Summary

Spot variation fluorescens korrelationsspektroskopi til analyse af molekylær diffusion ved plasmamembranen af levende celler

Published: November 12, 2020
doi:

Summary

Denne artikel har til formål at præsentere en protokol om, hvordan man bygger et spotvariation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) mikroskop til måling af molekylær diffusion ved plasmamembranen i levende celler.

Abstract

Dynamiske biologiske processer i levende celler, herunder dem, der er forbundet med plasmamembranorganisation, forekommer på forskellige rumlige og tidsmæssige skalaer, lige fra henholdsvis nanometer til mikrometer og mikrosekunder til minutter. En så bred vifte af biologiske processer udfordrer konventionelle mikroskopimetoder. Her beskriver vi proceduren for implementering af spotvariation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) målinger ved hjælp af et klassisk fluorescensmikroskop, der er blevet tilpasset. Protokollen indeholder en specifik præstationskontrol af svFCS-opsætningen og retningslinjerne for molekylære diffusionsmålinger af svFCS på plasmamembranen i levende celler under fysiologiske forhold. Derudover giver vi en procedure til forstyrrelse af plasmamembranflåde nanodomæner ved kolesteroloxidasebehandling og demonstrerer, hvordan disse ændringer i plasmamembranens laterale organisation kan afsløres ved svFCS-analyse. Afslutningsvis kan denne fluorescensbaserede metode give hidtil usete detaljer om plasmamembranens laterale organisation med den passende rumlige og tidsmæssige opløsning.

Introduction

Kompleksiteten af plasmamembranorganisation
Den nuværende forståelse af cellemembranorganisation skal tage højde for flere aspekter1. For det første varierer en kompleks lipidsammensætning ikke kun mellem celletyper, men også inden for en enkelt celle (membranorganeller / plasmamembran). Desuden er associerede eller iboende membranproteiner for det meste organiseret i dynamiske multimere komplekser, med store domæner, der strækker sig uden for membranen, og tegner sig for et betydeligt større område end transmembrandomænerne alene. Desuden udviser membranassocierede proteiner specifikke lipidbindende eller lipid-interagerende kapaciteter, der spiller roller i reguleringen af proteinfunktionen. Disse afhænger direkte af lipidernes lokale sammensætning og tilgængelighed2.

Endelig observeres et signifikant niveau af asymmetri mellem to membranblade på grund af den iboende asymmetriske struktur af membranproteiner og fordelingen af lipider. Faktisk genererer en lipidmetabolsk balance mellem syntese og hydrolyse kombineret med lipid flip-flop mellem brochurerne en sådan asymmetrisk fordeling. Da enhver transport over dobbeltlaget er begrænset af den frie energi, der kræves for at flytte den polære hovedgruppe gennem membranernes hydrofobe indre, bistås den normalt af selektive transportører. For hver celletype har asymmetri tendens til at blive fastholdt. Alt i alt bidrager disse faktorer til lateral inhomogenitet eller ruminddeling af plasmamembranen 3,4.

Vi beriger denne repræsentation af plasmamembranen ved at tage højde for den iboende molekylære diffusion i og på tværs af dobbeltlaget, hvilket bidrager til den dynamiske laterale heterogenitet på en skala fra tiendedele til hundreder af nanometer og mikrosekunder til sekunder. For eksempel bidrager lipidafhængige membrannanodomæner – de såkaldte lipidflåder, defineret som kolesterol, og sphingolipidrige signalplatforme – til ruminddelingen af plasmamembranen 5,6. Imidlertid er den nuværende opfattelse af membranorganisation ikke begrænset til lipidflåder alene. Membran nanodomæner er mere komplekse og heterogene i sammensætning, oprindelse og funktion. Alligevel skal deres tilstedeværelse ved plasmamembranen koordineres tæt, og dynamiske interaktioner mellem proteiner og lipider synes at være vigtige i den rumlige fordeling og kemisk modifikation af membrannanodomæner 1,3,7,8.

SvFCS-princippet og dets anvendelse til at undersøge organiseringen af plasmamembranen
Selvom der er gjort store fremskridt i analysen af membrandomæner, hovedsageligt gennem biofysiske teknikker, skal de determinanter, der dikterer den lokale organisering af plasmamembranen, raffineres med passende rumlig og tidsmæssig opløsning. Determinanter baseret på sporing af individuelle molekyler giver fremragende rumlig præcision og tillader karakterisering af forskellige bevægelsesformer 9,10,11,12, men har en begrænset tidsmæssig opløsning med klassiske lave kamerabilledhastigheder og kræver mere eksperimentel indsats for at registrere et betydeligt antal baner. Alternativt kan diffusionskoefficienten for membrankomponenter evalueres ved Fluorescens Recovery After Photobleaching (FRAP)13 eller Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)14. Sidstnævnte har fået mere opmærksomhed, hovedsageligt på grund af dets høje følsomhed og selektivitet, mikroskopiske detektionsvolumen, lav invasivitet og brede dynamiske område15.

Det konceptuelle grundlag for FCS blev introduceret af Magde og kolleger for omkring 50 år siden16,17. Det er baseret på registrering af udsving i fluorescensemission med en høj tidsmæssig opløsning (fra μs til s)18. I sin moderne version udføres målinger i levende celler af et lille konfokalt excitationsvolumen (~ 0,3 femtoliter) placeret inden for et område af interesse (f.eks. Ved plasmamembranen); fluorescenssignalet genereret ved diffuse fluorescerende molekyler, der går ind og ud af observationsvolumenet, opsamles med meget høj tidsmæssig opløsning (dvs. ankomsttidspunktet for hver foton på detektoren). Derefter beregnes signalet for at generere autokorrelationsfunktionen (ACF), hvorfra den gennemsnitlige tid td (diffusionstid), for hvilken et molekyle forbliver inden for brændvolumenet, ekstraheres sammen med det gennemsnitlige antal partikler (N), der er til stede i observationsvolumenet, hvilket er omvendt proportionalt med amplituden af ACF. Denne sidste parameter kan være nyttig information om molekylekoncentrationen inden for observationsvolumenet.

Siden da er et stigende antal FCS-modaliteter blevet implementeret takket være hurtigt udviklende instrumentering inden for biofotonik, hvilket gør det muligt at beskrive dynamiske fænomener, der forekommer i levende systemer. Alligevel ville en molekylær art opleve en mere overlappende fordeling af diffusionskoefficientværdierne, hvilket normalt afspejles af en uregelmæssig diffusionskarakteristik, hvor molekyler diffunderer med et ikke-lineært forhold i tid19 og vanskeligheder med at identificere den biologiske betydning af denne uregelmæssige subdiffusion. Tidligere er denne vanskelighed blevet noget overvundet ved at registrere den molekylære diffusion af FRAP fra områder af forskellig størrelse snarere end fra kun et område og derved give yderligere rumlig information. Dette muliggjorde for eksempel konceptualisering af membranmikrodomæner 20,21,22.

En oversættelse af denne strategi til FCS-målinger (dvs. den såkaldte spotvariation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS)) blev etableret ved at variere størrelsen af observationsens brændvolumen, hvilket gjorde det muligt at registrere fluktuationen i fluorescens på forskellige rumlige skalaer23. SvFCS-tilgangen giver således indirekte rumlig information, der muliggør identifikation og bestemmelse af molekylære diffusionstilstande og type membranpartitionering (isolerede versus sammenhængende domæner24) af studerede molekyler. Ved at plotte diffusionstiden td som en funktion af de forskellige rumlige skalaer defineret af taljeværdien (ω), som svarer til detektionsstråleradiusstørrelsen i dette tilfælde23,25, kan man karakterisere diffusionsloven for et givet molekyle i en given fysiologisk tilstand. SvFCS er derfor en perfekt analog til enkeltpartikelsporing i tidsdomænet26. Under den brownske diffusionsbegrænsning bør man forvente et strengt lineært forhold mellem diffusionstiden td og taljen ω (figur 1)23,25. Oprindelsen af diffusionslovens afvigelse fra denne ordning kan tilskrives ikke-eksklusive årsager, såsom cytoskeletnet, molekylær trængsel, dynamisk partitionering i nanodomæner eller enhver kombination af disse og andre virkninger (figur 1) og skal testes eksperimentelt25.

Her leverer vi alle nødvendige kontrolpunkter til daglig brug af et specialfremstillet svFCS optisk system bygget fra bunden, som supplerer vores tidligere protokolanmeldelser27,28 på den eksperimentelle tilgang. Som et bevis på konceptet giver vi desuden retningslinjer for kalibrering af opsætningen, forberedelse af celler, dataindsamling og analyse til etablering af svFCS diffusionslov (DL) for Thy1-GFP, et plasmamembran glycosylphosphatidylinositolforankret protein, som vides at være lokaliseret i lipid-raft nanodomæner29. Endelig demonstrerer vi, hvordan den delvise destabilisering af lipid-raft nanodomæner ved kolesteroloxidasebehandling påvirker diffusionsegenskaberne for Thy1-GFP. Derudover findes en detaljeret beskrivelse af opbygning af en svFCS-opsætning fra bunden i supplerende materiale.

