Denne artikel har til formål at præsentere en protokol om, hvordan man bygger et spotvariation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) mikroskop til måling af molekylær diffusion ved plasmamembranen i levende celler.
Dynamiske biologiske processer i levende celler, herunder dem, der er forbundet med plasmamembranorganisation, forekommer på forskellige rumlige og tidsmæssige skalaer, lige fra henholdsvis nanometer til mikrometer og mikrosekunder til minutter. En så bred vifte af biologiske processer udfordrer konventionelle mikroskopimetoder. Her beskriver vi proceduren for implementering af spotvariation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) målinger ved hjælp af et klassisk fluorescensmikroskop, der er blevet tilpasset. Protokollen indeholder en specifik præstationskontrol af svFCS-opsætningen og retningslinjerne for molekylære diffusionsmålinger af svFCS på plasmamembranen i levende celler under fysiologiske forhold. Derudover giver vi en procedure til forstyrrelse af plasmamembranflåde nanodomæner ved kolesteroloxidasebehandling og demonstrerer, hvordan disse ændringer i plasmamembranens laterale organisation kan afsløres ved svFCS-analyse. Afslutningsvis kan denne fluorescensbaserede metode give hidtil usete detaljer om plasmamembranens laterale organisation med den passende rumlige og tidsmæssige opløsning.
Kompleksiteten af plasmamembranorganisation
Den nuværende forståelse af cellemembranorganisation skal tage højde for flere aspekter1. For det første varierer en kompleks lipidsammensætning ikke kun mellem celletyper, men også inden for en enkelt celle (membranorganeller / plasmamembran). Desuden er associerede eller iboende membranproteiner for det meste organiseret i dynamiske multimere komplekser, med store domæner, der strækker sig uden for membranen, og tegner sig for et betydeligt større område end transmembrandomænerne alene. Desuden udviser membranassocierede proteiner specifikke lipidbindende eller lipid-interagerende kapaciteter, der spiller roller i reguleringen af proteinfunktionen. Disse afhænger direkte af lipidernes lokale sammensætning og tilgængelighed2.
Endelig observeres et signifikant niveau af asymmetri mellem to membranblade på grund af den iboende asymmetriske struktur af membranproteiner og fordelingen af lipider. Faktisk genererer en lipidmetabolsk balance mellem syntese og hydrolyse kombineret med lipid flip-flop mellem brochurerne en sådan asymmetrisk fordeling. Da enhver transport over dobbeltlaget er begrænset af den frie energi, der kræves for at flytte den polære hovedgruppe gennem membranernes hydrofobe indre, bistås den normalt af selektive transportører. For hver celletype har asymmetri tendens til at blive fastholdt. Alt i alt bidrager disse faktorer til lateral inhomogenitet eller ruminddeling af plasmamembranen 3,4.
Vi beriger denne repræsentation af plasmamembranen ved at tage højde for den iboende molekylære diffusion i og på tværs af dobbeltlaget, hvilket bidrager til den dynamiske laterale heterogenitet på en skala fra tiendedele til hundreder af nanometer og mikrosekunder til sekunder. For eksempel bidrager lipidafhængige membrannanodomæner – de såkaldte lipidflåder, defineret som kolesterol, og sphingolipidrige signalplatforme – til ruminddelingen af plasmamembranen 5,6. Imidlertid er den nuværende opfattelse af membranorganisation ikke begrænset til lipidflåder alene. Membran nanodomæner er mere komplekse og heterogene i sammensætning, oprindelse og funktion. Alligevel skal deres tilstedeværelse ved plasmamembranen koordineres tæt, og dynamiske interaktioner mellem proteiner og lipider synes at være vigtige i den rumlige fordeling og kemisk modifikation af membrannanodomæner 1,3,7,8.
SvFCS-princippet og dets anvendelse til at undersøge organiseringen af plasmamembranen
Selvom der er gjort store fremskridt i analysen af membrandomæner, hovedsageligt gennem biofysiske teknikker, skal de determinanter, der dikterer den lokale organisering af plasmamembranen, raffineres med passende rumlig og tidsmæssig opløsning. Determinanter baseret på sporing af individuelle molekyler giver fremragende rumlig præcision og tillader karakterisering af forskellige bevægelsesformer 9,10,11,12, men har en begrænset tidsmæssig opløsning med klassiske lave kamerabilledhastigheder og kræver mere eksperimentel indsats for at registrere et betydeligt antal baner. Alternativt kan diffusionskoefficienten for membrankomponenter evalueres ved Fluorescens Recovery After Photobleaching (FRAP)13 eller Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)14. Sidstnævnte har fået mere opmærksomhed, hovedsageligt på grund af dets høje følsomhed og selektivitet, mikroskopiske detektionsvolumen, lav invasivitet og brede dynamiske område15.
Det konceptuelle grundlag for FCS blev introduceret af Magde og kolleger for omkring 50 år siden16,17. Det er baseret på registrering af udsving i fluorescensemission med en høj tidsmæssig opløsning (fra μs til s)18. I sin moderne version udføres målinger i levende celler af et lille konfokalt excitationsvolumen (~ 0,3 femtoliter) placeret inden for et område af interesse (f.eks. Ved plasmamembranen); fluorescenssignalet genereret ved diffuse fluorescerende molekyler, der går ind og ud af observationsvolumenet, opsamles med meget høj tidsmæssig opløsning (dvs. ankomsttidspunktet for hver foton på detektoren). Derefter beregnes signalet for at generere autokorrelationsfunktionen (ACF), hvorfra den gennemsnitlige tid td (diffusionstid), for hvilken et molekyle forbliver inden for brændvolumenet, ekstraheres sammen med det gennemsnitlige antal partikler (N), der er til stede i observationsvolumenet, hvilket er omvendt proportionalt med amplituden af ACF. Denne sidste parameter kan være nyttig information om molekylekoncentrationen inden for observationsvolumenet.
Siden da er et stigende antal FCS-modaliteter blevet implementeret takket være hurtigt udviklende instrumentering inden for biofotonik, hvilket gør det muligt at beskrive dynamiske fænomener, der forekommer i levende systemer. Alligevel ville en molekylær art opleve en mere overlappende fordeling af diffusionskoefficientværdierne, hvilket normalt afspejles af en uregelmæssig diffusionskarakteristik, hvor molekyler diffunderer med et ikke-lineært forhold i tid19 og vanskeligheder med at identificere den biologiske betydning af denne uregelmæssige subdiffusion. Tidligere er denne vanskelighed blevet noget overvundet ved at registrere den molekylære diffusion af FRAP fra områder af forskellig størrelse snarere end fra kun et område og derved give yderligere rumlig information. Dette muliggjorde for eksempel konceptualisering af membranmikrodomæner 20,21,22.
En oversættelse af denne strategi til FCS-målinger (dvs. den såkaldte spotvariation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS)) blev etableret ved at variere størrelsen af observationsens brændvolumen, hvilket gjorde det muligt at registrere fluktuationen i fluorescens på forskellige rumlige skalaer23. SvFCS-tilgangen giver således indirekte rumlig information, der muliggør identifikation og bestemmelse af molekylære diffusionstilstande og type membranpartitionering (isolerede versus sammenhængende domæner24) af studerede molekyler. Ved at plotte diffusionstiden td som en funktion af de forskellige rumlige skalaer defineret af taljeværdien (ω), som svarer til detektionsstråleradiusstørrelsen i dette tilfælde23,25, kan man karakterisere diffusionsloven for et givet molekyle i en given fysiologisk tilstand. SvFCS er derfor en perfekt analog til enkeltpartikelsporing i tidsdomænet26. Under den brownske diffusionsbegrænsning bør man forvente et strengt lineært forhold mellem diffusionstiden td og taljen ω (figur 1)23,25. Oprindelsen af diffusionslovens afvigelse fra denne ordning kan tilskrives ikke-eksklusive årsager, såsom cytoskeletnet, molekylær trængsel, dynamisk partitionering i nanodomæner eller enhver kombination af disse og andre virkninger (figur 1) og skal testes eksperimentelt25.
