Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

مفاعل حيوي متعدد العظة لتقييم القدرة الالتهابية والتجديدية للمواد الحيوية تحت التدفق والتمدد

Published: December 10, 2020 doi: 10.3791/61824
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1, 1,2, *1,2, *1,2
1Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems (ICMS), Eindhoven University of Technology
* These authors contributed equally

Summary

الهدف من هذا البروتوكول هو تنفيذ ثقافة مشتركة ديناميكية من الضامة البشرية و myofibroblasts في سقالات كهربائية أنبوبية للتحقيق في تجديد الأنسجة التي تحركها المواد ، وذلك باستخدام مفاعل حيوي يمكن من فصل إجهاد القص والتمدد الدوري.

Abstract

استخدام المواد الحيوية القابلة للتك00 للحث على التجديد مباشرة في الجسم هو استراتيجية جذابة من منظور تحويلي. هذه المواد تحفز استجابة التهابية عند الزرع ، وهو المحرك لإعادة امتصاص المواد اللاحقة وتجديد الأنسجة الجديدة. هذه الاستراتيجية، والمعروفة أيضا باسم هندسة الأنسجة في الموقع، يتم اتباعها للحصول على بدائل القلب والأوعية الدموية مثل ترقيع الأوعية الدموية المهندسة الأنسجة. يتم تحديد كل من العمليات الالتهابية والتجددية من خلال الإشارات الميكانيكية الحيوية المحلية على السقالة (أي إجهاد التمدد والقص). هنا، ونحن نصف بالتفصيل استخدام مفاعل حيوي وضعت خصيصا التي تمكن بشكل فريد من فصل تمتد والقص الإجهاد على سقالة أنبوبي. وهذا يسمح للتقييم المنهجي والموحد للقدرة الالتهابية والتجديدية للسقالات الأنبوبية تحت تأثير الأحمال الميكانيكية التي يتم التحكم فيها بشكل جيد ، والتي نظهرها على أساس تجربة ديناميكية للثقافة المشتركة باستخدام الضامة البشرية والخلايا العضلية. وتناقش بالتفصيل الخطوات العملية الرئيسية في هذا النهج - بناء وإنشاء المفاعل الحيوي، وإعداد السقالات وبذر الخلايا، وتطبيق وصيانة تدفق التمدد والقص، وحصاد العينات للتحليل.

Introduction

هندسة أنسجة القلب والأوعية الدموية (TE) ويجري السعي كخيار علاج بديل لأطراف القلب والأوعية الدموية المستخدمة حاليا دائمة (على سبيل المثال، ترقيع الأوعية الدموية، واستبدال صمام القلب)، والتي هي دون المستوى الأمثل لأفواج كبيرة من المرضى1،2،3،4. وتشمل التطبيقات المطلوبة كثيرا بعد ترقيع الأوعية الدموية المهندسة الأنسجة (TEVGs)5و6 وصمامات القلب (TEHVs)7،8. في معظم الأحيان، تستخدم منهجيات TE القلبية الوعائية المواد الحيوية القابلة لإعادة التكثير (سواء كانت طبيعية أو اصطناعية) التي تعمل سقالة مفيدة للأنسجة الجديدة التي سيتم تشكيلها. تشكيل نسيج جديد يمكن إما أن تكون هندسية تماما في المختبر، عن طريق بذر السقالة مع الخلايا وزراعة في مفاعل حيوي قبل زرع (في المختبر TE)9،10،11، أو مباشرة في الموقع، والتي يتم زرع السقالة الاصطناعية دون زرع قبل من أجل الحث على تشكيل أنسجة جديدة مباشرة في الجسم (في الموقع TE)12،13،14. لكل من المختبر وفي الموقع نهج TE القلب والأوعية الدموية، وتجديد وظيفي ناجح يعتمد بشكل مهيمن على كل من الاستجابة المناعية المضيف لبناء مزروع وتحميل الميكانيكا الحيوية المناسبة.

أهمية التحميل الميكانيكي الحيوي لTE القلب والأوعية الدموية هو معترف به جيدا15. في حالة زراعة القلب والأوعية الدموية ، تتعرض الخلايا التي تملأ السقالة لإجهادات التمدد الدوري والقص التي تنشأ نتيجة للبيئة الدموية. وقد ذكرت العديد من الدراسات تأثير تحفيزي من (دوري) تمتد على تشكيل مكونات مصفوفة, مثل الكولاجين16,17,18,19, الجليكوسامينوجليكان (GAGs)20, والإيلاستين21,22, من قبل أنواع مختلفة من الخلايا. على سبيل المثال، أثبت هوانغ وآخرون أن امتداد ثنائي ساكسيال رفع ترسب وتنظيم الكولاجين والإيلاستين في المختبر TEVGs باستخدام مفاعل حيوي الأوعية الدموية23. في حين أن التركيز يكمن عادة على التمدد كحمل مهيمن ، فإن هذه الدراسات غالبا ما تستخدم المفاعلات الحيوية التي تحركها التدفق والتي تتعرض فيها العينة أيضا لتدفق القص. على الرغم من أنه لا يعرف سوى القليل نسبيا عن التأثير المعزول لضغوط القص على تكوين الأنسجة والالتهاب في 3D ، إلا أن بعض البيانات متوفرة. على سبيل المثال، أظهر Hinderer et al. و Eoh وآخرون أن تدفق القص، بالإضافة إلى البنية الدقيقة للسقالة ثلاثية الأبعاد، كان مهما لتشكيل الإيلاستين الناضج بواسطة خلايا العضلات الملساء الوعائية البشرية في نظام نموذج المختبر24،25. وإجمالا، توضح هذه النتائج أهمية كل من التمدد الدوري والإجهاد القصي ل TE القلبي الوعائي.

محدد مهم آخر لنجاح أو فشل يزرع TE هو استجابة المضيف المناعية للكسب غير المشروع المزروعة26. وهذا مهم بشكل خاص لاستراتيجيات TE التي تحركها المواد في الموقع ، والتي تعتمد في الواقع على الاستجابة الالتهابية الحادة للسقالة لبدء العمليات اللاحقة لتدفق الخلايا وتشكيل الأنسجة الذاتية وإعادة عرض27. الماكروفاج هو البادئ الحاسم لتجديد الأنسجة الوظيفية، والتي أظهرتها دراسات متعددة28،29،30. مماثلة لتضميد الجروح، ويحكم تجديد الأنسجة من قبل إشارات الباراكورين بين الضامة والخلايا المنتجة للأنسجة مثل الخلايا الليفية والخلايا العضليةالليفية 31،32،33. بالإضافة إلى تنسيق ترسب الأنسجة الجديدة ، وتشارك الضامة في ارتشاف نشط من المواد سقالة الأجنبية34،35. على هذا النحو ، تم تحديد استجابة الضامة في المختبر للمواد الحيوية كمعلمة تنبؤية لنجاح الجسم الحي للغرسات36و37و38.

تعتمد استجابة الضامة على السقالة المزروعة على ميزات تصميم السقالات مثل تكوين المواد والبنية المجهرية35و39و40. بالإضافة إلى خصائص السقالة ، تتأثر استجابة الضامة إلى سقالة ومكائدها المتقاطعة مع الخلايا الميوفيبروبلاست أيضا بالأحمال الديناميكية الدموية. على سبيل المثال، تبين أن امتداد دوري هو المغير المهم للنمط الظاهري الضام41،42،43،44 وإفراز السيتوكينات43،44،45،46 في سقالات كهربائية ثلاثية الأبعاد. باستخدام نظام الثقافة المشتركة من الضامة وخلايا العضلات الملساء الوعائية، أظهر باتيستون وآخرون أن وجود الضامة أدى إلى زيادة مستويات الإيلاستين وGAGs وأن المستويات المعتدلة من الامتداد الدوري (1.07-1.10) حفزت ترسب الكولاجين I والإيلاستين47. في الأعمال السابقة، لقد أثبتنا أن الإجهاد القص هو محدد مهم للتجنيد monocyte في سقالات electrospun 3D48،49،وأن كلا من الإجهاد القص وتمتد دوري تؤثر على الإشارات الباراترين بين الخلايا الأحادية البشرية والخلايا النجمية mesenchymal50. أظهر فاهي وآخرون أن تدفق القص زاد من إفراز السيتوكينات المؤيدة للالتهابات بواسطة الخلايا الأحادية البشرية51.

إذا أخذنا معا، فإن الأدلة المذكورة أعلاه تظهر أن الفهم الكافي للأحمال الديناميكية الدموية والتحكم فيها أمر بالغ الأهمية ل TE القلب والأوعية الدموية، وأنه من المهم النظر في الاستجابة الالتهابية لتحقيق ذلك. وقد وصفت العديد من المفاعلات الحيوية سابقا للمزود في المختبر52،53،54،55،56،57،58 أو ex vivo59،60،61 ثقافة أنسجة القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك، تم تصميم جميع هذه الأنظمة لمحاكاة ظروف التحميل الهيمودية الفسيولوجية قدر الإمكان. في حين أن هذا هو قيمة للغاية لغرض خلق أنسجة القلب والأوعية الدموية في المختبر أو الحفاظ على الثقافات الجسم الحي السابق، مثل هذه النظم لا تسمح لدراسات منهجية في الآثار الفردية للإشارات الفردية. وذلك لأن تطبيق كل من التمدد الدوري والإجهاد القص في هذه المفاعلات الحيوية مدفوعة بنفس التدفق المضغوط ، الذي يربط بينهما في جوهره. في حين تم وصف النظم الدقيقة التي تسمح للتلاعب الميكانيكية متعددة جديلة دقيقة لركائز 2D62 أو 3D هيدروجيل الاجهزة63،64، مثل هذه الاجهزة لا تسمح لدمج السقالات 3D elastomeric المواد الحيوية.

هنا، نقدم تطبيق نظام المفاعل الحيوي أنبوبي التي تمكن بشكل فريد من فصل الإجهاد القص وتمتد دوري ويساعد على التحقيق ميكانيكيا آثارها الفردية والمجمعة. يسمح هذا النظام باختبار مجموعة واسعة من ترقيع الأوعية الدموية المهندسة للأنسجة (على سبيل المثال ، المنشأ الاصطناعي أو الطبيعي ، والهندسة المعمارية الدقيقة المختلفة ، والمساميات المختلفة). لفصل فعال تطبيق الإجهاد القص وتمتد، والمفاهيم الرئيسية التي يستخدمها المفاعل الحيوي هي (1) فصل السيطرة على الإجهاد القص وتمتد باستخدام أنظمة مضخة متميزة و (2) تحفيز السقالات بطريقة "من الداخل إلى الخارج" مع أبعاد مدفوعة حسابيا. يتم تطبيق التدفق على السطح الخارجي للسقالة الأنبوبية من خلال استخدام مضخة تدفق ، في حين يتم حث الامتداد المحيطي للسقالة عن طريق توسيع أنبوب السيليكون الذي يتم تركيب السقالة عليه من خلال استخدام مضخة إجهاد منفصلة. يتم اختيار أبعاد أنبوب السيليكون وأنبوب الزجاج الذي يحتوي على البناء بعناية والتحقق من صحتها باستخدام محاكاة ديناميات السوائل الحسابية ، لضمان أن إجهاد القص على السقالة (بسبب التدفق) والتمدد المحيطي (بسبب توسع الأنبوب) لا يؤثران بشكل كبير على بعضهما البعض. هذا التصميم من الداخل إلى الخارج له عدة مبررات عملية. إذا تم تطبيق التمدد بواسطة ضغط السائل الإنارة (على غرار التحميل الفسيولوجي) ، فإنه يتطلب بطبيعته تصميم العينة لتكون خالية من التسرب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الضغط المطلوب لتمديد العينة سيتم تحديده بالكامل من خلال صلابة العينة ، والتي قد تختلف بين العينات وداخل عينة مع مرور الوقت ، مما يجعل من الصعب التحكم في الامتداد. هذا المفاعل الحيوي يتصاعد الكسب غير المشروع الأنسجة المهندسة حول أنبوب السيليكون ويسمح لتطبيق الإجهاد القص الجدار (WSS) على الجدار الخارجي للكسب غير المشروع ويضغط على الكسب غير المشروع من الداخل. وبهذه الطريقة ، يمكن ضمان ظروف تحميل متساوية بين العينات وداخل العينات مع مرور الوقت ، وعلاوة على ذلك ، يسمح للعينات بأن تكون متسربة ، كما هو شائع للسقالات الوعائية المسامية19. يهدف هذا المفاعل الحيوي من الداخل إلى الخارج على وجه التحديد لإجراء دراسات منهجية حول آثار القص و / أو التمدد ، بدلا من هندسة وعاء دموي يشبه الأم في المختبر ، والذي تكون أجهزة المفاعل الحيوي الوعائية التقليدية أكثر ملاءمة له. انظر الشكل 1ألف - باء للاطلاع على رسومات تصميم المفاعل الحيوي، والجدول 1 المقابل له للحصول على وصف وظيفي ومنطقي وراء المكونات الرئيسية للمضبر الحيوي.

ويتجلى استخدام المفاعل الحيوي على أساس سلسلة من الدراسات الحديثة من قبل مجموعتنا التي قمنا بالتحقيق في التأثيرات الفردية والمجمعة من إجهاد القص وتمتد دوري على الالتهاب وتشكيل الأنسجة في سقالات electrospun قابلة لإعادة التكهرب في الموقع أنسجة القلب والأوعية الدموية19،43،44. وتحقيقا لتلك الإنسان الضامة والخلايا الميوفيبرومية إما في أحادية أو في ثقافة مشتركة لمحاكاة مختلف مراحل سلسلة التجدد في الموقع. لقد أثبتنا أن إفراز السيتوكين بواسطة الضامة البشرية يتأثر بشكل واضح بكل من التمدد الدوري والإجهاد القصي ، مما يؤثر على ترسب المصفوفة وتنظيمها من قبل الخلايا العضلية البشرية في هذه السقالات ، سواء عن طريق إشارات الباراكورين والاتصال المباشر19،43،44. وتجدر الإشارة إلى أن هذه الدراسات كشفت أنه في حالة التطبيق المشترك للإجهاد القص وتمتد، والآثار على تشكيل الأنسجة والتهاب إما تهيمن عليها واحدة من اثنين من الأحمال، أو هناك آثار التآزر من كلا الأحمال. توضح هذه النتائج أهمية فصل كلا الحمولتين للحصول على فهم أفضل لمساهمة البيئة الميكانيكية في عمليات TE. ويمكن تطبيق هذا الفهم لتحسين منهجي المعلمات تصميم سقالة في أنظمة التحميل الحيوية ذات الصلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن البيانات الآلية المستمدة من هذه البيئات التي تسيطر عليها سيطرة جيدة قد تكون بمثابة مدخلات للنماذج العددية التي يجري تطويرها للتنبؤ بمسار إعادة عرض الأنسجة في الموقع، كما ورد مؤخرا بالنسبة ل TEVGs65 أو TEHVs66،لزيادة تحسين القدرة التنبؤية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

في الدراسات الموصوفة في هذا البروتوكول، تم استخدام الضامة البشرية الأولية المعزولة عن معاطف برتقالي الدم المحيطي والخلايا الميوفيبروبلاست البشرية المعزولة عن الوريد الشافيني بعد جراحة المرور الشرياني التاجي44. تم الحصول على المعاطف بافي من صحية، والمتطوعين مجهولي الهوية الذين قدموا موافقة خطية مستنيرة، والتي وافقت عليها اللجنة الأخلاقية الطبية المؤسسية للبحوث Sanquin. وكان استخدام خلايا الفينا النسينا البشرية (HVSCs) وفقا ل "قانون الاستخدام الثانوي السليم للأنسجة البشرية" الذي وضعه اتحاد الجمعيات الطبية في هولندا.

1. الاستعدادات العامة والإجراءات المطلوبة قبل إنشاء المفاعل الحيوي

ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول بروتوكولات العزل والاستزراع الخاصة بها، يرجى الرجوع إلى العمل السابق19،43،44. وترد جميع الحسابات في البروتوكول كأمثلة لتجربة الثقافة المشتركة مع monocytes و myofibroblasts، المصنف في 8 سقالات محملة بشكل ديناميكي و2 ضوابط ثابتة (ن = 10).

  1. بدء عزل الخلايا وثقافة الخلايا. كثافة البذر للعينات المستزرعة المشتركة من monocytes و myofibroblasts (مع نسبة البذر من 2:1) هي 30 × 106 monocytes / سم3 و 15 × 106 myofibroblasts / سم3، على التوالي.
    ملاحظة: المواد electrospun له المسامية عالية (>90٪). لتقدير العدد المطلوب من الخلايا لكل الكسب غير المشروع، يتم حساب حجم السقالة مع صيغة لحجم اسطوانة جوفاء: π *(سمك)2* طول ≈ 0.04 سم3. المبلغ الإجمالي للخلايا في الكسب غير المشروع هو 1.2 × 106 monocytes و 0.6 × 106 الخلايا العضلية. وبالنسبة إلى 10 عينات، يلزم ما لا يقل عن 12 ×10 6 بويضات و6 ×10 6 من الخلايا العضلية الليفية؛ تبدأ مع ما يصل إلى ~ 10-15٪ خلايا أكثر لحساب الأخطاء المحتملة pipetting.
  2. ديغا وسيلة ثقافة الخلية التي سيتم استخدامها للتجارب التي تنطوي على المفاعل الحيوي.
    1. إعداد المتوسطة للثقافات المشتركة، والتي تتكون من RPMI-1640:aDMEM (1:1)، تكملها مع 10٪ مصل البقر الجنيني، 1٪ البنسلين-streptomycin و 0.5٪ L-الجلوتامين.
    2. ضع الوسط بين عشية وضحاها (O/N) في حاضنة في قارورة ثقافة الخلية مع غطاء فلتر إلى ديغا.
    3. استبدل غطاء الفلتر بغطاء محكم الهواء وخزنه عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    4. قبل الاستخدام مباشرة، أضف 0.25 ملغم/مل من حمض الأسكوربيك 2-فوسفات (فيتامين ج) إلى الوسط.
      ملاحظة: بالنسبة للحسابات، يبلغ مقدار الوسيط المطلوب لكل غرفة ثقافة تدفق 50 مل. تحديث المتوسط ثلاث مرات في الأسبوع; يتم استبدال 25 مل المتوسطة القديمة من قبل 25 مل المتوسطة الطازجة. ل 10 عينات; بعد البذر، مطلوب ما مجموعه 500 مل المتوسطة الطازجة، ولكل تغيير متوسط لاحق، يتم استخدام ما مجموعه 250 مل المتوسطة الطازجة. دائما إعداد متوسطة الطازجة، وخاصة، ينبغي إضافة فيتامين (ج) فقط قبل تغيير المتوسطة.
  3. إعداد سقالات electrospun متساوية الخواص (قطرها 3 مم مضيئة، 200 ميكرومتر سماكة الجدار) كما وصفها فان هافتن وآخرون.19 (الشكل 1G-I). باختصار، يتم إنتاج سقالات البوليكابرولاكتون الأنبوبي (PCL-BU) عن طريق التكروسبينينج من حلول الكلوروفورم البوليمرية بنسبة 15٪ (ث/ث). حلول البوليمر هي electrospun في درجة حرارة الغرفة والرطوبة النسبية 30٪، بمعدل تدفق 40 ميكرولتر / دقيقة، 16 سم المسافة من الهدف الأسطواني الدورية (Ø 3 ملم، 500 دورة في الدقيقة)، والجهد التطبيقي من 16 كيلو فولت على فوهة كهربائية و-1 كيلو فولت على الهدف.
    ملاحظة: على الرغم من استخدام ترقيع PCL-BU لهذه التجارب، يمكن تركيب مجموعة واسعة من الطعوم المهندسة للأنسجة الإيلاستومية في هذا المفاعل الحيوي (على سبيل المثال، من أصل اصطناعي أو طبيعي مختلف، وهندسة مصغرة مختلفة، و مساميات مختلفة)
    1. إزالة السقالات الكهربائي من mandrel.
      1. جعل ثقب صغير في غطاء أنبوب 15 مل ل 'عقد' mandrel في المركز ومنعه من لمس جدار الأنبوب.
      2. ضع المندول مع سقالة الكهربائي في أنبوب الصقر وملئه بالماء deionized.
      3. تجميد أنابيب O / N في -20 درجة مئوية.
      4. ضع الأنابيب في درجة حرارة الغرفة (RT) وسحب الماندريل بعد بضع دقائق ، وترك الطعوم الكهربائي في الجليد.
      5. دع الجليد يذوب تماما ، وأزل أنبوب الكهربائي من الماء المذاب ، و لتجف عموديا لعدة ساعات. تأكد من أن السقالات لا "تنهار" تحت وزنها.
    2. السقالات الجافة تحت فراغ O / N.
    3. صورة عينة صغيرة من الطعوم electrospun باستخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM) لتقييم هيكلها المجهري (على سبيل المثال، مورفولوجيا الألياف، قطر الألياف). الطعوم في دراسات المثال لديها اتجاه الألياف متساوي الخواص وقطر الألياف من 5 ميكرومتر(الشكل 1H-I).
  4. قبل يوم واحد من بدء التجربة، ضع الخزان الهيدروليكي المليء بالمياه المتأينة في الحاضنة. أغلق جميع الاتصالات الثمانية لغرف ثقافة التدفق بقبعات Luer البيضاء. الاتصال بنظام الهواء المضغوط وإدراج مستشعر الضغط. تشغيل مضخة سلالة (انظر الخطوة 5.6) O / N للسماح للتوسع صغيرة من خوار تفلون.
    ملاحظة: تأكد من تنظيف جميع المواد والمعدات الضرورية و/أو تعقيمها تلقائيا (راجع جدول المواد، عمود التعليقات / الوصف الذي يسمح بتعقيم المواد تلقائيا) ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة أو كما هو موضح في الخطوات 7.3-7.6.
  5. ضمان ظروف عمل معقمة لبقية البروتوكول.
    1. قم بتنفيذ الخطوات 2-5.3 (إعداد النظام)، والخطوة 6.3 (التغيير المتوسط)، والخطوات 7.1-7.2 (حصاد بنيات الأوعية الدموية) في خزانة تدفق صفح معقمة.
    2. ضع المواد التي لا تحتاج إليها مباشرة للخطوات اللاحقة في أطباق بيتري المغلقة للحفاظ على كل شيء نظيف قدر الإمكان.
    3. أسطح المواد النظيفة أو الجافة بانتظام عن طريق نقع نسيج ورقي مع الإيثانول 70٪، ومسح أسطح مكونات المفاعل الحيوي وخزانة تدفق صفح.

2. إعداد المفاعل الحيوي

ملاحظة: تنفيذ الخطوة 2 في خزانة تدفق صفح.

  1. قطع السقالات electrospun في أنابيب من حوالي 25 ملم في الطول، وتوثيقها قبل الاستخدام (على سبيل المثال، صورة للطول، تزن مع التوازن للكتلة الأولية).
  2. إزالة التلوث من السقالات الكهربائية.
    1. ضع السقالات الكهربائي إمالة في لوحة بئر أو طبق بيتري ، مع فتحة واحدة تواجه مصدر الضوء فوق البنفسجي (UV) ، لتمكين الأشعة فوق البنفسجية (253.7 نانومتر) لإلقاء الضوء على داخل السقالات.
    2. تعريض السقالات electrospun للأشعة فوق البنفسجية لمدة 5 دقائق.
    3. بدوره جميع السقالات وتكرار الإضاءة للأشعة فوق البنفسجية لفتحة أخرى.
      ملاحظة: بعد هذه الخطوة، المس سقالة الكهرسبون فقط عند الحاجة. استخدم دائما ملاقط نظيفة أو قفازات نظيفة.
    4. خذ الأنابيب الزجاجية لغرف ثقافة التدفق التي يتم تخزينها في 70٪، واغسل الأنابيب الزجاجية في المياه فائقة النبع، وجافة، ووضعها في طبق بيتري كبير مغلق.
      ملاحظة: الخطوات التالية، وخاصة الخطوات 2.3-2.5، يتم تنفيذها بشكل مثالي من قبل اثنين من المجربين.
  3. قم بتركيب سقالات الكهرسبون على أنابيب السيليكون.
    1. إرفاق خياطة البرولين 5-0 إلى نهاية واحدة من أنابيب السيليكون عن طريق اتخاذ خياطة من خلال جانب واحد من الأنبوب والخروج من الآخر، وترك اثنين من الغرز مشدود المعاكس تمتد المقطع العرضي من الأنابيب. جعل عقدة صغيرة على كلا الجانبين من الأنبوب في حين ضغط أنبوب في مكان عقدة وترك ما يقرب من 10 سم من الأسلاك على كل عقدة. جعل عقدة ثالثة في نهاية اثنين من 10 سم من الأسلاك المتبقية.
      1. قطع إبرة خياطة وجميع المواضيع الحرة التي قد التمسك بها وتلف داخل سقالة electrospun. قطع حواف أنابيب السيليكون في شكل مثلث للمساعدة في سحب أنابيب السيليكون من خلال سقالة electrospun.
    2. تراجع سقالة electrospun في الإيثانول 30 ٪ (وهذا بمثابة خطوة إزالة التلوث اضافية ويساعد في انزلاق سقالة electrospun على أنابيب السيليكون) ووضع سقالة electrospun على سلك 10 سم مجانا. المجرب A تمتد أنابيب السيليكون عن طريق سحب بلطف على كل من أنابيب السيليكون وعقدة من سلك خياطة 10 سم، في حين أن المجرب B الشرائح بلطف سقالة electrospun على أنابيب السيليكون باستخدام ملاقط مع طرف داخلي سلس لمنع إتلاف السقالات.
    3. حرر ببطء امتداد على أنابيب السيليكون، في حين تنعيم في وقت واحد سقالة electrospun مع ملاقط. تراجع سقالة electrospun على أنابيب السيليكون في المياه فائقة البور مرتين.
      ملاحظة: من الممكن أن يحدث بعض التجاعيد من سقالة electrospun. هذا تجعد سوف تختفي خلال تطبيق ما قبل تمتد الحق قبل تحديد السقالات إلى قنوات الضغط في الخطوة 2.5.3.
    4. كرر الخطوتين 2.3.2 و 2.3.3 للسقالات الكهربائي الأخرى. اعتمادا على طول أنابيب السيليكون، يمكن تركيب سقالات كهربائية متعددة على نفس أنابيب السيليكون.
    5. عندما يتم تركيب جميع السقالات electrospun على أنابيب السيليكون، وقطع أنابيب السيليكون حول السقالات، وكلها لنفس الطول (5.5 سم)؛ في جانب واحد، على مقربة من نهاية سقالة electrospun، في الجانب الآخر، وترك ~ 2-3 سم من أنابيب السيليكون مجانا.
  4. بناء المقصورة السفلية من غرفة ثقافة التدفق(الشكل 1A-B).
    1. خذ الجزء العلوي من المقصورة السفلية التي تحتوي على منفذ التدفق، وقم بإغلاق منفذ التدفق بقابس Luer ذكر.
    2. دفع قناة الضغط مع ثقوب من خلال المقصورة السفلية، ووضع سيليكون O-حلقة حول الطرف السفلي من قناة الضغط لمنع التسرب. المسمار الجزء السفلي من المقصورة السفلية إلى الجزء العلوي من المقصورة السفلي لتأمين قناة الضغط. تأكد من أن الأخدود المحفور السفلي من قناة الضغط هو تقريبا 3-5 مم فوق حافة محول بوشينج من المقصورة السفلية; هذا سوف في وقت لاحق 'عقد' عقدة ضيقة من سلك خياطة، وتحديد سقالة electrospun على أنابيب السيليكون.
      ملاحظة: إذا كان يمكن بسهولة المناورة قناة الضغط صعودا وهبوطا، فإنه يشير إلى أن المقصورة السفلية ليست مؤمنة بشكل جيد. كرر الخطوة 2.4.2 لمنع التسرب في مراحل لاحقة(الشكل 2D).
  5. تأمين أنابيب السيليكون مع سقالة electrospun إلى قناة الضغط.
    1. سحب أنبوب السيليكون مع سقالة electrospun على قناة الضغط.
    2. جعل عقدة مع سلك خياطة في الطرف السفلي من سقالة electrospun في موقع الأخدود محفورة على قناة الضغط. جعل عقدة ثانية في الجانب الآخر لتأمين بإحكام أنابيب السيليكون مع الكسب غير المشروع electrospun.
      تنبيه: هذه خطوة حاسمة. تأكد من أن العقدة بالضبط "تقع" في الأخدود المحفور من قناة الضغط لمنع تسرب المياه من الخزان الهيدروليكي إلى غرف ثقافة التدفق. إذا لم يكن متأكدا، في محاولة لتشديد سلك خياطة في عدة مواقع، فوق أو تحت الموقع المتوقع من الأخدود، لضمان أن العقدة النهائية هي بالضبط في الأخدود محفورة (الشكل 2A).
    3. ضع المشبك المقص في الطرف العلوي من أنبوب السيليكون ، ومد أنابيب السيليكون إلى الأعلى (وهذا سيختبر مباشرة العقدة الأولى ، إذا كان من الممكن تحريك أنابيب السيليكون مع سقالة electrospun فوق قناة الضغط ، لم يتم تشديدها بشكل جيد بما فيه الكفاية). مع قوة السحب، أنابيب السيليكون هي ما قبل امتدت. لضمان أن أنابيب السيليكون متسقة بين العينات المختلفة، قم بإرفاق مسطرة بمشبك المقص. سحب المشبك مقص صعودا حتى الطرف السفلي من المسطرة تصل إلى ارتفاع الطرف السفلي من السقالة.
      ملاحظة: من المهم الحفاظ على ما قبل التمدد في كل عينة تقريبا نفس (~ 5٪) لسببين: (1) إذا كانت أنابيب السيليكون ممتدة مسبقا، فإنها ستؤدي إلى توسع أكثر تجانسا على طول العينة عند الضغط عليها. (2) فإن ما قبل تمتد تؤثر على الخصائص الميكانيكية للسيليكون، وبالتالي ينبغي أن يكون هو نفسه عبر جميع العينات لضمان ظروف تمتد على قدم المساواة بين العينات.
    4. إزالة التجاعيد في سقالة electrospun عن طريق سحب بلطف على سقالة electrospun. مرة أخرى، وجعل عقدة اثنين في كلا الجانبين مع سلك خياطة على الطرف العلوي من السقالة في موقع الأخدود محفورة العلوي على قناة الضغط.
    5. الإفراج عن المشبك مقص، وقطع بعيدا الزائدة من أنابيب السيليكون بسكين، وترك 20-30٪ من الخيط المسمار مغطاة أنابيب السيليكون، لمنع التسرب عندما يتم تركيب مخروط الأنف على الخيط المسمار.
      ملاحظة: كرر الخطوتين 2.4 و 2.5 لكافة العينات الحيوية.
    6. لعينات التحكم الثابتة، قم بتأمين سقالة الكهرسبون المثبتة على أنابيب السيليكون على قنوات الضغط دون ثقوب. يمكن الاحتفاظ بهذه القنوات بشكل منفصل في أنبوب 15 مل حتى البذر (الخطوة 4) ولا تحتاج إلى تركيبها في مقصورات غرفة ثقافة التدفق.
  6. إزالة التلوث من غرف ثقافة التدفق التي شيدت جزئيا مع سقالة electrospun عن طريق تعريضه للأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق. بدوره غرف ثقافة تدفق مع السقالات electrospun إلى الجانب الآخر، وتكرار التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة.
  7. المسمار المخاريط الأنف على الخيط المسمار من قنوات الضغط مع ثقوب للعينات الحيوية.
    1. تأكد من أن الطرف العلوي من أنابيب السيليكون يناسب مخروط الأنف لمنع التسرب في مراحل لاحقة. إذا كان هناك الكثير من أنابيب السيليكون، وقطع الزائدة من أنابيب بعيدا بسكين.
    2. ضع غرف ثقافة التدفق التي تم بناؤها جزئيا في طبق بيتري كبير ، ونقطة مخروط الأنف نحو مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تطبيق الإضاءة فوق البنفسجية لمدة 5 دقائق.
  8. البناء الكامل لغرفة ثقافة التدفق مع الأنبوب الزجاجي والمقصورة العلوية لغرفة ثقافة التدفق(الشكل 1A-B).
    1. قبل الرطب السقالات electrospun عن طريق غمس قناة الضغط مع أنابيب السيليكون وسقالة electrospun في الإيثانول 30٪، تليها تراجع في المياه فائقة الشراء مرتين.
    2. ضع الأنبوب الزجاجي فوق قناة الضغط، وادفع برفق في المقصورة السفلية وآمنه برفق.
    3. خذ المقصورة العلوية التي تحتوي على مدخل التدفق ، ضع حلقة O السيليكون ، ومستقيم التدفق ، ومحول الأدغال بالترتيب الصحيح(الشكل 1A-B)، ووضعها على الطرف المفتوح للأنبوب الزجاجي وتأمينها بلطف.
    4. المسمار قبعة لوير بيضاء على مدخل تدفق المقصورة العلوية.
    5. قم بإزالة قابس Luer الذكر من منفذ التدفق في المقصورة السفلية ، وتنظيف السطح حوله بأنسجة ورقية غارقة في الإيثانول.
    6. ضع حقنة مع 10 مل من المياه فائقة البرودة في منفذ التدفق ، وافتح غطاء Luer الأبيض على المقصورة العلوية ، واملأ الغرفة بالماء فائق النبور. أغلق غطاء Luer الأبيض مرة أخرى ، وأزل الحقنة ، وانظف مرة أخرى بالإيثانول ، واغلق منفذ التدفق بقابس Luer الذكر.
      ملاحظة: كرر الخطوات 2.6-2.8 لكافة غرف ثقافة التدفق.
    7. بالنسبة للعناصر الثابتة، أضف 10 مل من المياه فائقة السعة إلى أنابيب 15 مل التي تحمل العينات المثبتة على قنوات الضغط دون ثقوب.
  9. ضع جميع غرف ثقافة التدفق في الحاضنة. استبدل الماء فائق النبع بمتوسط ثقافي قبل يوم واحد من بذر الخلايا بنفس الطريقة كما هو موضح في الخطوتين 2.8.5 و 2.8.6 (تأكد من جمع الماء فائق الشراء "القديم" مع نسيج ورقي غارق في الإيثانول يوضع مباشرة على منفذ التدفق).

[يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا]

3. الاستعدادات لإعداد مضخة تدفق

ملاحظة: تنفيذ الخطوة 3 في خزانة تدفق صفح.

  1. جمع جميع المواد إعداد مضخة والاستعداد للاستخدام.
    ملاحظة: تتم إحالة المجربين إلى بروتوكول الشركة المصنعة للحصول على وصف مفصل لإعداد المضخة والوحدات السائلة والأنابيب المتوسطة من خلال صمامات الوحدة السائلة.
    1. تعيين المضخة إلى سعة 200 mbar.
    2. المسمار أصحاب الخزانات لخزانات 60 مل إلى وحدات السوائل.
    3. تنظيف مرشحات الهواء المطاطي القابلة لإعادة استخدامها مع نسيج ورقي غارق في الإيثانول، تأكد من أن فلتر الهواء يبقى جافا.
  2. ضع خزانات 60 مل في حاملات الخزانات، وضع أنابيب متوسطة القياسية من خلال صمامات وحدة السوائل. ربط الأنابيب المتوسطة مع قطر داخلي أكبر مع الإناث لوير قفل التوصيلات في حلقة مغلقة.
  3. المشبك أنابيب المتوسطة مع مقطع خرطوم، مباشرة تحت الخزانات.
  4. ملء الخزانات مع 25 مل من المتوسطة الثقافة لكل خزان 60 مل. الإفراج عن مقطع خرطوم، والسماح للوسط دخول الأنابيب.
  5. أغلق الخزانات المتوسطة باستخدام مرشحات الهواء المطاطي، وضع إعداد مضخة التدفق في الحاضنة حتى الخطوة 4.

4. زرع الخلايا باستخدام فيبرين باعتباره الناقل الخلية

ملاحظة: تنفيذ الخطوة 4 في خزانة تدفق صفح.

  1. إعداد هلام الفيبرين لخطوة البذر الخلية. للحصول على التفاصيل، راجع مول وآخرون67 لهلام الفيبرين، يجب أن يكون لمحلول الفيبرينوجين تركيز نهائي قدره 10 ملغم/مل (صحيح لنقاء مخزون البروتين)، وينبغي أن يكون لمحلول الثرومبين تركيز نهائي قدره 10 U/mL.
    1. ذوبان الفيبرينوجين إلى RT، قبل أن تزن ~ 50 ملغ (ما يكفي ل10 عينات) في وعاء من البلاستيك مع غطاء أحمر.
    2. إضافة خلية الثقافة المتوسطة لإعداد محلول الفيبرينوجين (بتركيز 10 ملغم / مل, الصحيح لنقاء المخزون البروتين). تخلط جيدا ومرشح لتعقيم محلول الفيبرينوجين مع مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر في أنبوب معقم 15 مل. الحفاظ على محلول الفيبرينوجين المصفاة على الجليد.
      ملاحظة: تجنب إعداد محلول الفيبرينوجين لفترة طويلة جدا مقدما، وإلا فإن الفيبرينوجين قد يتخثر تلقائيا.
    3. تذوب الثرومبين وجعل حل الثرومبين (بتركيز 10 U / مل) في خلية الثقافة المتوسطة ومكان على الجليد. إعداد 20 ميكرولتر thrombin + حل الخلايا لكل عينة. وبالنسبة لعينات n=10، يلزم 200 ميكرولتر؛ لذلك، تحضير حل 250 ميكرولتر thrombin لحساب أخطاء pipetting المحتملة.
  2. جمع وإحصاء الخلايا من قوارير الثقافة. خلط الخلايا في النسبة المطلوبة والمبلغ (1.2 × 106 monocytes و 0.6 × 106 الخلايا العضلية لكل سقالة). تأكد من وجود خلايا كافية لعينات n+1 لتصحيح أخطاء ماسورة. جهاز الطرد المركزي في 350 × غرام لمدة 10 دقائق في RT. إزالة supernatant.
  3. جعل خليط من الخلايا المعلقة والثرومبين.
    1. لكل عينة، استخدم 20 ميكرولتر من محلول الثرومبين. بالنسبة لعينات n=10، أضف 200 ميكرولتر ثرومبين إلى بيليه الخلية واخلطها. قياس حجم تعليق الخلية (خلايا + thrombin)، وحساب كيفية تقسيم بالتساوي على جميع السقالات 10 (على سبيل المثال، إذا thrombin + تعليق الخلية لديها حجم 260 ميكرولتر، وسوف تتلقى كل عينة electrospun 260 ميكرولتر/10 عينات = 26 ميكرولتر thrombin + تعليق الخلية).
    2. كما يتم تنفيذ البذر من السقالات في خطوتين، وإعداد اثنين من أنابيب الميكروفوجي 1.5 مل التي سوف تعقد نصف تعليق الخلية لكل سقالة (في حساب المثال من الخطوة السابقة: إعداد أنبوبين مع 13 ميكروغرام من thrombin + تعليق الخلية). ضعه على الثلج
      ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية، وخاصة الخطوة 4.4، بشكل مثالي من قبل اثنين من المجربين.
  4. جفف السقالات الكهربائية المبللة مسبقا بالفراغ للتحضير زراعة الخلايا.
    1. توصيل ماصة باستور الزجاج لنظام فراغ من خزانة تدفق صفح، ومكان في أنبوب فارغ 50 مل لتخزين مؤقت معقمة.
    2. خذ غرف ثقافة التدفق من الحاضنة ، وأزل قابس Luer الذكر من منفذ التدفق ، وأزل الوسط بعد فتح غطاء Luer الأبيض ووضع نسيج ورقي غارق في الإيثانول أمام منفذ التدفق.
    3. خلع المقصورة العلوية وأنبوب زجاجي، ووضعها في طبق بيتري العقيمة للتخزين المؤقت.
    4. وضع الأنابيب باستور فراغ على سقالة electrospun، وإزالة أكبر قدر ممكن من المتوسطة.
      تنبيه: فراغ الجافة سقالة electrospun بلطف جدا. بدلا من حركة خطية ذهابا وإيابا على السقالة، ضع ماصة الفراغ في مواقع متعددة. المشبك أنابيب فراغ على رأس ماصة باستور في بين الأصابع لتحسين السيطرة.
    5. اخلط محلول الفيبرينوجين بنسبة 1:1 مع تعليق الجلطات + الخلية (على سبيل المثال، اخلط 13 ميكرولتر من الفيبرينوجين مع 13 ميكرولتر من الثرومبين + تعليق الخلية). للتأكد من أن الفيبرين يبلمرة في السقالة وليس في أنبوب microfuge، pipet الفيبرينوجين، بدوره عجلة الأنابيب ل 'حجم إضافي' من thrombin + تعليق الخلية، وماصة صعودا وهبوطا مرة واحدة في أنبوب microfuge مع تعليق الخلية لخلط.
    6. بالتنقيط بشكل متجانس مباشرة الحل على طول كامل من سقالة electrospun. وينصح بأن المجرب A يقطر خليط الفيبرين، في حين أن المجرب B يحمل المقصورة السفلية مع سقالة electrospun التي شنت على قناة الضغط.
    7. بعد أن يتم قطر الفيبرين مع الخلايا على سقالة electrospun ، يقوم Experimenter B بتحريك السقالة ببطء ، من اليسار إلى اليمين وأعلى لأسفل ، لزيادة تقسيم الخلايا بالتساوي على السقالة.
    8. كرر الخطوة 4.4.5 - 4.4.7 على الجانب الآخر من سقالة الكهرسبون.
    9. قم بتركيب غرفة ثقافة التدفق مرة أخرى عن طريق وضع الأنبوب الزجاجي بعناية (منع الالتصاق الفيبرين والتخثر إلى الجانب الداخلي من الأنبوب الزجاجي) ، ودفع المقصورة العلوية لغرفة ثقافة التدفق. ضع مباشرة البناء المصنف دون أي ملحي متوسط أو عازل للفوسفات (PBS) في غرفة ثقافة التدفق في الحاضنة.
    10. كرر الخطوات 4.4.1-4.4.9 لجميع العينات الديناميكية. بالنسبة للعينات الثابتة المثبتة على قنوات الضغط بدون ثقوب ، البذور وفقا للخطوات 4.4.1-4.4.8 ، ووضعها في أنبوب 15 مل بعد ذلك.
    11. دع الفيبرين يبوليمر لمدة 60 دقيقة في الحاضنة.

[يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا لمدة 30-60 دقيقة.]

  1. بعد البلمرة، قم بملء غرف زراعة التدفق (عينات ديناميكية) أو أنابيب 15 مل (عينات ثابتة) مع متوسطة.

5. اقتران أنظمة المفاعل الحيوي وتدفق مضخة قبل بدء التجربة

ملاحظة: تنفيذ الخطوات 5.1-5.3 في خزانة تدفق صفح.

  1. خذ الدرج الذي يحمل غرف زراعة التدفق والوحدات السائلة مع الخزانات المتوسطة المملوءة والأنابيب المتوسطة المتصلة داخل خزانات تدفق صفح.
  2. ضع غرف ثقافة التدفق على قاعدة المفاعل الحيوي للمجموعات التجريبية المحملة بالتمدد الدوري ومع الأحمال الديناميكية الدموية المجمعة(الشكل 1E).
    1. إمالة غرفة ثقافة التدفق رأسا على عقب، وملء قناة الضغط من أسفل مع المياه فائقة النبع باستخدام حقنة مع أنابيب رقيقة (وهذا يمكن أن يكون من أي نوع، طالما أنها مرنة ورقيقة، في هذه التجربة، تم إرفاق 10 سم طويلة، 0.15 ملم سلك القطر الداخلي إلى الإبرة).
    2. ضع الأنابيب الرقيقة داخل قناة الضغط ، وبينما تمتلئ قناة الضغط بالماء فائق النبور عن طريق دفع الماء تدريجيا من الحقنة ، اسحب السلك من قناة الضغط في وقت واحد ، للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل قناة الضغط.
    3. ضع غرفة ثقافة التدفق على أحد الخيوط المسمارية الثمانية على قاعدة المفاعل الحيوي. ضع حلقة O السيليكون بين قاعدة المفاعل الحيوي وموصل Luer الأبيض لمنع التسرب المحتمل ، وتشديد موصل Luer الأبيض من المقصورة السفلية.
    4. كرر الخطوتين 5.2.2 و5.2.3 لجميع العينات الممتدة دوريا.
  3. قم بتوصيل غرف ثقافة التدفق لجميع المجموعات التجريبية، باستثناء عنصر التحكم الثابت، بنظام مضخة التدفق.
    1. ضع مشبك خرطوم على الأنابيب المتوسطة. قم بإزالة غطاء Luer الأبيض الذي يغطي مدخل التدفق في المقصورة العلوية لغرفة ثقافة التدفق. إزالة الزوجين Luer الإناث من الأنابيب المتوسطة، وربط الأنابيب المتوسطة على جانب واحد مع مدخل تدفق على المقصورة العليا، والجانب الآخر من الأنابيب المتوسطة مع منفذ تدفق في المقصورة السفلية.
    2. كرر الخطوة 5.3.1 لجميع غرف ثقافة التدفق. عند هذه النقطة، يتم تعبئة المفاعل الحيوي وغرف ثقافة التدفق مع المتوسطة ومتصلة بأنظمة التدفق.
    3. لعينات التحكم الثابتة، ضع العينات عموديا في قارورة ثقافة الخلية مع غطاء التصفية باستخدام المشبك المقص. ملء قارورة ثقافة الخلية مع المتوسطة، ومكان في الحاضنة.
  4. نقل الإعداد الكامل من خزانة تدفق صفح إلى الحاضنة، وربط وحدات السوائل إلى أنابيب ضغط الهواء والكابل الكهربائي.
  5. بدء تشغيل البرنامج، وتهيئة مضخات التدفق. بدء تدفق متوسطة للعينات واحدا تلو الآخر.
    1. تحقق مما إذا كانت صمامات الوحدة السائلة تنقر.
    2. إزالة المشبك خرطوم من الأنابيب المتوسطة.
    3. بدء تشغيل مضخة التدفق مع 100 mbar و 10 ق وقت التبديل.
    4. تحقق بعناية من اتجاه التدفق لاحتمال تسرب أو فقاعات الهواء. يمكن إزالة أي فقاعات الهواء المحاصرين عن طريق تحويل غرفة ثقافة التدفق رأسا على عقب.
      ملاحظة: تأكد من أن المستويات المتوسطة في الخزانات المتوسطة متوازنة، لمنع شفط الهواء في النظام وفقاعات الهواء في غرف ثقافة التدفق، وعدم السماح للخزانات بالجفاف(الشكل 2C).
    5. كرر الخطوة 5.5 لجميع الوحدات السائلة واحدا تلو الآخر.
  6. تهيئة مضخة سلالة.
    1. قم بتوصيل المضخة الهوائية المشغلة عبر مدخل الهواء على الأسطوانة الهوائية بالهواء المضغوط. توصيل منفذ الهواء السفلي مع أنابيب زرقاء للهواء خارج (الشكل 1F).
    2. فتح برنامج LabVIEW، تشغيل البرنامج النصي LabVIEW وضغط الهواء المضغوط نظام التطبيق، كما هو موضح من قبل فان كيليوآخرون. 68،أدخل التشريد والتردد (تبدأ مع التردد المنخفض من 0.2 هرتز). إيقاف المضخة مؤقتا عندما يكون خوار تفلون في أدنى مستوى له.
    3. ضع مستشعر الضغط في مدخل مستشعر الضغط على الخزان الهيدروليكي.
  7. تغيير إعدادات المضخة إلى الإعدادات المطلوبة (ل1.5 السلطة الفلسطينية، واستخدام 150 mbar، 10 ق وقت التبديل).
  8. بدء تشغيل مضخة سلالة، وتطبيق الإعداد المفضل (على سبيل المثال، 0.5 هرتز، 1.05 تمتد).

6. تشغيل التجربة لعدة أيام؛ رصد القص وتمتد خلال الثقافة واستبدال المتوسطة

  1. حساب WSS في جدار السقالة.
    1. سجل حجم التدفق كل يومين (انظر دليل الشركة المصنعة لمضخة التدفق للحصول على التفاصيل). باختصار، لاحظ التغير في مستويات السائل (بال مل) في الخزانات المتوسطة بين تبديل خزان الوحدة السائلة لمدة 10 s. إجراء خمسة قياسات على الأقل، وحساب متوسط القيمة، وضرب في 6 للحصول على معدل التدفق Q في مل / دقيقة.
    2. يتم وصف التدفق من خلال تدفق Poiseuille من خلال قناة حلقية. على افتراض الثقافة المتوسطة كسائل النيوتونية، وحساب WSS في جدار سقالة، ص1،من المعادلة 1.
      Equation 1 (1)
      حيث WSS ثفي جدار سقالة (ص1; هنا ص1 = 1.7 مم), الناتجة عن تدفق حالة ثابت, يتم تحديدها من قبل P الضغط المطبق ونصف القطر الداخلي للأنبوب الزجاجي ص2 (هنا ص2 = 2.3 مم). ويفترض أن تدرج الضغط في الاتجاه المحوري موحد بين مدخل التدفق ومنفذ التدفق وتعطى المعادلة 2(الشكل 1J).
      Equation 2 (2)
      مع μ اللزوجة الديناميكية (هنا يفترض اللزوجة المتوسطة ثابتة، μ = 0.7 × 10-3 Pa∙s في 37 درجة مئوية) و Q معدل التدفق التطبيقي.
  2. رصد تمتد تطبيقها على السقالات كل يومين.
    1. ضع خلفية داكنة خلف غرفة ثقافة التدفق لزيادة التباين بين السقالة والخلفية. ضع مصابيح LED الضوئية ، مشيرا نحو السقالة ، للمساعدة في تصور السقالة.
    2. التقط صورا فوتوغرافية للسقالة بتردد 30 هرتز لمدة 6 s (أي 3 دورات تمدد) مع كاميرا عالية السرعة.
      ملاحظة: قد يكفي انخفاض تردد التسجيل إذا سمحت الكاميرا بذلك. غير أن التردد المطلوب إلى أدنى حد لم يتحدد.
    3. تحديد قطر الحد الأدنى والحد الأقصى من سقالة يدويا من الصور.
    4. حساب القطر الخارجي الحد الأدنى والحد الأقصى من سقالة electrospun لحساب أقصى تمتد وفقا للمعادلة 3.
      Equation 3 (3)
      حيث يتم إعطاء امتداد محيطي(λο)بنسبة بين القطر الخارجي للسقالة، د1،وقطرها الأولي، د0.
  3. تصحيح للتبخر المتوسط، وتحديث المتوسطة ثلاث مرات في الأسبوع.
    1. إيقاف وفصل الكابلات لأنظمة التدفق ومضخة سلالة.
    2. ضع مقاطع خرطوم على الأنابيب المتوسطة.
    3. تحديد مقدار المتوسطة المتبخرة استنادا إلى علامات مؤشر الحجم على الخزانات المتوسطة.
    4. نقل صينية مع المفاعل الحيوي ووحدات السوائل إلى خزانة تدفق صفح.
    5. إزالة مرشحات الهواء المطاطي من الخزانات المتوسطة؛ إضافة المياه فائقة البوري autoclaved للتعويض عن حجم تبخرت من المتوسطة. أغلق الخزانات المتوسطة مرة أخرى، وربط إلى المضخة مرة أخرى لخلط المتوسط مع المياه فائقة البور.
    6. كرر الخطوات 6.3.1-6.3.5. إزالة مرشحات الهواء المطاط مرة أخرى، وإخراج 25 مل من الثقافة المتوسطة، وتدور أسفل في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في RT.
      1. جمع 1.5 مل فائقة، وتخزينها في -30 درجة مئوية لتحليل ملامح إفرازية (للتحليل مع اختبار المناعي المرتبطة الانزيم (ELISA)).
      2. جمع الحجم المطلوب من supernatant لدراسات الإشارات الباراكورين، وذلك باستخدام supernatant كما المتوسطةمشروطة 43.
    7. أضف 25 مل من الوسائل الطازجة إلى الخزانات المتوسطة.
    8. ضع مرشحات الهواء المطاطي مرة أخرى على الخزانات المتوسطة.
    9. ضع الإعداد الكامل مرة أخرى في الحاضنة؛ توصيل جميع الكابلات وأنابيب الهواء إلى مضخة ومضخة سلالة. حرر مقاطع الخرطوم وكرر الخطوات 5.4-5.8.
  4. تحقق مما إذا كانت حبات تجفيف السيليكا في زجاجات التجفيف المتصلة بالمضخة رطبة (مظهر أبيض) ، واستبدالها بالخرز الجاف للسيليكا إذا لزم الأمر (المظهر البرتقالي).

7. إنهاء التجربة، جمع العينات، وتنظيف المعدات وتخزينها

  1. في اليوم الأخير من التجربة، صحيح للتبخر المتوسط كما هو موضح في الخطوات 6.3.1-6.3.5، وحصاد العينات واحدا تلو الآخر.
    1. لحصاد العينات واحدا تلو الآخر، مضخة تدفق ومضخة سلالة تحتاج إلى التوقف عدة مرات. ضع مشبك خرطوم على أنابيب متوسطة. مؤقتا وقف تدفق مضخة ومضخة سلالة. فصل غرفة واحدة ثقافة التدفق من قاعدة المفاعل الحيوي؛ استبدال بواسطة غطاء لوير أبيض على قاعدة المفاعل الحيوي. خذ غرفة ثقافة التدفق ووحدة السوائل إلى خزانة تدفق صفح. بدء ضخ تدفق ومضخة سلالة مرة أخرى لتطبيق الحمل الهمودي إلى عينات أخرى حتى الحصاد.
    2. جمع المتوسطة من الخزانات المتوسطة لتحليل إنتاج السيتوكينات الباراكين عن طريق ELISA.
  2. فصل وحدات التدفق والحصاد بناء أنبوبي. قسم وفقا لخطة القطع المطلوبة. يمكن تخزين أجزاء من البناء عند 4 درجات مئوية (بعد تثبيت 15 دقيقة في 3.7٪ الفورمالديهايد و 3 × 5 دقائق غسل في PBS) أو -30 درجة مئوية (بعد التجميد المفاجئ في النيتروجين السائل) حتى مزيد من التحليل.
  3. تنظيف مكونات المفاعل الحيوي والمضخات. بالإضافة إلى ذلك، يتم ذكر طريقة التنظيف الموصى بها لكل عنصر في جدول المواد.
    1. تنظيف مرشحات الهواء المطاطي مع الإيثانول 70٪. كن حذرا جدا لعدم ترطيب مرشح الداخلية!
    2. جمع جميع المكونات المنفصلة: أنابيب متوسطة، والخزانات المتوسطة، والأنابيب الزجاجية، والمقابس لوير الذكور وأقفال لوير الإناث، قبعات لوير الأبيض، قنوات الضغط، المخاريط الأنف، سيليكون O-الحلقات، محول بوشينج، مستقيم تدفق (باستثناء مضخات، وحدات السوائل، مرشحات الهواء المطاطي، قاعدة المفاعل الحيوي)، وشطف في مياه الصنبور الجارية.
    3. ضع O/N في 0.1٪ دودسيلسلفات الصوديوم في الماء deionized.
      ملاحظة: لا تستخدم المياه فائقة النبور حيث قد تصدأ الأجزاء.
    4. شطف مع ماء الصنبور والصابون غسل الصحون.
    5. تزج في الماء deionized، تليها 70٪ الإيثانول مرتين، تليها المياه deionized.
    6. ضع جميع المواد بشكل منفصل على الأنسجة الورقية والسماح لها الجافة. استخدام الهواء الضغط إلى الأنابيب الجافة.
    7. تنظيف جميع المواد غير القابلة للاعتراف الذاتي مع نسيج ورقي غارق في الإيثانول 70٪. وهذا يشمل مرشح الهواء المطاطي (ضع في اعتبارك أن فلتر الهواء يجب أن يبقى جافا) وقاعدة المفاعل الحيوي (تفلون بيلو واسطوانة هوائية).
    8. أوتوكلاف مكونات الغرفة السائلة (بما في ذلك حلقة O السيليكون) ، والأنابيب المتوسطة ، والخزانات المتوسطة (بدون فلتر الهواء المطاطي) ، ومقابس Luer الذكور وأزواج Luer الأنثوية ، وقبعات Luer البيضاء ، ومقاطع الخرطوم ، والمعدات القياسية (على سبيل المثال ، الملاقط ، مقص اللقط)
    9. للاستخدام المريح أثناء التجارب التالية، اجمع المكونات المنفصلة لغرفة سائلة كاملة واحدة في صندوق قابل للاستراف التلقائي.
  4. إزالة المياه من الخزان الهيدروليكي. نظيفة مع الإيثانول 70٪، تليها المياه deionized. دعه يجف. إعادة تعبئة مع المياه deionized وبضع قطرات من المياه حمام الحفاظ على مطهر.
  5. تخزين أنابيب الزجاج لغرفة ثقافة التدفق في الإيثانول 70٪.
  6. ضع حبات تجفيف السيليكا الرطبة (المظهر الأبيض) في الفرن O/N عند 120 درجة مئوية للسماح لها بالجفاف (المظهر البرتقالي)، وتخزينها في قارورة محكمة الهواء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تطوير هذا المفاعل الحيوي لدراسة الآثار الفردية والمجمعة لإجهاد القص والتمدد الدوري على نمو الأنسجة الوعائية وإعادة عرضها في سقالات المواد الحيوية ثلاثية الأبعاد. تصميم المفاعل الحيوي يسمح لزراعة ما يصل إلى ثمانية بنيات الأوعية الدموية تحت ظروف التحميل المختلفة(الشكل 1A). يتم وضع البنى الوعائية في غرفة ثقافة التدفق(الشكل 1B)حيث يمكن التحكم بشكل مستقل في كل من الامتداد المحيطي وWSS. المقصورة العلوية من غرفة ثقافة التدفق يحمل مستقيم تدفق لتحقيق الاستقرار في تدفق في طول تسوية قصيرة نسبيا(الشكل 1C). مباشرة المصب من مستقيم تدفق، مخروط الأنف يوزع تدفق بالتساوي من خلال القناة الحلقية(الشكل 1D). عندما يتم تنفيذ جميع خطوات البروتوكول بالطريقة الصحيحة ، يمكن أن تتعرض السقالات الوعائية في غرفة ثقافة التدفق لتدفق أحادي الاتجاه مستمر عبر القناة الحلقية بين السقالة والجدار الزجاجي وتمتد محيطيا بواسطة المضخة الهوائية(الشكل 1E-F). قبل تركيب السقالة، يجب قطع أنبوب الكهرسبون إلى أنابيب 25 مم(الشكل 1G)ويمكن فحصه مع SEM لتحليل الميكروبيتات(الشكل 1H-I). من المهم ملاحظة أنه يمكن استبدال ترقيع PCL-BU في هذا المثال بأي ترقيع أنسجة غير رقمية أخرى مصممة (أصل طبيعي أو اصطناعي ، أو هندسة صغيرة مختلفة أو مسامية). يسمح التصميم الداخلي باختبار الطعوم المسامية للغاية لأنه ليس بالضرورة أن يكون خاليا من التسرب. تظهر الصورة التخطيطية لغرفة ثقافة التدفق التفسير المادي للمعلمات المستخدمة في المعادلات لوصف WSS (المعادلة 1) وتدرج الضغط (المعادلة 2) والتمدد المحيطي (المعادلة 3)(الشكل 1J).

تنفيذ غير صحيح من الخطوات الهامة للبروتوكول يمكن أن يؤدي إلى سيناريوهات قليلة. على سبيل المثال، يمكن أن يحدث تسرب من الخزان الهيدروليكي نتيجة لعقدة مثبتة بشكل غير صحيح، مما يؤدي إلى تسرب السوائل الهيدروليكية من قنوات الضغط مع ثقوب تمر أنبوب السيليكون ودخول غرفة ثقافة التدفق(الشكل 2A). تسرب السائل الهيدروليكي في الاتصال بين المواضيع المسمار وقاعدة المفاعل الحيوي يمكن أن يحدث أيضا عندما حلقة السيليكون ليست في وضع جيد أو إذا كان لا يسمح للخوار تفلون لتوسيع طفيف O / N قبل يوم واحد من التجربة (الشكل 2B). وعلاوة على ذلك، عندما لا يتم إزالة الغاز من المتوسط، أو إذا كانت المستويات المتوسطة في الخزانات المتوسطة ليست متوازنة بشكل جيد وخزان واحد متوسط يجف، مما يؤدي إلى امتصاص الهواء في النظام، يمكن أن تنشأ فقاعات الهواء في غرفة ثقافة التدفق(الشكل 2C)،مما يزعج باترز WSS، مما يعرض بقاء الخلية ونمو الأنسجة اللاحقة للخطر. وأخيرا، عندما لا يتم وضع حلقة O السيليكون في المقصورة السفلية بشكل صحيح، يمكن ملاحظة تسرب متوسط تحت غرفة ثقافة التدفق(الشكل 2D).

بما أن إعداد المفاعل الحيوي هذا يسمح بتطبيق الأحمال الديناميكية الدموية الفردية والمجمعة ، يمكن تضمين مجموعات تجريبية متعددة محملة ديناميكيا في تجربة واحدة(الشكل 3A). في السابق، تم التحقق من صحة الأحمال الديناميكية الدموية المختلفة (أي نظامين للإجهاد القص ونظامين للتمدد) من خلال تطبيق إعدادات النظام الممكنة المختلفة(الشكل 3B). عندما تم رصد امتداد (الشكل 3C) وWSS (الشكل 3D) على مدى فترات الثقافة على المدى الطويل ، تم التحقق من أنه يمكن الحفاظ على هذه عند مستويات ثابتة نسبيا على مدى فترة تصل إلى 20 يوما.

المفاعل الحيوي مناسب بشكل خاص لدراسة تأثير التحميل الديناميكي الدموي على النمو وإعادة العرض في سياق TE الأوعية الدموية في الموقع. يفترض مراحل TE في الموقع لتعكس مراحل استجابة التئام الجروح الطبيعية(الشكل 4A). تم تأسيس الثقافات المشتركة لل الضامة المشتقة من الخلايا الأحادية والخلايا العضلية المشتقة من الأوردة الشافينية البشرية ، كما هو موضح هنا ، كتقليد في المختبر للمرحلة التكاثرية. بعد ثلاثة أيام من البذر، أظهرت تلطيخ immunofluorescence توزيع متجانسة من كلا النوعين من الخلايا في جميع أنحاء السقالة(الشكل 4B). بعد 20 يوما من الثقافة المشتركة، أدى امتداد دوري وحده في ترسب أكثر عددا وأكثر سمكا الكولاجين نوع I الألياف، بينما في المجموعة مع الأحمال الهمودية مجتمعة، تم نقض هذا التأثير من امتداد دوري من الإجهاد القص، مما أدى إلى أقل وضوحا الكولاجين نوع الأول ترسب، يتضح هنا من تلطيخ immunofluorescence(الشكل 4C). لنجاح تجديد الأنسجة في الموقع، يلزم تحقيق توازن محكم بين إنتاج الأنسجة وا ارتشاف السقالات. بالإضافة إلى تكوين الأنسجة ، يسمح المفاعل الحيوي لتحريض ارتشاف السقالة المدفوع بالخلايا. على سبيل المثال، عند زراعة ثقافة أحادية من الضامة لمدة 8 أيام على الطعوم electrospun، لوحظ تآكل الألياف وانشقاق الألياف في جميع أنظمة التحميل الهيمودية، مع resorption الأكثر وضوحا في المجموعة ثابتة وأقل وضوحا ارتشاف في مجموعة الإجهاد القص(الشكل 4D). وتظهر هذه النتائج مجتمعة تأثير نظم التحميل الديناميكية الدموية المختلفة على النمو وإعادة البناء على حد سواء. هذه الرؤى مفيدة في تحسين معايير التصميم ل TEVGs المطورة حديثا في الموقع.

محدد مهم آخر لعملية تجديد الأنسجة هو وجود السيتوكينات المؤيدة والمضادة للالتهابات. بما أن المفاعل الحيوي هو نظام حلقي مغلق ، فإن الخلايا في النظام ستتعرض باستمرار لمحفزات الباراكورين للعوامل المفرزة. تم تحليل ملامح إفراز السيتوكين في وسط الثقافات المشتركة المحملة ديناميكيا للخلية النووية الأحادية الدم المحيطية البشرية (PBMC) المشتقة من الضامة والخلايا الميوفيبروبلاست البشرية من الأوردة الشافينية في المراحل المبكرة واللاحقة(الشكل 5A). توضح هذه النتائج التمثيلية تأثير كل من التمدد الدوري والإجهاد القص على ملف إفراز السيتوكين في إعداد الثقافة المشتركة. ومن المثير للاهتمام أن الآثار المجمعة لكلا الحمولتين أظهرت إما هيمنة أحد الحمولتين (على سبيل المثال، الامتداد الدوري للإنترلوكين-6 (IL-6) والبروتين -1 (MCP-1) أو الآثار التآزرية لكلا الحمولتين (على سبيل المثال، بالنسبة ل IL-10)(الشكل 5B). هذه الرؤى، التي تم جمعها باستخدام هذه المنصة الاختبار في المختبر، تعطي معلومات قيمة لتطوير TEVGs في الموقع التي تستند إلى الأساس المنطقي لتجديد الأنسجة الموقعية التي تحركها الضامة.

وأظهرت تجارب الثقافة المشتركة لل الضامة والورم الميوفيبرومي أن البيئة الميكانيكية والبيئات الالتهابية الناتجة التي تعتمد على التحميل تحوير النمط الظاهري للخلايا الميوفيبروبلاست. بعد 20 يوما من التحميل الهمودي، أظهر التعبير الجيني لعلامات الورم العضلي اختلافات واضحة في التأثير الفردي والمجمع للتحميل وفي الإشارات المباشرة والباراكورين لل الضامة على الخلايا العضلية الليفية(الشكل 6A). وعلاوة على ذلك، فإن أنماط التعبير الجيني من علامة انكماش ألفا العضلات الملساء أكتين ترتبط تخليق البروتين(الشكل 6B). وعلاوة على ذلك، حفز تمتد دوري الكولاجين ومرونة مصفوفة التعبير الجيني ومصفوفة مخففة metalloproteinase 1/الأنسجة المانع مصفوفة metalloproteinase 1-بوساطة إعادة عرض الكولاجين، في حين لوحظ تأثير استقرار الإجهاد القص في الثقافة المشتركة(الشكل 6C). هذه التجارب طويلة الأجل في مجال الثقافة المشتركة تظهر إمكانية دراسة مرحلة إعادة عرض الأنسجة في مرحلة لاحقة(الشكل 4A)في مختلف نظم التحميل الهيمودي في الأنسجة المهندسة ترقيع الأوعية الدموية مع هذا المفاعل الحيوي. كما يتم تركيب TEVG "من الداخل إلى الخارج" على أنبوب السيليكون، يمكن تطبيق امتداد دائري وWSS لفترات أطول الثقافة.

Figure 1
الشكل 1: تصميم المفاعل الحيوي ونظرة عامة عليه. (أ)رسم البناء من قاعدة مفاعل حيوي و (ب) انفجرت عرض غرفة زراعة السوائل مع جميع أجزاء المشار إليها (الخطوات 2.4-2.8). المقصورة العلوية لغرفة ثقافة التدفق تحمل مستقيم تدفق. (C) يتم وضع مخروط الأنف حاد كرويا بعد مستقيم تدفق لتوزيع التدفق من خلال القناة الحلقية (اتجاه التدفق المشار إليها باللون الوردي). (د) معا، تتحكم هذه المكونات في اتجاه التدفق وتوجهه. انظر الجدول 1 للحصول على وصف وظيفي للأجزاء المذكورة بشكل فردي. (ه) صورة من الإعداد مفاعل حيوي كامل (الخطوة 5.2) و (F) عرض عن قرب من غرف ثقافة تدفق واسطوانة هوائية (الخطوة 5.6.1). (G) المظهر الإجمالي للسقالة إلكتروسبون PCL-BU قبل البذر (المسطرة القراد 1 مم). مسح الصور المجهرية الإلكترونية من سقالة أنبوبي electrospun PCL-BU مع قطر 3 مم الداخلية و 5 ميكرومتر متوسط قطر الألياف في التكبيرات المختلفة، والحانات مقياس (H) 100 ميكرومتر و (I) 10 ميكرومتر (الخطوة 1.3). (J) صورة تخطيطية لغرفة الثقافة تتكون من سقالة كهربائية أنبوبية ، مع نصف قطر خارجي (ص1) مركزها في أنبوب زجاجي من نصف قطرها الداخلي (ص2). تدفق (Q) مداخل ومنافذ متصلة الحلقي حلقة, مع قناة ارتفاع ح لتطبيق جدار القص الإجهاد (ر). يتم توصيل مدخل الضغط / التمدد(P)بالسقالة المثبتة على السيليكون لتطبيق امتداد محيطي(λ(t))إلى السقالات الكهربائية المثبتة من الداخل (الخطوة 6.1). الاختصارات: البوليكابرولاكتون بيسوريا (PCL-BU). وقد اقتبست الأفرقة جيم و د و جي من فان هافتن وآخرون19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أجزاء المفاعل الحيوي وصف وظيفي
تطبيق التمدد
اسطوانة هوائية يعمل على رفع صوت تفلون.
تفلون بيلو تحميل الخزان الهيدروليكي.
الخزان الهيدروليكي يمكن أن تكون متصلة مع ما يصل إلى 8 غرف ثقافة التدفق، ومليئة المياه ديمي، ويطبق الضغط على سيليكون شنت البنى.
المسمار الموضوع الاتصال بين غرفة زراعة التدفق والخزان الهيدروليكي. مدخل الضغط للتشييدات التي شنت السيليكون.
موصل لوير أبيض تستخدم المسمار غرفة ثقافة تدفق ضيق إلى واحد من المواضيع المسمار ثمانية على الخزان الهيدروليكي / قاعدة المفاعل الحيوي.
قناة الضغط مع ثقوب صغيرة متصل مباشرة بالماء في الخزان الهيدروليكي. عندما يتم الضغط على الخزان الهيدروليكي، تملأ قنوات الضغط المساحة بين أنبوب السيليكون (الذي يتم تركيبه على قناة الضغط) بالماء، مما يدفع أنابيب السيليكون إلى الخارج، مما يؤدي إلى امتداد محيطي على الكسب غير المشروع المثبت من داخل السيليكون.
أنابيب السيليكون لتركيب الكسب غير المشروع electrospun على قناة الضغط. أنابيب السيليكون تمتد محيطيا من الداخل.
تطبيق التدفق
نظام مضخة التدفق تستخدم للسيطرة على تدفق في غرف ثقافة التدفق. (في المثال لدينا: يتم استخدام نظام مضخة ibidi.)
المقصورة العلوية والسفلية مع مدخل التدفق ومنفذ يربط غرفة ثقافة التدفق في حلقة التدفق.
أنبوب زجاجي يحتوي على سقالة مضغوط في المركز ويسمح تغلغل السقالات.
مستقيم التدفق استقرار التدفق في طول تسوية قصيرة نسبيا.
مخروط الأنف توزيع التدفق بالتساوي.
محول بوشينج يصلح الأنبوب الزجاجي.
سيليكون O-حلقة يمنع تسرب المتوسطة.

الجدول 1: الوصف الوظيفي للسمات الرئيسية للمضاحث الحيوية، يتوافق مع الأجزاء المشار إليها في الشكل 1 ألف - دال.

Figure 2
الشكل 2: نتائج التنفيذ غير الدقيق للخطوات الحاسمة في البروتوكول. صور لبعض الأحداث التي يمكن ملاحظتها في إعداد المفاعل الحيوي عندما لا يتم تنفيذ الخطوات الحرجة بالطريقة الصحيحة. (أ)إذا لم تكن العقدة ضيقة بما فيه الكفاية أو لم توضع بالضبط في الأخدود المحفور (المشار إليها بالسهم) ، فقد يحدث تسرب طفيف للسائل الهيدروليكي في غرفة ثقافة التدفق(الخطوة 2.5). (ب)إذا لم يسمح للخوار تفلون لتوسيع O / N قبل يوم واحد من التجربة أو عندما حلقة السيليكون ليست في وضع جيد، تسرب السائل الهيدروليكي من السائل الهيدروليكي في الاتصال بين المواضيع المسمار وقاعدة المفاعل الحيوي قد تحدث (المشار إليها بالسهم) (الخطوة 1.4 و 5.2.3). (ج)فقاعات الهواء في غرفة ثقافة التدفق (المشار إليها بالسهم) سيؤدي إلى أنماط الإجهاد القص المضطربة. دائما ديغا المتوسطة الثقافة وتأكد من أن المستويات المتوسطة في الخزانات المتوسطة متوازنة لمنع خزان واحد تشغيل الجافة والحصول على الهواء امتص في نظام غرفة التدفق (الخطوتين 1.2 و 5.5.4). (د)عندما لا يتم وضع حلقة السيليكون في المقصورة السفلية بشكل صحيح، يمكن ملاحظة انسكاب الوسط (المشار إليه بالسهم) (الخطوة 2.4.2). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: السيطرة على الإجهاد القص وتمتد. بما أن المفاعل الحيوي يسمح بتطبيق مستقل ومدمج للتمدد والقص ، يمكن تضمين(أ)مجموعات تجريبية متعددة في تجربة واحدة. (ب)أمثلة على الاختلافات في أقصى فترات وضغوط القص في نقطة زمنية محددة تم اختبارها تحت أربعة إعدادات نظام متميزة (يشار إليها بالألوان). تمثل المستطيلات السوداء متوسط الانحراف المعياري ± القياسات لكل إعداد. يتم حساب الخطوط المنقطة على أنها متوسط الامتدادات(الخط الأفقي)وضغوط القص(الخط الرأسي)للإشارة إلى ظروف التحميل الأربعة المتميزة. (ج) تمتد المحيطية الدورية في امتداد دوري ومجموعات مجتمعة على مدار التجربة لمدة 20 يوما ، استنادا إلى قياسات القطر الخارجي لبنى السقالة التي يتم رصدها مع مرور الوقت للكاميرا عالية السرعة (الخطوة 6.2). (د)رصد جدار القص الضغوط في الإجهاد القص والمجموعات مجتمعة على مدار التجربة، استنادا إلى مستويات متوسطة المتغيرة في الحقنة (الخطوة 6.1). تم اقتباس الألواح A و C و D من فان هافتن و Wissing et al.44; تم تكييف لوحة B من فان هافتنوآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مفهوم هندسة الأنسجة الوعائية في الموقع، وتوزيع الخلايا، وإنتاج الأنسجة، وتدهور السقالة. (أ)رسم تخطيطي يصور المراحل المفترضة لتجديد الأنسجة التي تحركها السقالة في الموقع الوظيفي للمضيف. النتائج المعروضة مستمدة من التجارب التي ركزت على مرحلة التكاثر، والتي استعمرت فيها الضامة والخلايا المنتجة للأنسجة مادة السقالة. (ب) الخلايا الميوفيبروبلاست من الوريد الشافيني البشري(الأحمر)والكوافير المشتق من PBMC(أخضر)التوزيع في الجانب الخارجي من سقالة electrospun(رمادي)في اليوم 3. شريط مقياس 200 ميكرومتر. (C) المقطع العرضي من بناء الثقافة المشتركة في اليوم 20 ملطخة للكولاجين نوع I (الأخضر), الكولاجين نوع الثالث (أحمر), وDAPI (أبيض). مقياس شريط 100 ميكرومتر، * يشير إلى الجانب الخارجي من البناء، المقابلة إلى جانب التدفق. (D) صور SEM من الطعوم decellularized من 8 أيام زراعة أحادية الضامة التي تظهر تدهور الضامة; شريط مقياس 20 ميكرومتر. المختصرات: الخلايا الوريدية النسغية البشرية (HVSC)؛ خلايا الدم المحيطي أحادية النووية (PBMC); 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI); المسح المجهري الإلكتروني (SEM). وقد اقتبس الفريق ألف من ويسينغ وبونيتو وآخرون27؛ تم تكييف لوحات B و C من فان هافتن ووزينغوآخرون. و تم تكييف لوحة D من ويسينج وآخرون43. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: البيئة الالتهابية في بناء الثقافة المشتركة المحملة بشكل شكلي في 3 أيام و 20 يوما. الثقافة المشتركة لل الضامة البشرية المشتقة من PBMC والخلايا الميوفيبروبلاست البشرية من الأوردة السابهينية. (أ) خريطة الحرارة من إفراز السيتوكين الكلي تقاس في supernatant عبر ELISA متعددة. (ب) Boxplots لعملية اختيار السيتوكينات في اليوم 20، تطبيع إلى مجموع محتوى الحمض النووي. تم حساب القيم P باستخدام اختبار كروسكال واليس مع اختبار مقارنة متعددة دان; * ص < 0.05 ، ** ع < 0.01 ، *** اختصارات: مثبطات الأنسجة من ميتالوبروتايناز (تيمب)، مصفوفة ميتالوبروتايناز (MMP)، إنترلوكين (IL)، بروتين chemoattractant أحادية 1 (MCP-1)، وتحويل عامل النمو بيتا 1 (TGF-β1)، عامل نمو النسيج الضام (CTGF)، عامل نخر الورم ألفا (TNF-α)، عامل النمو المشتقة من الصفائح الدموية (PDGF)، ثابت (ST)، تمتد دوري (CS)، إجهاد القص (SS). تم اقتباس الفريقين A و B من فان هافتن و ويسينج وآخرون44. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التغيرات في النمط الظاهري للورم الميوفيبرومي وعلامات نمو المصفوفة وإعادة عرضها استجابة للتحميل الديناميكي الدموي في بنيات الأوعية الدموية في اليوم 20. (أ)التعبير الجيني النسبي للعلامات الظاهرية الخاصة بالورم الميوفيبرومي. (ب) المقاطع العرضية الملطخة لαSMA(الأخضر)وDAPI (الأزرق)، شريط مقياس 100 ميكرومتر. (ج)التعبير النسبي للجينات المتعلقة مصفوفة الكولاجين، مصفوفة مرنة، بروتيوغليكانس، وإعادة عرض الجينات. تم حساب القيم P باستخدام اختبار كروسكال واليس مع اختبار مقارنة متعددة دان; * ص < 0.05 ، ** ع < 0.01 ، *** ع < 0.001. الاختصارات: S100 بروتين ربط الكالسيوم A4 (S100A4)، ألفا على نحو سلس العضلات أكتين (αSMA أو ACTA2)، كالبونين 1 (CNN1)، سلسلين (SMTN)، فيمينتين (VIM)، الكولاجين الأول (COL1A1)، الإيلاستين (إلن), versican (VCAN), مصفوفة metalloproteinase (MMP), مثبطات الأنسجة من metalloproteinase (تيمب), ثابت (ST), امتداد دوري (CS), الإجهاد القص (SS), 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). # تقاس عند أو تحت حد الكشف. تم اقتباس الألواح A و B و C من فان هافتن ووزينغ وآخرون44. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: التعبير البروتيني myofibroblast- وزراعة أحادية الضامة تتعرض لأحمال فردية ومجتمعة من الخلايا الدموية. (أ)صور ممثل confocal من الخلايا الميوفيبروبلاست، مثقف لمدة 10 أيام مع ألياف أكتين(الأخضر)،نواة(أحمر)،وسقالة(الأزرق)،وتظهر اتجاه واضح الألياف أكتين في العينات المحملة، بالمقارنة مع عينات ثابتة التي لا يمكن ملاحظة اتجاه الألياف actin تفضيلية. شريط مقياس 50 ميكرومتر(ب) صور Confocal من نفس زراعة أحادية ميوفيبروبلاست ملطخة للكولاجين(الأخضر)ونوى / سقالة (أبيض). شريط المقياس 50 ميكرومتر. (ج) Boxplots من ملامح إفراز البروتين من الضامة THP1 المستزرعة بشكل ثابت وديناميكي لمدة 8 أيام، مع نسب M1/M2 محسوبة على أساس مستويات إفراز السيتوكين من IL-6، TNF-α، MCP-1 (الموالية للالتهابات) وIL-10، IL-13، MMP-9 (المضادة للالتهابات). تمثل النقطة في الرسم البياني MCP-1 أبعد إحصائية. (د) بيانات ELISA لمستويات إفراز البروتين النسبية للبروتينات المستزرعة بشكل ثابت وديناميكي في اليوم 8 مقارنة بمتوسط إفراز البروتينات المؤيدة للالتهابات والمضادة للالتهابات والنمو وإعادة عرضها (تم تصحيح مستويات البروتين لمتوسط محتوى الحمض النووي لكل مجموعة). تشير النقاط والمناطق المظللة، على التوالي، إلى النسبتين المئويتين 50 و25-75. الاختصارات: بروتين chemoattractant أحادي الخلية 1 (MCP-1)، إنترلوكين (IL)، تحويل عامل النمو بيتا (TGF-β)، مصفوفة ميتالوبروتايناز (MMP)، المستمدة من الصفائح الدموية عامل النمو (PDGF), عامل نمو النسيج الضام (CTGF), عامل نخر الورم ألفا (TNF-α), فحص مناعة مرتبطة بالإنزيم (ELISA).* ص < 0.05; ** ص < 0.01، *** ص < 0.001. وقد اقتبست الأفرقة ألف وباء من فان هافتن وآخرون19. تم تكييف الفريقين C و D من Wissingوآخرون. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يسمح المفاعل الحيوي الموصوف هنا بإجراء تقييم منهجي لمساهمات التأثيرات الفردية والمجمعة لإجهاد القص والتمدد الدوري على الالتهاب وتجديد الأنسجة في السقالات القابلة للتكثير الأنبوبي. ويتيح هذا النهج أيضا إجراء مجموعة كبيرة ومتنوعة من التحليلات على البنى الوعائية، كما يتضح من قسم النتائج التمثيلية. وتبين هذه النتائج الأثر المميز لمختلف نظم التحميل الهيمودية (أي مجموعات مختلفة من القص والتمدد) على كل من نمو وإعادة تصميم بناء TEVG. هذه الأفكار، التي تم جمعها عبر هذه المنصة في المختبر، والمساعدة في تحسين المعلمات تصميم سقالة لتطويرها حديثا في الموقع TEVGs. لضمان سير عمل تجريبي مناسب، من المهم فهم الخطوات الهامة وحدود هذا البروتوكول.

