. Como o modelo 4T1 é amplamente utilizado, e como a metástase pulmonar é um parâmetro crítico para medir em modelos pré-clínicos, acreditamos que esse método pode ser amplamente utilizado e é altamente valioso para os pesquisadores de câncer de mama. Os únicos suprimentos adicionais necessários são uma câmera e acesso a um computador com Fiji-ImageJ, um software livre usado com frequência na análise deimagens 9. Este método se concentra especificamente na metástase pulmonar, mas pode ser usado para outros tecidos com carga metastática significativa.

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Protocol

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Virginia Tech e de acordo com o Guia Nacional dos Institutos de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A realização deste protocolo requer permissão das instituições competentes e adesão a todas as diretrizes adequadas.

1. Cultura celular

  1. Faça mídia de cultura completa (RPMI + 10% soro bovino fetal +1% Pen Strep). Reviva células 4T1 de acordo com o Protocolo ATCC10 e incubar a 37 °C e 5% de CO2 em um frasco T-25 até confluente. Mude a mídia no dia seguinte à revitalização para remover células mortas, e novamente se a mídia for gasta antes que as células sejam confluentes o suficiente para a passagem.
  2. Uma vez que o frasco T-25 é confluente, as células de passagem para um frasco T-75 descartando mídia, lavando frasco com 5 mL de 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), e adicionando 500 μL de Trypsin-EDTA. Incubar por 5-10 minutos a 37 °C até que as células se desprendem.
    1. Uma vez destacado, adicione 5 mL de mídia de cultura completa aquecida às células. Aspire e transfira os 5 mL para um frasco T-75 contendo 15 mL de mídia cultural completa aquecida.
  3. Células de passagem em frascos T-75 pelo menos quatro vezes. Faça isso uma vez que o frasco é confluente lavando com 8 mL de 1x DPBS, adicionando 1 mL de Trypsin-EDTA para desacoplar células, adicionando 10 mL de mídia aquecida às células, e diluindo 1:6-1:8 em um novo frasco T-75 contendo 20 mL de mídia cultura completa aquecida.
  4. Células de passagem até o número apropriado de frascos T-150 contendo 40 mL de mídia de cultura completa aquecida para o número de ratos a serem injetados. A maioria dos estudos exigirá vários frascos T-150 para garantir células suficientes para injeção.
  5. Quando os ratos estão prontos para serem injetados (8 semanas de idade ou pesando mais de 20 g, dependendo do IACUC ou protocolos institucionais), as células de colheita descartando mídia, lavando cada frasco com 10 mL de 1x DPBS e adicionando 2 mL de trypsin-EDTA. Incubar por 5-10 minutos a 37 °C até que as células se desprendem.
  6. Lave o frasco com 10 mL de mídia completa e transfira todos os conteúdos (10 mL de mídia + 2 mL de mistura celular trypsin-EDTA) para o próximo frasco. Continue a lavar e coletar células de cada frasco usando os mesmos 10 mL de mídia para evitar o uso de uma quantidade excessiva de mídia.
    1. Uma vez coletados todos os frascos, transfira o conteúdo para um tubo de centrífuga de 50 mL. Colete uma amostra de 10 μL para contar em um tubo de microcentrifuuagem e centrifugar o tubo cônico de 50 mL a 125 x g por 5 minutos.
  7. Enquanto as células estão sendo centrifugadas, adicione 10 μL de azul Trypan a 10 μL de amostra celular. Conte células usando um hemócito. Uma vez determinado o número total de células, calcule a concentração de células necessárias para injetar camundongos para 1,2 x 106 células por rato (por 100 μL).
  8. Após centrifugação, mídia decantada e pelota de célula resuspend em quantidade correta de 1x DPBS estéreis para 1,2 x 106 células por 100 μL. Divida a mistura celular/DPBS em tubos de microcentrifuuge para fácil acesso com a seringa ao aspirar células para injeção. Mantenha as células no gelo e injete logo depois, pois as células começarão a morrer depois de ficarem no gelo por longos períodos de tempo.