Protocol

1. Indstilling af specifikation til samling af en specialfremstillet svFCS-opsætning BEMÆRK: Enkelheden i den foreslåede svFCS-opsætning muliggør nem installation, drift og vedligeholdelse til en lav pris, samtidig med at effektiviteten i fotongendannelse sikres. For flere detaljer, se Supplerende materiale. Forsøgsrum og sikkerhed Installer systemet i et rum, der er stabiliseret ved ca. 21 °C. Undgå direkte luftstrøm på det passive (eller aktive) optiske bord, og følg lasersikkerhedsreglerne for optisk justering. Hardware og softwareBEMÆRK: Supplerende materiale beskriver installationstrinnene vist i figur 2. Skriv den vigtigste anskaffelses- og styringssoftware i LabVIEW ved hjælp af en tilstandsmaskine- og begivenhedsstrukturarkitektur, hvor et multifunktionsopkøbskort driver de fleste controllere.BEMÆRK: Korrelatoren, laseren og effektmåleren styres eller overvåges af deres egen software. Tilpas hardware- og softwareinstallationsprocedurerne i henhold til den anvendte hardware. Optisk opsætningBEMÆRK: Figur 3 illustrerer de optiske bænkmoduler, der anvendes i de følgende afsnit til at kontrollere kvaliteten af de optiske justeringer. Alle specifikationer for optiske elementer er angivet i tabellen over materialer. Proceduren for at opbygge opsætningen er meget detaljeret i Supplerende materiale. Dette system består af en kontinuerlig bølgelaser, et motoriseret omvendt mikroskop udstyret med et nedsænkningsvandsmål, en lavinefotodiodedetektor koblet til et enkelt fotontællingsmodul og en hardwarekorrelator. Et mikroskopinkubationskammer med vibrationsfrie varmeapparater er specielt designet til at styre temperaturen til eksperimenter på levende celler. Ved konvention svarer XY-aksen til den optiske stis vinkelrette plan, og Z-aksen svarer til den optiske sti. 2. Dagligt kontrolpunkt, før eksperimentet køres Kontroller excitationsstien (figur 3, & ). Åbn alle irismembraner. Mål lasereffekten med effektmåleren, og hold den første iris helt åben. Drej halvbølgepladen (HWP) for at finde den maksimale effekt. Kontroller justeringen ved hjælp af iriserne, hvis lasereffekten er lavere end normalt, og flyt L1 og M1 skiftevis, hvis det er nødvendigt. Bemærk effektværdien i eksperimentlaboratorienotesbogen. Kontroller registreringsstien (Figur 3, & ). Placer vandet, en dækslip og en dråbe af en 2 nM rhodamin 6G (Rh6G) opløsning på målet. Hvis fluorescenssignalet (tællenummer på APD’en, registreret med LabVIEW-softwaren) er lavere end normalt, skal du lave Rh6G-løsningen om, kontrollere placeringen og dækslipsens nummer på objektivlinsen eller fjerne eventuelle bobler. Hvis fluorescenssignalet stadig er lavere end normalt, skal du placere effektmåleren inde i den optiske sti for at blokere strålen. Sluk for APD (i det følgende henviser APD til APD og enkeltfotontællingsmodulet). Fjern prøven. Rengør og udskift objektivlinsen med et reflekterende mål. Kontroller laserstrålen på det reflekterende mål ved at fjerne effektmåleren fra lysbanen. Sørg for, at målets stråle er centreret, og at tilbagerefleksionen når den første iris på linjen (figur 3). Hvis ikke, skal du justere midterpositioneringen med M2 eller rygrefleksionen med det dikroiske spejl. Hvis mikroskopkoblingen er korrekt, skal du skubbe objektivlinsen tilbage, tilføje en dråbe vand, en dækslip og en dråbe af en mere koncentreret Rh6G-opløsning (dvs. 200 nM) og indstille en lavere lasereffekt end for de klassiske målinger (få μW). Tænd for APD og optimer APD- og pinhole-justering skiftevis med deres respektive XYZ-justeringsskruer, mens du overvåger intensitetssignalet (LabVIEW-software). Skift dækslip og tilføj en lavere koncentration af Rh6G (2 nM). Flyt pinhole langs Z-aksen for at finde en position, hvor det molekylære lysstyrkeforhold øges, og taljen er minimal. Luk iris, indtil signalet falder ned: laserstrålestørrelsen når målets bagblankestørrelse (dvs. den minimale taljestørrelse, se Supplerende materiale). Start korrelatorsoftwaren, og registrer data (se afsnit 7 for dataregistrering). Kontroller ACF, som skal vise en lav mængde støj, give en lille taljestørrelse og en høj tællehastighed pr. molekyle pr. Sekund (se afsnit 7 for dataanalyse og taljestørrelsesevaluering). 3. Generelle betragtninger vedrørende registrering og analyse af svFCS-data Registrer og analyser fluorescensdata efter denne generelle ordning (se afsnit 7, 8 og 9): (1) fluorescensregistrering og ACF-generering (korrelatorsoftware), (2) uventet kassering af data, et gennemsnit af bevarede data, der passer til den relevante model (med hjemmelavet Igor Pro-software), (3) diffusionslovplot (hjemmelavet MATLAB-software 1) og (4) valgfri diffusionslovsammenligning (hjemmelavet MATLAB-software 2). De forskellige softwareprogrammer er tilgængelige efter anmodning.BEMÆRK: Hardwarekorrelatoren har en minimum samplingstid på 12,5 ns (dvs. en samplingfrekvens på 80 MHz). Det giver en tidsmæssig opløsning, der er mindst 1.000 lavere end den typiske residente tid for frit diffuserende lille molekyle i opløsning og 106 mindre end diffusionstiden for membranproteiner inden for et konfokalt observationsvolumen. 4. Cellekultur og transfektion Frø Cos7-cellerne i 8-brøndkammerdæksglas med # 1.0 borosilikatglasbund med en densitet på 10.000 celler / brønd ved hjælp af komplet Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 5% føtalt bovint serum, penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 U / ml) og L-glutamin (1 mM). Cellerne dyrkes ved 37 °C i en befugtet atmosfære indeholdende 5 % CO2 i 24 timer. Fjern mediet, tilsæt 300 μL af det friske komplette dyrkningsmedium pr. brønd, og forinkuber cellerne i 30 minutter ved 37 °C. 0,5 μg af plasmid-DNA’et, der koder for Thy-1-proteinet, fortyndes med eGFP25 i 50 μL serumfri DMEM. Vortex kort at blande. 1,5 μL DNA-transfektionsreagens fortyndes i 50 μL serumfrit DMEM, og opløsningen blandes godt. Det fortyndede transfektionsreagens tilsættes direkte i den fremstillede DNA-opløsning, og forbindelserne blandes straks. Inkuber den tilberedte blanding i 10 til 15 minutter ved stuetemperatur. Der tilsættes 10 μL af de kombinerede DNA/transfektionsreagenskomplekser dråbevis på mediet i hver brønd, og homogeniseres ved forsigtigt at hvirvle pladen. Cellerne inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2 i 3 timer. Efter inkubationen erstattes det medium, der indeholder DNA/transfektionsreagenskomplekser, med 400 μL frisk komplet DMEM, og cellerne skal dyrkes i 16 timer før svFCS-eksperimentet. 5. Forberedelse af celler til svFCS-målinger Fjern kulturmediet. Cellerne vaskes forsigtigt to til tre gange med serumfri Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) buffer indeholdende Ca2+ og Mg2+ suppleret med 10 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsyre) (HEPES), pH 7,4 (HBSS/HEPES). Vedligehold cellerne i HBSS/HEPES-bufferen under alle svFCS-anskaffelser. 6. Farmakologisk behandling Kulturmediet fjernes, og cellerne vaskes to til tre gange med serumfri HBSS suppleret med 10 mM HEPES, pH 7,4 (HBSS/HEPES). Cellerne inkuberes med 1 U/ml kolesteroloxidaseopløsning (COase) i HBSS/HEPES-buffer i 1 time ved 37 °C. Opløsningen fjernes, og cellerne opretholdes i nærværelse af 0,1 U/ml COase i HBSS/HEPES-bufferen, mens svFCS-målingerne udføres. 7. Kalibrering af spotstørrelse Forvarm mikroskopkammeret ved 37 °C. Der fremstilles en standard 2 nM opløsning af Rh6G ved seriel fortynding. Dråbe 200 μL 2 nM Rh6G-opløsning på en glasdæksler placeret på vandsænkningsmålet. Start al hardware og software. Mål og juster laserstråleeffekten på 488 nm til 300 μW. Afhængigt af lysstyrken og fotostabiliteten af den anvendte fluorescerende sonde skal du tilpasse denne effekt i henhold til (1) fluorescensintensiteten (på LabVIEW-softwaren), som skal være stabil, (2) ACF-formen (på korrelatorsoftwaren), som skal have en konstant form over tiden, og (3) tilpasningsparametrene, der giver en lille taljestørrelse og en høj tællehastighed pr. molekyle (fotoner pr. molekyle pr. sekund, typisk få titusinder til hundreder af fotoner pr. molekyle pr. Sekund).BEMÆRK: Amplituden af ACF (kaldet G (0)) er omvendt proportional med molekylets antal (dvs. koncentrationen af den fluorescerende sonde). Til kalibrering af taljestørrelse er dette en god kvalitetskontrolkandidatparameter. Derfor bør G(0) være ens for den samme koncentration fra dag til dag, da den forbinder taljestørrelsen og koncentrationen. For cellemålinger, da FCS er mere nøjagtig for lav koncentration, skal G (0) være høj for den korrekte parametertilpasningsekstraktion. Indstil svFCS-belysnings-/detektionsmikroskopporten med LabVIEW-softwaren. Tænd for APD. Luk iris, indtil signalet falder ned for at opnå den minimale taljestørrelse, eller luk den for større taljestørrelse. Optag flere ACF’er af valgt varighed (nemlig en kørsel) for at forbedre den statistiske reproducerbarhed, typisk 10 kørsler, der varer i 20 s hver med korrelatorsoftwaren. Sluk for ADGANGSPUNKTET. Brug Igor Pro-softwaren til at kontrollere og kassere kørslerne med stærke udsving på grund af molekylære aggregater. Udfør dette trin manuelt – det skal være brugeruafhængigt, efter at brugerne er blevet uddannet. Tilpas gennemsnittet af de tilbageholdte ACF’er med en 3D-diffusionsmodel. Uddrag fra tilpasningsparametrene den gennemsnitlige diffusionstid og gem den i en “.txt” -fil (filformatet dikteres af Igor Pro-softwaren). Molekyle pr. sekund (en god præstationsindikator) kontrolleres ved at dividere den gennemsnitlige intensitet (ekstraheret fra fluorescenssporet) med antallet af molekyler (ekstraheret fra ACF).BEMÆRK: Sørg for, at denne værdi er høj og stabil fra dag til dag for de samme anskaffelsesparametre. Kendskab til diffusionskoefficienten for Rh6G i vandig opløsning ved 37 ° C (D) og (se 7.13) beregnes den eksperimentelle taljestørrelse ω i henhold til: . Anvend proceduren for hver taljestørrelsesændring, der kræves for at plotte FCS-diffusionsloven og før enhver ny eksperimentel serie af svFCS-dataindsamling. 8. svFCS dataindsamlinger på celler Mål og juster stråleeffekten på 488 nm mellem 2 og 4 μW. Afhængigt af lysstyrken og fotostabiliteten af den anvendte fluorescerende sonde skal du tilpasse denne effekt for at tillade en høj tællehastighed pr. molekyle (typisk flere tusinde fotoner pr. molekyle pr. sekund), samtidig med at fotoblegningen holdes lav (dvs. et stabilt intensitetsspor på LabVIEW-softwaren). Ækvilibreringsprøver i 10 minutter ved 37 °C, inden målingerne påbegyndes. Indstil epi-fluorescensbelysningsmikroskopet med LabVIEW-softwaren. Vælg en celle med en passende fluorescerende sondeplacering og (lav) fluorescenssignalintensitet.BEMÆRK: Jo lavere fluorescensen er, jo bedre er FCS-målingerne (se trin 8.1). Indstil svFCS-belysnings-/detektionsmikroskopporten med LabVIEW-softwaren. Tænd for APD. Udfør en xy-scanning af den valgte celle med LabVIEW-softwaren. Udfør en z-scanning, og find det konfokale sted ved den maksimale fluorescensintensitet ved at vælge plasmamembranen øverst og starte dataindsamlingen. For at maksimere adskillelsen mellem de to membraner skal du fortrinsvis udføre scanningen i cellens nukleare område. Optag en serie på 20 kørsler, der varer i 5 s, hver med korrelatorsoftwaren.BEMÆRK: Sørg for, at varigheden af hver kørsel er lang nok til at opnå ACF’er med reduceret støj. Lange opkøb er modtagelige for fotobleaching eller uventede væsentlige variationer (f.eks. Aggregater). Tilpas antallet af kørsler, deres varighed og antallet af serier til prøverne, men sørg for, at de forbliver konstante inden for samme bulk af eksperimenter for reproducerbarhed. Sluk for ADGANGSPUNKTET. Kassér uventede kørsler med Igor Pro-softwaren. Tilpas den gennemsnitlige ACF med en 2-arts 2D diffusionsmodel. Tilpas denne model til typen af diffusionsadfærd for målmolekylet. Gem tilpasningsparametrene i den forrige fil (se trin 7.13). Udfør 10 til 15 serier af optagelser på mindst 10 forskellige celler, og gengiv trin 8.3 til 8.13. Kontroller, at den opnåede enkeltfil indeholder taljestørrelsesoplysninger og tilpasningsparametrene for de 10-15 optagelser. For at etablere en enkelt diffusionslov skal du analysere mindst fire taljestørrelser, der varierer mellem 200 og 400 nm. Dette interval er defineret af diffraktionsoptiske grænse, men er objektiv- (numerisk blænde) og laser (bølgelængde) afhængig.BEMÆRK: Da kalibreringen af taljestørrelsen ikke er absolut og har en vis grad af usikkerhed, blev en dedikeret MATLAB-software28 , der tegner sig for x- og y-fejlen (nemlig ω2 og td), bygget til at passe til diffusionsloven. Start MATLAB-softwaren 1, og vælg en mappe, der indeholder alle “.txt” -filer svarende til mindst fire taljestørrelseseksperimenter. Plot <td> versus <ω2>, nemlig diffusionsloven. To hovedparametre kan ekstraheres: y-akse-skæringspunktet (t0) og den effektive diffusionskoefficient (Deff, omvendt proportional med hældningen). 9. Diffusionslove af forskellige eksperimentelle tilstandssammenligninger BEMÆRK: Om nødvendigt gengives afsnit 7 og 8 for forskellige forsøgsbetingelser. En dedikeret software (MATLAB software 2) blev udviklet for at afgøre, om disse diffusionslove er ens eller ej i henhold til t0 – og Deff-værdierne 28. Det tester to hypoteser: de to værdier er forskellige, eller de to værdier er ikke forskellige ved en tærskel, der er fastsat over en sandsynlighed for falsk alarm (PFA). En vilkårlig PFA-værdi på 5% (T = 3,8) betragtes som den øvre signifikansgrænse mellem to parametre (t0 eller Deff), hvilket indikerer, at der kun er 5% chance for, at de to værdier er identiske. Opret en “.xls”-fil, der indeholder de karakteristiske diffusionslovværdier for hver betingelse, der skal sammenlignes (dvs. en fil, der indeholder t0, t0-fejlen , Deff – og Deff-fejlen for de ikke-behandlede (NT) og behandlede (COase) betingelser som en tabel). Start MATLAB-softwaren 2. Vælg filen “.xls”. Analyser det genererede farvekodede 2D-plot, hvor de statistiske test t0 og Deff skal afbildes på henholdsvis x- og y-akserne (figur 4). Jo højere T er, jo større er forskellen mellem de sammenlignede værdier. 10. Målinger af kolesterolkoncentration Cellebehandling og lysis Frø Cos7-cellerne i tredobling i 6-brøndsplader ved 4 × 105 celler / brønd og inkuber i 2 ml komplet DMEM ved 37 ° C med 5% CO2 natten over for at give cellerne mulighed for at fastgøre til pladen. Fjern kulturmediet og vask cellerne tre gange med fosfatbufferet saltvand (PBS). Der tilsættes 1 ml HBSS/HEPES-buffer, der indeholder (eller ikke indeholder 1 U/ml coase, og der inkuberes i 1 time ved 37 °C med 5 % CO2. Mediet erstattes med 1 ml HBSS/HEPES indeholdende 0,1 U/ml coase, og der inkuberes i 1 time ved 37 °C med 5 % CO2. Fjern opløsningen og høst cellerne. Cellerne vaskes tre gange med PBS, og centrifugeres ved 400 × g i 5 min ved stuetemperatur. Lyse cellerne med radioimmunoprecipitation assay buffer (25 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10 mM,MgCl2, 1 mM ethylendiamin tetraeddikesyre, 2% glycerol, protease og fosfatasehæmmer cocktail) i 30 minutter på is. Lysaterne centrifugeres ved 10000 × g i 10 minutter ved 4 °C, og supernatanten opsamles. Kvantificer den samlede proteinkoncentration for hver prøve ved modificeret Bradfords proteinassay ved hjælp af arbejdsløsningen i henhold til producentens anbefalinger. Måling af kolesterolkoncentration For at bestemme det samlede cellulære kolesterolniveau enzymatisk skal du bruge det relevante sæt (f.eks. Amplex Red Cholesterol Assay Kit) i henhold til producentens anbefalinger. For hver reaktion blandes prøven indeholdende 5 μg protein med Amplex Red reagens/peberrodsperoxidase/kolesteroloxidase/kolesterolesterase arbejdsløsning og inkuberes i 30 minutter ved 37 °C i mørke. Mål fluorescensen ved hjælp af excitering på 520 nm, og detekter emissionen ved 560-590 nm ved hjælp af en mikropladelæser. Træk baggrunden fra den endelige værdi, og bestem kolesterolkoncentrationen ved hjælp af en standardkurve. Beregn det endelige kolesterolindhold i ng kolesterol pr. μg protein.

