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Engineering

フローとストレッチの下でバイオ材料の炎症と再生能力を評価するマルチキューバイオリアクター

Published: December 10, 2020 doi: 10.3791/61824
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1, 1,2, *1,2, *1,2
1Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems (ICMS), Eindhoven University of Technology
* These authors contributed equally

Summary

このプロトコルの目的は、剪断応力と環状ストレッチの分離を可能にするバイオリアクターを使用して、材料駆動組織再生を調査するために、管状の電気スピン足場でヒトマクロファージと筋線維芽細胞の動的共培養を実行することです。

Abstract

体内で直接再生を誘導する再ソーブルバイオマテリアルの使用は、翻訳の観点から魅力的な戦略です。このような物質は、移植時に炎症反応を誘発し、これは材料のその後の再吸収および新しい組織の再生の原動力である。この戦略は、現場組織工学としても知られており、組織工学的に設計された血管移植片などの心血管置換を得るために追求される。炎症と再生プロセスの両方は、足場上の局所的な生体力学的手がかり(すなわち、ストレッチおよび剪断応力)によって決定される。ここでは、管状足場上のストレッチとせん断応力の分離を独自に可能にするカスタム開発バイオリアクターの使用について詳しく説明する。これにより、よく制御された機械的負荷の影響下での管状足場の炎症および再生能力の体系的かつ標準化された評価が可能となり、ヒトマクロファージおよびミオ線維芽細胞を用いた動的共培養実験に基づいて実証する。このアプローチの主要な実践的なステップ(バイオリアクターの構築とセットアップ、足場と細胞の播種の準備、ストレッチとせん断の流れの適用とメンテナンス、分析用のサンプル採取)について詳しく説明します。

Introduction

心臓血管組織工学(TE)は、患者1、2、3、4の大コホートに最適でない現在使用されている永久的な心臓血管補修(例えば、血管移植片、心臓弁置換術)に対する代替治療選択肢として追求されている。多くの求められているアプリケーションは、組織工学的に設計された血管移植片(TEVGs)5、6および心臓弁(TEHV)7、8を含む。ほとんどの場合、心臓血管TEの方法論は、新しい組織が形成される有益な足場として機能する再ソーブルバイオマテリアル(天然または合成のいずれか)を利用する。新しい組織の形成は、細胞で足場を播種し、移植前にバイオリアクターで培養することによって完全にインビトロで設計することができる(in vitroTE)9、10、11、または合成足場が体内に新しい組織の形成を直接誘導するために前培養せずに移植されるその中で直接(situ TEにおいて)12,12, 13.in vitroとininin心臓血管TEアプローチの両方について、機能的再生の成功は、移植された構築物に対する宿主免疫応答および適切な生体力学的負荷の両方に主に依存する。

心血管TEのための生体力学的負荷の重要性は、十分に認められている15.心臓血管インプラントの場合、足場に入る細胞は、血行力学的環境の結果として生じる周期的なストレッチおよびせん断ストレスにさらされる。多くの研究は、様々な細胞タイプによる、例えばコラーゲン16、17、18、19、グリコサミノグリカン(GAGs)20、およびエラスチン21、22、などのマトリックス成分の形成に対する(環状)ストレッチの刺激効果を報告している。例えば、Huang et al. は、二軸ストレッチが血管バイオリアクター23を用いてインビトロTEVGsにおけるコラーゲンおよびエラスチンの堆積および組織を上昇させたことを実証した。主な負荷として強調される一方で、これらの研究は、多くの場合、サンプルがせん断流に曝露されるフロー駆動のバイオリアクターを利用しています。シアストレスが3Dの組織形成や炎症に及ぼす孤立した影響については比較的ほとんど知られていないが、いくつかのデータが利用可能である。例えば、ヒンダーらおよびEohら.は、剪断流が、3D足場微細構造に加えて、インビトロモデルシステム24、25におけるヒト血管平滑筋細胞による成熟エラスチンの形成にとって重要であることを実証した。全体として、これらの知見は、心血管TEの環状ストレッチとせん断ストレスの両方の関連性を示している。

TEインプラントの成功または失敗に対するもう一つの重要な決定要因は、移植された移植片26に対する宿主の免疫応答である。これは、細胞流入および内因性組織形成および再モデリング27のその後のプロセスを開始するために足場に対する急性炎症反応に実際に依存する、その中での物質駆動のTE戦略にとって特に重要である。マクロファージは、機能的組織再生の重要なイニシエータであり、複数の研究28、29、30によって示されている。創傷治癒に類似して、組織の再生は、マクロファージと線維芽細胞と筋線維芽細胞31、32、33などの組織産生細胞との間のパラクリンシグナル伝達によって支配される。新しい組織堆積の調整に加えて、マクロファージは、外来足場材料34、35の活性再吸収に関与している。このように、生体材料に対するインビトロマクロファージ応答は、インプラント36、37、38の生体内成功の予測パラメータとして同定されている。

埋め込まれた足場に対するマクロファージ応答は、材料組成および微細構造35、39、40などの足場設計特徴に依存する。足場の特性に加えて、足場に対するマクロファージ応答および筋線維芽細胞とのクロストークも血行力学的負荷の影響を受ける。例えば、環状ストレッチは、マクロファージ表現型41、42、43、44およびサイトカイン43、44、45、46の分泌の重要なモジュレーターであることが示された。マクロファージと血管平滑筋細胞の共培養システムを用いて、Battistonらは、マクロファージの存在がエラスチンおよびGAGのレベルの増加につながり、適度なレベルの環状ストレッチ(1.07-1.10)がコラーゲンIおよびエラスチン47の沈着を刺激することを実証した。これまでの研究では、剪断応力が3Dエレクトロスパン足場48,49への単球採用にとって重要な決定要因であり、剪断応力と環状ストレッチの両方がヒト単球と間葉間質細胞50との間のパラクリンシグナル伝達に影響を及ぼすことを実証した。Fahy et al. は、剪断流がヒト単球51による炎症性サイトカインの分泌を増加することを実証した。

まとめると、上記の証拠は、血行力学的負荷の十分な理解と制御が心血管TEにとって重要であり、これを達成するために炎症反応を考慮することが重要であることを示しています。多数のバイオリアクターが、心血管組織のinvitro 52、53、54、55、56、57、58またはex vivo 59、60、61培養物について以前に説明されている。しかし、これらのシステムはすべて、可能な限り生理学的な血行負荷条件を模倣するように設計されています。これは、体外で心血管組織を作成したり、エキビボ培養を維持する目的で非常に貴重であるが,そのようなシステムは、個々の手がかりの個々の効果に体系的な研究を可能にしません.これは、これらのバイオリアクターにおける環状ストレッチとせん断応力の両方の適用は、本質的にそれらをリンクする同じ加圧流によって駆動されるためです。正確なマルチキュー機械操作を可能にするマイクロシステムは、2D基板62または3Dハイドロゲルセットアップ63、64のために記述されているが、そのようなセットアップは、エラストマー3D生体材料足場の組み込みを可能にしていない。

ここでは、せん断応力と環状ストレッチの分離を独自に可能にし、個々の効果と組み合わせた効果を機械論的に調査するのに役立つ管状バイオリアクターシステムの適用を提示する。このシステムは、多種多様な組織工学的に設計された血管移植片(例えば、合成または天然起源、異なるマイクロアーキテクチャ、様々な多孔質)の試験を可能にする。せん断応力とストレッチの適用を効果的に切り離すために、バイオリアクターが使用する重要な概念は、(1)異なるポンプシステムを使用したせん断応力とストレッチの制御の分離と(2)計算駆動寸法を持つ「インサイドアウト」方式で足場の刺激です。流れは流れポンプの使用によって管状足場の外面に適用され、足場の周伸張は、足場が別のひずみポンプを使用して取り付けられるシリコーン管を拡大することによって誘発される。シリコンチューブと構成体を含むガラス管の寸法は、スキャフォールド(流れによる)と周伸縮(チューブ膨張による)のせん断応力が互いに大きな影響を与えないようにするために、計算流体力学シミュレーションを使用して慎重に選択され、検証されます。この裏返しの設計には、いくつかの実用的な根拠があります。ストレッチが(生理学的負荷に似た)発光流体圧力によって適用される場合、サンプル設計は本質的に漏れのないものでなければなりません。さらに、サンプルの伸張に必要な圧力は、サンプルの剛性によって完全に決定され、サンプル間およびサンプル内で時間の経過とずれによって変化し、ストレッチの制御が困難になります。このバイオリアクターは、シリコーンチューブの周りに組織工学的に設計された移植片を取り付け、移植片の外壁に壁せん断応力(WSS)の適用を可能にし、内部から移植片を加圧する。このようにして、サンプルとサンプル内の間の等しい負荷条件を時間をかけて確保することができ、また、多孔性血管足場19に対して一般的であるように、サンプルが漏れやすい状態が許される。この内部出力バイオリアクターは、従来の血管バイオリアクターのセットアップがより適しているインビトロのネイティブのような血管のエンジニアリングではなく、せん断および/またはストレッチの効果に関する体系的な研究のために特に意図されています。バイオリアクター設計図面の 図1A-B およびそれに対応する 表1 を参照して、バイオリアクターの主要成分の背後にある機能の説明と根拠を確認してください。

バイオリアクターの使用は、我々は、その現場の心血管組織19、43、44における再ソーブルエレクトロスパン足場における炎症および組織形成に関する剪断ストレスおよび環状ストレッチの個々および組み合わせた影響を調査した我々のグループによる一連の最近の研究に基づいて実証される。そのために、ヒトマクロファージと筋線維芽細胞をモノ培養または共培養で使用して、イン・シチュの再生カスケードの様々な相をシミュレートしました。ヒトマクロファージによるサイトカイン分泌は、周期的な伸縮とせん断応力の両方によって明らかに影響を受け、これらの足場におけるヒト筋線維芽細胞によるマトリックス沈着および組織に影響を及ぼすことを実証した。特に、これらの研究は、せん断応力とストレッチの併用の場合、組織形成および炎症への影響が2つの負荷のいずれかによって支配されるか、または両方の負荷の相乗効果があることを明らかにした。これらの知見は、両方の負荷を分離して、TE プロセスにおける機械的環境の寄与をより深く理解する関連性を示している。この理解は、関連する血行負荷のレジームでスキャフォールド設計パラメータを体系的に最適化するために適用できます。さらに、このような十分に制御された環境からの機械化データは、TEV65またはTEHV66に対して最近報告されているように、その場での組織改修の経過を予測するために開発されている数値モデルの入力として役立つ可能性があり、予測能力をさらに向上させる。

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Protocol

本プロトコルに記載された研究では、冠状動脈通過手術後にサペヌス静脈から分離された末梢血バフィーコートおよびヒト筋線維芽細胞から分離されたヒトマクロファージの原発が44に用いられている。バフィーコートは、サンキン研究制度医学倫理委員会によって承認された書面によるインフォームド・コンセントを提供した健康で匿名のボランティアから入手されました。ヒトのサペナ細胞(HVSC)の使用は、オランダの医療学会(FMWV)が開発した「ヒト組織のコード適正な二次使用」に従った。

1. バイオリアクターをセットアップする前の一般的な準備と必要なアクション

注: それぞれの分離と培養プロトコルの詳細については、前の作業19、43、44を参照してください。プロトコル内のすべての計算は、8つの血球と筋線維芽細胞を用いた共培養実験の例として与えられ、8つの血球にロードされた足場および2つの静的制御(n=10)に播種される。

  1. 細胞分離と細胞培養を開始します。単球と筋線維芽細胞の共培養サンプル(播種比2:1)の播種密度は、それぞれ30×106 単球/cm3 および15×106 筋線維芽細胞/cm3である。
    メモ:エレクトロスパン材料は、高い空隙率(>90%)を有しています。グラフト当たりの必要な細胞数を推定するために、足場の体積は中空円柱の体積の式で計算されます: π*(厚さ)2*長さ≈ 0.04 cm3.移植片当たりの細胞の総量は1.2×106単球、0.6×106筋線維芽細胞である。10個のサンプルの場合、少なくとも12×106個の単球と6×106の筋線維芽細胞が必要です。ピペットのエラーの可能性を考慮して、最大〜10〜15%以上のセルで開始します。
  2. バイオリアクターを用いた実験に用いられる細胞培養培地を脱気する。
    1. RPMI-1640:aDMEM(1:1)で構成される共培養用培地を調製し、10%のウシ胎児血清、1%ペニシリンストレプトマイシン、0.5%L-グルタミンを添加します。
    2. 培地を一晩(O/N)を、フィルターキャップを付けて脱気する細胞培養フラスコの培養フラスコにインキュベーターに入れます。
    3. フィルターキャップを気密キャップに交換し、4°Cで保管してください。
    4. 使用直前に、0.25 mg/mL L-アスコルビン酸2リン酸(ビタミンC)を培地に加えます。
      注:計算のために、流れの培養チャンバーあたりの必要な媒体の量は50 mLである。週に 3 回メディアを更新します。25 mL古い培地は25 mLの新鮮な培地に置き換えられます。10サンプルの場合。播種後、合計500mLの新鮮な培地が必要となり、その後の培地交換ごとに、合計250mLの新鮮な培地が使用されます。常に新鮮な培地を準備し、特に、ビタミンCは培地を変更する直前に添加する必要があります。
  3. Van Haaften らの説明に従って等方性電気スパン足場 (3 mm の光径、200 μm の壁厚さ) を準備します (図1 G-I)。簡単に言えば、管状ポリカプロラクコンバイシュレーナ(PCL-BU)足場は、クロロホルムポリマー溶液の15%(w/w)からエレクトロスピニングすることによって製造される。ポリマー溶液は、室温および相対湿度30%で、40μL/minの流速、回転円筒形目標(Ø 3mm、500 rpm)から16cmの距離、およびエレクトロスピニングノズルで16kV、目標に-1kVの印加電圧である。
    注:PCL-BU移植片はこれらの実験に使用されましたが、このバイオリアクターに多種多様なエラストマー組織を組み込むことができます(例えば、異なる合成起源または天然起源、異なるマイクロアーキテクチャ、異なる多孔質)
    1. マンドレルから電気スパン足場を取り除きます。
      1. 15 mLチューブのキャップに小さな穴を開けて、中央にマンドレルを「保持」し、チューブの壁に触れないようにします。
      2. エレクトロスパンの足場を持つマンドレルをハヤブサチューブに入れ、脱イオン水で満たします。
      3. チューブO/Nを-20°Cで凍らせます。
      4. チューブを室温(RT)に置き、数分後にマンドレルを引き抜き、エレクトロスパングラフトを氷の中に残します。
      5. 氷を完全に解凍し、解凍した水からエレクトロスパンチューブを取り出し、数時間垂直に乾燥するように「ハング」します。足場が自分の体重で「崩壊」しないことを確認してください。
    2. 真空O/Nの下で乾燥した足場。
    3. 走査型電子顕微鏡(SEM)を用いたエレクトロスパングラフトの小サンプルを画像化して、その微細構造(例えば、繊維形態、繊維径)を評価する。この研究例の移植片は、等方性繊維配向と繊維径5μmを有する(図1H-I)。
  4. 実験を開始する前日に、脱イオン水で満たされた油圧貯留層をインキュベーターに入れます。白い Luer キャップを使用して、フロー培養チャンバーの 8 つの接続をすべて閉じます。圧縮空気システムに接続し、圧力センサを挿入します。テフロンベローズの小さな拡張を可能にするために、ひずみポンプ(ステップ5.6を参照)O/Nを実行します。
    注:メーカーのプロトコルに従って、または手順7.3-7.6に記載されているように、必要なすべての材料および機器が洗浄および/またはオートクレーブされていることを確認してください( 材料表、材料がオートクレーブされる材料を許可するコメント/説明欄を参照してください)。
  5. プロトコルの残りの部分のための無菌の労働条件を確認してください。
    1. 手順 2 ~ 5.3 (システムの設定)、ステップ 6.3 (中程度の変更)、および手順 7.1 ~ 7.2 (血管構造の収穫) を無菌層流れキャビネットで実行します。
    2. 閉じたペトリ皿の後続のステップに直接必要とされない材料を置き、可能な限り清潔に保ちます。
    3. 70%エタノールで紙のティッシュを浸すことによって定期的にきれいまたは乾燥した材料表面、およびバイオリアクターコンポーネントおよび層流キャビネットの表面を拭く。

2. バイオリアクターのセットアップ

注: 手順 2 を層流キャビネットで実行します。

  1. エレクトロスパンスキャフォールドを約25mmの長さのチューブに切り、使用前にそれらを文書化します(例えば、長さの写真は、初期質量のバランスで重量を量ります)。
  2. エレクトロスパン足場を除染します。
    1. 電気スパンスキャフォールドをウェルプレートまたはペトリ皿に傾け、1つの開口部を紫外線(UV)光源に向けて置き、UV光(253.7 nm)が足場の内側を照らします。
    2. 5分間、電気スパン足場をUV光に当てろ。
    3. すべての足場を回し、他の開口部の UV 照明を繰り返します。
      注:このステップの後、必要なときだけエレクトロスパン足場に触れてください。常にきれいなピンセットまたはきれいな手袋を使用してください。
    4. 70%に貯蔵されている流れの培養室のガラス管を取り、超純水でガラス管を洗い、乾燥し、そして大きく、閉じたペトリ皿に置く。
      注: 次の手順、特に手順 2.3 ~ 2.5 は、2 人の実験者が実行するのが理想的です。
  3. エレクトロスパンスキャフォールドをシリコンチューブに取り付けます。
    1. 5-0プロレン縫合糸をチューブの片側を通ってもう一方の端から縫合を取り出し、チューブの断面にまたがる2つの反対側のトート縫合糸を残して、シリコーンチューブの一方の端に取り付けます。結び目の軌跡でチューブを圧縮しながら、チューブの両側に小さな結び目を作り、両方の結び目に約10 cmのワイヤーを残します。2本の10cm左ワイヤーの端に3番目の結び目を作ります。
      1. 縫合針と、エレクトロスパン足場の内側に損傷を与える可能性のあるすべてのフリースレッドを切断します。シリコンチューブの端を三角形に切り取り、エレクトロスパン足場を通してシリコーンチューブを引っ張るのを助けます。
    2. エレクトロスパンスキャフォールドを30%エタノールに浸し(これは余分な除染ステップとして機能し、シリコンチューブの上にエレクトロスパン足場を滑らせるのに役立ちます)、電気スパン足場を無料の10cmワイヤーの上に置きます。実験者Aは、シリコーンチューブと10cm縫合線の結び目の両方を優しく引っ張ってシリコーンチューブを伸ばし、実験者Bはスキャフォールドの損傷を防ぐために滑らかな内側の先端を持つピンセットを使用して、シリコンチューブの上にエレクトロスパン足場を優しくスライドさせます。
    3. シリコーンチューブのストレッチをゆっくりと解放すると同時に、ピンセットでエレクトロスパンスキャフォールドを滑らかにします。超純水にシリコンチューブにエレクトロスパンスキャフォールドを2回浸します。
      メモ:エレクトロスパン足場のしわが発生する可能性があります。このしわは、ステップ2.5.3で圧力導管に足場を固定する前に、適用されたプリストレッチの間に消えます。
    4. 他のエレクトロスパンスキャフォールドについて、手順 2.3.2 と 2.3.3 を繰り返します。シリコーンチューブの長さに応じて、複数のエレクトロスパン足場を同じシリコンチューブに取り付けることができます。
    5. すべてのエレクトロスパンスキャフォールドがシリコーンチューブに取り付けられている場合は、足場の周りのシリコーンチューブを同じ長さ(5.5 cm)に切ります。一方の側で、電気スパン足場の端に近い反対側で、フリーシリコーンチューブの〜2〜3 cmを残します。
  4. 流量培養チャンバーの底部を構築する(図1A–B)。
    1. フロー出口を含む底部の上部を取り、男性のLuerプラグでフロー出口を閉じます。
    2. 圧力導管を下のコンパートメントに穴を開けて押し、漏れを防ぐために圧力導管の下端の周りにシリコーンOリングを置きます。下部コンパートメントの下部を下部コンパートメントの上部にねじ込み、圧力導管を固定します。圧力導管の下に刻まれた溝が、下側区画のアダプターブッシングの端から約 3 ~ 5 mm 上に収まっていることを確認します。これは後で縫合線のタイトな結び目を「保持」し、シリコンチューブの上にエレクトロスパン足場を固定します。
      注: 圧力導管を上下に簡単に操作できる場合は、底部が十分に固定されないことを示します。ステップ 2.4.2 を繰り返して、後の段階で漏れを防ぎます (図 2D)。
  5. エレクトロスパン足場でシリコーンチューブを圧力導管に固定します。
    1. 圧力導管の上にエレクトロスパン足場でシリコーンチューブを引っ張ります。
    2. 圧力導管に刻まれた溝の位置にあるエレクトロスパン足場の下端に縫合線を使用して結び目を作ります。反対側に2番目の結び目を作り、エレクトロスパングラフトでシリコーンチューブをしっかりと固定します。
      注意: これは重要なステップです。水圧貯留所から流れの培養チャンバーへの水の漏出を防ぐために、圧力導管の刻まれた溝に結び目が正確に「落ちる」ことを確認してください。不明な場合は、溝の予想位置の上または下のいくつかの位置で縫合線を締めて、最終的な結び目が刻まれた溝にあることを確認します(図2A)。
    3. シリコーンチューブの上端にシリコーンチューブを上方に伸ばしてシリコーンを上に伸ばします(これは直接最初の結び目をテストしますが、電解管の上に電気スピン足場を持つシリコーンチューブを移動させることができれば、十分に締め付けできませんでした)。引っ張り力によって、シリコーン管は前伸張される。シリコーンチューブが異なるサンプル間で一貫していることを確認するには、シザークランプに定規を取り付けます。定規の下端が足場の下端の高さに達するまで、はさみクランプを上方に引っ張ります。
      注:2つの理由から、各サンプルのプリストレッチをほぼ同じ(〜5%)保つことが重要です:(1)シリコーンチューブがプリストレッチされている場合、加圧時にサンプルの長さに沿ってより均一な膨張が生じ、(1)(2)プリストレッチはシリコーンの機械的特性に影響を与えるので、サンプル間の等しいストレッチ条件を確保するために、すべてのサンプルで同じである必要があります。
    4. エレクトロスパンスキャフォールドを優しく引っ張って、エレクトロスパンスキャフォールドのしわを取り除きます。再度、両側に、圧力導管の上部に刻まれた溝の位置にあるスキャフォールドの上端に縫合線を使用して、2 つのノットを作成します。
    5. シザークランプを外し、シリコーンチューブの余分をナイフで切り取り、シリコーンチューブで覆われたネジねじの20~30%を残して、鼻コーンがネジに取り付けられているときに漏れを防ぎます。
      注: すべての動的サンプルについて、手順 2.4 と 2.5 を繰り返します。
    6. 静電気制御サンプルの場合、シリコンチューブに取り付けられたエレクトロスパン足場を穴のない圧力導管に固定します。これらの導管は、播種(ステップ4)まで15 mLチューブに別々に保管することができ、フロー培養室コンパートメントに取り付ける必要はありません。
  6. 一部構築された流量培養チャンバーを、10分間UV光にさらして、エレクトロスパンスキャフォールドで除染します。電気スパン足場で流量培養チャンバーを反対側に回し、UV光露光を10分間繰り返します。
  7. 圧力導管のねじに鼻コーンをねじ込み、ダイナミックサンプル用の穴を開けます。
    1. シリコーンチューブの上端が後の段階で漏れを防ぐために、ノーズコーンに収まることを確認してください。シリコーンチューブが多すぎる場合は、ナイフでチューブの余分を切り取ります。
    2. 部分的に構築されたフロー培養チャンバーを大きなペトリ皿に入れ、鼻コーンをUV光源に向けます。5分間UV照明を適用します。
  8. フロー培養チャンバーのガラス管と上部コンパートメントを備えたフロー培養チャンバーの完成した構造(図1A–B)。
    1. シリコンチューブとエレクトロスパンスキャフォールドを30%エタノールに入れて圧力導管を浸し、続いて超純水に2回浸漬して、エレクトロスパンスキャフォールドを予め濡らした。
    2. 圧力管の上にガラス管を置き、底部にそっと押し込み、そっと固定します。
    3. 流れ入口を含む上部コンパートメントを取り、シリコーンOリング、フローストレートナー、およびアダプタブッシングを正しい順序(図1A–B)に配置し、ガラス管の開いた端に置き、穏やかに固定します。
    4. 上部コンパートメントのフロー入口に白いルアーキャップをねじ込みます。
    5. 下部コンパートメントのフロー出口からオスのLuerプラグを取り外し、エタノールを浸した紙ティッシュで周囲の表面をきれいにします。
    6. 流出口に10mLの超純水を入れたシリンジを入れ、上部コンパートメントの白いルアーキャップを開け、チャンバーに超純水を充填します。白いLuerキャップをもう一度閉じ、注射器を取り出し、エタノールで再びきれいにし、雄のLuerプラグでフローアウトレットを閉じます。
      注: すべての流れ培養チャンバーに対して、手順 2.6 ~ 2.8 を繰り返します。
    7. 静電気制御の場合、穴のない圧力導管に取り付けられたサンプルを保持する15 mLの管に10mLの超純水を加えます。
  9. すべてのフロー培養チャンバーをインキュベーターに入れます。ステップ2.8.5と2.8.6で説明したのと同じ方法で細胞播種する前の1日前に超純水を培養培地に置き換えます(フロー出口に直接置かれたエタノール浸し紙組織で「古い」超純水を収集してください)。

[プロトコルはここで一時停止することができます]

3. フローポンプのセットアップの準備

注: 層流キャビネットでステップ 3 を実行します。

  1. すべてのポンプセットアップ材料を収集し、使用の準備をします。
    注: 実験者は、ポンプ、流体ユニット、および流体ユニットのバルブを通る中型チューブの設定の詳細な説明については、製造元のプロトコルに言及されています。
    1. ポンプを200mbar容量に設定します。
    2. 60 mLのリザーバを流動ユニットにネジ込みます。
    3. 再使用可能なゴム製エアフィルターをエタノールに浸した紙のティッシュできれいにし、エアフィルターが乾燥したままであることを確認しなさい。
  2. 60 mL の貯留層を貯留槽のホールダーに置き、流体ユニットのバルブを通して標準の媒体の管を置きます。メスのLuerロックカプラを使用して、中径を大きくして囲まれたループに接続します。
  3. 中チューブをホースクリップで、貯水池の真下にクランプします。
  4. 60 mLの貯蔵所につき25mLの培養培地で貯水槽を満たします。ホースクリップを放し、媒体をチューブに入れます。
  5. ゴム製エアフィルターで媒体貯留を閉じ、フローポンプをインキュベーターにステップ4まで置きます。

4. フィブリンを細胞キャリアとして使用した細胞播種

注: 手順 4 を層流キャビネットで実行します。

  1. フィブリンゲルを細胞の播種工程に備えて準備します。詳細については、Mol et al.67 フィブリンゲルについては、フィブリノーゲン溶液の最終濃度が10mg/mL(タンパク質ストックの純度に対して正しい)を有し、トロンビン溶液の最終濃度は10 U/mLであるべきである。
    1. フィブリノーゲンをRTに解凍し、赤い蓋をしたプラスチック容器に~50mg(10サンプルで十分)を秤量する前に。
    2. 細胞培養培地を加えてフィブリノーゲン溶液を調製する(10mg/mLの濃度で、タンパク質ストックの純度を補正する)。よく混合し、滅菌15 mLチューブに0.2 μmのシリンジフィルターでフィブリノーゲン溶液を殺菌するためにフィルター。濾過フィブリノーゲン溶液を氷の上に置いておきます。
      注:フィブリノーゲン溶液を事前に長く準備しすぎないようにしてください。
    3. トロンビンを解凍し、細胞培養培地中にトロンビン溶液(10 U/mLの濃度)を作り、氷の上に置きます。サンプルあたり20μLトロンビン+細胞溶液を調製します。n=10サンプルの場合、200 μLが必要です。そのため、250 μL のトロンビン溶液を調製し、ピペット処理エラーの可能性を考慮してください。
  2. 培養フラスコから細胞を収集し、数えます。所望の比率と量(1.2×106単球と0.6×1010 6足場あたりの筋線維芽細胞)で細胞を混合する。n+1 サンプルがピペットのエラーを修正するのに十分なセルがあることを確認します。RTで10分間350×gの遠心分離機。
  3. 浮遊細胞とトロンビンの混合物を作る。
    1. サンプルごとに、トロンビン溶液20μLを使用してください。n=10サンプルの場合、細胞ペレットに200μLのトロンビンを加え、混合します。細胞懸濁液(細胞+トロンビン)の体積を測定し、10個の足場全体で均等に分割する方法を計算します(例えば、トロンビン+細胞懸濁液の体積が260μLの場合、各エレクトロスパンサンプルは260 μL/10サンプル=26μLトロンビン+細胞懸濁液を受け取ります)。
    2. スキャフォールドの播種は2段階で行われるので、各足場の細胞懸濁液の半分を保持する2つの1.5 mLマイクロフュージチューブを準備します(前のステップの例では、トロンビン+細胞懸濁液の13 μLで2つのチューブを調製します)。氷の上に置きます。
      注: 次の手順、特にステップ 4.4 は、2 人の実験者が実行するのが理想的です。
  4. あらかじめ湿ったエレクトロスパンスキャフォールドを真空で乾燥させて、細胞の播種に備えます。
    1. ガラスパスツールピペットを層流キャビネットの真空システムに接続し、無菌一時的な保管のために空の50 mLチューブに入れます。
    2. インキュベーターから流れの培養チャンバーを取り出し、フロー出口からオスのLuerプラグを取り外し、白色のルアーキャップを開けて、フロー出口の前にエタノール浸した紙ティッシュを置いた後、培地を取り除きます。
    3. 上部のコンパートメントとガラス管を取り外し、一時的な保管のために無菌ペトリ皿に入れます。
    4. エレクトロスパン足場に真空パスツールピペットを置き、できるだけ多くの媒体を取り除きます。
      注意:エレクトロスパン足場を真空乾燥させます。スキャフォールド上で直線的に前後に動く代わりに、真空パイプを複数の場所に配置します。より良い制御のために指の間にパスツールのピペットの上に真空管をクランプします。
    5. 1:1の比率でフィブリノーゲン溶液をトロンビン+細胞懸濁液と混合します(例えば、13μLのトロンビン+細胞懸濁液と13μLのフィブリノーゲンを混合します)。フィブリンがマイクロフュージチューブではなく足場で重合することを確認するには、フィブリノーゲンをピペットし、トロンビン+セルサスペンションの「余分なボリューム」のためにピペットホイールを回し、ミクロフュージチューブで一度上下にピペットを混合します。
    6. 直接均一にエレクトロスパン足場の全長にわたって溶液を滴下する。実験者Aはフィブリン混合物を滴下し、実験者Bは圧力導管に取り付けられた電気スパン足場で底部を保持することを推奨する。
    7. 細胞を持つフィブリンがエレクトロスパン足場の上に滴り落ちた後、実験者Bは足場を左から右に上下にゆっくりと動かして、足場の上にさらに均等に細胞を分割する。
    8. 電気スパン足場の反対側にステップ4.4.5-4.4.7を繰り返します。
    9. 慎重にガラス管を配置することによってフロー培養室を再度マウントし(ガラス管の内側にフィブリンが付着して凝固するのを防ぐ)、フロー培養室の上部コンパートメントを押し戻す。インキュベーター内のフロー培養チャンバーに培地またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含まない播種物を直接配置する。
    10. すべての動的サンプルについて、ステップ 4.4.1 ~ 4.4.9 を繰り返します。穴のない圧力導管に取り付けられた静的サンプルの場合、ステップ4.4.1~4.4.8に従ってシードし、その後15mLチューブに入れます。
    11. フィブリンをインキュベーターで60分間重合します。

[プロトコルは、ここで30〜60分間一時停止することができます。

  1. 重合後、流量培養チャンバー(動的サンプル)または15 mLチューブ(静的サンプル)を培地で充填します。

5. 実験開始前のバイオリアクターとフローポンプシステムの結合

注: 層流キャビネットでステップ 5.1 ~ 5.3 を実行します。

  1. 流量培養チャンバーと流体ユニットを持つトレイに、充填された媒体貯蔵所と、層流キャビネット内の接続された媒体チューブを持って取ります。
  2. 循環ストレッチを積み込んだ実験基のバイオリアクターベースにフロー培養チャンバーを配置し、血行力負荷を組み合わせた(図1E)。
    1. 流量培養チャンバーを逆さまに傾け、細いチューブでシリンジを使用して超純水で下からの圧力導管を満たします(これは、柔軟で薄い限り、長さ10cm、内径0.15mmのワイヤーを針に取り付けました)。
    2. 圧力導管の内側に細いチューブを入れ、圧力導管が徐々にシリンジから水を押し出すことによって超純水で満たされている間、圧力導管の内部に気泡がないことを確認するために、圧力導管から同時に電線を引き出します。
    3. フロー培養チャンバーをバイオリアクターベースの8本のねじ糸の1つに置きます。バイオリアクターベースと白色のルアーコネクタの間にシリコーンOリングを設置して漏出の可能性を防ぎ、下部コンパートメントから白いルアーコネクタを締めます。
    4. 周期的に伸びたサンプルすべてについて、ステップ 5.2.2 と 5.2.3 を繰り返します。
  3. 静的制御を除くすべての実験グループの流量培養チャンバーをフローポンプシステムに接続します。
    1. ホース クリップを中チューブに配置します。フロー培養チャンバーの上部区画の流れ入口を覆う白色のルアーキャップを取り外します。メスのLuerカプラの中チューブを取り外し、一方の側の中管を上部コンパートメントのフロー入口と接続し、下部コンパートメントにフロー出口を付けて中程度のチューブの反対側を接続します。
    2. すべてのフロー培養チャンバーに対してステップ 5.3.1 を繰り返します。この時点で、バイオリアクターとフロー培養チャンバは、培地で満たされ、フローシステムに接続されています。
    3. 静的制御サンプルの場合は、シザークランプを使用して、フィルターキャップ付きの細胞培養フラスコにサンプルを垂直に配置します。培養フラスコを培地で満たし、インキュベーターに入れる。
  4. ラミナーフローキャビネットからインキュベーターに完全なセットアップを移し、流体ユニットを空気圧チューブと電気ケーブルに接続します。
  5. ソフトウェアを起動し、フローポンプを初期化します。サンプルの中流を一つずつ開始します。
    1. 流体ユニットのバルブがクリックしているかどうかを確認します。
    2. 中チューブからホースクランプを取り外します。
    3. 100 mbarと10 sの切り替え時間でフローポンプを開始します。
    4. 漏れや気泡の可能性について、流れの方向を注意深く確認してください。閉じ込められた気泡は、流れの培養チャンバーを逆さまにすることで取り除くことができます。
      注:媒体貯留層の中程度がバランスが取れているか確認し、流量培養チャンバー内のシステムと気泡への空気の吸引を防ぎ、貯水池が乾燥しないようにしてください(図2C)。
    5. すべての流体単位に対してステップ 5.5 を 1 つずつ繰り返します。
  6. ひずみポンプを初期化します。
    1. 空気圧式ポンプは、空気圧シリンダーの空気入口を介して圧縮空気に接続します。下のエア・アウトレットを、エアアウト用の青いチューブに接続します(図1F)。
    2. LabVIEWソフトウェアを開き、Van Kelleら(68)の説明に従ってLabVIEWスクリプトと圧縮空気圧アプリケーションシステムを実行し、変位と周波数を入力します(低周波数0.2Hzから始まります)。テフロンベローズが最も低いレベルにあるときにポンプを一時停止します。
    3. 油圧リザーバーの圧力センサ入口に圧力センサを設置します。
  7. ポンプの設定を希望の設定に変更します(1.5 Paの場合は、150 mbar、10 s切り替え時間を使用)。
  8. ひずみポンプを起動し、好ましい設定(例えば、0.5 Hz、1.05ストレッチ)を適用します。

6. 複数日の実験を実行する。培養・培地交換時のせん断とストレッチのモニタリング

  1. 足場壁で WSS を計算します。
    1. 1日おきに流量の大きさを記録します(詳細はフローポンプの製造元のマニュアルを参照)。要するに、流体ユニットのリザーバの切り替え間における液体レベル(mL単位)の変化を10sに観察する。少なくとも 5 つの測定を行い、平均値を計算し、6 を掛けて流量 Q を mL/min で取得します。
    2. フローは、環状チャネルを通るポアトゥイユ流れによって記述されます。ニュートン流体として培地を培養すると仮定し、足場壁のWSSを計算し、r1、式1で算出する。
      Equation 1 (1)
      ここで、足場壁のWSS τw(r1;ここでr1 = 1.7mm)は、定常状態の流れから生じる、加圧pとガラス管r2の内径(ここではr2 = 2.3mm)によって決定される。軸方向の圧力勾配は、流出口と流出口の間で均一であると仮定し、式2(図1J)で与えられる。
      Equation 2 (2)
      μ動粘度(ここでは中粘度が一定と仮定され、μ 37°Cで10-3 Pa∙s×0.7×)とQの加えられた流量を有する。
  2. 1 日おきにスキャフォールディングに適用されるストレッチを監視します。
    1. フロー培養室の背後に暗い背景を配置して、足場と背景のコントラストを高くします。足場の視覚化を助けるために、足場に向かってLEDライトランプを配置します。
    2. 高速カメラで6 s(すなわち、3ストレッチサイクル)の周波数で30 Hzの周波数で足場のタイムラプス写真を撮ります。
      メモ:カメラが許可すれば、記録周波数が低ければ十分です。しかし、最小限必要な周波数は決定されなかった。
    3. 画像からスキャフォールドの最小直径と最大直径を手動で決定します。
    4. エレクトロスパン足場の最小および最大外径を計算し、式3に従って最大伸縮を計算します。
      Equation 3 (3)
      ここで、周伸縮(λθ)は、足場の外径d1と初期直径d0との比によって与えられる。
  3. 中程度の蒸発を補正し、週に3回培地をリフレッシュします。
    1. フローシステムとひずみポンプのケーブルを停止して切り離します。
    2. ホース クリップを中チューブに配置します。
    3. 媒体貯留層の体積インジケータマークに基づいて、どのくらいのメディアが蒸発するかを決定します。
    4. バイオリアクターと流体ユニットを備えたトレイを層流キャビネットに移します。
    5. 媒体貯留のゴム製エアフィルターを取り外します。媒体の蒸発量を補うためにオートクレーブ超純水を加える。再び培地貯留層を閉じ、再びポンプに接続して、培地と超純水を混ぜます。
    6. ステップ 6.3.1 ~ 6.3.5 を繰り返します。ゴム製エアフィルターを再び取り外し、25mLの培養培地を取り出し、RTで5分間300×gでスピンダウンします。
      1. 1.5 mLの上清を収集し、分泌プロファイルの分析のために-30°Cで保存します(酵素結合免疫吸着法(ELISA)による分析用)。
      2. パラクリンシグナリング研究のための上澄みの所望の容積を収集し、条件培地43として上清を使用して。
    7. 培地貯留層に25mLの新鮮な培地を加えます。
    8. ゴム製エアフィルターを媒体の貯留層に戻します。
    9. 完全なセットアップをインキュベーターに戻します。すべてのケーブルと空気管をポンプおよびひずみポンプに接続します。ホースクリップを解除し、ステップ 5.4 ~ 5.8 を繰り返します。
  4. ポンプに接続された乾燥ボトル内のシリカ乾燥ビーズが湿っているかどうか(白色の外観)を確認し、必要に応じて乾燥シリカビーズ(オレンジ色の外観)に交換してください。

7. 実験、サンプル収集、機器のクリーニングと保管の終了

  1. 実験の最終日に、ステップ6.3.1~6.3.5で説明した媒体蒸発を修正し、サンプルを1つずつ収穫します。
    1. サンプルを1つずつ収穫するには、フローポンプとひずみポンプを数回一時停止する必要があります。ホース クリップを中チューブに配置します。流れポンプとひずみポンプを一時的に停止します。バイオリアクターベースから1つのフロー培養チャンバーを切断します。バイオリアクターベースの白色のルアーキャップで交換してください。流れの培養チャンバーおよび流動単位を層流のキャビネットに取る。流量ポンプとひずみポンプを再び開始し、収穫まで他のサンプルに血行力負荷を加えます。
    2. ELISAを介してパラクリンサイトカインの生産分析のための培地貯留層から培地を収集します。
  2. フローユニットを切り離し、管状コンストラクトを収穫します。所望の切断スキームに従ってセクション。構築物の部品は、4°C(3.7%ホルムアルデヒドで15分固定後、PBSで3 x 5分洗浄)または-30°C(液体窒素中でのスナップ凍結後)でさらに分析されるまで保存することができます。
  3. バイオリアクターとポンプ部品を洗浄します。さらに、品目ごとの推奨クリーニング方法については、 材料表に記載されています。
    1. 70%エタノールでゴム製エアフィルターを洗浄してください。インナーフィルターを湿らせないように非常に注意してください!
    2. ミディアムチューブ、ミディアムリザーバ、ガラスチューブ、オスのルアープラグとメスのルアーロック、白いルアーキャップ、圧力導管、鼻コーン、シリコーンOリング、アダプターブッシュ、フローストレートナー(ポンプ、流体ユニット、ゴムエアーフィルター、バイオリアクターベースを除く)、および水道水を流す。
    3. O/Nを0.1%のドデシル硫酸ナトリウムに脱イオン水に入れます。
      注:部品が錆びる可能性があるため、超純水は使用しないでください。
    4. 水道水と食器洗い石鹸で洗い流します。
    5. 脱イオン水に浸し、続いて70%エタノールを2回、続いて脱イオン水を加える。
    6. すべての材料を紙のティッシュの上に別々に置き、乾燥させます。圧力をかけ空気を使用してチューブを乾燥させます。
    7. 70%エタノールに浸した紙ティッシュで、すべての非オートクレーブ可能な材料を洗浄します。これには、ゴム製エアフィルター(エアフィルターは乾燥したままでいるべきであることを念頭に置いて)とバイオリアクターベース(テフロンベローズと空気圧シリンダー)が含まれます。
    8. 流体室(シリコーンOリングを含む)、中管、ミディアムリザー(ゴム製エアフィルターなし)、オスのルアープラグとメスのルアーカプラー、白いルアーキャップ、ホースクリップ、標準機器(例えば、ピンセット、クランプハサミ)の部品をオートクレーブ
    9. 次の実験で便利に使用するには、オートクレーブ可能な箱の中に1つの完全な流体室のための別々の部品を組み合わせます。
  4. 油圧貯留層から水を取り除きます。70%エタノールで洗浄し、続いて脱イオン水を加えます。乾かします。脱イオン水と水浴保存消毒剤の数滴で補充します。
  5. 70%エタノールで流量培養チャンバー用のガラス管を保管してください。
  6. 湿ったシリカ乾燥ビーズ(白い外観)をオーブンO/Nに120°Cで入れて乾燥させます(オレンジ色の外観)、気密フラスコに保管します。

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Representative Results

このバイオリアクターは、3D生体材料足場における血管組織の成長とリモデリングに対するせん断応力と環状ストレッチの個々および組み合わせ効果を研究するために開発されました。バイオリアクターの設計により、様々な負荷条件下で最大8個の血管構造を培養することができます(図1A)。血管構築物は、周延伸とWSSの両方を独立して制御できるフロー培養チャンバー(図1B)内に位置付けられている。フロー培養チャンバの上部コンパートメントは、比較的短い定位長で流れを安定化させるフローストレートナーを保持している(図1C)。フローストレートナーの直接下流では、ノーズコーンは環状チャネルを通してフローを均等に分配します(図1D)。プロトコルのすべてのステップが正しい方法で行われると、フロー培養チャンバー内の血管足場は、足場とガラス壁の間の環状チャネルを通る連続的な単方向流を受けることができ、空気圧ポンプによって周方向に伸張される(図1E-F)。足場を取り付ける前に、エレクトロスパンチューブを25mmチューブ(図1G)に切断し、SEMでマイクロアーキテクチャを分析する必要があります(図1H-I)。この例のPCL-BU移植片は、他のエラストマー組織で置換できることに注意することが重要です(天然または合成起源、異なるマイクロアーキテクチャまたは気孔率)。内部の設計は漏れがない必要とは限らないので非常に多孔性の接木のテストを可能にする。流量培養チャンバの概略画像は、WSS(式1)、圧力勾配(式2)、および円周ストレッチ(式3)を記述するために式で使用されるパラメータの物理的解釈を示す(図1J)。

プロトコルの重要なステップを誤って実行すると、いくつかのシナリオが発生する可能性があります。例えば、油圧リザーバからの漏れが誤った結び目の結果として起こり、シリコンチューブを通過して流れの培養チャンバーに入る穴を持つ圧力導管からの作動油の漏出につながる可能性があります(図2A)。スクリュースレッドとバイオリアクターベースとの接続時の作動油の漏出は、シリコーンリングが十分に配置されていない場合、またはテフロンベローズが実験の前日にO/Nをわずかに拡大させなかった場合にも発生する可能性があります(図2B)。さらに、培地が脱気されない場合、または培地貯留層中の培地レベルが十分にバランスが取れておらず、1つの媒体貯蔵所が乾燥し、その結果、空気がシステムに吸い込まれると、WSSパターを乱す気泡が流れ培養チャンバー(図2C)で発生し、細胞の生存率およびそれに続く組織成長が損なわれる。最後に、底部のシリコンOリングが正しく配置されていない場合、流量培養チャンバの下に媒体の流出が観察され得る(図2D)。

このバイオリアクターのセットアップは、個々の血行力学的負荷の適用を可能にするので、複数の血行力学的にロードされた実験群を1つの実験に含めることができる(図3A)。以前は、さまざまな血行力学的負荷(すなわち、2つのせん断応力レジームと2つのストレッチレジーム)は、さまざまな可能なシステム設定を適用することによって検証されました(図3B)。長期培養期間にわたってストレッチ(図3C)およびWSS(図3D)を監視した場合、これらは20日間の比較的一定のレベルで維持できることが検証されました。

バイオリアクターは、血管TEの文脈における成長およびリモデリングにおける血球負荷の影響を研究するのに特に適している。in in situ TE の段階は、自然な創傷治癒応答の段階を反映するように仮定される(図4A)。ヒト伏伏静脈由来の単球由来マクロファージと筋線維芽細胞の共培養は、ここで説明するとおり、増殖期のインビトロ模倣として確立された。播種の3日後、免疫蛍光染色は、足場全体で両方の細胞型の均質な分布を示した(図4B)。20日間の共培養の後、環状ストレッチだけでもより多く、より厚いコラーゲンタイプI繊維の沈着をもたらし、血行力学的負荷を組み合わせたグループでは、この周期的ストレッチの効果はせん断応力によって却下され、免疫蛍光染色によってここに示されるコラーゲン型I沈着が少ない結果となった(図4C)。situ組織再生に成功するためには、組織産生と足場吸収との間の緊密なバランスが必要である。組織形成に加えて、バイオリアクターは細胞駆動足場の再吸収の誘導を可能にする。例えば、エレクトロスパン移植片で8日間マクロファージの単一培養を培養する場合、繊維浸食および繊維切断は全ての血行力学的負荷態において観察され、静的群における最も顕著な吸収およびせん断応力群での吸収は最も顕著ではない(図4D)。これらの結果は、成長とリモデリングの両方に異なる血力学的負荷レジームの影響を示しています。これらのインサイトは、新たに開発されたsitu TEVGs用の設計パラメータを最適化するのに役立ちます。

組織再生プロセスのもう一つの重要な決定要因は、プロおよび抗炎症性サイトカインの存在である。バイオリアクターは閉ループシステムであるため、システム内の細胞は、分泌因子のパラクリン刺激に継続的に曝されます。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)由来マクロファージとヒトミオ線維芽細胞のヒト末梢血同培養の培地におけるサイトカイン分泌プロファイルを、初期および後期の段階で分析した(図5A)。これらの代表的な結果は、環状ストレッチとせん断応力の両方が共培養セットアップにおけるサイトカイン分泌プロファイルに及ぼす影響を示す。興味深いことに、両方の負荷の組み合わせ効果は、2つの負荷のうちの1つの優位性(例えば、インターロイキン-6(IL-6)および単球化学誘引タンパク質-1(MCP-1)の環状ストレッチ)または両方の負荷の相乗効果(例えば、IL-10)のいずれかを示した(図5B)。これらの洞察は、このインビトロ試験プラットフォームを用いて収集し、その場でマクロファージ駆動の理論に基づくin situ TEVGsの開発のための貴重な情報を与える。

マクロファージと筋線維芽細胞の共培養実験は、機械的環境と結果として生じる負荷依存性炎症環境が筋線維芽細胞の表現型を変調することを示した。20日間の血行力学的負荷の後、筋線維芽細胞マーカーの遺伝子発現は、マイ線維芽細胞に対するマクロファージの直接的およびパラクリンシグナル伝達における個々および組み合わせの影響に明確な違いを示した(図6A)。さらに、収縮マーカーα平滑筋アクチンの遺伝子発現パターンはタンパク質合成と相関した(図6B)。さらに、環状ストレッチ刺激コラーゲンおよび弾性マトリックス遺伝子発現および減弱マトリックスメタロプロテイナーゼ1/組織阻害剤マトリックスメタロプロテイナーゼ1媒介コラーゲンリモデリング、一方、せん断ストレスの安定化効果が共同培養で観察された(図6C)。これらの長期の共培養実験は、このバイオリアクターを用いて組織工学的血管移植片における様々な血行力学的負荷のレジームにおける後段階の組織リモデリング段階(図4A)を研究する可能性を示す。TEVG はシリコンチューブに「裏返し」に取り付けられるため、円形ストレッチと WSS は培養期間の長い期間に適用できます。

Figure 1
図1:バイオリアクターの設計と概要(A)バイオリアクターベースの構築図と(B)すべての部品を示した流体培養室の分解図(ステップ2.4~2.8)。フロー培養チャンバの上部コンパートメントは、フローストレートナーを保持する。(C)球状に鈍い鼻コーンは、環状チャネル(ピンクで示される流れの方向)を通して流れを分配するために流れストレートナーの後に配置される。(D) これらのコンポーネントは、一緒にフローの方向性を制御し、制御します。個別に言及されている部品の機能説明については、表 1を参照してください。(E)完全なバイオリアクターのセットアップの写真(ステップ5.2)および(F)流動培養室および空気シリンダーのクローズアップビュー (ステップ5.6.1)。(G) フェスパンPCL-BUスキャフォールドのグロス外観をシードする前(定規は1mm刻む)。異なる倍率で3mmの内径および5μmの平均繊維径を有する管状エレクトロスパンPCL-BU足場の走査電子顕微鏡像、スケールバー(H)100μmおよび(I)10μm(ステップ1.3)(J)管状の電気スパン足場からなる培養チャンバーの模式画像を、内径のガラス管(r2)に中心にした外径(r1)を有する。流れ(Q)の入口と出口は環状リングに接続され、壁のせん断応力(t)を適用するためのチャネル高さhが付いています。圧力/伸張(P)入口は、内側から取り付けられた電気紡波足場に周伸張(λ(t))を適用するためのシリコーンマウントスキャフォールドに接続されています(ステップ6.1)。略語: ポリカプロラクチン二保険 (PCL-BU).パネルC,D,G-Jはヴァン・ハーフテンら19から適応された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

バイオリアクター部品 機能の説明
ストレッチアプリケーション
空気シリンダー テフロンベローズをアクチュエートします。
テフロンベローズ 油圧貯留をロードします。
油圧リザーバー 最大8つの流れの培養室と接続することができ、デミ水で満たされ、シリコーンマウントされた構造に圧力を加える。
ねじ 流れの培養室および油圧貯蔵所間の関係。シリコンマウントコンストラクト用の圧力入口。
ホワイトルアーコネクタ 油圧リザーバー/バイオリアクターベースの8本のねじ糸の1つにフロー培養チャンバーをしっかりとねじ込むために使用されます。
小さな穴を持つ圧力導管 油圧貯留槽の水と直接接続。油圧リザーバーが加圧されると、圧力導管はシリコーン管の間のスペース(圧力導管に取り付けられている)を水で満たし、シリコーンチューブを外側に押し出し、内側からシリコーンマウントされたグラフトの円周ストレッチを生じます。
シリコーンチューブ 圧力導管にエレクトロスパン移植片を取り付ける。シリコーンチューブは、内側から円周的に伸ばされます。
フローアプリケーション
フローポンプシステム 流れの培養チャンバーの流れを制御するために使用される。(この例では、ibidiポンプシステムが使用されています。
フローインレットと出口付きの上部および下部コンパートメント フロー培養チャンバーをフローループに接続します。
試験管 中央に加圧足場を含み、足場の灌流を可能にする。
フローストレートナー 比較的短い沈降長で流れを安定させます。
ノーズコーン フローを均等に分散します。
アダプターブッシング ガラス管を固定します。
シリコンOリング 媒体の漏出を防ぐ。

表1:バイオリアクター主な特徴の機能説明は、図1A-Dに示された部分に対応する。

Figure 2
図 2: プロトコルの重要なステップの実行が不正確な結果。重大なステップが正しい方法で行われない場合のバイオリアクターのセットアップで観察することができるいくつかの出来事の写真。(A)結び目が十分にタイトでないか、(矢印で示される)彫刻された溝に正確に配置されていない場合、流れの培養チャンバーへの油圧流体のわずかな漏れが発生する可能性があります(ステップ2.5)。(B)テフロンベローズが実験の前日にO/Nを拡大させなかったり、シリコーンリングが十分に配置されていない場合、スクリュースレッドとバイオリアクターベースの接続時に油圧液体からの油圧液漏れが発生する可能性があります(矢印で示される)(ステップ1.4および5.2.3)。(C)流れの培養チャンバー内の気泡(矢印で示される)は、乱れたせん断応力パターンをもたらす。常に培地を脱気し、媒体貯留層の中の培地レベルが、1つの貯留層が乾燥して空気が流れチャンバシステムに吸い込まれるのを防ぐためにバランスを取っていることを確認してください(ステップ1.2および5.5.4)。(D)底部のシリコーンリングが正しく配置されていない場合、媒体のこぼれが観察され得る(矢印で示される)(ステップ2.4.2)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:せん断応力とストレッチの制御バイオリアクターは、ストレッチとせん断の独立した複合アプリケーションを可能にするので、(A)複数の実験群を1つの実験に含めることができます。(B) 4 つの異なるシステム設定 (色で示される) でテストされた特定の時点における最大ストレッチおよびせん断応力の変動例。黒い長方形は、各設定±測定値の平均標準偏差を表します。点線は、ストレッチの平均値 (水平線) とせん断応力 (垂直線) として計算され、4 つの異なる荷重条件を示します。(C)高速カメラのタイムラプスで監視された足場構造の外径測定に基づいて、20日間の実験の過程で環状ストレッチおよび複合群における環周伸縮 (ステップ6.2)。(D) シリンジ内の変化する中濃度に基づいて、実験の過程でせん断応力と結合群における壁せん断応力を監視する (ステップ6.1)。パネルA、C、Dはヴァン・ハーフテンとウィッシングら44から適応された。パネルBはヴァン・ハーフテンら19から適応した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:血管組織工学における概念、細胞分布、組織産生、足場分解。(A) ホストの機能部位における足場駆動組織再生の仮説相を描いた模式図。示された結果は、マクロファージおよび組織産生細胞が足場物質を植民地化した増殖期に焦点を当てた実験に由来する。(B) 3日目の電気スピン足場の外側におけるヒトサフェノール静脈(赤)およびPBMC由来マクロファージ(緑色)分布からの筋線維芽細胞。スケールバー200μm(C)20日目の共培養構造の断面は、コラーゲンタイプI(緑色)、コラーゲンタイプIII(赤)、DAPI(白)に染色された20日目の構造である。スケールバー100μm、*は、構造の外側を示し、流側に対応する。(D) マクロファージの分解を示す8日間のマクロファージ単一培養の脱細胞化移植片のSEM画像;スケールバー20 μm。略語: ヒト伏綿静脈細胞 (HVSC);末梢血単核細胞 (PBMC);4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール(DAPI);走査電子顕微鏡(SEM)パネルAはウィッシングとカツイトら27から適応された。パネルBとCはヴァン・ハーフテンとウィッシングら44から適応された。パネルDは、ウィスシングら43から適応された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:3日及び20日における共培養構築物の浸透力学的に炎症環境。ヒトPBMC由来マクロファージと、伏毒静脈由来のヒト筋線維芽細胞の共培養(A)多重ELISAを介して上清で測定されたサイトカイン全分泌のヒートマップ。(B) 20日目のサイトカインの選択のための箱ひげ図を、全DNA含有量に正規化した。P値は、ダンの多重比較検定を用いてクルスカル・ウォリス検定を使用して計算した。* p < 0.05, ** p < 0.01, ***省略形:メタロプロテイナーゼ(TIMP)の組織阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、インターロイキン(IL)、単球化学誘引タンパク質1(MCP-1)、成長因子β1の転換 (TGF-β1)、結合組織成長因子(CTGF)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、血小板由来増殖因子(PDGF)、静的(ST)、環状ストレッチ(CS)、せん断応力(SS)。パネルAとBはヴァン・ハーフテンとウィッシングら44から適応した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:20日目における血管構築物における血行力学的負荷に応答した筋線維芽細胞表現型およびマトリックス成長およびリモデリングのマーカーの変化。(A)筋線維芽細胞特異的表現型マーカーの相対遺伝子発現(B)断面はαSMA(緑)およびDAPI(青)、スケールバー100μmに染色された。(C) コラーゲンマトリックス、弾性マトリックス、プロテオグリカン、およびリモデリング遺伝子に関連する遺伝子の相対発現。P値は、ダンの多重比較検定を用いてクルスカル・ウォリス検定を使用して計算した。* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.略語:S100カルシウム結合タンパク質A4(S100A4)、α平滑筋アクチン(αSMAまたはACTA2)、カルポニン1(CNN1)、スムーメリン(SMTN)、ビメンチン(VIM)、コラーゲンI(COL1A1)、エラスト イン(ELN)、ベルシカン(VCAN)、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、メタロプロテイナーゼ(TIMP)の組織阻害剤、静的(ST)、環状ストレッチ(CS)、せん断応力(SS)、4′,6-ジミディノ-2フェニリンドール(DAPI)。#検出限界以下で測定。パネルA、B、およびCは、ヴァン・ハーフテンとウィッシングら44から適応した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図S1:タンパク質発現筋線維芽細胞-およびマクロファージ-単培養は、個々のおよび結合された血行力学的負荷に供される。(A)筋線維芽細胞の代表的な共焦点像は、アクチン繊維(緑色)、核(赤)、足場(青)で10日間培養し、負荷されたサンプル中に明確なアクチン繊維配向を示し、優等アクチン繊維方向が観察できない静的サンプルと比較した場合である。スケールバー 50 μm(B) コラーゲン(緑色)と核/足場(白)に染色された同じ筋線維芽細胞単培養物の共焦点像。スケールバー 50 μm(C)8日間の静的および動的に培養されたTHP1由来マクロファージのタンパク質分泌プロファイルの箱ひげ図、IL-6、TNF-α、MCP-1(炎症前)およびIL-10、IL-13、MMP-9-炎症(抗炎症)のサイトカイン分泌レベルに基づいてM1/M2比を計算した。MCP-1 グラフのドットは、統計的な外れ値を表します。(D) 8日目の静的および動的に培養されたマクロファージの相対的なタンパク質分泌レベルのELISAデータは、炎症促進、抗炎症、成長、およびリモデリングタンパク質の平均分泌と比較した(タンパク質レベルは、グループあたりの平均DNA含有量について補正した)。ドットと陰の領域は、それぞれ 50 番目と 25番目の -75番目の百分位数を示します。省略形:単球化学誘起タンパク質1(MCP-1)、インターロイキン(IL)、トランスフォーム成長因子β(TGF-β)、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、血小板由来成長因子(PDGF)、結合組織成長因子(CTGF)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、酵素結合免疫吸着因子(ELISA*<)0.0.** p < 0.01, *** p < 0.001.パネルAとBはヴァン・ハーフテンら19から適応した。パネルCおよびDは、ウィスシングら43から適応した。こちらをダウンロードしてください。

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Discussion

本明細書に記載されたバイオリアクターは、尿細管付動性足場における炎症および組織再生に対する剪断応力および環状ストレッチの個々および結合された影響の系統的評価を可能にする。このアプローチはまた、代表的な結果セクションで例示されるように、血管構造上で行われる多種多様な分析を可能にする。これらの結果は、TEVG構造の成長とリモデリングの両方に異なる血行力負荷レジーム(すなわち、せん断と伸縮の異なる組み合わせ)の顕著な影響を示す。このin vitroプラットフォームを介して収集されたこれらの洞察は、新たに開発されたsitu TEVGs用の足場設計パラメータの最適化を支援します。適切な実験ワークフローを確保するには、このプロトコルの重要なステップと制限を理解することが重要です。

プロトコルの最も重要なステップは、サンプルへのストレッチの適用に関連しています。ストレッチアプリケーションの場合、セットアップがリークフリーである必要があります。システムには2つの弱点があります:エレクトロスパン移植片を圧力導管に取り付ける結び目と、バイオリアクターベースとフロー培養チャンバーとの間の接続。手順 2.5.2 と 2.5.4 で説明したように、複数のタイトなノットは、刻まれた溝に正確に配置する必要があります。結び目が十分にタイトでないか、溝の上または下にわずかに配置されている場合、流れの培養チャンバーに油圧流体のわずかな漏れが発生する可能性があります。この漏れは、油圧リザーバの圧力降下と、設定された圧力値に達するまでの歪みポンプの電圧を着実に増加させるものとして検出され得る。また、これは流れの培養チャンバー内の乱れ流れ、細胞培養物の汚染のリスクの増加、および培地の希釈をもたらす。これが起こると、流れの培養チャンバーは実験から取り出され、油圧貯留層のねじねじは白いLuerキャップで閉じるべきです。他の7つの流れの培養チャンバのための実験の適切な継続を保障するために必要な完全なサンプルを取り出すこの主要な尺度は、正確に刻まれた溝に、タイトな結び目を置くことの重要性を強調する。その後、流動培養チャンバー内の水と液中の媒体との間で適切な分離を確保することができます。足場の取り付けの堅牢性を向上させるために、圧力導管の溝は、バイオリアクターの改訂版でわずかに深く行われ、より簡単で良い結び目の配置を可能にし、したがって、媒体からの作動油の安全な分離を可能にする。

漏れの別の潜在的な原因は、バイオリアクターベースのねじ糸と流れの培養チャンバーの白色のルアーコネクタとの間にある。テフロン材料の摩耗が可能なため、漏れを防ぐために余分なシリコーンOリングを追加することができます (ステップ5.2.3)。さらに、歪みポンプのテフロンベローズは、実験の1日前にO / Nをわずかに拡大させるべきです (ステップ1.4)。漏れが発生した場合、失われた作動油は、8本のねじ糸の1つを介して少量の超純水を加えることによって補償されるべきです(針とフレキシブルワイヤー付きの注射器を使用してください)。フロー培養チャンバーの下部コンパートメントに、ねじ糸と白色のルアーコネクタの間に小さなパラフィルムを付けてフロー培養チャンバーを戻します。今後の実験でこの漏れ問題を克服するために、バイオリアクターベースの現在のテフロンねじ糸は、システムの摩耗を防ぐために、次世代バージョンのバイオリアクターのステンレス製の糸に置き換えられます。

ストレッチの変動(図3C)は、ストレッチの制御が難しいため、WSS(図3D)の変動よりも大きくなります。それにもかかわらず、漏れを防ぐための措置に加えて、ストレッチの変動を制限する他の措置があります:(i)フルートの気泡を避ける(ステップ1.4および5.2.1)、(ii)異なるサンプル間で一貫した前伸張を確保する(ステップ2.5.3)、および(iii)異なるサンプル間で一貫した足場特性を確保する(ステップ1.3)。

最後に、エレクトロスパン足場をシリコンチューブに取り付ける際には、特に注意が必要です(ステップ2.3)。具体的には、壊れやすいエレクトロスパン足場を伸ばしたシリコーンチューブの上に引っ張る必要がある場合、特にエレクトロスパン移植片の内側に、エレクトロスパン移植片が損傷するのを防ぐためにあまり力を加えないことが重要です。電解グラフトの内側に損傷が生じた場合、引っ張りが強いか、またはシリコンチューブの伸縮が弱すぎ、電解繊維の損傷の程度は、構築物が収穫され、分析された後にのみ見えるようになります。現在のセットアップでは、播種の成功は、サンプルを犠牲にした後、免疫蛍光または免疫ヒストケミカル分析でのみ確認することができます。しかし、細胞担体としてのフィブリンによる播種手順は、典型的には十分に大きな孔径を有する足場に対して均質な細胞分布を導く確立された方法67である。細胞の播種に関して最も重要な側面の1つは、スキャフォールドがシードする前にできるだけ乾燥していることを保証することです(ステップ4.4)、細胞とのフィブリンゲルが湿った足場を通過するのを防ぎ、不均一な播種をもたらす。最後に、30%エタノールに浸漬したUV照射によるエレクトロスパン移植片の除染方法は、インビボ試験のために調製されたエレクトロスパン移植片の殺菌ほど厳しくないが、 エチレンオキシドまたはガンマ照射によって滅菌されることが多いが、汚染の兆候なしに20日間まで続くインビトロ培養実験に十分である(例えば、図3、図4、図5、図6、ヴァン・ハーフテン及びウィッシング(2020)44)。また、ここで用いられているPCL-BU材料では、高いエタノール濃度への長期暴露を認めなくてはならない。最も適した殺菌方法は使用される材料によって選ばれる。

以前に行われた共培養研究の結果に加えて、より広範な研究を同じシステムで行うことができる。このシステムは、以前、個々の細胞タイプとそのパラクリンシグナル伝達に対する血行負荷の影響を調べる、筋線維芽細胞(補足図1A–B)およびマクロファージ(補足図1C–D)の動的単一培養を行うために採用された。異なる血行性負荷のレジームは、筋線維芽細胞(補足図1A)における明確なアクチン繊維配向性をもたらし、10日後に明らかに異なるコラーゲン沈着(補足図1B)をもたらした。THP1由来マクロファージによるサイトカイン産生は、異なる血行力学的負荷(補足図1C)とは大きく異なり、負荷時により炎症性のプロファイルを示した(補足図1D)。その他の検証済みの可能性には、余分なポンプと流体ユニットを使用して、振動流れの適用が含まれます。培地の粘度は、血液粘度の範囲に向けて増加させることができる(例えば、キサンタンガムを添加することによって)69。粘度の中程度を調節することは、適用可能なせん断応力の範囲を広げるための追加の変数を表します。最後に、説明されたプロトコルは「Ibidi」フローコンディショニングセットアップを採用していますが、同様のフローレジームを適用できる限り、他のメーカーの設定も同様に使用できます。

このバイオリアクターシステムを使用する主な利点の1つは、ヘモ力学的にロードできる比較的大きな構造(約15mm x 10.5 mm)であり、単一のサンプルから抽出できる様々な読み出しパラメータを可能にします。同時に、構築サイズは、同様に制限として見ることができる、このセットアップは、特にプライマリセルが使用されている場合、または培養培地が高価な添加剤を必要とする場合、比較的大量の(時には高価な)材料を必要とするため。また、セットアップのスループットは比較的低くなります。したがって、現在の設定は、読み出しが制限された多数の変数をスクリーニングするのではなく、限られた数の変数を包括的にテストする仮説主導の研究に特に適しています。今後の実験では、小規模な足場を取り付け、中程度の貯水池のサイズを縮小するためのオプションを有効にするために、現在のセットアップの小さな改善が行われています。後者に関しては、所望の剪断応力を達成するのに十分な体積流量を可能にするために、媒体貯留層の現在の容積が必要である。必要な流量は、培地貯留層の体積を増やすことで減少する(例えば、キサンタンガムを添加することで、以前に確立された69)。

結論として、このバイオリアクターは、多種多様なエラストマー3D生体材料足場に対する組織の成長と改造に対する剪断応力および環状ストレッチの個々および組み合わせの影響を定量化することを可能にする。バイオリアクターは、様々な負荷条件下で最大8つの血管構造を培養することができます。その設計のために、バイオリアクターは、特に、ヘモダイナミクスとその場の血管TEプロセスとの間の相互作用を研究するのに適しています。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

この研究は、LSH 2Treatプログラム(436001003)とオランダ腎臓財団(14a2d507)の一環としてZonMwによって財政的に支援されています。N.A.K.は、欧州研究評議会(851960)からの支援を認めています。オランダ科学研究機構(024.003.013)が出資する重力プログラム「物質主導再生」を感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM) Gibco 12491-015 cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil Julabo 8940012 prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen Sigma F8630 to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin Sigma T4648 to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge Eppendorf 5804 to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor - "kelly forceps" Almedic P-422 clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators Sanyo MCO-170AIC-PE for cell culturing
Compressed air reservoir Festo CRVZS-5 smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches Matlab R2017. The Mathworks, Natick, MA calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board National Instruments BNC-2090 data processing in between amplifier system and computer
Ethanol VWR VWRK4096-9005 to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS) Greiner 758087 cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet Assistant HE40567002 apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology n.a. part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax Gibco 35050061 cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera MotionScope M-5 to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens Nikon JAA616AB to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip ibidi GmbH 10821 block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads ibidi GmbH 10902 set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped) Swann Morton 0301; 0933 to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software National Instruments version 2018 to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light Labconco 302310001 to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes Greiner 664-160 for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C) Sigma A8960 cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500 Zeiss Schott AG to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps ibidi GmbH various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories) to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS) PEEKEL instruments B.V. n.a. to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders ibidi GmbH 10974 medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter Rubber BV 1805 to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software Idtvision 2.15.00 to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G) BD Microlance 301700 together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver Adson 2429218 to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues Kleenex 38044001 for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm Sigma P7793-1EA quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S) Lonza DE17-602E cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P4417-100TAB for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps Greiner 206202 to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder Festo AEVC-20-10-I-P to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length) SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands n.a. produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control) Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer BD TC-XX and P 10 EZ the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor Festo MPPES-3-1/8-2-010, 159596 provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) Gibco A1049101 cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL) Eppendorf 30120086 multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20% Sigma 5030 Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.  
Silicone O-rings Technirub 1250S to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness) Rubber BV 1805 to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL) Falcon 352095 multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle Ethicon, Johnson&Johnson EH7404H Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL) B. Braun Melsungen AG 2057932 to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm) Satorius 17597-K to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap Nunc 178983 to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap Nunc 156499 to culture static control samples
Teflon bellow Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel) PolarWare 15-248 for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers Wironit 4910 sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water Stakpure Omniapure UV 18200002 to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light Philips TUV 30W/G30 T8 for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding

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References

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フローとストレッチの下でバイオ材料の炎症と再生能力を評価するマルチキューバイオリアクター
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Koch, S. E., van Haaften, E. E.,… More

Koch, S. E., van Haaften, E. E., Wissing, T. B., Cuypers, L. A. B., Bulsink, J. A., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A., Smits, A. I. P. M. A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch. J. Vis. Exp. (166), e61824, doi:10.3791/61824 (2020).

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