2. Injeções

  1. Prepare as células para injeção tocando ou misturando suavemente o tubo de microcentrifuuge para resuspensar as células e, em seguida, aspirar 600 μL em uma seringa de 1 mL. Vire a seringa para cima e puxe o êmbolo para baixo para afastar as células da abertura da seringa. Toque na seringa para livrá-la de bolhas de ar.
  2. Conecte o bisel da agulha e distribua as células de volta ao tubo de microcentrifuuge até que apenas 500 μL permaneçam na seringa. Coloque a seringa no gelo.
    NOTA: As células 4T1 caem rapidamente da suspensão. Portanto, é importante misturar as células de volta à suspensão tocando com frequência.
  3. Anestesize 8 semanas de idade/>20 g fêmea BALB/c mouse usando isoflurane ou outro agente anestésico aprovado. Monitore a respiração do rato para avaliar a profundidade da anestesia.
  4. Uma vez que o mouse esteja devidamente anestesiado como indicado pela falta de reflexo da córnea, coloque o mouse em suas costas. Usando o polegar, o ponteiro e o dedo médio, segure suavemente o mouse. Use o ponteiro e os dedos médios para segurar a parte superior do corpo e o polegar do mouse para a perna esquerda traseira. Seja gentil, mas firme.
  5. Com o bisel da agulha para cima, injete 100 μL de células subcutâneas na almofada de gordura mamária abdominal esquerda do rato. Monitore para uma boa sangria e qualquer vazamento, e certifique-se de que o mouse acorde e se mova facilmente após a injeção.
    1. Troque agulhas entre cada rato.
      NOTA: Não permita que a agulha entre na cavidade peritoneal. Isso faria com que o câncer se espalhasse rapidamente e não representasse o modelo. Para garantir uma injeção subcutânea, puxe suavemente para cima na agulha quando inserida na almofada de gordura mamária abdominal esquerda. Se a agulha for facilmente levantada para cima, ela está corretamente posicionada subcutânea.

3. Monitoramento

  1. Monitore camundongos pelo menos 3 vezes por semana para peso, escore de condição corporal, tamanho do tumor, condição do tumor, respiração, nível de atividade, aparência e movimento. Uma vez que o tumor atinja 0,7-0,8 cm de diâmetro, comece a monitorar diariamente.
    1. Considere a eutanásia quando o tamanho do tumor atinge 1,5 cm, ou a perda de peso atinge 20%, ou declínio clínico severo no escore da condição corporal, condição do tumor, respiração, nível de atividade, aparência ou movimento são observados com base em diretrizes institucionais.
      NOTA: O escore da condição corporal é crucial para monitorar, pois o peso corporal pode aumentar à medida que o tumor aumenta de tamanho, negando a perda de condições corporais devido à carga da doença. Os protocolos exatos de monitoramento dependerão do IACUC aprovado ou dos protocolos institucionais.

4. Necropsia

  1. Eutanize o mouse usando CO2 seguindo as diretrizes institucionais.
  2. Spray mouse com 70% de etanol para desinfetar. Faça uma incisão na linha média ventral do rato para expor a cavidade corporal.
  3. Remova o rim. Continue cortando a linha média até que o diafragma esteja visível. Use uma tesoura para perfurar o diafragma para esvaziar os pulmões. Corte o diafragma para ter melhor acesso à cavidade.
  4. Use uma tesoura sem corte para cortar o centro da caixa torácica. Torção de pino de volta para expor o pulmão e o coração.
  5. Perfunda o coração com 2 mL de 1x DPBS não estéril inserindo uma agulha no ápice do coração até que ele se acumule na cavidade abdominal onde o rim foi removido.
  6. Para remover o coração e os pulmões, use uma tesoura sem cortes para cortar o esôfago e a traqueia diretamente acima do coração. Usando fórceps, comece a puxar o coração para longe do corpo e corte em qualquer tecido conjuntivo mantendo-o preso. Os pulmões sairão com o coração.
  7. Identifique os pulmões multi-lobed (direita) e single-lobed (esquerda). Mantenha o coração preso para referência, mas uma vez identificados os pulmões, corte o coração.
  8. Rotule uma placa de 12 poços contendo 1x Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) em cada poço. Cada rato precisa de 2 poços. Coloque o pulmão multi-lobed (à direita) na placa de 12 poços para avaliação de metástase e mantenha no gelo. Mantenha o vizinho bem vazio por enquanto.
    NOTA: É importante usar o mesmo pulmão (multi-lobed) de cada rato para garantir que cada amostra esteja próxima em tamanho. O pulmão mono lobed pode então ser usado para outras análises, como histopatologia.
    NOTA: As amostras estão estáveis no gelo ou a 4 °C por algumas horas.

5. Tecidos de processamento

NOTA: Todas as etapas desta seção devem ser feitas utilizando técnica estéril.

  1. Rotule 1 tubo cônico de 15 mL por rato e adicione 2,5 mL de mistura de colagenase tipo IV e 30 unidades de elastase a cada tubo. Para fazer a mistura de colagem tipo IV, dissolva 2 mg de colagenase tipo IV por mL 1x HBSS e filtro estéril. Isso pode ser armazenado até 12 meses a -20 °C e descongelado quando necessário.
  2. Transfira o pulmão para o segundo, limpe 1x HBSS bem para essa amostra. Redemoinho usando fórceps para remover qualquer sangue restante. Transfira o pulmão limpo para a placa de cultura de tecido de 3,5 cm vazia. Pulmão picado com tesoura. Enxágüe a placa com 2,5 mL de HBSS 1x, transfira 1x HBSS e peças pulmonares em um tubo cônico de 15 mL já contendo coquetel de colagenase/elastase (total de 5 mL).
  3. Incubar por 75 minutos a 4 °C. Continue misturando amostras durante este tempo, então coloque tubos em uma roda de roqueiro ou rotativa. Durante esta etapa de incubação, rotule tubos de centrífugas de 50 mL e placas de cultura tecidual de 10 cm para cada rato. Se fizer uma diluição, rotule placas suficientes de cultura tecidual de 10 cm para as diluições.
    NOTA: Rotule a tampa das placas de cultura tecidual. Se rotular a placa em si, a escrita interferirá na análise Fiji-ImageJ.
  4. Traga volume de cada tubo até 10 mL total com 1x HBSS. Despeje o conteúdo sobre um coador de células de 70 μm em um tubo cônico de 50 mL para cada amostra. Use o êmbolo de uma seringa de 1 mL para moer suavemente a amostra através do coador para permitir que mais células se filtrem.
  5. Centrifugar por 5 minutos a 350 x g em temperatura ambiente (RT). Descarte o supernatante e lave a pelota com 10 mL de 1x HBSS. Repita este passo duas vezes.
  6. Resuspend pellet em 10 mL de 60 μM 6TG mídia de cultura completa, seja RPMI ou IMDM. Amostras de placas em placas de cultura celular de 10 cm, utilizando um esquema de diluição, se desejar. Incubar a 37 °C, 5% de CO2 por 5 dias.
    NOTA: 1:2, 1:10 e 1:100 são diluições comuns que precisarão ser empiricamente determinadas com base nos parâmetros do estudo.
    ATENÇÃO: O 6TG é tóxico. Tenha cuidado ao manusear e siga todas as diretrizes de Saúde e Segurança Ambiental para o descarte.

6. Placas de coloração

  1. Despeje a mídia cultural das placas em recipiente de lixo apropriado. Fixar as células adicionando 5 mL de metanol não diluído por placa e incubar por 5 minutos no RT, certificando-se de girar metanol para que cubra toda a placa.
    ATENÇÃO: O metanol é perigoso se ingerido, inalado ou está na pele. Use um capuz de fumaça para este passo.
  2. Despeje o metanol das placas em recipiente de lixo apropriado. Enxágüe placas com 5 mL de água destilada por prato e despeje água em recipiente de resíduos apropriado. Adicione 5 mL de 0,03% azul de metileno por placa e incubar por 5 minutos na RT, certificando-se de redemoinho de solução azul de metileno para cobrir toda a placa.
  3. Despeje o azul de metileno no recipiente de resíduos apropriado. Enxágüe novamente as placas com 5 mL de água destilada por prato. Vire as placas de cabeça para baixo e borre contra uma toalha de papel para remover o excesso de líquido. Coloque a placa em sua tampa e deixe o ar secar durante a noite no RT.
    NOTA: Colônias metastáticas serão azuis. Uma vez que as placas são secas, elas podem ser armazenadas em RT indefinidamente.

7. Análise de imagem

  1. Remova as tampas rotuladas das placas, tomando cuidado para garantir a identificação clara das amostras. Alinhe todas as placas de pulmão manchadas em uma superfície limpa e leve para tirar uma foto de todas as placas em uma imagem.
  2. Tire uma foto da coleção de placas em uma área bem iluminada, certificando-se de minimizar reflexos, pois as placas são muito reflexivas. Reflexões nas placas influenciarão a análise da imagem e, portanto, precisam ser evitadas.
    NOTA: Fiji-ImageJ tem um limite superior de 2 gigapixels. A maioria dos smartphones modernos terá câmeras suficientes. Não use uma câmera inferior a 8 megapixels. A câmera usada neste experimento foi de 12,2 megapixels em um Google Pixel 2.
  3. Corte a imagem para incluir as placas, mas exclua as tampas ou qualquer outra coisa no fundo da imagem. Carregue a imagem cortada no Fiji-ImageJ.
  4. Alterar a imagem para preto e branco usando os seguintes comandos: Imagem, Ajuste, Limiar de Cor, Método de Limiar: Padrão, Cor limiar: B&W, Espaço limiar: Laboratório. Deselecione a caixa de fundo Escuro. A imagem agora deve ser em preto e branco. Preto representa o fundo leve, e branco representa as colônias metastáticas azuis.
  5. Usando a ferramenta Circle na barra de ferramentas Fiji-ImageJ, selecione a área a ser analisada. Desenhe um círculo para usar em todas as placas para garantir que cada placa seja analisada para a mesma área. Escolha um tamanho que maximize a área analisada nas placas, minimizando o ruído de fundo que aparece na borda das placas. O tamanho aparece na barra de ferramentas à medida que é desenhado, por isso é possível fazer um círculo perfeito monitorando a altura e a largura à medida que o círculo é desenhado.
  6. Analise o círculo selecionado para determinar qual percentual da área é branca, o que representa a área da placa que possui colônias metastáticas azuis. Use os seguintes comandos:
    Analisar, Analisar partículas, tamanho (pixel2): 0-Infinito, Circularidade: 0.00-1.00, Mostrar: Nada, e verificar a caixa Resumo. Bata ok.
  7. Registo da área de %. Este é o percentual da área selecionada que é branca e, portanto, representa a carga metastática.
    NOTA: Recomenda-se salvar os resultados em Fiji-ImageJ ou copiar/colar toda a página de resultados em um documento separado. Se os resultados da % Área forem inesperados ou suspeitos, é possível ver se alguma das outras medidas também estava suspeita ou se a % Área foi registrada incorretamente.
  8. Mova o círculo, sem alterar seu tamanho, agarrando-o em seu centro, para a próxima placa da imagem. Repita as etapas 7.6 e 7.7 para todas as placas da imagem.
  9. Repita as etapas 7.1 – 7.8 em pelo menos mais duas imagens. Uma vez analisadas todas as placas e imagens, a média dos resultados da área % entre diferentes imagens para cada placa para mitigar quaisquer inconsistências entre as imagens.

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Representative Results

Este método contém ajustes simples do protocolo Pulaski e Ostrand-Rosenberg 4T13 e pode ser visualizado na Figura 1. Quando 3 pesquisadores separados contaram manualmente colônias metastáticas para 12 placas pulmonares (diluição de 1:10), os resultados foram muito inconsistentes entre diferentes contadores(Figura 2A). Todos os pesquisadores foram orientados a "contar as colônias metastáticas que aparecem como pontos azuis", mas as inconsistências demonstram o problema com a contagem manual de placas altamente metastáticas. Os pesquisadores tiveram diferentes níveis de experiência com o modelo 4T1. Um patologista veterinário certificado pela placa analisou as lâminas pulmonares manchadas de H&E para metástase como outro método para comparar com a análise da placa pulmonar Fiji-ImageJ(Figura 2B).

Usando a análise Fiji-ImageJ, 3 pesquisadores separados analisaram 3 imagens separadas da coleção de 12 placas (diluição 1:2). As imagens foram tiradas em dois espaços de laboratório separados com iluminação ligeiramente diferente. O arranjo das placas ou o ângulo a partir do qual a imagem foi tirada eram diferentes entre cada imagem. Em contraste com os resultados manuais de contagem, os resultados do Fiji-ImageJ foram consistentes entre os contadores para cada uma das 3 imagens(Figura 3A). Para determinar se houve inconsistências entre as 3 imagens, os resultados das 3 imagens e dos 3 contadores foram combinados por placa pulmonar(Figura 3B). Há diferenças entre as imagens para algumas placas, mas as tendências gerais são semelhantes e oferece mais consistência do que a contagem manual. Para explicar as variações entre as 3 imagens diferentes, os resultados de cada imagem foram mediados para cada placa (Figura 3C). Essas médias forneceram resultados consistentes entre contadores que analisam com precisão e precisão a carga metastática. Portanto, este protocolo sugere tirar pelo menos 3 imagens da coleção da placa em diferentes arranjos, de diferentes ângulos, ou em configurações de luz ligeiramente diferentes, e depois analisar e média dos resultados. O contraste entre a contagem manual e a análise Fiji-ImageJ é visualizado ao comparar a Figura 2A à Figura 3C.

Outra forma de demonstrar as melhorias oferecidas por este protocolo é comparar a classificação das placas da maioria com a menor carga metastática entre os contadores, com base nas contagens da Figura 2 e Figura 3. A contagem manual concordou com a placa mais confluente, mas todas as fileiras seguintes eram inconsistentes entre os contadores(Figura 4A). Em contraste, as fileiras da análise Fiji-ImageJ para cada imagem foram muito mais consistentes entre contadores(Figura 4B). A consistência também é observada quando os resultados de cada imagem para cada placa foram mediados(Figura 4C). Reconhecemos que este protocolo não oferece consistência completa entre os contadores, mas é uma melhoria da contagem manual ao comparar a Figura 4A com a Figura 4C. A análise histopatológica difere tanto da contagem manual quanto da Fiji-ImageJ(Figura 4D).

Para demonstrar a importância de evitar reflexões nas imagens, uma imagem com reflexo de uma mão e sua subsequente análise Fiji-ImageJ é mostrada (esquerda) oposta à mesma placa sem reflexão (direita) (Figura 5A). Outras manchas escuras de uma superfície de fundo suja ou resíduo de amostra de sangue nas placas podem afetar negativamente a análise fiji-imageJ também. A placa sanguínea na Figura 5B tem apenas 2 colônias metastáticas (notadas por setas brancas), mas o resíduo escuro (notado por setas negras) fez com que Fiji-ImageJ a considerasse como 31,6% metastática. Portanto, é importante ter uma superfície limpa e leve e não usar este método para amostras de sangue, pois amostras de sangue normalmente deixam manchas escuras residuais na placa que não são colônias metastáticas.

Figure 1
Figura 1: Esquema de Protocolo. Este protocolo se concentra apenas na análise da metástase pulmonar no modelo 4T1. O fluxo geral deste protocolo inclui o crescimento de células 4T1 na cultura, injetando camundongos fêmeas BALB/c com células 4T1 na almofada de gordura mamária abdominal esquerda, monitorando camundongos de acordo com a IACUC e protocolos institucionais, sacrificando camundongos e coletando o pulmão, coletando células das amostras de pulmão, chapeando e incubando células em mídia de seleção 6TG, fixação e coloração de células após 5 dias, tirando fotos das placas e analisando usando Fiji-ImageJ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Contagem manual de células metastáticas e análise histopatológica têm resultados inconsistentes. A. 12 placas pulmonares com diluição de 1:10 foram contadas manualmente por 3 pesquisadores separados instruídos a contar colônias metastáticas da mesma forma, embora a experiência com o modelo variasse entre os pesquisadores. O número de colônias metastáticas contadas variou muito entre os pesquisadores. B. A análise histopatológica identificou e quantificou agregados individuais de células tumorais, classificados como metástases, presentes em lâminas pulmonares manchadas de H&E. Imagens altas, médias e de baixa ampliação de um slide representativo são mostradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: A análise fiji-imageJ é precisa e precisa na determinação da carga metastática. A. 12 placas pulmonares com diluição de 1:2 foram analisadas por 3 pesquisadores separados em 3 imagens separadas das 12 placas pulmonares. B. Foram combinados resultados de cada uma das 3 imagens de cada um dos 3 pesquisadores. C. Os resultados de cada placa pulmonar das 3 imagens foram mediados. ANOVA unidirecional com o teste de comparação múltipla de Tukey não determinou diferenças significativas entre contadores para cada placa pulmonar. Os dados são mostrados como média + SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: A análise fiji-imageJ fornece um ranking mais consistente de carga metastática em comparação com a contagem manual e análise histopatológica. A. As mesmas placas pulmonares da Figura 2 foram classificadas da maioria para a menor metastática com base nas contagens manuais da Figura 2. B. As mesmas 12 placas pulmonares da Figura 3 foram classificadas da maioria para a menos metastática com base na análise Fiji-ImageJ da Figura 3A. C. As médias da Figura 3C foram classificadas da maioria para a menos metastática. D. Os deslizamentos pulmonares foram classificados da maioria para a menor metastática com base na avaliação histopatológica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Reflexões e manchas escuras não metastáticas impactarão negativamente os resultados. A. Uma imagem com um reflexo de uma mão tirando a imagem interrompe a análise Fiji-Image J, como mostrado na comparação da análise Fiji-ImageJ (esquerda) com a análise correta fiji-imageJ (direita) B. Placas de sangue muitas vezes deixam sobras de manchas (setas pretas) nas placas que não são colônias metastáticas (setas brancas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Como demonstrado, contar manualmente as colônias metastáticas em cada placa pulmonar pode ser um método impreciso e impreciso para quantificar a metástase pulmonar, demonstrando a necessidade de um melhor meio de quantificação(Figura 2). A análise histopatológica difere ligeiramente da contagem manual e da análise fiji-imageJ(Figura 2B e 4D),provavelmente porque os slides de H&E não são uma amostra representativa de todo o órgão. O protocolo colhe um pulmão inteiro e, portanto, é mais representativo da metástase pulmonar total, e é mais consistente do que a contagem manual. Várias abordagens diferentes para a análise fiji-imageJ foram tentadas e são discutidas abaixo, mas o protocolo descrito acima parece ser o método superior.

Foram coletadas amostras de pulmão, sangue e cérebro para este estudo. No entanto, as amostras de sangue e cérebro tinham muito poucas colônias metastáticas, se houver. Determinamos que contar manualmente as colônias metastáticas é ideal para esses tecidos menos metastáticos e, portanto, os dados sanguíneos e cerebrais não foram incluídos. Quando a carga metastática é fácil de contar manualmente (por exemplo, dez ou vinte colônias metastáticas em oposição a milhares), a questão original do erro humano não é relevante e, portanto, este protocolo não é necessário. Além disso, amostras de sangue podem deixar manchas escuras nas placas após a fixação, o que interfere na análise Fiji-ImageJ(Figura 5). É importante ressaltar que a quantidade de células injetadas pode influenciar a carga metastática. Por exemplo, se menos células são injetadas e os camundongos podem sobreviver por mais tempo, o câncer tem mais tempo para se espalhar para os locais tradicionalmente menos metastáticos como o cérebro3,4. Portanto, este protocolo poderia ser modificado para incluir a carga metastática de outros tecidos se eles tiverem tempo para se tornarem altamente metastáticos. Se experimentar o modelo 4T1 pela primeira vez ou alterar a quantidade de células injetadas, recomendamos tentar pelo menos duas diluições ao emplacamento de células. Para este estudo, utilizou-se uma diluição de 1:2 e 1:10. A diluição de 1:2 teria sido difícil de contar manualmente, mas foi contada facilmente em Fiji-ImageJ. A diluição de 1:10 ainda era difícil de contar manualmente e, portanto, levou a resultados inconsistentes. As diluições podem ser modificadas com base nos parâmetros específicos do estudo.

Foram tiradas fotos de placas pulmonares individuais e as 12 placas pulmonares juntas. Placas individuais foram analisadas de duas maneiras: ou cortando a imagem para um quadrado central da placa antes de carregar para Fiji-ImageJ, ou usando a ferramenta de seleção de círculo em Fiji-ImageJ para selecionar o círculo central da placa na imagem não derrubada. Descobrimos que o uso da ferramenta de seleção de círculos em Fiji-ImageJ ofereceu a maneira mais fácil e consistente de criar uma área do mesmo tamanho para análise de todas as placas. Além disso, analisar toda a coleção de placas pulmonares na mesma imagem foi superior à análise de imagens individuais de placas de pulmão simples. Ter todas as placas pulmonares na mesma imagem permite que o círculo do mesmo tamanho seja usado facilmente entre as placas pulmonares. Ele garante que todas as placas pulmonares estão a mesma distância da câmera e, portanto, o círculo do mesmo tamanho para análise deve ser o tamanho correto para todas as placas pulmonares da imagem. Também torna a análise mais rápida, pois redesenhar o círculo não é necessário entre as placas. Ele é simplesmente arrastado para a próxima placa na imagem sem alterar seu tamanho, o que garante que o mesmo tamanho é usado para todas as placas da imagem. Ao selecionar o tamanho do círculo, é importante torná-lo grande o suficiente para analisar a maioria da placa, enquanto pequeno o suficiente para evitar o ruído de fundo das bordas da placa. Além disso, na tentativa de salvar reagentes, as células também foram banhadas em 6 placas de poço e comparadas com as placas de cultura tecidual de 10 cm. Os resultados do Fiji-ImageJ das 6 placas do poço foram menos consistentes e não se correlacionavam com os pratos de 10 cm (dados não mostrados). Uma explicação é que a área de superfície menor fornece uma área menor para analisar, levando a dados menos representativos. Outra é que a redução da área da superfície permite que as células cresçam mais rapidamente à medida que estão mais próximas de outras células sobreviventes. Portanto, não recomendamos o uso de reagentes de cultura tecidual que não sejam os descritos no protocolo.

Como mencionado anteriormente, evitar reflexões e ter um fundo limpo e leve são absolutamente críticos para este método. A Figura 5A demonstra como uma reflexão é analisada em Fiji-ImageJ e, portanto, mostra a importância crítica de evitar reflexões. Como as placas de cultura tecidual são altamente reflexivas, é benéfico tirar a imagem em um pequeno ângulo para evitar reflexos de si mesmo tirar a foto ou das fontes de luz acima. As condições de iluminação da área de trabalho específica precisarão ser contabilizadas. Sugerimos tirar várias fotos das placas a serem analisadas, tentando arranjos e/ou ângulos ligeiramente diferentes, em uma área bem iluminada. Estude as imagens intensamente para qualquer reflexão. Se houver inconsistências na análise, é provável que seja devido a um problema de qualidade de imagem. Para solucionar problemas, compare a imagem normal com a imagem em preto e branco. Se áreas que não são azuis na imagem normal estão aparecendo como brancas na imagem em preto e branco, provavelmente há um reflexo ou mancha que está alterando os resultados.

Além da consistência, outro benefício notável deste método é que ele produz dados muito mais rapidamente do que a contagem manual. Contar manualmente várias placas é muito demorado, enquanto a análise Fiji-ImageJ pode ser feita rapidamente. Também permite um menor tempo de incubação. Pulaski e Ostrand-Rosenberg recomendam um período de incubação de 10 a 14 dias para as células banhadas, adicionando uma quantidade substancial de tempo ao estudo3. O período de incubação de 10 a 14 dias permite que colônias maiores e mais fáceis de contar se formem. No entanto, muitas placas pulmonares podem se tornar confluentes antes disso. Em vez disso, 5 dias de incubação dá tempo suficiente para a seleção 6TG matar células não cancerosas (comprovada por camundongos de controle saudável não tendo colônias em suas placas pulmonares, dados não mostrados), e para que as células cresçam o suficiente para serem facilmente quantificadas com Fiji-ImageJ. Isso diminui significativamente o tempo entre os camundongos sendo sacrificados e analisando dados metastáticos essenciais.