Representative Results

Vi genererede en DL for Thy1-GFP udtrykt i Cos-7 celler (figur 4, sorte firkanter). Diffusionsloven har en positiv t0-værdi (19,47 ms ± 2 ms), hvilket indikerer, at Thy1-GFP er begrænset i nanodomænestrukturer i plasmamembranen. Kolesteroloxidasebehandlingen af cellerne, der udtrykker Thy1-GFP, resulterede i forskydningen af DL t0-værdien til 7,36 ± 1,34 ms (figur 4, grå firkanter). Denne observation bekræfter, at arten af Thy1-GFP indeslutning afhænger af kolesterolindholdet og er forbundet med lipidflåde nanodomæner. Disse to diffusionslove viser sig at være forskellige i henhold til den ovenfor beskrevne statistiske test (se trin 9.1.3) med hensyn til t0 – og Deff-værdier . Derudover vurderede vi koncentrationen af totalt cellulært kolesterol i ikke-behandlede Cos-7-celler versus de celler, der blev behandlet med COase. Et lille, men signifikant fald i det samlede kolesterolindhold observeres ved COase-behandling (figur 5). Da dette enzym kun virker på kolesterolpuljen, der er tilgængelig ved plasmamembranens ydre folder, antager vi, at det observerede fald i kolesterol kun er forbundet med plasmamembranen og resulterer i destabilisering af lipidflåde nanodomæner. Figur 1: Simuleret fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) diffusionslove etableret ved spotvariation FCS for forskellige former for membranorganisation. (Øverste paneler) Skematisk repræsentation af membranorganisation – (A) fri diffusion, (B) meshworkbarrierer og (C) fælde / domæneindeslutninger – med banen tegnet for et enkelt molekyle (rød). Blå cirkler angiver skæringspunktet mellem membranen og laserstrålen i taljen ω. (Nederste paneler) FCS diffusionslove repræsenteret ved at plotte diffusionstiden td som en funktion af den kvadrerede radius ω2. Diffusionslovprojektion (grøn stiplet linje) opfanger tidsaksen ved (A) oprindelsen (t0 = 0) i tilfælde af fri diffusion; B) i negativ akse (t0 < 0), når der er maskebarrierer, eller (C) i minusakse (t0 > 0), når der er fælder og domæner (lipidflåder). D er den laterale diffusionskoefficient for brownsk bevægelse; Deff, den effektive diffusionskoefficient; Dmikro, den mikroskopiske diffusionskoefficient inde i maskefælderne; Di, diffusionskoefficienten inden for domæner; Dud, diffusionskoefficienten uden for domæner; L, størrelsen på siden af et firkantet domæne; og rD, radius af et cirkulært domæne. Denne figur er blevet ændret fra He og Marguet6. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 2: Skematisk visning af svFCS-hardwarekontrol. Computeren styrer alle enheder gennem forskellige kommunikationsprotokoller: seriel (mikroskop, ekstern lukker), USB (XYZ piezoelektrisk scene, korrelator) og PCI (erhvervelseskort). DAQ: dataindsamlingskort, APD: lavinefotodiode, SPCM: enkeltfotontællingsmodul, DO: digitalt output. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 3: Skematisk visning af excitations- og emissionsoptiske stier i svFCS-opsætningen. SvFCS-opsætningen indeholder fire moduler: (1) outputtet fra en fiberet 488 nm laser kollimeres, (2) en kombination af en halvbølgeplade og polariserende strålesplitter indstiller den optiske effekt, (3) laserstrålen fokuseret på prøven efter at have rejst gennem et rørlinsefrit motoriseret mikroskop, og (4) fluorescensen detekteres gennem en konfokallignende detektionssti på en lavinefotodiode koblet til et enkelt fotontællingsmodul, som leverer et signal til en hardwarekorrelator. Enkelhed giver systemet dets følsomhed, robusthed og brugervenlighed (bredt kommenteret i supplerende materiale). Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 4: SvFCS-diffusionslovene genereret fra diffusionsanalyse af Thy1-GFP udtrykt i Cos-7. svFCS diffusionslove af Cos-7 celler uden behandling (NT, sorte firkanter) og efter kolesteroloxidasebehandling (COase, grå cirkler). Indsættelsen i grafen repræsenterer statistisk test af en signifikant forskel mellem de to præsenterede svFCS-diffusionslove (ifølge Mailfert et al.28). Testværdien (T) skal være over den tærskel, der er fastsat til 3,8, når begge diffusionslove er forskellige. Jo højere det er, jo større er forskellen mellem diffusionslovene. Værdien af T er farvekodet. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 5: Sammenligning af totalt kolesterolindhold i Cos-7 celler. Cos-7 celler blev enten ikke-behandlet (NT) eller behandlet med 1 U / ml kolesteroloxidase (COase) i 1 time. Dataene repræsenterer et eksempel på et eksperiment i tre eksemplarer. En tosidet, uparret t-test blev brugt til at vurdere den statistiske forskel (α = 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur. Tabel over materialer: Listen over optiske elementer, der kræves til svFCS-opsætningen. Supplerende materiale: Dette dokument beskriver opbygningen af en svFCS-opsætning fra bunden. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Her har vi beskrevet implementeringen af svFCS-modulet på et standard fluorescerende mikroskop, en kraftfuld eksperimentel tilgang til at dechiffrere dynamikken i plasmamembranorganisationen i levende celler takket være FCS-diffusionslovanalysen. Konceptuelt er svFCS baseret på et simpelt princip: korrelationsmålinger af fluorescens i tidsdomænet, mens størrelsen af belysningsområdet varierer23. Denne strategi har været medvirkende til at udlede nanoskopisk information fra mikroskopiske målinger, hvilket hjælper med at dechiffrere de vigtigste fysisk-kemiske elementer, der bidrager til plasmamembranorganisationen i steady state25 og fysiologiske processer 30,31,32,33. Alt i alt viser disse svFCS-analyser utvetydigt eksistensen af lipidafhængige nanodomæner i forskellige celletyper og deres direkte implikation i tuning af forskellige signalhændelser.

Inden for denne ramme er der nogle optiske aspekter, der skal overvejes, mens du bygger svFCS-opsætningen for at optimere fotonbudgettet og minimere optiske afvigelser. Derfor anbefaler vi at bruge et mikroskop, hvorfra rørlinsen kan fjernes, når svFCS-målingen udføres. Desuden spiller en enkelt iris en nøglerolle i svFCS-opsætningen: den ændrer strålestørrelsen ved målets bageste blænde og varierer dermed direkte den effektive taljestørrelse (dvs. det effektive excitationsvolumen). Bjælkediameteren skal passe til den objektive bage pupil for at opnå den mindste taljestørrelse34. Denne mulighed, som hjælper med at indstille taljestørrelsen, sikrer optimering af fotonbudgettet og er let at implementere. Endelig anvendes et minimalt antal optiske dele langs lysstien; jo mindre komplekst systemet er, jo færre fotoner går tabt. Alle disse muligheder forbedrer robustheden af svFCS-eksperimenter betydeligt.

Med hensyn til selve protokollen skal et par kritiske trin overvejes. Det vigtigste er en passende justering af de optiske stier, der er afgørende for vellykkede svFCS-målinger (protokol, afsnit 2). Dette er let at kontrollere ved at analysere fluorescenssignalet fra en 2 nM Rh6G-opløsning, som skal være ~ 200 kHz under 300 μW laserbelysning. Alle iriser skal åbnes, og ACF’erne skal have en vigtig amplitude (typisk G0 ~ 1,5-2,0). Et andet kritisk punkt vedrører cellerne og deres forberedelse til svFCS-analyse (protokol, afsnit 4-8). Deres massefylde skal tilpasses, således at isolerede celler, der skal observeres, er tilgængelige til analyse. Ikke-klæbende celler skal immobiliseres på et kammerdækselglas ved anvendelse af poly-L-lysinopløsning. Fluorescenssignalet fra cellemærkning bør ikke være for stærkt, eller det vil resultere i meget flade ACF’er, der er vanskelige at passe, og tilpasningsparametrene er belastet med en vigtig fejl. Derudover gør ikke-homogen mærkning og fluorescensaggregater i celler svFCS-målingerne ekstremt vanskelige at fortolke. Endelig påvirker kolesteroloxidasebehandling cellelevedygtighed, og svFCS-analysen bør ikke overstige en time efter behandlingen. Det er også bedre at registrere fluorescensfluktuationerne fra den øvre plasmamembran, da den ikke er fastgjort til understøtningen, og der er ingen risiko for hindret diffusion af molekyler på grund af de fysiske interaktioner med understøtningen.

Der har været nok fremskridt i svFCS-teknikken til dens anvendelse i forskellige tilgange på grund af mangfoldigheden af modaliteter til justering af detektionsvolumenet, hvilket gør det muligt at studere forskellige biologiske processer i levende celler. Et alternativ til at justere størrelsen på excitationsvolumenet er at bruge en variabel stråleudvidelse35. Det er også muligt blot at modulere størrelsen af belysningsområdet ved at registrere det fluorescerende signal fra skæringspunktet af plasmamembranen langs z-retningen36. Dette kan gøres på et standard konfokalt mikroskop, for hvilket der er udviklet en teoretisk ramme for at udlede diffusionsloven37,38.

Selvom svFCS-metoden tilbyder spatio-temporal opløsning, hvilket er nødvendigt for karakteriseringen af plasmamembranens inhomogene laterale organisation, udelukker de geometriske indeslutningsformer ikke hinanden. En afvigelse på t0 i den ene eller den anden retning afslører udelukkende en dominerende indeslutningsmåde25. Desuden skyldes en anden vigtig begrænsning af den nuværende svFCS-metode den klassiske optiske diffraktionsgrænse (~ 200 nm). Dette er utvivlsomt større end de domæner, der begrænser molekylerne i celleplasmamembranen. Derfor udledes analysen af indespærringen af t0-værdien , ekstrapoleret fra diffusionsloven.

Denne ulempe er blevet overvundet ved at implementere alternative metoder. Oprindeligt gav brugen af metalliske film boret med nanoaperturer mulighed for at belyse et meget lille membranområde (dvs. under den optiske diffraktionsgrænse for enkelte nanometriske åbninger af radier, der varierer mellem 75 og 250 nm)39. Overgangsregimet forudsagt fra den teoretiske diffusionslov for isoleret domæneorganisation blev således rapporteret, og det tillod en forfining af den karakteristiske størrelse af de nanometriske membran heterogeniteter og et kvantitativt skøn over overfladearealet optaget af lipidafhængige nanodomæner39. Alternativt er nanometrisk belysning også udviklet ved hjælp af nærfeltsscanning optisk mikroskopi40 eller plane optiske nanoantennas41. For nylig har kombinationen af stimuleret emissionsudtømning (STED) og FCS givet et kraftfuldt og følsomt værktøj til at dokumentere diffusionsloven med meget høj rumlig opløsning. Denne STED-FCS giver adgang til molekylære diffusionsegenskaber på nanoskala, der forekommer inden for en kort periode, hvilket muliggør undersøgelsen af den dynamiske organisering af lipidprober ved plasmamembranen42,43. Den ufuldstændige undertrykkelse af fluorescens i STED-processen udfordrer imidlertid analysen af autokorrelationskurverne i FCS.

En ny tilpasningsmodel er blevet udviklet for at overvinde denne vanskelighed og forbedre nøjagtigheden af diffusionstiderne og de gennemsnitlige molekyletalsmålinger44. Endelig kan svFCS-princippet anvendes til langsom molekylær diffusion ved plasmamembranen på data registreret ved billedkorrelationsspektroskopi45. For nylig er det blevet påvist, at kombination af atomkraftmikroskopi (AFM) med billeddannelse af total intern refleksion-FCS (ITIR-FCS) bidrager til forfining af arten af den mekanisme, der hindrer molekylær diffusion ved plasmamembranen, især nær perkolationstærskelmembrankonfigurationen på grund af en høj densitet af nanodomæner46.

Afslutningsvis har etablering af diffusionslov af svFCS givet det eksperimentelle bevis for at udlede lokal heterogenitet skabt af dynamiske kollektive lipider og membranproteiners foreninger. Som anført af Wohland og kolleger46, “FCS diffusion lov analyse forbliver et værdifuldt værktøj til at udlede strukturelle og organisatoriske træk under opløsningsgrænsen fra dynamisk information”. Alligevel er vi nødt til at udvikle nye modeller for at forfine fortolkningen af diffusionsloven, der skal give mulighed for en bedre forståelse af dynamikken i de molekylære begivenheder, der forekommer ved plasmamembranen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SB, SM og DM blev støttet af institutionel finansiering fra CNRS, Inserm og Aix-Marseille Universitet og programtilskud fra det franske nationale forskningsagentur (ANR-17-CE15-0032-01 og ANR-18-CE15-0021-02) og det franske “Investissement d’Avenir” (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). KW anerkender “BioTechNan”, et program med tværfaglige miljødoktorale studier KNOW inden for bioteknologi og nanoteknologi. EB anerkender den økonomiske støtte fra Polens nationale videnskabscenter (NCN) under projekt nr. 2016/21/D/NZ1/00285 samt den franske regering og Frankrigs ambassade i Polen. MŁ anerkender den økonomiske støtte fra det polske udviklingsministerium (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) og det nationale center for forskning og udvikling (Innochem POIR.01.02.00-00-00-0064/17). TT anerkender økonomisk støtte fra National Science Center of Poland (NCN) under projekt nr. 2016/21/B/NZ3/00343 og fra Wroclaw Biotechnology Center (KNOW).