Her leverer vi alle nødvendige kontrolpunkter til daglig brug af et specialfremstillet svFCS optisk system bygget fra bunden, som supplerer vores tidligere protokolanmeldelser27,28 på den eksperimentelle tilgang. Som et bevis på konceptet giver vi desuden retningslinjer for kalibrering af opsætningen, forberedelse af celler, dataindsamling og analyse til etablering af svFCS diffusionslov (DL) for Thy1-GFP, et plasmamembran glycosylphosphatidylinositolforankret protein, som vides at være lokaliseret i lipid-raft nanodomæner29. Endelig demonstrerer vi, hvordan den delvise destabilisering af lipid-raft nanodomæner ved kolesteroloxidasebehandling påvirker diffusionsegenskaberne for Thy1-GFP. Derudover findes en detaljeret beskrivelse af opbygning af en svFCS-opsætning fra bunden i supplerende materiale.
Her har vi beskrevet implementeringen af svFCS-modulet på et standard fluorescerende mikroskop, en kraftfuld eksperimentel tilgang til at dechiffrere dynamikken i plasmamembranorganisationen i levende celler takket være FCS-diffusionslovanalysen. Konceptuelt er svFCS baseret på et simpelt princip: korrelationsmålinger af fluorescens i tidsdomænet, mens størrelsen af belysningsområdet varierer23. Denne strategi har været medvirkende til at udlede nanoskopisk information fra mikroskopiske målinger, hvilket hjælper med at dechiffrere de vigtigste fysisk-kemiske elementer, der bidrager til plasmamembranorganisationen i steady state25 og fysiologiske processer 30,31,32,33. Alt i alt viser disse svFCS-analyser utvetydigt eksistensen af lipidafhængige nanodomæner i forskellige celletyper og deres direkte implikation i tuning af forskellige signalhændelser.
Inden for denne ramme er der nogle optiske aspekter, der skal overvejes, mens du bygger svFCS-opsætningen for at optimere fotonbudgettet og minimere optiske afvigelser. Derfor anbefaler vi at bruge et mikroskop, hvorfra rørlinsen kan fjernes, når svFCS-målingen udføres. Desuden spiller en enkelt iris en nøglerolle i svFCS-opsætningen: den ændrer strålestørrelsen ved målets bageste blænde og varierer dermed direkte den effektive taljestørrelse (dvs. det effektive excitationsvolumen). Bjælkediameteren skal passe til den objektive bage pupil for at opnå den mindste taljestørrelse34. Denne mulighed, som hjælper med at indstille taljestørrelsen, sikrer optimering af fotonbudgettet og er let at implementere. Endelig anvendes et minimalt antal optiske dele langs lysstien; jo mindre komplekst systemet er, jo færre fotoner går tabt. Alle disse muligheder forbedrer robustheden af svFCS-eksperimenter betydeligt.
Med hensyn til selve protokollen skal et par kritiske trin overvejes. Det vigtigste er en passende justering af de optiske stier, der er afgørende for vellykkede svFCS-målinger (protokol, afsnit 2). Dette er let at kontrollere ved at analysere fluorescenssignalet fra en 2 nM Rh6G-opløsning, som skal være ~ 200 kHz under 300 μW laserbelysning. Alle iriser skal åbnes, og ACF’erne skal have en vigtig amplitude (typisk G0 ~ 1,5-2,0). Et andet kritisk punkt vedrører cellerne og deres forberedelse til svFCS-analyse (protokol, afsnit 4-8). Deres massefylde skal tilpasses, således at isolerede celler, der skal observeres, er tilgængelige til analyse. Ikke-klæbende celler skal immobiliseres på et kammerdækselglas ved anvendelse af poly-L-lysinopløsning. Fluorescenssignalet fra cellemærkning bør ikke være for stærkt, eller det vil resultere i meget flade ACF’er, der er vanskelige at passe, og tilpasningsparametrene er belastet med en vigtig fejl. Derudover gør ikke-homogen mærkning og fluorescensaggregater i celler svFCS-målingerne ekstremt vanskelige at fortolke. Endelig påvirker kolesteroloxidasebehandling cellelevedygtighed, og svFCS-analysen bør ikke overstige en time efter behandlingen. Det er også bedre at registrere fluorescensfluktuationerne fra den øvre plasmamembran, da den ikke er fastgjort til understøtningen, og der er ingen risiko for hindret diffusion af molekyler på grund af de fysiske interaktioner med understøtningen.