Para concluir, os benefícios deste método superam em muito as limitações. Reconhecemos que este método não oferece consistência perfeita. Embora este não seja o método ideal para tecidos menos metastáticos, esses tecidos podem ser facilmente contados manualmente. Embora obter uma imagem sem reflexões pode exigir alguma fotografia cuidadosa, a consistência adquirida com este método é significativa. É possível que este método possa ser usado para outros tecidos altamente metastáticos e outros protocolos que requerem a contagem de objetos manchados. O desenho do estudo também poderia permitir a análise da taxa de metástase ou efeito de tratamentos anticâncológicos em metástase. Este método fornecerá dados de metástase altamente consistentes e confiáveis e representará um refinamento significativo para o modelo 4T1. A aplicação desse modelo para a próxima pesquisa sobre metástase do câncer de mama é de extrema importância para armar pesquisadores com ferramentas para combater a mortalidade por câncer de mama.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), pelo Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) e pelos Institutos Nacionais de Saúde R21EB028429 (IA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia chamber See comments See comments Use approved materials in your institution's policies
Anesthetic agent See comments See comments Use approved materials in your institution's policies
BALB/c Female Mice The Jackson Laboratory 000651
Blunt scissors Roboz RS-6700
Calculator Any Any
Camera Any Any Minimum of 8 megapixels
Centrifuge Any Any Needs to be capable of 125 x g and 300 x g
CO2 euthanasia setup See comments See comments Use approved materials in your institution's policies
Cold room, refrigerator, cold storage Any Any
Computer with Fiji-ImageJ Any Any Needs to be capable of running Fiji-ImageJ
Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-10
Curved scissors Roboz RS-5859
Distilled water Any Any
Elastase MP Biomedicals 100617
Electronic scale Any Any
Fetal Bovine Serum (FBS) R&D Systems S11150
Forceps Roboz RS-8100
Ice N/A N/A
Incubator See comments See comments Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C
Methanol Fisher Scientific A412SK-4
Methylene blue Sigma-Aldrich 03978-250ML
Penicillin Streptomycin ATCC 30-2300
Pins or needles Any Any For pinning down mice during necropsy
Plastic calipers VWR 25729-670
RMPI-1640 Medium ATCC 30-2001
Rocker or rotating wheel Any Any
Sharp scissors Roboz RS-6702
Sterile disposable filter with PES membrane ThermoFisher Scientific 568-0010
T-150 Flasks Fisher Scientific 08-772-48
T-25 Flasks Fisher Scientific 10-126-10
T-75 Flasks Fisher Scientific 13-680-65
Tri-cornered plastic beaker Fisher Scientific 14-955-111F Used to weigh mice
Trypan blue VWR 97063-702
Trypsin-EDTA ATCC 30-2101
Type IV collagenase Sigma-Aldrich C5138
3.5 cm tissue culture plates Nunclon 153066
1 mL syringe BD 309659
1.7 mL microcentrifuge tubes VWR 87003-294
10 cm tissue culture plates Fisher Scientific 08-772-22
12 well plate Corning 3512
15 mL centrifuge tube Fisher Scientific 14-959-70C
1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) Fisher Scientific SH30028FS
1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) Thermo Scientific SH3026802
27 g 1/2 in needles Fisher Scientific 14-826-48
4T1 (ATCC® CRL­2539™) ATCC CRL-2539
50 mL centrifuge tube Fisher Scientific 14-959-49A
6-Thioguanine Sigma-Aldrich A4882
70 μM cell strainer Fisher Scientific 22-363-548
70% ethanol Sigma Aldrich E7023 Dilute to 70% with DI water

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References

  1. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
  2. Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
  3. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20.22 (2001).
  4. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).
  5. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).
  6. Sikpa, D., et al. Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools. Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).
  7. Valkonen, M., et al. Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests. Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).
  8. Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression. Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  10. ATCC. A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet. ATCC. , (2020).

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Pesquisa sobre câncer Questão 164 Câncer de Mama metástase 4T1 quantificação Fiji ImageJ metástase pulmonar
Usando análise de imagem baseada em computador para melhorar a quantificação da metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1
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Nagai-Singer, M. A.,More

Nagai-Singer, M. A., Hendricks-Wenger, A., Brock, R. M., Morrison, H. A., Tupik, J. D., Coutermarsh-Ott, S., Allen, I. C. Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model. J. Vis. Exp. (164), e61805, doi:10.3791/61805 (2020).

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