Et λ-rødmedieret rekombinationssystem blev brugt til at skabe en deletionsmutant af en lille ikke-kodende RNA-micC.
Et ikke-kodende lille RNA (sRNA) er en ny faktor til regulering af genekspression på posttranskriptionelt niveau. En slags sRNA MicC, kendt i Escherichia coli og Salmonella Typhimurium, kunne undertrykke ekspressionen af ydre membranproteiner. For yderligere at undersøge reguleringsfunktionen af micC i Salmonella Enteritidis klonede vi micC-genet i Salmonella Enteritidis-stammen 50336 og konstruerede derefter mutanten 50336Δ micC af λ Red-baseret rekombinationssystem og den komplementerede mutant 50336Δ micC/p micC, der bærer rekombinant plasmid pBR322, der udtrykker micC. qRT-PCR-resultater viste, at transkription af ompD i 50336Δ micC var 1,3 gange højere end i vildtypestammen, mens transkriptionen af ompA og ompC i 50336ΔmicC var 2,2 gange højere end dem i vildtypestammen. Disse indikerede, at micC undertrykker ekspressionen af ompA og ompC. I den følgende undersøgelse blev patogeniciteten af 50336ΔmicC påvist af både inficerende 6 uger gamle Balb / c-mus og 1 dag gamle kyllinger. Resultatet viste, at LD 50 af vildtypestammen 50336, mutanterne 50336Δ micC og 50336Δ micC/pmicC for 6 uger gamle Balb/c mus var henholdsvis 12,59 CFU, 5,01 CFU og 19,95 CFU. LD50 af stammerne til 1 dag gamle kyllinger var henholdsvis 1,13 x 109 CFU, 1,55 x 10 8 CFU og 2,54 x 108 CFU. Det indikerede, at sletning af micC øgede virulensen af S. Enteritidis hos mus og kyllinger ved at regulere ekspression af ydre membranproteiner.
Ikke-kodende små RNA’er (sRNA’er) er 40-400 nukleotider lange, som generelt ikke koder for proteiner, men kan transkriberes uafhængigt i bakteriekromosomer 1,2,3. De fleste sRNA’er er kodet i de intergene regioner (IGR’er) mellem genkodende regioner og interagerer med mål-mRNA’er gennem baseparringshandlinger og regulerer målgenekspression på posttranskriptionsniveau 4,5. De spiller vigtige reguleringsroller i stofmetabolisme, proteinsyntese i ydre membran, quorum sensing og virulens genekspression5.
MicC er et 109-nukleotid lille RNA-transkript til stede i Escherichia coli og Salmonella enterica serovar Typhimurium, som kunne regulere flere ydre membranproteinekspressioner såsom OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 og Omp36 6,7,8,9. MicC regulerer ekspressionen af OmpC ved at hæmme ribosombinding til ompC mRNA-lederen in vitro, og det kræver Hfq RNA-chaperon for dets funktion i Escherichia coli6. I Salmonella Typhimurium tavsgør MicC ompD mRNA via en ≤12-bp RNA duplex inden for kodningssekvensen (kodoner 23-26) og destabiliserer derefter endonukleolytisk mRNA7. Denne reguleringsproces assisteres af chaperonprotein Hfq10. OmpC er et rigeligt ydre membranprotein, der blev anset for at være vigtigt i miljøer, hvor næringsstof- og toksinkoncentrationer var høje, såsom i tarmen6. OmpD porin er det mest rigelige ydre membranprotein i Salmonella Typhimurium og repræsenterer ca. 1% af det samlede celleprotein11. OmpD er involveret i overholdelse af humane makrofager og intestinale epitelceller12. MicC undertrykker også udtrykket af både OmpC og OmpD poriner. Det menes, at MicC kan regulere virulens. For at udforske nye målgener reguleret af MicC og studere virulensreguleringsfunktionen af micC, klonede vi micC-genet i Salmonella Enteritidis (SE) stammen 50336 og konstruerede derefter mutanten 50336ΔmicC og den komplementerede mutant 50336ΔmicC / p micC. Nye målgener blev screenet af qRT-PCR. Virulensen af 50336ΔmicC blev påvist af mus og kyllingeinfektioner.
S. Enteritidis er et vigtigt fakultativt intracellulært patogen, der kan inficere unge kyllinger og producerer symptomer fra enteritis til systemisk infektion og død17,18. Derudover forårsager S. Enteritidis latente infektioner hos voksne kyllinger, og kroniske bærere forurener fjerkræprodukter, hvilket resulterer i fødevarebårne infektioner hos mennesker19. Den patogene mekanisme af S. Enteritidis skal undersøges…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Chinese National Science Foundation (nr. 31972651 og 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (nr. 14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (nr. SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (nr. YZ2014019), et projekt finansieret af det prioriterede akademiske program udvikling af Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
(NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |