Summary

En ikke-kodende lille RNA-mikrofon bidrager til virulens i ydre membranproteiner i Salmonella enteritidis

Published: January 27, 2021
doi:

Summary

Et λ-rødmedieret rekombinationssystem blev brugt til at skabe en deletionsmutant af en lille ikke-kodende RNA-micC.

Abstract

Et ikke-kodende lille RNA (sRNA) er en ny faktor til regulering af genekspression på posttranskriptionelt niveau. En slags sRNA MicC, kendt i Escherichia coli og Salmonella Typhimurium, kunne undertrykke ekspressionen af ydre membranproteiner. For yderligere at undersøge reguleringsfunktionen af micC i Salmonella Enteritidis klonede vi micC-genet i Salmonella Enteritidis-stammen 50336 og konstruerede derefter mutanten 50336Δ micC af λ Red-baseret rekombinationssystem og den komplementerede mutant 50336Δ micC/p micC, der bærer rekombinant plasmid pBR322, der udtrykker micC. qRT-PCR-resultater viste, at transkription af ompD i 50336Δ micC var 1,3 gange højere end i vildtypestammen, mens transkriptionen af ompA og ompC i 50336ΔmicC var 2,2 gange højere end dem i vildtypestammen. Disse indikerede, at micC undertrykker ekspressionen af ompA og ompC. I den følgende undersøgelse blev patogeniciteten af 50336ΔmicC påvist af både inficerende 6 uger gamle Balb / c-mus og 1 dag gamle kyllinger. Resultatet viste, at LD 50 af vildtypestammen 50336, mutanterne 50336Δ micC og 50336Δ micC/pmicC for 6 uger gamle Balb/c mus var henholdsvis 12,59 CFU, 5,01 CFU og 19,95 CFU. LD50 af stammerne til 1 dag gamle kyllinger var henholdsvis 1,13 x 109 CFU, 1,55 x 10 8 CFU og 2,54 x 108 CFU. Det indikerede, at sletning af micC øgede virulensen af S. Enteritidis hos mus og kyllinger ved at regulere ekspression af ydre membranproteiner.

Introduction

Ikke-kodende små RNA’er (sRNA’er) er 40-400 nukleotider lange, som generelt ikke koder for proteiner, men kan transkriberes uafhængigt i bakteriekromosomer 1,2,3. De fleste sRNA’er er kodet i de intergene regioner (IGR’er) mellem genkodende regioner og interagerer med mål-mRNA’er gennem baseparringshandlinger og regulerer målgenekspression på posttranskriptionsniveau 4,5. De spiller vigtige reguleringsroller i stofmetabolisme, proteinsyntese i ydre membran, quorum sensing og virulens genekspression5.

MicC er et 109-nukleotid lille RNA-transkript til stede i Escherichia coli og Salmonella enterica serovar Typhimurium, som kunne regulere flere ydre membranproteinekspressioner såsom OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 og Omp36 6,7,8,9. MicC regulerer ekspressionen af OmpC ved at hæmme ribosombinding til ompC mRNA-lederen in vitro, og det kræver Hfq RNA-chaperon for dets funktion i Escherichia coli6. I Salmonella Typhimurium tavsgør MicC ompD mRNA via en ≤12-bp RNA duplex inden for kodningssekvensen (kodoner 23-26) og destabiliserer derefter endonukleolytisk mRNA7. Denne reguleringsproces assisteres af chaperonprotein Hfq10. OmpC er et rigeligt ydre membranprotein, der blev anset for at være vigtigt i miljøer, hvor næringsstof- og toksinkoncentrationer var høje, såsom i tarmen6. OmpD porin er det mest rigelige ydre membranprotein i Salmonella Typhimurium og repræsenterer ca. 1% af det samlede celleprotein11. OmpD er involveret i overholdelse af humane makrofager og intestinale epitelceller12. MicC undertrykker også udtrykket af både OmpC og OmpD poriner. Det menes, at MicC kan regulere virulens. For at udforske nye målgener reguleret af MicC og studere virulensreguleringsfunktionen af micC, klonede vi micC-genet i Salmonella Enteritidis (SE) stammen 50336 og konstruerede derefter mutanten 50336ΔmicC og den komplementerede mutant 50336ΔmicC / p micC. Nye målgener blev screenet af qRT-PCR. Virulensen af 50336ΔmicC blev påvist af mus og kyllingeinfektioner.

Protocol

Alle forsøgene blev udført i overensstemmelse med Det Nationale Forskningsråds vejledning for pleje og brug af forsøgsdyr. Dyrepleje- og brugsudvalget ved Yangzhou University godkendte alle forsøg og procedurer, der blev anvendt på dyrene (SYXK2016-0020). 1. Bakteriestammer, plasmider og kulturbetingelser Brug de bakterier og plasmider, der er anført i tabel 1. Kulturbakterier i LB-bouillon eller på LB-agarplader ved 37 °C under tilstedeværelse af…

Representative Results

Konstruktion af den mutante 50336Δ micC og suppleret stamme 50336Δ micC /pmicC MicC-genklonresultatet indikerede, at dette gen var sammensat af 109 bp, der viste 100% identitet med S. Typhimurium. Baseret på sekvensdataene blev deletionsmutanten 50336ΔmicC og den komplementerede mutant 50336ΔmicC/pmicC konstrueret med succes….

Discussion

S. Enteritidis er et vigtigt fakultativt intracellulært patogen, der kan inficere unge kyllinger og producerer symptomer fra enteritis til systemisk infektion og død17,18. Derudover forårsager S. Enteritidis latente infektioner hos voksne kyllinger, og kroniske bærere forurener fjerkræprodukter, hvilket resulterer i fødevarebårne infektioner hos mennesker19. Den patogene mekanisme af S. Enteritidis skal undersøges…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Chinese National Science Foundation (nr. 31972651 og 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (nr. 14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (nr. SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (nr. YZ2014019), et projekt finansieret af det prioriterede akademiske program udvikling af Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).

Materials

dextrose Sangon Biotech A610219 for broth preparation
DNA purification kit TIANGEN DP214 for DNA purification
Ex Taq TaKaRa RR01A PCR
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent 10017608 for broth preparation
K2HPO4 Sinopharm Chemical Reagent 20032116 for broth preparation
L-Arabinose Sangon Biotech A610071 λ-Red recombination
Mini Plasmid Kit TIANGEN DP106 plasmid extraction
NaCl Sinopharm Chemical Reagent 10019308 for broth preparation
(NH4)2SO4 Sinopharm Chemical Reagent 10002917 for broth preparation
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser  TaKaRa RR047 qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq II TaKaRa RR820 qRT-PCR
T4 DNA Ligase NEB M0202 Ligation
TRIzol  Invitrogen 15596018 RNA isolation
Tryptone Oxoid LP0042 for broth preparation
Yeast extract Oxoid LP0021 for broth preparation
centrifuge Eppendorf 5418 centrifugation
Electrophoresis apparatus Bio-Rad 164-5050 Electrophoresis
 Electroporation System Bio-Rad 165-2100 for bacterial transformation
Spectrophotometer BioTek Epoch Absorbance detection
Real-Time PCR system Applied Biosystems 7500 system qRT-PCR

References

  1. Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).
  2. Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
  3. Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
  4. Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
  5. Waters, L. S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136 (4), 615-628 (2009).
  6. Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
  7. Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
  8. Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).
  9. Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
  10. Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
  11. Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
  12. Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
  13. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  14. Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
  15. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  16. Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
  17. Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).
  18. Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
  19. De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
  20. Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
  21. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).
  22. Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).
  23. Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
  24. Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
  25. Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
  26. Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
  27. Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
  28. Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
  29. Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
  30. Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
  31. Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
  32. Papenfort, K., Vogel, J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).

Play Video

Cite This Article
Meng, X., Cui, W., Meng, X., Wang, J., Wang, J., Zhu, G. A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis. J. Vis. Exp. (167), e61808, doi:10.3791/61808 (2021).

View Video