Der har været nok fremskridt i svFCS-teknikken til dens anvendelse i forskellige tilgange på grund af mangfoldigheden af modaliteter til justering af detektionsvolumenet, hvilket gør det muligt at studere forskellige biologiske processer i levende celler. Et alternativ til at justere størrelsen på excitationsvolumenet er at bruge en variabel stråleudvidelse35. Det er også muligt blot at modulere størrelsen af belysningsområdet ved at registrere det fluorescerende signal fra skæringspunktet af plasmamembranen langs z-retningen36. Dette kan gøres på et standard konfokalt mikroskop, for hvilket der er udviklet en teoretisk ramme for at udlede diffusionsloven37,38.
Selvom svFCS-metoden tilbyder spatio-temporal opløsning, hvilket er nødvendigt for karakteriseringen af plasmamembranens inhomogene laterale organisation, udelukker de geometriske indeslutningsformer ikke hinanden. En afvigelse på t0 i den ene eller den anden retning afslører udelukkende en dominerende indeslutningsmåde25. Desuden skyldes en anden vigtig begrænsning af den nuværende svFCS-metode den klassiske optiske diffraktionsgrænse (~ 200 nm). Dette er utvivlsomt større end de domæner, der begrænser molekylerne i celleplasmamembranen. Derfor udledes analysen af indespærringen af t0-værdien , ekstrapoleret fra diffusionsloven.
Denne ulempe er blevet overvundet ved at implementere alternative metoder. Oprindeligt gav brugen af metalliske film boret med nanoaperturer mulighed for at belyse et meget lille membranområde (dvs. under den optiske diffraktionsgrænse for enkelte nanometriske åbninger af radier, der varierer mellem 75 og 250 nm)39. Overgangsregimet forudsagt fra den teoretiske diffusionslov for isoleret domæneorganisation blev således rapporteret, og det tillod en forfining af den karakteristiske størrelse af de nanometriske membran heterogeniteter og et kvantitativt skøn over overfladearealet optaget af lipidafhængige nanodomæner39. Alternativt er nanometrisk belysning også udviklet ved hjælp af nærfeltsscanning optisk mikroskopi40 eller plane optiske nanoantennas41. For nylig har kombinationen af stimuleret emissionsudtømning (STED) og FCS givet et kraftfuldt og følsomt værktøj til at dokumentere diffusionsloven med meget høj rumlig opløsning. Denne STED-FCS giver adgang til molekylære diffusionsegenskaber på nanoskala, der forekommer inden for en kort periode, hvilket muliggør undersøgelsen af den dynamiske organisering af lipidprober ved plasmamembranen42,43. Den ufuldstændige undertrykkelse af fluorescens i STED-processen udfordrer imidlertid analysen af autokorrelationskurverne i FCS.
En ny tilpasningsmodel er blevet udviklet for at overvinde denne vanskelighed og forbedre nøjagtigheden af diffusionstiderne og de gennemsnitlige molekyletalsmålinger44. Endelig kan svFCS-princippet anvendes til langsom molekylær diffusion ved plasmamembranen på data registreret ved billedkorrelationsspektroskopi45. For nylig er det blevet påvist, at kombination af atomkraftmikroskopi (AFM) med billeddannelse af total intern refleksion-FCS (ITIR-FCS) bidrager til forfining af arten af den mekanisme, der hindrer molekylær diffusion ved plasmamembranen, især nær perkolationstærskelmembrankonfigurationen på grund af en høj densitet af nanodomæner46.
Afslutningsvis har etablering af diffusionslov af svFCS givet det eksperimentelle bevis for at udlede lokal heterogenitet skabt af dynamiske kollektive lipider og membranproteiners foreninger. Som anført af Wohland og kolleger46, “FCS diffusion lov analyse forbliver et værdifuldt værktøj til at udlede strukturelle og organisatoriske træk under opløsningsgrænsen fra dynamisk information”. Alligevel er vi nødt til at udvikle nye modeller for at forfine fortolkningen af diffusionsloven, der skal give mulighed for en bedre forståelse af dynamikken i de molekylære begivenheder, der forekommer ved plasmamembranen.
The authors have nothing to disclose.
SB, SM og DM blev støttet af institutionel finansiering fra CNRS, Inserm og Aix-Marseille Universitet og programtilskud fra det franske nationale forskningsagentur (ANR-17-CE15-0032-01 og ANR-18-CE15-0021-02) og det franske “Investissement d’Avenir” (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). KW anerkender “BioTechNan”, et program med tværfaglige miljødoktorale studier KNOW inden for bioteknologi og nanoteknologi. EB anerkender den økonomiske støtte fra Polens nationale videnskabscenter (NCN) under projekt nr. 2016/21/D/NZ1/00285 samt den franske regering og Frankrigs ambassade i Polen. MŁ anerkender den økonomiske støtte fra det polske udviklingsministerium (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) og det nationale center for forskning og udvikling (Innochem POIR.01.02.00-00-00-0064/17). TT anerkender økonomisk støtte fra National Science Center of Poland (NCN) under projekt nr. 2016/21/B/NZ3/00343 og fra Wroclaw Biotechnology Center (KNOW).
Aligment tool | Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings | Thorlabs | SPW602 |
Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM) | Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode | Excelitas | SPCM-AQRH-15 |
BNC 50 Ω plug to 50 Ω plug lead 2 m | RS Components | 742-4315 | |
Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 Ω With connector, 1.22 m, RoHS2 | RS Components | 885-8172 | |
Tee 50Ω RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 → 1GHz | RS Components | 546-4948 | |
Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E – French Extension Lead, 230 V | RS Components | 768-5500 | |
Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C | RS Components | 452-8394 | |
Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter | RS Components | 792-4079 | |
Fluorescence filtering | 535/70 ET Bandpass, AOI 0° Chroma Diameter 25 mm | AHF filter | F47-539 |
Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45° Chroma 25.5 x 36 x 1 mm | AHF filter | F43-088 | |
496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0° Chroma Diameter 25 | AHF filter | F37-496 | |
Hardware correlator | 80 MHz Digital Correlator | Correlator.com | Flex02-12D |
Laser | LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW | Lasos | BLD-XT 488100 |
Laser safety | High-Performance Black Masking Tape, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Roll | Thorlabs | T743-2.0 |
Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets | Thorlabs | MC-5 | |
Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission | Thorlabs | LG3B | |
Microscope | Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters |
Carl Zeiss | |
C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS (D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR |
Carl Zeiss | 421767-9971-711 | |
Adapter W0.8 / M27x0.75 H "5" | Carl Zeiss | 000000-1698-345 | |
Middle ring W0.8 – W0.8 H "5" | Carl Zeiss | 000000-1698-347 | |
Optical path | D25.4mm Mirror, Protected Silver | Thorlabs | PF10-03-P01 |
D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat | Thorlabs | AC254-060-A | |
D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat | Thorlabs | AC254-035-A | |
25 µm mounted pinhole | Thorlabs | P25S I | |
25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm | Thorlabs | WPH10M-488 (HWP) | |
20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm | Thorlabs | PBS201 | |
Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID | Thorlabs | RSP1/M | |
52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount | Thorlabs | KM100B/M | |
Adjustable Prism Clamp | Thorlabs | PM3/M | |
Beam block – active area 19 mm x 38 mm | Thorlabs | LB1/M | |
Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture | Thorlabs | ID25/M | |
Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount | Thorlabs | KM100CL | |
1" Optic Holder, M4 Tap | Thorlabs | MFF101/M | |
1" Stackable Lens Tube | Thorlabs | SM1L03 | |
Stackable Lens Mount for 1" optic-usable depth ½ | Thorlabs | SM1L05 | |
Stackable Lens Mount For 1"Optic-usable Depth 2" | Thorlabs | SM1L20 | |
Small Optical Rails 600mm, metric | Thorlabs | RLA600/M | |
Small Optical Rails 75mm, metric | Thorlabs | RLA075/M | |
Small Optical Rails 150mm, metric | Thorlabs | RLA150/M | |
Rail Carrier, Counterbored Hole 1"x 1" | Thorlabs | RC1 | |
Rail Carrier, Perpendicular Dovetail | Thorlabs | RC3 | |
High Precision Translating Lens Mount for 1 inch | Thorlabs | LM1XY/M | |
½ " (12mm) Dovetail Translation Stage | Thorlabs | DT12/M | |
Rail Clamps | Thorlabs | CL6 | |
Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102) | Thorlabs | PT3/M | |
Black Rubberized Fabric | Thorlabs | BK5 | |
Ball Driver kit/ 6 tools | Thorlabs | BD-KIT/M | |
Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads | Thorlabs | AP6M4M | |
Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack | Thorlabs | BA1S/M-P5 | |
Lens Mount for 25.4mm optic | Thorlabs | LMR1/M | |
SM1 FC/APC Adapter | Thorlabs | SM1FCA | |
Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics | Thorlabs | KM100 | |
Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW | Thorlabs | S120C | |
12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=50 mm, 5 Pack |
Thorlabs | PH50/M-P5 | |
Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm | Thorlabs | PH20/M | |
12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole, 5 Pack |
Thorlabs | TR50/M-P5 | |
12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole, 5 Pack |
Thorlabs | TR75/M-P5 | |
USB Power and Energy Meter Interface | Thorlabs | PM100USB | |
12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole |
Thorlabs | TR30/M | |
12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole |
Thorlabs | TR20/M | |
750 mm long Structural Rail (detection box) | Thorlabs | XE25L750/M | |
350 mm long Structural Rail (detection box) | Thorlabs | XE25L350/M | |
Quick Corner Cube for 25 mm Rails | Thorlabs | XE25W3 | |
Right-Angle Bracket for 25 mm Rails | Thorlabs | XE25A90 | |
Black posterboard 20" x 30" (508 mm x 762 mm), 1/16" (1.6 mm) Thick, 5 Sheets | Thorlabs | TB5 | |
Hinge for 25 mm Rail Enclosures | Thorlabs | XE25H | |
Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures | Thorlabs | XE25LS | |
M4 Cap Screw Kit | Thorlabs | HW-KIT1/M | |
M6 Cap Screw Kit and Hardware kit | Thorlabs | HW-KIT2/M | |
Table Clamp, L-Shape, 5 Pack | Thorlabs | CL5-P5 | |
SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (Ø0.8 – Ø12 mm) | Thorlabs | SM1D12D | |
Ø1" SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/Ø1 mm Hole | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | |
Honeycomb Optical Table Top, Standa | Standa | 1HB10-15-12 | |
Optical Table support, Standa | Standa | 1TS05-12-06-AR | |
Sample nano-positionning | Precision XYZ Nanopositioning | Physik Instrumente | PI P527-3.CD |
Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors, |
Physik Instrumente | PI E727-3.CD | |
Temperature chamber | Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK | Digital Pixel | |
Dual Channel Microprocessor Temperature Controller | Digital Pixel | DP_MTC_2000_DUO | |
Two Vibration Free Heater Modules | Digital Pixel | DP_150_VF | |
PT100 Temperature Sensor | Digital Pixel | DP_P100_TS | |
Biological Reagents and Materials | |||
Cell culture and transfection | Cos7 cells | ATCC® | CRL-1651™ |
8- well Lab-Tek chambers | Thermo Fisher Scientific | 155411PK | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
PBS buffer | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
PenStrep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
PolyJet Transfection Reagent | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
Cholesterol content measurement | Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A12216 |
Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 87786 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78420 | |
ROTI Nanoquant Working Solution | Roth | K880 | |
GloMax Discover Microplate Reader | Promega | GM3000 | |
svFCS measurements | HBSS buffer | Thermo Fisher Scientific | 14025092 |
Hepes buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
Cholesterol oxidase | Sigma-Aldrich | C8868 | |
Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 83697-1G |