Materials

Aligment tool Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings Thorlabs SPW602
Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM) Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode Excelitas SPCM-AQRH-15
BNC 50 Ω plug to 50 Ω plug lead 2 m RS Components 742-4315
Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 Ω With connector, 1.22 m, RoHS2 RS Components 885-8172
Tee 50Ω RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 → 1GHz RS Components 546-4948
Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E – French Extension Lead, 230 V RS Components 768-5500
Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C RS Components 452-8394
Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter RS Components 792-4079
Fluorescence filtering 535/70 ET Bandpass, AOI 0° Chroma Diameter 25 mm AHF filter F47-539
Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45° Chroma 25.5 x 36 x 1 mm AHF filter F43-088
496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0° Chroma Diameter 25 AHF filter F37-496
Hardware correlator 80 MHz Digital Correlator Correlator.com Flex02-12D
Laser LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW Lasos BLD-XT 488100
Laser safety High-Performance Black Masking Tape, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Roll Thorlabs T743-2.0
Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets Thorlabs MC-5
Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission Thorlabs LG3B
Microscope Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope
Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters
Carl Zeiss
C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS
(D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR
Carl Zeiss 421767-9971-711
Adapter W0.8 / M27x0.75 H "5" Carl Zeiss 000000-1698-345
Middle ring W0.8 – W0.8 H "5" Carl Zeiss 000000-1698-347
Optical path D25.4mm Mirror, Protected Silver Thorlabs PF10-03-P01
D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat Thorlabs AC254-060-A
D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat Thorlabs AC254-035-A
25 µm mounted pinhole Thorlabs P25S I
25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm Thorlabs WPH10M-488 (HWP)
20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm Thorlabs PBS201
Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID Thorlabs RSP1/M
52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount Thorlabs KM100B/M
Adjustable Prism Clamp Thorlabs PM3/M
Beam block – active area 19 mm x 38 mm Thorlabs LB1/M
Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture Thorlabs ID25/M
Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount Thorlabs KM100CL
1" Optic Holder, M4 Tap Thorlabs MFF101/M
1" Stackable Lens Tube Thorlabs SM1L03
Stackable Lens Mount for 1" optic-usable depth ½ Thorlabs SM1L05
Stackable Lens Mount For 1"Optic-usable Depth 2" Thorlabs SM1L20
Small Optical Rails 600mm, metric Thorlabs RLA600/M
Small Optical Rails 75mm, metric Thorlabs RLA075/M
Small Optical Rails 150mm, metric Thorlabs RLA150/M
Rail Carrier, Counterbored Hole 1"x 1" Thorlabs RC1
Rail Carrier, Perpendicular Dovetail Thorlabs RC3
High Precision Translating Lens Mount for 1 inch Thorlabs LM1XY/M
½ " (12mm) Dovetail Translation Stage Thorlabs DT12/M
Rail Clamps Thorlabs CL6
Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102) Thorlabs PT3/M
Black Rubberized Fabric Thorlabs BK5
Ball Driver kit/ 6 tools Thorlabs BD-KIT/M
Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads Thorlabs AP6M4M
Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack Thorlabs BA1S/M-P5
Lens Mount for 25.4mm optic Thorlabs LMR1/M
SM1 FC/APC Adapter Thorlabs SM1FCA
Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics Thorlabs KM100
Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW Thorlabs S120C
12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew,
L=50 mm, 5 Pack
Thorlabs PH50/M-P5
Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm Thorlabs PH20/M
12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole, 5 Pack
Thorlabs TR50/M-P5
12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole, 5 Pack
Thorlabs TR75/M-P5
USB Power and Energy Meter Interface Thorlabs PM100USB
12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole
Thorlabs TR30/M
12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole
Thorlabs TR20/M
750 mm long Structural Rail (detection box) Thorlabs XE25L750/M
350 mm long Structural Rail (detection box) Thorlabs XE25L350/M
Quick Corner Cube for 25 mm Rails Thorlabs XE25W3
Right-Angle Bracket for 25 mm Rails Thorlabs XE25A90
Black posterboard 20" x 30" (508 mm x 762 mm), 1/16" (1.6 mm) Thick, 5 Sheets Thorlabs TB5
Hinge for 25 mm Rail Enclosures Thorlabs XE25H
Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures Thorlabs XE25LS
M4 Cap Screw Kit Thorlabs HW-KIT1/M
M6 Cap Screw Kit and Hardware kit Thorlabs HW-KIT2/M
Table Clamp, L-Shape, 5 Pack Thorlabs CL5-P5
SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (Ø0.8 – Ø12 mm) Thorlabs SM1D12D
Ø1" SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/Ø1 mm Hole Thorlabs DG10-1500-H1-MD
Honeycomb Optical Table Top, Standa Standa 1HB10-15-12
Optical Table support, Standa Standa 1TS05-12-06-AR
Sample nano-positionning Precision XYZ Nanopositioning Physik Instrumente PI P527-3.CD
Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V
Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors,
Physik Instrumente PI E727-3.CD
Temperature chamber Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK Digital Pixel
Dual Channel Microprocessor Temperature Controller Digital Pixel DP_MTC_2000_DUO
Two Vibration Free Heater Modules Digital Pixel DP_150_VF
PT100 Temperature Sensor Digital Pixel DP_P100_TS
Biological Reagents and Materials
Cell culture and transfection Cos7 cells ATCC® CRL-1651™
8- well Lab-Tek chambers Thermo Fisher Scientific 155411PK
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 16000044
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
PBS buffer Thermo Fisher Scientific 14190144
PenStrep Thermo Fisher Scientific 15140122
PolyJet Transfection Reagent SignaGen Laboratories SL100688
Cholesterol content measurement Amplex Red Cholesterol Assay Kit Thermo Fisher Scientific A12216
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 87786
Phosphatase Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78420
ROTI Nanoquant Working Solution Roth K880
GloMax Discover Microplate Reader Promega GM3000
svFCS measurements HBSS buffer Thermo Fisher Scientific 14025092
Hepes buffer Thermo Fisher Scientific 15630080
Cholesterol oxidase Sigma-Aldrich C8868
Rhodamine 6G Sigma-Aldrich 83697-1G

References

  1. Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
  2. Newton, A. C. Regulation of the ABC kinases by phosphorylation: protein kinase C as a paradigm. The Biochemical Journal. 370, 361-371 (2003).
  3. Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. The EMBO Journal. 25 (15), 3446-3457 (2006).
  4. Edidin, M. The state of lipid rafts: From model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. , (2003).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. , (2010).
  6. He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annual Reviews of Physical Chemistry. 62, 417-436 (2011).
  7. Rossy, J., Ma, Y., Gaus, K. The organisation of the cell membrane: Do proteins rule lipids. Current Opinion in Chemical Biology. 20 (1), 54-59 (2014).
  8. Nicolson, G. L. The Fluid – Mosaic Model of Membrane Structure: Still relevant to understanding the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1838 (6), 1451-1466 (2014).
  9. Fujiwara, T., Ritchie, K., Murakoshi, H., Jacobson, K., Kusumi, A. Phospholipids undergo hop diffusion in compartmentalized cell membrane. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 1071-1081 (2002).
  10. Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 351-378 (2005).
  11. Destainville, N., Salomé, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), 17-19 (2006).
  12. Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schütz, G. J. Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy. Biophysical Journal. 92 (10), 3719-3728 (2007).
  13. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. , (1976).
  14. Petrášek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. , (2008).
  15. Elson, E. L. 40 Years of FCS: How it all began. Methods in Enzymology. , (2013).
  16. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. , (1974).
  17. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. , (1974).
  18. Schwille, P., Haupts, U., Maiti, S., Webb, W. W. Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopy with one- and two-photon excitation. Biophysical Journal. , (1999).
  19. Bouchaud, J. P., Georges, A. Anomalous diffusion in disordered media: Statistical mechanisms, models and physical applications. Physics Reports. , (1990).
  20. Yechiel, E., Edidin, M. Micrometer-scale domains in fibroblast plasma membranes. Journal of Cell Biology. 105 (2), 755-760 (1987).
  21. Salomé, L., Cazeils, J. L., Lopez, A., Tocanne, J. F. Characterization of membrane domains by FRAP experiments at variable observation areas. European Biophysics Journal. 27 (4), 391-402 (1998).
  22. Niv, H., Gutman, O., Kloog, Y., Henis, Y. I. Activated K-Ras and H-Ras display different interactions with saturable nonraft sites at the surface of live cells. The Journal of Cell Biology. 157 (5), 865-872 (2002).
  23. Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., Lenne, P. F. Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization. Biophysical Journal. 89 (6), 4029-4042 (2005).
  24. Saxton, M. J. Fluorescence corralation spectroscopy. Biophysical Journal. , (2005).
  25. Lenne, P. F., et al. Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork. EMBO Journal. 25 (14), 3245-3256 (2006).
  26. Ruprecht, V., et al. Cortical contractility triggers a stochastic switch to fast amoeboid cell motility. Cell. , (2015).
  27. Billaudeau, C., et al. Probing the plasma membrane organization in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 519, 277-302 (2013).
  28. Mailfert, S., Hamon, Y., Bertaux, N., He, H. T., Marguet, D. A user’s guide for characterizing plasma membrane subdomains in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Cell Biology. 139, 1-22 (2017).
  29. Rege, T. A., Hagood, J. S. Thy-1, a versatile modulator of signaling affecting cellular adhesion, proliferation, survival, and cytokine/growth factor responses. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. , (2006).
  30. Cahuzac, N., et al. Fas ligand is localized to membrane rafts, where it displays increased cell death-inducing activity. Blood. , (2006).
  31. Guia, S., et al. Confinement of activating receptors at the plasma membrane controls natural killer cell tolerance. Science Signaling. 4 (167), 21 (2011).
  32. Blouin, C. M., et al. Glycosylation-dependent IFN-γR partitioning in lipid and actin nanodomains is critical for JAK activation. Cell. 166 (4), 920-934 (2016).
  33. Chouaki-Benmansour, N., et al. Phosphoinositides regulate the TCR/CD3 complex membrane dynamics and activation. Scientific Reports. , (2018).
  34. Wawrezinieck, L., Lenne, P. F., Marguet, D., Rigneault, H. Fluorescence correlation spectroscopy to determine diffusion laws: application to live cell membranes. Biophotonics Micro- and Nano-Imaging. , (2004).
  35. Masuda, A., Ushida, K., Okamoto, T. New fluorescence correlation spectroscopy enabling direct observation of spatiotemporal dependence of diffusion constants as an evidence of anomalous transport in extracellular matrices. Biophysical Journal. , (2005).
  36. Humpolíčková, J., et al. Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. , (2006).
  37. Benda, A., et al. How to determine diffusion coefficients in planar phospholipid systems by confocal fluorescence correlation spectroscopy. Langmuir. , (2003).
  38. Ganguly, S., Chattopadhyay, A. Cholesterol depletion mimics the effect of cytoskeletal destabilization on membrane dynamics of the serotonin1A receptor: A zFCS study. Biophysical Journal. , (2010).
  39. Wenger, J., et al. Diffusion analysis within single nanometric apertures reveals the ultrafine cell membrane organization. Biophysical Journal. 92 (3), 913-919 (2007).
  40. Manzo, C., Van Zanten, T. S., Garcia-Parajo, M. F. Nanoscale fluorescence correlation spectroscopy on intact living cell membranes with NSOM probes. Biophysical Journal. , (2011).
  41. Regmi, R., et al. Planar optical nanoantennas resolve cholesterol-dependent nanoscale heterogeneities in the plasma membrane of living cells. Nano Letters. , (2017).
  42. Mueller, V., et al. FCS in STED microscopy: Studying the nanoscale of lipid membrane dynamics. Methods in Enzymology. , (2013).
  43. Sezgin, E., et al. Measuring nanoscale diffusion dynamics in cellular membranes with super-resolution STED-FCS. Nature Protocols. , (2019).
  44. Wang, R., et al. A straightforward STED-background corrected fitting model for unbiased STED-FCS analyses. Methods. , (2018).
  45. Veerapathiran, S., Wohland, T. The imaging FCS diffusion law in the presence of multiple diffusive modes. Methods. , (2018).
  46. Gupta, A., Phang, I. Y., Wohland, T. To hop or not to hop: exceptions in the FCS diffusion law. Biophysical Journal. , (2020).

Play Video

Cite This Article
Mailfert, S., Wojtowicz, K., Brustlein, S., Blaszczak, E., Bertaux, N., Łukaszewicz, M., Marguet, D., Trombik, T. Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells. J. Vis. Exp. (165), e61823, doi:10.3791/61823 (2020).

View Video