ترتبط الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول بتطبيق التمدد على العينات. لتطبيق التمدد، من الضروري أن يكون الإعداد خاليا من التسرب. هناك نقطتا ضعف في النظام: العقدة التي تتصاعد بها ترقيع الكتروسبون إلى قنوات الضغط والاتصال بين قاعدة المفاعل الحيوي وغرف ثقافة التدفق. كما هو موضح في الخطوتين 2.5.2 و 2.5.4، يجب وضع عقد متعددة وضيقة بالضبط في الأخدود المحفور. إذا لم تكن العقدة ضيقة بما فيه الكفاية أو وضعت فوق أو تحت الأخدود قليلا، فقد يحدث تسرب طفيف للسائل الهيدروليكي في غرفة ثقافة التدفق. ويمكن الكشف عن هذا التسرب كما انخفاض الضغط في الخزان الهيدروليكي والجهد المتزايد باطراد على مضخة سلالة للوصول إلى قيمة الضغط المحدد. إلى جانب ذلك ، يؤدي هذا إلى تدفق مضطرب في غرفة ثقافة التدفق ، وزيادة خطر تلوث ثقافة الخلية ، وتخفيف الوسط. بمجرد حدوث ذلك ، يجب إخراج غرفة ثقافة التدفق من التجربة ، ويجب إغلاق الخيط المسماري على الخزان الهيدروليكي بغطاء Luer أبيض. هذا المقياس الرئيسي لإخراج عينة كاملة ، وهو أمر ضروري لضمان استمرار التجربة بشكل صحيح لغرف ثقافة التدفق السبع الأخرى ، يؤكد على أهمية وضع عقد ضيقة بدقة ، بالضبط في الأخافير المحفورة. وعندئذ فقط يمكن ضمان الفصل السليم بين المياه في الخزان الهيدروليكي والوسط في غرف ثقافة التدفق. لتحسين متانة تركيب السقالات ، سيتم جعل الأخاسير في قنوات الضغط أعمق قليلا في نسخة منقحة من المفاعل الحيوي ، مما يسمح بوضع عقدة أسهل وأفضل ، وبالتالي ، فصل آمن للسائل الهيدروليكي عن الوسط.

مصدر محتمل آخر للتسرب هو بين خيوط المسمار من قاعدة المفاعل الحيوي والموصلات لوير الأبيض من غرفة ثقافة التدفق. بسبب احتمال البلى من المواد تفلون، يمكن إضافة سيليكون إضافية O-حلقة لمنع التسرب (الخطوة 5.2.3). وعلاوة على ذلك، ينبغي السماح للخوار تفلون من مضخة سلالة لتوسيع قليلا O / N قبل يوم واحد من التجربة (الخطوة 1.4). إذا حدث تسرب، يجب تعويض السائل الهيدروليكي المفقود بإضافة كمية صغيرة من المياه فائقة النبور عبر أحد خيوط المسمار الثمانية (استخدم حقنة مع إبرة وأسلاك مرنة). ضع غرفة ثقافة التدفق مرة أخرى مع قطعة صغيرة من البارافيلم بين الخيط المسمار وموصل Luer الأبيض على المقصورة السفلية لغرفة ثقافة التدفق. للتغلب على هذه المسألة تسرب في التجارب المستقبلية، سيتم استبدال المواضيع المسمار تفلون الحالية على قاعدة المفاعل الحيوي من قبل خيوط الفولاذ المقاوم للصدأ في إصدار الجيل القادم من المفاعل الحيوي لمنع ارتداء خارج النظام.

الاختلاف في امتداد(الشكل 3C)أكبر من الاختلاف في WSS (الشكل 3D)، وتمتد هو أكثر صعوبة للسيطرة. ومع ذلك، وإلى جانب التدابير الرامية إلى منع التسرب، هناك تدابير أخرى تحد من التباين في التمدد: '1' تجنب فقاعات الهواء في الناي (الخطوة 1-4 و 5-2-1) و '2'ضمان الاتساق قبل التمدد بين العينات المختلفة (الخطوة 2-5-3)، و'3' ضمان خصائص سقالة متسقة بين عينات مختلفة (الخطوة 1-3).

وأخيرا، هناك حاجة إلى مزيد من الحذر عند تركيب سقالة electrospun على أنابيب السيليكون (الخطوة 2.3). على وجه التحديد ، عندما تحتاج سقالة electrospun الهشة إلى سحبها فوق أنابيب السيليكون الممتدة ، من المهم عدم تطبيق الكثير من القوة لمنع الكسب غير المشروع الكهربائي من التلف ، خاصة في داخل الكسب غير المشروع الكهربائي. إذا حدث ضرر في داخل الكسب غير المشروع electrospun ، إما من سحب قوي أو من امتداد ضعيف جدا من أنبوب السيليكون ، فإن مدى الضرر الذي لحق بألياف electrospun يصبح مرئيا فقط بعد حصاد البناء وتحليله. في الإعداد الحالي ، لا يمكن تأكيد نجاح البذر إلا عند الفلورة المناعية أو التحليل الكيميائي المناعي ، بعد التضحية بالعينة. ومع ذلك ، فإن إجراء البذر مع الفيبرين كحامل الخلية هو طريقة راسخة67 تؤدي عادة إلى توزيع خلايا متجانسة للسقالات ذات حجم المسام الكبير بما فيه الكفاية. واحدة من أهم الجوانب فيما يتعلق بذر الخلايا هو التأكد من أن السقالة جافة قدر الإمكان قبل البذر (الخطوة 4.4)، لمنع هلام الفيبرين مع الخلايا من المرور عبر السقالة الرطبة ، مما يؤدي إلى البذر غير الوراثي. وأخيرا ، على الرغم من أن طريقة إزالة التلوث من الكسب غير المشروع electrospun بالأشعة فوق البنفسجية وغمس في الإيثانول 30 ٪ ليست صارمة مثل تعقيم الطعوم electrospun أعدت لدراسات في الجسم الحي ، التي غالبا ما يتم تعقيمها بواسطة أكسيد الإيثيلين أو أشعة غاما ، ويكفي لتجارب زراعة المختبر التي يمكن أن تستمر لمدة تصل إلى 20 يوما دون أي علامات تلوث (على سبيل المثال ، انظر الشكل 3، الشكل 4، الشكل 5، الشكل 6، وفان هافتن ووزينغ (2020)44). وعلاوة على ذلك، فإن مادة PCL-BU المستخدمة هنا، لا تسمح بالتعرض الطويل لتركيزات الإيثانول العالية. يمكن اختيار طريقة التعقيم الأنسب اعتمادا على المواد المستخدمة.

بالإضافة إلى نتائج دراسات الثقافة المشتركة التي أجريت سابقا، يمكن إجراء مجموعة أوسع من الدراسات مع نفس النظام. وكان النظام يستخدم سابقا لأداء الاستزراع الأحادي الديناميكي للخلاياالعضلية الليفية (الشكل التكميلي 1A-B)والالضامة (الشكل التكميلي 1C-D)للتحقيق في آثار التحميل الديناميكي الدموي على أنواع الخلايا الفردية وإشارة الباراكورين الخاصة بهم19،43. أنظمة تحميل الهمودية المختلفة أسفرت عن اتجاه واضح الألياف أكتين في الخلايا الميوفيبروبلاست (الشكل التكميلي 1A) وترسب الكولاجين مختلفة بوضوح (الشكل التكميلي 1B) بعد 10 أيام. كان إنتاج السيتوكين بواسطة الضامة المشتقة من THP1 مختلفا بشكل كبير بين الأحمال الديناميكية الدموية المختلفة(الشكل التكميلي 1C)وأظهر ملفا شخصيا أكثر تأييدا للالتهابات عند تحميله(الشكل التكميلي 1D). وتشمل الاحتمالات الأخرى التي تم التحقق من صحتها تطبيق تدفق التذبذب، وذلك باستخدام مضخة إضافية ووحدة السوائل. يمكن زيادة لزوجة الوسط نحو نطاق لزوجة الدم (على سبيل المثال ، عن طريق إضافة علكة زانثان)69. تعديل اللزوجة المتوسطة يمثل متغير إضافي لتوسيع نطاق الضغوط القص المطبقة. وأخيرا، على الرغم من أن البروتوكول الموصوف يستخدم إعداد تكييف التدفق "Ibidi"، إلا أنه يمكن استخدام الإعدادات من الشركات المصنعة الأخرى أيضا، طالما أنه يمكن تطبيق أنظمة تدفق مماثلة.

واحدة من المزايا الرئيسية لاستخدام هذا النظام مفاعل حيوي هو بناء كبيرة نسبيا (حوالي 15 ملم × 10.5 ملم) التي يمكن تحميلها بشكل ديناميكي، مما يسمح لمجموعة واسعة من المعلمات قراءات ممكن أن تستخرج من عينة واحدة. في الوقت نفسه، قد ينظر إلى حجم البناء على أنه قيد أيضا، حيث يتطلب هذا الإعداد كمية كبيرة نسبيا من المواد (المكلفة أحيانا)، خاصة إذا تم استخدام الخلايا الأساسية، أو إذا كانت وسيطة الثقافة تتطلب إضافات مكلفة. علاوة على ذلك، الإنتاجية الإعداد منخفض نسبيا. وبالتالي، فإن الإعداد الحالي مناسب بشكل خاص للأبحاث التي تستند إلى الفرضية والتي يتم فيها اختبار عدد محدود من المتغيرات بشكل شامل، بدلا من فحص عدد كبير من المتغيرات ذات القراءة المحدودة. بالنسبة للتجارب المستقبلية، يتم إجراء تحسينات صغيرة على الإعداد الحالي لتمكين خيار تركيب سقالات أصغر وتصغير حجم الخزانات المتوسطة. وفيما يتعلق بالحجم الحالي للخزانات المتوسطة، يلزم للتمكين من الحصول على معدلات تدفق حجمية كافية لتحقيق ضغوط القص المطلوبة. يمكن تخفيض معدلات التدفق المطلوبة - ومع ذلك حجم الخزانات المتوسطة - عن طريق زيادة لزوجة الوسط (على سبيل المثال ، عن طريق إضافة علكة زانثان ، كما تم إنشاؤها مسبقا69).

في الختام، يسمح هذا المفاعل الحيوي بتقدير الآثار الفردية والمجمعة لإجهاد القص والتمدد الدوري على نمو الأنسجة وإعادة عرضها على مجموعة واسعة من سقالات المواد الحيوية ثلاثية الأبعاد الإيلاستوميرية. يمكن للممفاعلات الحيوي زراعة ما يصل إلى ثمانية بنيات الأوعية الدموية في ظل ظروف التحميل المختلفة. نظرا لتصميمه، فإن المفاعل الحيوي مناسب بشكل خاص لدراسة التفاعل بين الديناميكا الدموية وعمليات TE الوعائية في الموقع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

يتم دعم هذه الدراسة ماليا من قبل ZonMw كجزء من برنامج LSH 2Treat (436001003) ومؤسسة الكلى الهولندية (14a2d507). ن. أ. ك. تعترف بدعم مجلس البحوث الأوروبي (851960). ونعرب عن امتناننا لبرنامج الجاذبية "تجديد المواد المدفوعة"، الذي تموله المنظمة الهولندية للبحث العلمي (024.003.013).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM) Gibco 12491-015 cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil Julabo 8940012 prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen Sigma F8630 to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin Sigma T4648 to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge Eppendorf 5804 to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor - "kelly forceps" Almedic P-422 clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators Sanyo MCO-170AIC-PE for cell culturing
Compressed air reservoir Festo CRVZS-5 smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches Matlab R2017. The Mathworks, Natick, MA calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board National Instruments BNC-2090 data processing in between amplifier system and computer
Ethanol VWR VWRK4096-9005 to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS) Greiner 758087 cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet Assistant HE40567002 apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology n.a. part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax Gibco 35050061 cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera MotionScope M-5 to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens Nikon JAA616AB to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip ibidi GmbH 10821 block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads ibidi GmbH 10902 set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped) Swann Morton 0301; 0933 to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software National Instruments version 2018 to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light Labconco 302310001 to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes Greiner 664-160 for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C) Sigma A8960 cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500 Zeiss Schott AG to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps ibidi GmbH various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories) to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS) PEEKEL instruments B.V. n.a. to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders ibidi GmbH 10974 medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter Rubber BV 1805 to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software Idtvision 2.15.00 to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G) BD Microlance 301700 together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver Adson 2429218 to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues Kleenex 38044001 for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm Sigma P7793-1EA quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S) Lonza DE17-602E cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P4417-100TAB for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps Greiner 206202 to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder Festo AEVC-20-10-I-P to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length) SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands n.a. produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control) Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer BD TC-XX and P 10 EZ the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor Festo MPPES-3-1/8-2-010, 159596 provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) Gibco A1049101 cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL) Eppendorf 30120086 multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20% Sigma 5030 Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.  
Silicone O-rings Technirub 1250S to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness) Rubber BV 1805 to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL) Falcon 352095 multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle Ethicon, Johnson&Johnson EH7404H Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL) B. Braun Melsungen AG 2057932 to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm) Satorius 17597-K to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap Nunc 178983 to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap Nunc 156499 to culture static control samples
Teflon bellow Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel) PolarWare 15-248 for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers Wironit 4910 sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water Stakpure Omniapure UV 18200002 to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light Philips TUV 30W/G30 T8 for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chlupác, J., Filová, E., Bacáková, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiological Research. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
  2. Huygens, S. A., et al. Bioprosthetic aortic valve replacement in elderly patients: Meta-analysis and microsimulation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 157 (6), 2189-2197 (2019).
  3. Huygens, S. A., et al. Contemporary outcomes after surgical aortic valve replacement with bioprostheses and allografts: a systematic review and meta-analysis. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (4), 605-616 (2016).
  4. Loh, S. A., et al. Mid- and long-term results of the treatment of infrainguinal arterial occlusive disease with precuffed expanded polytetrafluoroethylene grafts compared with vein grafts. Annals of Vascular Surgery. 27 (2), 208-217 (2013).
  5. Tara, S., et al. Vessel bioengineering. Circulation Journal. 78 (1), 12-19 (2014).
  6. Huang, A. H., Niklason, L. E. Engineering of arteries in vitro. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (11), 2103-2118 (2014).
  7. Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M., Baaijens, F. P. T. Can we grow valves inside the heart? Perspective on material-based in situ heart valve tissue engineering. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 54 (2018).
  8. Fioretta, E. S., et al. Next-generation tissue-engineered heart valves with repair, remodelling and regeneration capacity. Nature Reviews Cardiology. , (2020).
  9. Kirkton, R. D., et al. Bioengineered human acellular vessels recellularize and evolve into living blood vessels after human implantation. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  10. Gutowski, P., et al. Arterial reconstruction with human bioengineered acellular blood vessels in patients with peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. , (2020).
  11. Syedain, Z., et al. Tissue engineering of acellular vascular grafts capable of somatic growth in young lambs. Nature Communications. 7 (12951), 12951 (2016).
  12. Sugiura, T., et al. Tissue-engineered vascular grafts in children with congenital heart disease: intermediate term follow-up. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery. 30 (2), 175-179 (2018).
  13. Kluin, J., et al. In situ heart valve tissue engineering using a bioresorbable elastomeric implant - material design to 12 months follow-up in sheep. Biomaterials. 125, 101-117 (2017).
  14. Fioretta, E. S., et al. Differential leaflet remodeling of bone marrow cell pre-seeded versus nonseeded bioresorbable transcatheter pulmonary valve replacements. JACC. Basic to Translational Science. 5 (1), 15-31 (2020).
  15. Van Haaften, E. E., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A. Vascular mechanobiology: towards control of. Cells. , 1-24 (2017).
  16. De Jonge, N., et al. Matrix production and organization by endothelial colony forming cells in mechanically strained engineered tissue constructs. PLoS ONE. 8 (9), 73161 (2013).
  17. Schmidt, J. B., Chen, K., Tranquillo, R. T. Effects of intermittent and incremental cyclic stretch on ERK signaling and collagen production in engineered tissue. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (1), 55-64 (2016).
  18. Luo, J., et al. Tissue-engineered vascular grafts with advanced mechanical strength from human iPSCs. Cell Stem Cell. 26 (2), 251-261 (2020).
  19. Van Haaften, E. E., et al. Decoupling the effect of shear stress and stretch on tissue growth and remodeling in a vascular graft. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (7), 418-429 (2018).
  20. Gupta, V., Tseng, H., Lawrence, B. D., Jane Grande-Allen, K. Effect of cyclic mechanical strain on glycosaminoglycan and proteoglycan synthesis by heart valve cells. Acta Biomaterialia. 5 (2), 531-540 (2009).
  21. Lin, S., Mequanint, K. Bioreactor-induced mesenchymal progenitor cell differentiation and elastic fiber assembly in engineered vascular tissues. Acta Biomaterialia. 59, 200-209 (2017).
  22. Venkataraman, L., Bashur, C. A., Ramamurthi, A. Impact of cyclic stretch on induced elastogenesis within collagenous conduits. Tissue Engineering. Part A. 20 (9-10), 1403-1415 (2014).
  23. Huang, A. H., et al. Biaxial stretch improves elastic fiber maturation, collagen arrangement, and mechanical properties in engineered arteries. Tissue Engineering Part C Methods. 22 (6), 524-533 (2016).
  24. Hinderer, S., et al. In vitro elastogenesis: instructing human vascular smooth muscle cells to generate an elastic fiber-containing extracellular matrix scaffold. Biomedical Materials. 10 (3), 034102 (2015).
  25. Eoh, J. H., et al. Enhanced elastin synthesis and maturation in human vascular smooth muscle tissue derived from induced-pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 52, 49-59 (2017).
  26. Smits, A. I. P. M., Bouten, C. V. C. Tissue engineering meets immunoengineering: Prospective on personalized in situ tissue engineering strategies. Current Opinion in Biomedical Engineering. 6, 17-26 (2018).
  27. Wissing, T. B., Bonito, V., Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M. Biomaterial-driven in situ cardiovascular tissue engineering-a multi-disciplinary perspective. npj Regenerative Medicine. 2 (1), 18 (2017).
  28. Hibino, N., et al. A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts. The FASEB Journal. 25 (12), 4253-4263 (2011).
  29. Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. Macrophages are required for adult salamander limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).
  30. Godwin, J. W., Debuque, R., Salimova, E., Rosenthal, N. A. Heart regeneration in the salamander relies on macrophage-mediated control of fibroblast activation and the extracellular landscape. npj Regenerative Medicine. 2 (1), 22 (2017).
  31. McBane, J. E., Cai, K., Labow, R. S., Santerre, J. P. Co-culturing monocytes with smooth muscle cells improves cell distribution within a degradable polyurethane scaffold and reduces inflammatory cytokines. Acta Biomaterialia. 8 (2), 488-501 (2012).
  32. Battiston, K. G., Ouyang, B., Labow, R. S., Simmons, C. A., Santerre, J. P. Monocyte/macrophage cytokine activity regulates vascular smooth muscle cell function within a degradable polyurethane scaffold. Acta Biomaterialia. 10 (3), 1146-1155 (2014).
  33. Ploeger, D. T., et al. Cell plasticity in wound healing: paracrine factors of M1/ M2 polarized macrophages influence the phenotypical state of dermal fibroblasts. Cell Communication and Signaling. 11 (1), 29 (2013).
  34. McBane, J. E., Santerre, J. P., Labow, R. S. The interaction between hydrolytic and oxidative pathways in macrophage-mediated polyurethane degradation. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 82 (4), 984-994 (2007).
  35. Wissing, T. B., et al. Macrophage-driven biomaterial degradation depends on scaffold microarchitecture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 87 (2019).
  36. Wolf, M. T., Vodovotz, Y., Tottey, S., Brown, B. N., Badylak, S. F. Predicting in vivo responses to biomaterials via combined in vitro and in silico analysis. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (2), 148-159 (2015).
  37. Grotenhuis, N., Bayon, Y., Lange, J. F., Van Osch, G. J. V. M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M. A culture model to analyze the acute biomaterial-dependent reaction of human primary macrophages. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 115-120 (2013).
  38. Jannasch, M., et al. A comparative multi-parametric in vitro model identifies the power of test conditions to predict the fibrotic tendency of a biomaterial. Scientific Reports. 7 (1), 1689 (2017).
  39. Wang, Z., et al. The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(ε-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration. Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).
  40. McWhorter, F. Y., Davis, C. T., Liu, W. F. Physical and mechanical regulation of macrophage phenotype and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (7), 1303-1316 (2014).
  41. Ballotta, V., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Strain-dependent modulation of macrophage polarization within scaffolds. Biomaterials. 35 (18), 4919-4928 (2014).
  42. Dziki, J. L., et al. The effect of mechanical loading upon extracellular matrix bioscaffold-mediated skeletal muscle remodeling. Tissue Engineering. Part A. 24 (1-2), 34-46 (2018).
  43. Wissing, T. B., et al. Hemodynamic loads distinctively impact the secretory profile of biomaterial-activated macrophages - implications for in situ vascular tissue engineering. Biomaterials Science. 8 (1), 132-147 (2020).
  44. Van Haaften, E. E., Wissing, T. B., Kurniawan, N. A., Smits, A. I. P. M., Bouten, C. V. C. Human in vitro model mimicking material-driven vascular regeneration reveals how cyclic stretch and shear stress differentially modulate inflammation and matrix deposition. Advanced Biosystems. 4 (6), 1900249 (2020).
  45. Ballotta, V., Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Synergistic protein secretion by mesenchymal stromal cells seeded in 3D scaffolds and circulating leukocytes in physiological flow. Biomaterials. 35 (33), 9100-9113 (2014).
  46. Bonito, V., de Kort, B. J., Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M. Cyclic strain affects macrophage cytokine secretion and extracellular matrix turnover in electrospun scaffolds. Tissue Engineering Part A. 25 (17-18), 1310-1325 (2019).
  47. Battiston, K. G., Labow, R. S., Simmons, C. A., Santerre, J. P. Immunomodulatory polymeric scaffold enhances extracellular matrix production in cell co-cultures under dynamic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 24, 74-86 (2015).
  48. Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. A mesofluidics-based test platform for systematic development of scaffolds for in situ cardiovascular tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (6), 475-485 (2012).
  49. Smits, A. I. P. M., Ballotta, V., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. T. Shear flow affects selective monocyte recruitment into MCP-1-loaded scaffolds. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (11), 2176-2188 (2014).
  50. Ballotta, V., Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Synergistic protein secretion by mesenchymal stromal cells seeded in 3D scaffolds and circulating leukocytes in physiological flow. Biomaterials. 35 (33), 9100-9113 (2014).
  51. Fahy, N., Menzel, U., Alini, M., Stoddart, M. J. Shear and dynamic compression modulates the inflammatory phenotype of human monocytes in vitro. Frontiers in Immunology. 10, 383 (2019).
  52. Pennings, I., et al. Layer-specific cell differentiation in bi-layered vascular grafts under flow perfusion. Biofabrication. 12 (1), 015009 (2019).
  53. Wang, J., et al. Ex vivo blood vessel bioreactor for analysis of the biodegradation of magnesium stent models with and without vessel wall integration. Acta Biomater. 50, 546-555 (2017).
  54. Huang, A. H., et al. Design and use of a novel bioreactor for regeneration of biaxially stretched tissue-engineered vessels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (8), 841-851 (2015).
  55. Huang, A. H., Niklason, L. E. Engineering biological-based vascular grafts using a pulsatile bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (52), e2646 (2011).
  56. Bono, N., et al. A Dual-mode bioreactor system for tissue engineered vascular models. Annals of Biomedical Engineering. 45 (6), 1496-1510 (2017).
  57. Wolf, F., et al. VascuTrainer: a mobile and disposable bioreactor system for the conditioning of tissue-engineered vascular grafts. Annals of Biomedical Engineering. 46 (4), 616-626 (2018).
  58. Ramaswamy, S., et al. A novel bioreactor for mechanobiological studies of engineered heart valve tissue formation under pulmonary arterial physiological flow conditions. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (12), 121009 (2014).
  59. Piola, M., et al. A compact and automated ex vivo vessel culture system for the pulsatile pressure conditioning of human saphenous veins. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (3), 204-215 (2016).
  60. Vanerio, N., Stijnen, M., de Mol, B. A. J. M., Kock, L. M. An innovative ex vivo vascular bioreactor as comprehensive tool to study the behavior of native blood vessels under physiologically relevant conditions. Journal of Engineering and Science in Medical Diagnostics and Therapy. 2 (4), (2019).
  61. Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplantation. 27 (9), 1375-1389 (2018).
  62. Sinha, R., et al. A medium throughput device to study the effects of combinations of surface strains and fluid-flow shear stresses on cells. Lab on a Chip. 15 (2), 429-439 (2015).
  63. Beca, B. M., Sun, Y., Wong, E., Moraes, C., Simmons, C. A. Dynamic bioreactors with integrated microfabricated devices for mechanobiological screening. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 581-592 (2019).
  64. Liu, H., Usprech, J., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform with hydrogel arrays for 3D mechanical stimulation of cells. Acta Biomaterialia. 34, 113-124 (2016).
  65. Szafron, J. M., Ramachandra, A. B., Breuer, C. K., Marsden, A. L., Humphrey, J. D. Optimization of tissue-engineered vascular graft design using computational modeling. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 561-570 (2019).
  66. Emmert, M. Y., et al. Computational modeling guides tissue-engineered heart valve design for long-term in vivo performance in a translational sheep model. Science Translational Medicine. 10 (440), (2018).
  67. Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26 (16), 3113-3121 (2005).
  68. van Kelle, M. A. J., et al. A Bioreactor to identify the driving mechanical stimuli of tissue growth and remodeling. Tissue Engineering Part C: Methods. 23 (6), (2017).
  69. van den Broek, C. N., et al. Medium with blood-analog mechanical properties for cardiovascular tissue culturing. Biorheology. 45 (6), 651-661 (2008).

Tags

الهندسة، العدد 166، هندسة الأنسجة في الموقع، القلب والأوعية الدموية، ترقيع الأوعية الدموية المهندسة بالأنسجة (TEVGs)، الضامة، الورم العضلي، الثقافة المشتركة، الإجهاد، إجهاد القص، الديناميكا الدموية، السقالة، في المختبر، الميكانيكا الحيوية
مفاعل حيوي متعدد العظة لتقييم القدرة الالتهابية والتجديدية للمواد الحيوية تحت التدفق والتمدد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koch, S. E., van Haaften, E. E.,… More

Koch, S. E., van Haaften, E. E., Wissing, T. B., Cuypers, L. A. B., Bulsink, J. A., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A., Smits, A. I. P. M. A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch. J. Vis. Exp. (166), e61824, doi:10.3791/61824 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter