En multi-cue bioreaktor for å evaluere den inflammatoriske og regenerative kapasiteten til biomaterialer under strømning og strekk

Summary

Målet med denne protokollen er å utføre en dynamisk samkultur av menneskelige makrofager og myofibroblaster i rørformede elektrospun stillaser for å undersøke materialdrevet vevregenerering, ved hjelp av en bioreaktor som muliggjør frakobling av skjærspenning og syklisk strekk.

Abstract

Bruk av resorberbare biomaterialer for å indusere regenerering direkte i kroppen er en attraktiv strategi fra et translasjonelt perspektiv. Slike materialer induserer en inflammatorisk respons ved implantasjon, som er driveren for etterfølgende resorpsjon av materialet og regenerering av nytt vev. Denne strategien, også kjent som in situ vevsteknikk, forfølges for å oppnå kardiovaskulære erstatninger som vevskonstruerte vaskulære transplantater. Både de inflammatoriske og regenerative prosessene bestemmes av de lokale biomekaniske signalene på stillaset (dvs. strekk og skjærspenning). Her beskriver vi i detalj bruken av en spesialutviklet bioreaktor som unikt muliggjør frakobling av strekk- og skjærspenning på et rørformet stillas. Dette muliggjør systematisk og standardisert evaluering av den inflammatoriske og regenerative kapasiteten til rørformede stillaser under påvirkning av godt kontrollerte mekaniske belastninger, som vi demonstrerer på grunnlag av et dynamisk samkultureksperiment ved hjelp av menneskelige makrofager og myofibroblaster. De viktigste praktiske trinnene i denne tilnærmingen – konstruksjon og oppsett av bioreaktoren, tilberedning av stillasene og cellesåing, påføring og vedlikehold av strekk- og skjærstrøm og prøvehøsting for analyse – diskuteres i detalj.

Introduction

Kardiovaskulær vevsteknikk (TE) forfølges som et alternativt behandlingsalternativ til de nåværende brukte permanente kardiovaskulære protesene (f.eks. vaskulære transplantater, hjerteklafferstatninger), som er suboptimale for store kohorter av pasienter^1,2,3,4. Ettertraktede bruksområder inkluderer vevskonstruerte vaskulære transplantater (TEVG)^5,6 og hjerteklaffer (TEHVer)^7,8. Ofte bruker kardiovaskulære TE-metoder resorberbare biomaterialer (enten naturlige eller syntetiske) som tjener som et lærerikt stillas for det nye vevet som skal dannes. Dannelsen av nytt vev kan enten konstrueres helt in vitro, ved å så stillaset med celler og kultivering i en bioreaktor før implantasjon (in vitro TE)^9,10,11, eller direkte in situ, der det syntetiske stillaset implanteres uten pre-culturing for å indusere dannelsen av nytt vev direkte i kroppen (in s TEitu)^12,13,^13,1 . For både in vitro og in situ kardiovaskulær TE tilnærminger, vellykket funksjonell regenerering er dominerende avhengig av både verten immunrespons på implantert konstruksjon og passende biomekanisk lasting.

Betydningen av biomekanisk lasting for kardiovaskulær TE er godt anerkjent¹⁵. Når det gjelder kardiovaskulære implantater, blir cellene som fyller stillaset utsatt for syklisk strekk og skjærspenninger som oppstår som følge av det hemodynamiske miljøet. Tallrike studier har rapportert den stimulatoriske effekten av (syklisk) strekk på dannelsen av matrisekomponenter, for eksempel kollagen^16,17,18,19, glykosaminoglykaner (GAG)²⁰og elastin^21,22, av ulike celletyper. For eksempel viste Huang et al. at biaxial strekk forhøyet avsetningen og organiseringen av kollagen og elastin i in vitro TEVGs ved hjelp av en vaskulær bioreaktor²³. Selv om vektleggingen typisk ligger på strekk som den dominerende belastningen, bruker disse studiene ofte strømningsdrevne bioreaktorer der prøven også utsettes for skjærstrøm. Selv om relativt lite er kjent om den isolerte påvirkningen av skjærspenninger på vevsdannelse og betennelse i 3D, er noen data tilgjengelige. For eksempel viste Hinderer et al. og Eoh et al. at skjærstrøm, i tillegg til en 3D stillasmikrostruktur, var viktig for dannelsen av moden elastin av humane vaskulære glatte muskelceller i et in vitro-modellsystem^24,25. Til sammen illustrerer disse funnene relevansen av både syklisk strekk og skjærspenning for kardiovaskulær TE.

En annen viktig determinant for suksess eller svikt i TE-implantater er vertens immunrespons på den implanterte graft²⁶. Dette er spesielt viktig for materialdrevne IN SITU TE-strategier, som faktisk er avhengige av den akutte inflammatoriske responsen på stillaset for å starte de påfølgende prosessene for cellulær tilstrømning og endogen vevsdannelse og ombygging²⁷. Makrofagen er en kritisk initiativtaker til funksjonell vevregenerering, som har blitt vist ved flere studier^28,29,30. Analogt med sårheling styres regenerering av vev ved parakriminalisering mellom makrofager og vevsproduserende celler som fibroblaster og myofibroblaster^31,32,33. I tillegg til å koordinere ny vevsavsetning, er makrofager involvert i aktiv resorpsjon av utenlandsk stillasmateriale^34,35. Som sådan har in vitro makrofagresponsen til en biomateriale blitt identifisert som en prediktiv parameter for in vivo-suksessen til^{implantater 36,37,38}.

Makrofagresponsen på et implantert stillas er avhengig av stillasdesignfunksjoner som materialsammensetning og mikrostruktur^35,39,40. I tillegg til stillasegenskaper påvirkes også makrofagresponsen på et stillas og deres krysstale med myofibroblaster av hemodynamiske belastninger. For eksempel ble syklisk strekning vist å være en viktig modulator av makrofag fenotype^41,42,43,44 og sekresjonen av cytokiner^43,44,45,46 i 3D elektrospun stillaser. Ved hjelp av et samkultursystem av makrofager og vaskulære glatte muskelceller viste Battiston et al. at tilstedeværelsen av makrofager førte til økte nivåer av elastin og GAG og at moderate nivåer av syklisk strekning (1,07-1,10) stimulerte avsetningen av kollagen I og elastin⁴⁷. I tidligere arbeider har vi vist at skjærspenning er en viktig determinant for monocyttrekruttering til 3D-elektrospun stillaser^48,49, og at både skjærspenning og syklisk strekk påvirker parakrinen som signaliserer mellom menneskelige monocytter og mesenchymale stromalceller⁵⁰. Fahy et al. viste at skjærstrømmen økte sekresjonen av proinflammatoriske cytokiner av menneskelige monocytter⁵¹.

Samlet sett viser ovennevnte bevis at en tilstrekkelig forståelse av og kontroll over hemodynamiske belastninger er avgjørende for kardiovaskulær TE, og at det er viktig å vurdere den inflammatoriske responsen for å oppnå dette. Tallrike bioreaktorer har tidligere blitt beskrevet for in vitro^{52,53,54,55,56,57,58} eller ex vivo^59,60,61 kultur av kardiovaskulært vev. Imidlertid er alle disse systemene designet for å etterligne de fysiologiske hemodynamiske lasteforholdene så mye som mulig. Selv om dette er svært verdifullt med det formål å skape kardiovaskulære vev in vitro eller opprettholde ex vivo-kulturer, tillater slike systemer ikke systematiske studier i de individuelle effektene av individuelle signaler. Dette skyldes at anvendelsen av både syklisk strekk og skjærspenning i disse bioreaktorer er drevet av samme trykkstrøm, som i seg selv forbinder dem. Mens mikrosystemer som tillater nøyaktig multi-cue mekanisk manipulasjon er beskrevet for 2D-substrater⁶² eller 3D hydrogel oppsett^63,64, slike oppsett tillater ikke inkorporering av elastomeriske 3D biomaterialer stillaser.

Her presenterer vi anvendelsen av et rørformet bioreaktorsystem som unikt muliggjør frakobling av skjærspenning og syklisk strekning og bidrar til mekanistisk å undersøke deres individuelle og kombinerte effekter. Dette systemet gjør det mulig å teste et bredt utvalg av vevskonstruerte vaskulære transplantater (f.eks. syntetisk eller naturlig opprinnelse, forskjellig mikroarkitektur, ulike porøsiteter). For effektivt å koble fra anvendelsen av skjærspenning og strekk, er nøkkelbegrepene som bioreaktoren bruker (1) separasjon av kontrollen av skjærspenning og strekk ved hjelp av distinkte pumpesystemer og (2) stimulering av stillasene på en "inside-out" måte med beregningsdrevne dimensjoner. Strømning påføres på utsiden av det rørformede stillaset ved bruk av en strømningspumpe, mens omkretsstrekning av stillaset induseres ved å utvide et silikonrør som stillaset er montert ved bruk av en separat strekkpumpe. Dimensjonene til silikonrøret og glassrøret som inneholder konstruksjonen er nøye valgt og validert ved hjelp av beregningsvæskedynamikksimuleringer, for å sikre at skjærspenningen på stillaset (på grunn av strømning) og omkretsstrekningen (på grunn av rørutvidelse) ikke påvirker hverandre betydelig. Denne innvendige designen har flere praktiske begrunnelser. Hvis strekk påføres av det lysende væsketrykket (ligner fysiologisk belastning), krever det iboende at prøvedesignet er lekkasjefritt. I tillegg vil trykket som kreves for å strekke prøven være helt bestemt av prøvestivheten, som kan variere mellom prøver og innenfor en prøve over tid, noe som gjør det vanskelig å kontrollere strekningen. Denne bioreaktoren monterer vevskonstruert graft rundt et silikonrør og tillater veggskjærstress (WSS) -applikasjon på graftens yttervegg og trykker graftet fra innsiden. På denne måten kan like lasteforhold mellom prøver og innenfor prøver over tid sikres, og dessuten kan prøvene lekke, som det er vanlig for porøse vaskulære stillaser¹⁹. Denne innside-ut bioreaktoren er spesielt beregnet for systematiske studier på effekten av skjær og / eller strekk, i stedet for å konstruere et innfødt-lignende blodkar in vitro, som tradisjonelle vaskulære bioreaktoroppsett er mer egnet for. Se figur 1A–B for bioreaktordesigntegningene, og tilhørende tabell 1 for funksjonsbeskrivelse og begrunnelse bak bioreaktorens hovedkomponenter.

Bruken av bioreaktoren er demonstrert på grunnlag av en rekke nyere studier av vår gruppe der vi undersøkte de individuelle og kombinerte påvirkningene av skjærspenning og syklisk strekk på betennelse og vevsdannelse i resorberbare elektrospun stillaser for in situ kardiovaskulært vev^19,43,44. For det formål brukte vi menneskelige makrofager og myofibroblaster enten i mono- eller i samkultur for å simulere de ulike fasene av in situ regenerativ kaskade. Vi har vist at cytokinsekresjon av menneskelige makrofager er tydelig påvirket av både syklisk strekk og skjærspenning, som påvirker matriseavsetningen og organiseringen av menneskelige myofibroblaster i disse stillasene, både via parakrinesignalering og direkte kontakt^19,43,44. Spesielt viste disse studiene at i tilfelle kombinert påføring av skjærspenning og strekk, er effektene på vevsdannelse og betennelse enten dominert av en av de to belastningene, eller det er synergistiske effekter av begge belastningene. Disse funnene illustrerer relevansen av frakobling av begge belastningene for å få en bedre forståelse av det mekaniske miljøets bidrag i TE-prosesser. Denne forståelsen kan anvendes for systematisk å optimalisere stillasdesignparametere i relevante hemodynamiske lasteregimer. I tillegg kan mekanistiske data fra slike velkontrollerte miljøer fungere som inndata for numeriske modeller som utvikles for å forutsi løpet av in situ vevsoppussing, som nylig rapportert for TEVGs⁶⁵ eller TEHVs⁶⁶, for ytterligere å forbedre prediktiv kapasitet.

Protocol

I studiene beskrevet i denne protokollen, primære menneskelige makrofager isolert fra perifere blod buffy strøk og menneskelige myofibroblaster isolert fra saphenous venen etter koronar bi-pass kirurgi har blitt brukt⁴⁴. De buffy jakkene ble hentet fra friske, anonymiserte frivillige som ga skriftlig informert samtykke, som ble godkjent av Sanquin Research Institutional Medical Ethical Committee. Bruken av humane vena saphena celler (HVSCs) var i samsvar med "Code Proper Secondary Use of Human Tissue" utviklet av Federation of Medical Societies (FMWV) i Nederland.

1. Generelle forberedelser og nødvendige tiltak før du setter opp bioreaktoren

MERK: For detaljer om de respektive isolasjons- og modningsprotokollene, se tidligere arbeid^19,43,44. Alle beregninger i protokollen er gitt som eksempler på et samkultureksperiment med monocytter og myofibroblaster, sådd i 8 hemodynamisk belastede stillaser og 2 statiske kontroller (n = 10).

1. Start celleisolasjon og cellekultur. Såingstetthetene for de samkulturerte prøvene av monocytter og myofibroblaster (med et såingsforhold på 2:1) er henholdsvis 30 × 10⁶ monocytter / cm³ og 15 × 10⁶ myofibroblaster / cm³.
   MERK: Elektrospunmaterialet har høy porøsitet (>90%). For å estimere det nødvendige antall celler per graft, beregnes stillasvolumet med formelen for volum av en hul sylinder: π^{*(tykkelse) 2}* lengde ≈ 0,04 cm³. Den totale mengden celler per graft er 1,2 × 10⁶ monocytter og 0,6 × 10⁶ myofibroblaster. For 10 prøver kreves minst 12 × 10⁶ monocytter og 6 × 10⁶ myofibroblaster; starte med opptil ~ 10-15% flere celler for å ta hensyn til mulige pipetteringsfeil.
2. Degas cellekulturmediet som skal brukes til eksperimenter som involverer bioreaktoren.
   1. Forbered mediet for samkulturer, som består av RPMI-1640: aDMEM (1:1), supplert med 10% foster bovin serum, 1% penicillin-streptomycin og 0,5% L-glutamin.
   2. Plasser mediet over natten (O/N) i en inkubator i en cellekulturflaske med filterhette til degas.
   3. Sett på plass filterhetten med en lufttett hette og oppbevar den ved 4 °C.
   4. Rett før bruk, tilsett 0,25 mg/ml L-askorbinsyre 2-fosfat (vitamin C) til mediet.
      MERK: For beregninger er mengden medium som kreves per strømningskulturkammer 50 ml. Oppdater mediet tre ganger i uken. 25 ml gammelt medium erstattes av 25 ml friskt medium. For 10 prøver; Etter sådd er det nødvendig med totalt 500 ml friskt medium, og for hver etterfølgende middels endring brukes totalt 250 ml friskt medium. Forbered alltid medium frisk, spesielt vitamin C bør tilsettes like før du endrer mediet.
3. Forbered isotrope elektrospunstillaser (3 mm lysdiameter, 200 μm veggtykkelse) som beskrevet av Van Haaften et al.¹⁹ (Figur 1G–I). Kort sagt produseres rørformede polycaprolactone bisurea (PCL-BU) stillaser ved elektrospinning fra 15% (m / w) kloroformpolymerløsninger. Polymerløsningene er elektrospun ved romtemperatur og 30% relativ fuktighet, med en strømningshastighet på 40 μL / min, 16 cm avstand fra det roterende sylindriske målet (Ø 3 mm, 500 rpm), og en påført spenning på 16 kV på elektrospinningsdysen og -1 kV på målet.
   MERK: Selv om PCL-BU-transplantater ble brukt til disse eksperimentene, kan et bredt utvalg av elastomeriske vevskonstruerte transplantater monteres i denne bioreaktoren (f.eks. av forskjellig syntetisk eller naturlig opprinnelse, forskjellig mikroarkitektur, forskjellige porøsiteter)
   1. Fjern elektrospun stillasene fra mandrel.
      1. Lag et lite hull i hetten på et 15 ml rør for å "holde" mandrel i midten og forhindre at den berører veggen på røret.
      2. Plasser mandrel med elektrospun stillaset i falkerøret og fyll det med deionisert vann.
      3. Frys rørene O/N ved -20 °C.
      4. Plasser rørene ved romtemperatur (RT) og trekk ut mandlene etter noen minutter, og la elektrospuntransplantene ligge i isen.
      5. La isen tine helt, fjern elektrospunrøret fra det opptinte vannet, og "heng" for å tørke vertikalt i flere timer. Pass på at stillasene ikke "kollapser" under egen vekt.
   2. Tørre stillaser under vakuum O/N.
   3. Bilde en liten prøve av elektrospuntransplantater ved hjelp av skanning elektronmikroskopi (SEM) for å vurdere deres mikrostruktur (f.eks. fibermorfologi, fiberdiameter). Transplantatene i eksempelstudiene har en isotrop fiberorientering og en fiberdiameter på 5 μm (Figur 1H–I).
4. En dag før du starter eksperimentet, plasser det hydrauliske reservoaret fylt med deionisert vann i inkubatoren. Lukk alle åtte forbindelsene for strømningskulturkamre med hvite Luer-caps. Koble til trykkluftsystemet og sett inn trykksensoren. Kjør strekkpumpen (se trinn 5.6) O/N for å muliggjøre liten utvidelse av Teflon-belgen.
   MERK: Sørg for at alle nødvendige materialer og utstyr rengjøres og/eller autoklaveres (se Tabell over materialer, Kommentarer/Beskrivelse-kolonnen som materialer kan autoklaveres for), i henhold til produsentens protokoll eller som beskrevet i trinn 7.3–7.6.
5. Sørg for sterile arbeidsforhold for resten av protokollen.
   1. Utfør trinn 2–5.3 (sette opp systemet), trinn 6.3 (middels endring) og trinn 7.1-7.2 (innhøsting av vaskulære konstruksjoner) i et sterilt laminært strømningsskap.
   2. Plasser materialer som ikke er direkte nødvendig for de påfølgende trinnene i lukkede Petri-retter for å holde alt så rent som mulig.
   3. Rengjør eller tørk materialoverflater regelmessig ved å suge et papirvev med 70% etanol, og tørk overflatene på bioreaktorkomponentene og laminært strømningsskap.

2. Sette opp bioreaktoren

MERK: Utfør trinn 2 i et laminært strømningsskap.

1. Skjær elektrospunstillasene i rør med en lengde på ca. 25 mm, og dokumenter dem før bruk (f.eks. fotografi for lengden, vei med balanse for startmassen).
2. Dekontaminere elektrospun stillasene.
   1. Plasser elektrospunstillasene vippet i en brønnplate eller Petri-tallerken, med en åpning vendt mot den ultrafiolette (UV) lyskilden, for å aktivere UV-lys (253,7 nm) for å belyse innsiden av stillasene.
   2. Utsett elektrospunstillasene for UV-lys i 5 minutter.
   3. Drei alle stillaser og gjenta UV-belysningen for den andre åpningen.
      MERK: Etter dette trinnet må du bare berøre elektrospunstillaset ved behov. Bruk alltid rene pinsett eller rene hansker.
   4. Ta glassrørene til strømningskulturkamrene som er lagret i 70%, vask glassrørene i ultrapure vann, tørk og legg i en stor, lukket Petri-tallerken.
      MERK: Følgende trinn, spesielt trinn 2.3-2.5, utføres ideelt av to eksperimenter.
3. Monter elektrospunstillasene på silikonslangen.
   1. Fest 5-0 prolen suturen til den ene enden av silikonrørene ved å ta suturen gjennom den ene siden av røret og ut av den andre, slik at to motsatte stramme suturer spenner over tverrsnittet av slangen. Lag en liten knute på begge sider av røret mens du komprimerer røret ved locus av knutene og la ca 10 cm ledning på begge knuter. Lag en tredje knute på slutten av de to 10 cm venstre ledningene.
      1. Klipp av suturnålen og alle frie tråder som kan stikke ut og skade innsiden av elektrospunstillaset. Klipp bort kantene på silikonslangen i trekantet form for å hjelpe til med å trekke silikonslangen gjennom elektrospunstillaset.
   2. Dypp elektrospunstillaset i 30% etanol (dette fungerer som ekstra dekontamineringstrinn og hjelper til med å skyve elektrospun stillaset over silisiumslangen) og plasser elektrospun stillaset over den frie 10 cm ledningen. Eksperimenterer A strekker silikonslangen ved å trekke forsiktig på både silikonslangen og knuten på den 10 cm suturtråden, mens eksperimenter B forsiktig skyver elektrospun stillaset over silikonslangen ved hjelp av pinsett med en jevn indre spiss for å forhindre skade på stillasene.
   3. Slipp strekningen langsomt på silikonslangen, samtidig som du glatter ut elektrospunstillaset med pinsett. Dypp elektrospunstillaset på silikonslangen i ultrarent vann to ganger.
      MERK: Det er mulig at noe rynke av elektrospun stillas oppstår. Denne rynken vil forsvinne under den påførte forstrekkingen rett før du fester stillasene til trykkledningene i trinn 2.5.3.
   4. Gjenta trinn 2.3.2 og 2.3.3 for de andre elektrospunstillasene. Avhengig av lengden på silikonslangen, kan flere elektrospun stillaser monteres på samme silikonrør.
   5. Når alle elektrospun stillaser er montert på silikonslangen, kutt silikonslangen rundt stillasene, alt i samme lengde (5,5 cm); på den ene siden, nær enden av elektrospun stillaset, på den andre siden, og etterlater ~ 2-3 cm gratis silikonrør.
4. Konstruer det nederste rommet i strømningskulturkammeret (Figur 1A–B).
   1. Ta den øvre delen av det nederste rommet som inneholder strømuttaket, og lukk strømuttaket med en mannlig Luer-plugg.
   2. Skyv trykkledningen med hull gjennom bunnrommet, og plasser en silikon O-ring rundt den nedre enden av trykkledningen for å forhindre lekkasje. Skru den nedre delen av bunnrommet til den øvre delen av bunnrommet for å feste trykkledningen. Pass på at det nedre graverte sporet på trykkledningen er ca. 3–5 mm over kanten av adapterhylsen på bunnrommet. Dette vil senere "holde" den stramme knuten på suturledningen, og feste elektrospunstillaset over silikonslangen.
      MERK: Hvis trykkledningen lett kan manøvreres opp og ned, indikerer det at bunnrommet ikke er godt festet. Gjenta trinn 2.4.2 for å unngå lekkasje i senere stadier (Figur 2D).
5. Fest silikonslangen med elektrospunstillaset til trykkledningen.
   1. Trekk silikonrøret med elektrospunstillaset over trykkledningen.
   2. Lag en knute med suturtråden i den nedre enden av elektrospunstillaset på plasseringen av det graverte sporet på trykkledningen. Lag en ny knute på motsatt side for å feste silikonslangen tett med elektrospuntransplantatet.
      FORSIKTIG: Dette er et kritisk trinn. Pass på at knuten nøyaktig "faller" inn i den graverte sporet på trykkledningen for å forhindre lekkasje av vannet fra hydraulikkbeholderen til strømningskulturkamrene. Hvis du ikke er sikker, prøv å stramme suturledningen i flere posisjoner, over eller under den forventede plasseringen av sporet, for å sikre at de siste knutene er nøyaktig ved den graverte sporet (Figur 2A).
   3. Plasser sakseklemmen i den øvre enden av silikonrøret, og strekk silikonslangen oppover (dette vil direkte teste den første knuten, hvis det er mulig å flytte silikonslangen med elektrospunstillaset over trykkledningen, ble den ikke strammet godt nok). Med trekkraften er silikonslangen forhåndsstrukket. For å sikre at silikonslangen er konsistent mellom de forskjellige prøvene, fest en linjal til saksklemmen. Trekk sakseklemmen oppover til den nedre enden av linjalen når høyden på den nedre enden av stillaset.
      MERK: Det er viktig å holde forstrekket i hver prøve omtrent det samme (~5%) av to grunner: (1) hvis silikonslangen er forhåndsstrukket, vil det resultere i mer homogen ekspansjon langs lengden på prøven når den trykkes; (2) forstrekket vil påvirke silikonets mekaniske egenskaper, derfor bør det være det samme på tvers av alle prøver for å sikre like strekkforhold mellom prøvene.
   4. Fjern rynker i elektrospun stillaset ved å trekke forsiktig på elektrospun stillaset. Igjen, lag to knuter på begge sider med en suturtråd på den øvre enden av stillaset på plasseringen av det øvre graverte sporet på trykkledningen.
   5. Løsne sakseklemmen, og kutt bort overflødig silikonrør med en kniv, og la 20-30% av skruegjengen dekket med silikonrør, for å forhindre lekkasje når nesekjeglen er montert på skruegjengen.
      MERK: Gjenta trinn 2.4 og 2.5 for alle dynamiske prøver.
   6. For de statiske kontrollprøvene, fest elektrospunstillaset montert på silikonslangen på trykkledninger uten hull. Disse ledningene kan oppbevars separat i et 15 ml rør til sådd (trinn 4) og ikke trenger å monteres i strømningskulturkammerrommene.
6. Dekontaminere de delvis konstruerte strømningskulturkamrene med elektrospunstillas ved å utsette det for UV-lys i 10 minutter. Vri strømningskulturkamrene med elektrospunstillaser til den andre siden, og gjenta UV-lyseksponering i 10 minutter.
7. Skru nesekjeglene på skruegjengen på trykkledningene med hull for de dynamiske prøvene.
   1. Pass på at den øverste enden av silikonslangen passer inn i nesekjeglen for å forhindre lekkasje i senere stadier. Hvis det er for mye silikonrør, kutt overskuddet av slanger bort med en kniv.
   2. Plasser de delvis konstruerte strømningskulturkamrene i en stor Petri-tallerken, og pek nesekjeglen mot UV-lyskilden. Påfør UV-belysning i 5 min.
8. Komplett konstruksjon av strømningskulturkammeret med glassrøret og det øverste rommet i strømningskulturkammeret (Figur 1A–B).
   1. For-våt elektrospun stillasene ved å dyppe trykkrøret med silikonrør og elektrospun stillas i 30% etanol, etterfulgt av en dukkert i ultrapure vann to ganger.
   2. Plasser glassrøret over trykkledningen, og skyv forsiktig inn i det nederste rommet og fest det forsiktig.
   3. Ta det øverste rommet som inneholder strømningsinntaket, plasser en silikon O-ring, strømnings rettetangen og adapterhylsen i riktig rekkefølge (Figur 1A-B), og plasser den over den åpne enden av glassrøret og fest den forsiktig.
   4. Skru en hvit luerhette på strømningsinntaket på det øverste rommet.
   5. Fjern den mannlige Luer-pluggen fra strømuttaket i bunnrommet, og rengjør overflaten rundt den med et etanol-gjennomvåt papirvev.
   6. Legg en sprøyte med 10 ml ultrarent vann i strømningsutløpet, åpne den hvite Luer-hetten på topprommet og fyll kammeret med ultrarent vann. Lukk den hvite Luer-hetten igjen, fjern sprøyten, rengjør igjen med etanol, og lukk strømuttaket med en mannlig Luer-plugg.
      MERK: Gjenta trinn 2.6–2.8 for alle strømningskulturkamre.
   7. For de statiske kontrollene, tilsett 10 ml ultrarent vann til de 15 ml rørene som holder prøvene montert på trykkledningene uten hull.
9. Plasser alle strømningskulturkamre i inkubatoren. Bytt ut det ultrarenke vannet med kulturmedium en dag før cellesåing på samme måte som beskrevet i trinn 2.8.5 og 2.8.6 (sørg for å samle det "gamle" ultrapure vannet med et etanol-gjennomvåt papirvev plassert direkte på strømningsutløpet).

[Protokollen kan stanses midlertidig her]

3. Forberedelser for strømningspumpeoppsettet

MERK: Utfør trinn 3 i et laminært strømningsskap.

1. Samle alle pumpeoppsettsmaterialer og forbered bruk.
   MERK: Eksperimenter henvises til produsentens protokoll for en detaljert beskrivelse av oppsett av pumpen, de fluidiske enhetene og middels rør gjennom ventilene til den fluidiske enheten.
   1. Sett pumpen til 200 mbar kapasitet.
   2. Skru reservoarholderne for 60 ml reservoarer til de fluidiske enhetene.
   3. Rengjør de gjenbrukbare gummiluftfiltrene med et papirvev gjennomvåt i etanol, sørg for at luftfilteret forblir tørt.
2. Plasser de 60 ml reservoarene i reservoarholderne, og plasser standard middels rør gjennom ventilene til den fluidiske enheten. Koble medium slangen med en større indre diameter med kvinnelige Luer låskoblinger i en lukket sløyfe.
3. Klem de mellomstore slangene med en slangeklemme, rett under reservoarene.
4. Fyll reservoarene med 25 ml kulturmedium per 60 ml reservoar. Løsne slangeklemmen, og la mediet komme inn i slangen.
5. Lukk de mellomstore reservoarene med gummiluftfiltrene, og plasser strømningspumpeoppsettet i inkubatoren til trinn 4.

4. Cellesåing Ved hjelp av Fibrin som cellebærer

MERK: Utfør trinn 4 i et laminært strømningsskap.

1. Forbered fibringelen til cellefrøtrinnet. For detaljer, se Mol et al.⁶⁷ For fibringelen skal fibrinogenoppløsningen ha en endelig konsentrasjon på 10 mg/ml (riktig for renheten av proteinbestanden), og trombinoppløsningen skal ha en endelig konsentrasjon på 10 U/ml.
   1. Tine fibrinogen til RT, før du veier ~ 50 mg (nok til 10 prøver) i en plastbeholder med rødt lokk.
   2. Tilsett cellekulturmedium for å forberede fibrinogenoppløsningen (i en konsentrasjon på 10 mg / ml, riktig for renheten av proteinbestanden). Bland godt og filtrer for å sterilisere fibrinogenoppløsningen med et 0,2 μm sprøytefilter i et sterilt 15 ml rør. Oppbevar den filtrerte fibrinogenoppløsningen på is.
      MERK: Unngå å klargjøre fibrinogenoppløsningen for lenge på forhånd, ellers kan fibrinogenet koagulere spontant.
   3. Tine trombin og lag en trombinoppløsning (i en konsentrasjon på 10 U/ml) i cellekulturmedium og legg på is. Forbered 20 μL trombin + celleoppløsning per prøve. For n= 10 prøver er det nødvendig med 200 μL; Forbered derfor 250 μL trombinoppløsning for å ta hensyn til mulige pipetteringsfeil.
2. Samle og telle cellene fra kulturflaskene. Bland cellene i ønsket forhold og mengde (1,2 × 10⁶ monocytter og 0,6 × 10⁶ myofibroblaster per stillas). Kontroller at det er nok celler til at n+1-prøver kan korrigeres for pipetteringsfeil. Sentrifuge ved 350 × g i 10 min ved RT. Fjern supernatanten.
3. Lag en blanding av suspenderte celler og trombin.
   1. For hver prøve, bruk 20 μL av trombinoppløsningen. For n = 10 prøver, tilsett 200 μL trombin til cellepellet og bland. Mål volumet av celleopphenget (celler + trombin), og beregn hvordan du deler jevnt over alle 10 stillaser (f.eks. hvis trombin + cellefjæring har et volum på 260 μL, vil hver elektrospunprøve motta 260 μL / 10 prøver = 26 μL trombin + cellefjæring).
   2. Når sådd av stillasene utføres i to trinn, forberede to 1,5 ml mikrofugerør som vil holde halvparten av cellefjæringen for hvert stillas (i eksempelberegningen av forrige trinn: lag to rør med 13 μL trombin + cellefjæring). Plasser på is.
      MERK: Følgende trinn, spesielt trinn 4.4, utføres ideelt av to eksperimenter.
4. Tørk de fort fuktede elektrospunstillasene med vakuum for å forberede cellesåing.
   1. Koble en pasteurpipet i glass til vakuumsystemet på laminært strømningsskap, og plasser den i et tomt 50 ml rør for steril midlertidig lagring.
   2. Ta strømningskulturkamrene fra inkubatoren, fjern den mannlige Luer-pluggen fra strømuttaket, og fjern mediet etter at du har åpnet den hvite Luer-hetten og plassert et etanol-gjennomvåt papirvev foran strømningsutløpet.
   3. Ta av topprommet og glassrøret, og legg det i en steril Petri-tallerken for midlertidig oppbevaring.
   4. Plasser vakuumet Pasteur pipet på elektrospun stillaset, og fjern så mye medium som mulig.
      FORSIKTIG: Støvsug elektrospunstillaset svært forsiktig. I stedet for en frem og tilbake lineær bevegelse over stillaset, plasser vakuumrøret flere steder. Klem vakuumslangen på toppen av Pasteurs pipet mellom fingrene for bedre kontroll.
   5. Bland fibrinogenoppløsningen i et 1:1-forhold med trombin + cellefjæring (bland for eksempel 13 μL fibrinogen med 13 μL trombin + cellefjæring). For å sikre at fibrinpolymererer i stillaset og ikke i mikrofugerøret, rør fibrinogenet, drei pipethjulet for "ekstra volum" av trombin + cellefjæring, og rør opp og ned en gang i mikrofugerøret med celleoppheng for å blande.
   6. Drypp løsningen direkte homogent over hele lengden på elektrospunstillaset. Det anbefales at Experimenter A drypper fibrinblandingen, mens eksperimenter B holder bunnrommet med elektrospunstillaset montert på trykkrøret.
   7. Etter at fibrinen med cellene dryppes over elektrospun stillaset, flytter Experimenter B sakte stillaset, fra venstre til høyre og opp og ned, for å dele cellene jevnt over stillaset.
   8. Gjenta trinn 4.4.5 - 4.4.7 på den andre siden av elektrospunstillaset.
   9. Monter strømningskulturkammeret igjen ved å plassere glassrøret forsiktig (forhindre at fibrin stikker og koagulerer til innsiden av glassrøret), og skyv tilbake det øverste rommet i strømningskulturkammeret. Plasser frøkonstruksjonen direkte uten middels eller fosfatbufret saltvann (PBS) i strømningskulturkammeret i inkubatoren.
   10. Gjenta trinn 4.4.1–4.4.9 for alle dynamiske prøver. For statiske prøver montert på trykkledninger uten hull, frø i henhold til trinn 4.4.1-4.4.8, og plasser i et 15 ml rør etterpå.
   11. La fibrinpolymerisere i 60 min i inkubatoren.

[Protokollen kan settes på pause her i 30–60 minutter.]

5. Etter polymerisering fyller du strømningskulturkamrene (dynamiske prøver) eller 15 ml rørene (statiske prøver) med medium.

5. Kobling av bioreaktor- og strømningspumpesystemer før du starter eksperimentet

MERK: Utfør trinn 5.1-5.3 i et laminært strømningsskap.

1. Ta brettet med strømningskulturkamrene og de fluidiske enhetene med fylte mellomstore reservoarer og tilkoblede mellomstore rør inne i laminære strømningsskap.
2. Plasser strømningskulturkamrene på bioreaktorbasen for de eksperimentelle gruppene lastet med syklisk strekk og med kombinerte hemodynamiske belastninger (Figur 1E).
   1. Vipp strømningskulturkammeret opp ned, og fyll trykkledningen nedenfra med ultrapure vann ved hjelp av en sprøyte med tynne rør (dette kan være av hvilken som helst type, så lenge det er fleksibelt og tynt, i dette eksperimentet ble en 10 cm lang, 0,15 mm innvendig diametertråd festet til nålen).
   2. Plasser de tynne slangene inne i trykkledningen, og mens trykkledningen er fylt med ultrarent vann ved å gradvis skyve vannet ut av sprøyten, trekk ledningen ut av trykkledningen samtidig, for å sikre at det ikke er luftbobler inne i trykkledningen.
   3. Plasser strømningskulturkammeret på en av de åtte skruegjengene på bioreaktorbasen. Plasser en silikon O-ring mellom bioreaktorbasen og den hvite Luer-kontakten for å forhindre mulig lekkasje, og stram den hvite Luer-kontakten fra bunnrommet.
   4. Gjenta trinn 5.2.2 og 5.2.3 for alle syklisk strakte prøver.
3. Koble strømningskulturkamrene for alle eksperimentelle grupper, unntatt statisk kontroll, til strømningspumpesystemet.
   1. Plasser en slangeklemme på middels slange. Fjern den hvite Luer-hetten som dekker strømningsinntaket til det øverste rommet i strømningskulturkammeret. Fjern den kvinnelige Luer-koplingen på mediumslangen, og koble medium slangen på den ene siden med strømningsinntaket på topprommet, og den andre siden av mellomslangen med strømningsutløp i bunnrommet.
   2. Gjenta trinn 5.3.1 for alle strømningskulturkamre. På dette tidspunktet er bioreaktoren og strømningskulturkamrene fylt med medium og koblet til strømningssystemene.
   3. For de statiske kontrollprøvene plasserer du prøvene vertikalt i en cellekulturflaske med filterhette ved hjelp av sakseklemmen. Fyll cellekulturflasken med medium, og plasser i inkubatoren.
4. Overfør hele oppsettet fra laminært strømningsskap til inkubatoren, og koble de fluidiske enhetene til lufttrykksslangen og den elektriske kabelen.
5. Start programvaren, og initialiser strømningspumpene. Start den mellomstore flyten for prøvene én etter én.
   1. Sjekk om ventilene til den fluidiske enheten klikker.
   2. Fjern slangeklemmen fra de mellomstore slangene.
   3. Start strømningspumpen med 100 mbar og 10 s koblingstid.
   4. Kontroller forsiktig strømningsretningen for mulige lekkasjer eller luftbobler. Eventuelle fanget luftbobler kan fjernes ved å snu strømningskulturkammeret opp ned.
      MERK: Pass på at middels nivåer i de mellomstore reservoarene er balansert, for å forhindre luftsuging i systemet og luftbobler i strømningskulturkamrene, og for ikke å la reservoarene gå tørre (Figur 2C).
   5. Gjenta trinn 5.5 for alle fluidiske enheter en etter en.
6. Initialiser strekkpumpen.
   1. Koble den pneumatiske aktiverte pumpen via luftinntaket på den pneumatiske sylinderen til trykkluften. Koble det nedre luftuttaket til det blå slangen for luft ut (Figur 1F).
   2. Åpne LabVIEW-programvaren, kjør LabVIEW-skriptet og trykklufttrykkapplikasjonssystemet, som beskrevet av Van Kelle et al.⁶⁸, angi forskyvning og frekvens (start med lav frekvens på 0,2 Hz). Sett pumpen på pause når Teflon-belgen er på sitt laveste nivå.
   3. Plasser trykksensoren i trykksensorinntaket på hydraulikkbeholderen.
7. Endre pumpeinnstillingene til ønsket innstilling (for 1,5 Pa, bruk 150 mbar, 10 s koblingstid).
8. Start strekkpumpen, og påfør den foretrukne innstillingen (f.eks. 0,5 Hz, 1,05 strekk).

6. Kjøre eksperiment i flere dager; Overvåking av skjær og strekk under kultur og middels utskifting

1. Beregn WSS ved stillasveggen.
   1. Registrer strømningsstørrelsesorden annenhver dag (se strømningspumpeprodusentens håndbok for detaljer). Kort sagt, følg endringen i væskenivåer (i ml) i de mellomstore reservoarene mellom vekslingen av væskeenhetsreservoaret i 10 s. Utfør minst fem målinger, beregn gjennomsnittsverdien og multipliser med 6 for å få strømningshastigheten Q i ml/min.
   2. Flyten beskrives av en Poiseuille-strømning gjennom en ringformet kanal. Forutsatt kulturmedium som en newtonsk væske, beregn WSS ved stillasveggen, r₁, etter ligning 1.
      (1)
      hvor WSS τ_w ved stillasveggen (r₁; her r₁ = 1,7 mm), som følge av en jevn tilstandsstrøm, bestemmes av den påførte trykkplaten og glassrørets indre radius r₂ (her r₂ = 2,3 mm). Trykkgradienten i aksialretningen antas å være jevn mellom strømningsinntaket og strømningsutløpet og er gitt ved ligning 2 (figur 1J).
      (2)
      med μ den dynamiske viskositeten (her ble middels viskositet antatt konstant, μ = 0,7 × 10^-3 Pa∙s ved 37 °C) og Q den påførte strømningshastigheten.
2. Overvåk strekningen som påføres stillasene annenhver dag.
   1. Plasser en mørk bakgrunn bak strømningskulturkammeret for å øke kontrasten mellom stillaset og bakgrunnen. Plasser LED-lyslampene, pekende mot stillaset, for å hjelpe visualiseringen av stillaset.
   2. Ta tidsforløpfotografier av stillaset med en frekvens på 30 Hz i 6 s (dvs. 3 strekksykluser) med et høyhastighetskamera.
      MERK: En lavere opptaksfrekvens kan være tilstrekkelig hvis kameraet tillater det. Den minimalt nødvendige frekvensen ble imidlertid ikke bestemt.
   3. Bestem minimums- og maksimumsdiameteren til stillaset manuelt fra bildene.
   4. Beregn minimum og maksimal ytre diameter på elektrospun stillaset for å beregne de maksimale strekningene i henhold til ligning 3.
      (3)
      hvor omkretsstrekningen (λ_θ) er gitt av forholdet mellom stillasets ytre diameter, d₁, og dens opprinnelige diameter, d₀.
3. Korriger for middels fordampning, og oppdater medium tre ganger i uken.
   1. Stopp og koble fra kablene for strømningssystemene og strekkpumpen.
   2. Plasser slangeklemmene på de mellomstore slangene.
   3. Bestem hvor mye medium som fordampes basert på volumindikatormerkene på de mellomstore reservoarene.
   4. Overfør brettet med bioreaktoren og de fluidiske enhetene til laminært strømningsskap.
   5. Fjern gummiluftfiltrene til de mellomstore reservoarene; tilsett autoklavert ultrarent vann for å kompensere for det fordampede volumet av medium. Lukk de mellomstore reservoarene igjen, og koble til pumpen igjen for å blande mediet med det ultrarenne vannet.
   6. Gjenta trinn 6.3.1–6.3.5. Fjern gummiluftfiltrene igjen, ta ut 25 ml kulturmedium og spinn ned på 300 × g i 5 min på RT.
      1. Samle 1,5 ml supernatant, og oppbevar ved -30 °C for analyse av sekretoriske profiler (for analyse med enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA)).
      2. Samle ønsket volum av supernatant for parakrine signalstudier, ved å bruke supernatanten som betinget medium⁴³.
   7. Tilsett 25 ml friskt medium til de mellomstore reservoarene.
   8. Plasser gummiluftfiltre tilbake på de mellomstore reservoarene.
   9. Plasser hele oppsettet tilbake i inkubatoren; koble alle kabler og luftslanger til pumpen og strekkpumpen. Løsne slangeklemmene og gjenta trinn 5.4–5.8.
4. Kontroller om silikatørking av perler i tørkeflaskene som er koblet til pumpen er fuktige (hvitt utseende), og erstatt om nødvendig med tørre silikaperler (oransje utseende).

7. Avslutte eksperiment, prøveinnsamling og rengjøring og lagring av utstyr

1. På eksperimentets siste dag korrigerer du for middels fordampning som beskrevet i trinn 6.3.1-6.3.5, og høster prøvene en etter en.
   1. For å høste prøvene en etter en, må strømningspumpen og strekkpumpen settes på pause flere ganger. Plasser en slangeklemme på middels slange. Stopp strømningspumpen og strekkpumpen midlertidig. Koble ett strømningskulturkammer fra bioreaktorbasen; erstattes av en hvit Luer-hette på bioreaktorbasen. Ta strømningskulturkammeret og fluidenheten til laminært strømningsskap. Start strømningspumpen og strekkpumpen igjen for å påføre den hemodynamiske belastningen på de andre prøvene til høsting.
   2. Samle medium fra medium reservoarene for paracrine cytokin produksjonsanalyse via ELISA.
2. Koble fra strømningsenheter og høst rørformet konstruksjon. Seksjon i henhold til ønsket skjæreordning. Deler av konstruksjonen kan lagres ved 4 °C (etter 15 min fiksering i 3,7 % formaldehyd og 3 x 5 min vasking i PBS) eller -30 °C (etter snapfrysing i flytende nitrogen) inntil videre analyse.
3. Rengjør bioreaktor- og pumpekomponentene. I tillegg er den anbefalte rengjøringsmetoden per vare nevnt i Materiallisten.
   1. Rengjør gummiluftfiltrene med 70% etanol. Vær veldig forsiktig så du ikke fukter det indre filteret!
   2. Samle alle separate komponenter: middels rør, mellomstore reservoarer, glassrør, mannlige Luer-plugger og kvinnelige Luer-låser, hvite Luer-caps, trykkledninger, nesekjegler, silikon O-ringer, adapterhylse, strømnings rettetang (unntatt pumper, fluidiske enheter, gummiluftfiltre, bioreaktorbasen) og skyll i rennende vann fra springen.
   3. Plasser O/N i 0,1 % natriumddecylsulfat i deionisert vann.
      MERK: Ikke bruk ultrarent vann, da delene kan ruste.
   4. Skyll med vann fra springen og oppvasksåpe.
   5. Dypp i deionisert vann, etterfulgt av 70% etanol to ganger, etterfulgt av deionisert vann.
   6. Legg alle materialer separat på papirvev og la dem tørke. Bruk trykket luft til å tørke slanger.
   7. Rengjør alle ikke-autoklaverbare materialer med et papirvev gjennomvåt i 70% etanol. Dette inkluderer gummiluftfilteret (husk at luftfilteret skal holde seg tørt) og bioreaktorbasen (Teflon belg og pneumatisk sylinder).
   8. Autoklaver komponentene i det fluidiske kammeret (inkludert silikon O-ringen), middels rør, de mellomstore reservoarene (uten gummiluftfilteret), mannlige Luer-plugger og kvinnelige Luer-koblinger, hvite Luer-hetter, slangeklemmer og standardutstyr (f.eks. pinsett, klemsaks)
   9. For praktisk bruk under neste eksperimenter, kombiner de separate komponentene for ett komplett fluidisk kammer i en automatisk boks.
4. Fjern vann fra hydraulikkbeholderen. Rengjør med 70% etanol, etterfulgt av deionisert vann. La det tørke. Fyll på med deionisert vann og noen dråper vannbadbevarende desinfeksjonsmiddel.
5. Oppbevar glassrørene til strømningskulturkammeret i 70% etanol.
6. Plasser de fuktige silikatørkingsperlene (hvitt utseende) i ovnen O/N ved 120 °C for å la dem tørke (oransje utseende) og oppbevare dem i en lufttett kolbe.

Representative Results

Denne bioreaktoren ble utviklet for å studere de individuelle og kombinerte effektene av skjærspenning og syklisk strekk på vaskulær vevsvekst og ombygging i 3D biomaterialer. Bioreaktorens utforming gjør det mulig å dyrke opptil åtte vaskulære konstruksjoner under ulike lasteforhold (Figur 1A). De vaskulære konstruksjonene er plassert i et strømningskulturkammer (figur 1B) der både omkretsstrekningen og WSS kan kontrolleres uavhengig. Det øverste rommet i strømningskulturkammeret holder en strømnings rettetang for å stabilisere strømmen i en relativt kort sedimenteringslengde (Figur 1C). Direkte nedstrøms for strømnings rettetang fordeler nesekjeglen strømmen jevnt gjennom ringformet kanal (Figur 1D). Når alle trinnene i protokollen utføres på riktig måte, kan de vaskulære stillasene i strømningskulturkammeret utsettes for en kontinuerlig enveisstrøm gjennom ringformet kanal mellom stillaset og glassveggen og omkrets strekkes av den pneumatiske pumpen (Figur 1E–F). Før stillaset monteres, skal elektrospunrøret kuttes i rør på 25 mm (figur 1G) og undersøkes med SEM for å analysere mikroarkitekturen (Figur 1H–I). Det er viktig å merke seg at PCL-BU-transplantatene i dette eksemplet kan erstattes av andre elastomeriske vevskonstruerte transplantater (naturlig eller syntetisk opprinnelse, forskjellig mikroarkitektur eller porøsitet). Den innvendige designen tillater testing av svært porøse grafts, da det ikke nødvendigvis trenger å være lekkasjefritt. Det skjematiske bildet av strømningskulturkammeret viser den fysiske tolkningen av parametrene som brukes i ligningene for å beskrive WSS (ligning 1), trykkgradienten (ligning 2) og omkretsstrekningen (formel 3) (figur 1J).

Feil kjøring av de kritiske trinnene i protokollen kan føre til noen få scenarier. For eksempel kan lekkasje fra det hydrauliske reservoaret oppstå som følge av feilmonterte knuter, noe som fører til lekkasje av hydraulikkvæske fra trykkledningene med hull som passerer silikonrøret og inn i strømningskulturkammeret (Figur 2A). Lekkasje av hydraulikkvæsken ved forbindelsen mellom skruegjengene og bioreaktorbasen kan også oppstå når silikonringen ikke er godt plassert, eller hvis Teflon-belgen ikke fikk lov til å utvide O/N litt en dag før eksperimentet (Figur 2B). Videre, når medium ikke avgasses, eller hvis middels nivåer i de mellomstore reservoarene ikke er godt balansert og ett middels reservoar går tørt, noe som resulterer i at luft suges inn i systemet, kan luftbobler oppstå i strømningskulturkammeret (figur 2C), som forstyrrer WSS-patters, kompromitterende celle levedyktighet og etterfølgende vevsvekst. Til slutt, når silikon O-ringen i bunnrommet ikke er riktig plassert, kan middels søl observeres under strømningskulturkammeret (Figur 2D).

Siden dette bioreaktoroppsettet tillater anvendelse av individuelle og kombinerte hemodynamiske belastninger, kan flere hemodynamisk belastede eksperimentelle grupper inkluderes i ett eksperiment (Figur 3A). Tidligere ble forskjellige hemodynamiske belastninger (dvs. to skjærspenningsregimer og to strekkregimer) validert ved å bruke ulike mulige systeminnstillinger (figur 3B). Når strekk (figur 3C) og WSS (figur 3D) ble overvåket over langsiktige kulturperioder, ble det validert at disse kan opprettholdes på relativt konstante nivåer over en periode på opptil 20 dager.

Bioreaktoren er spesielt godt egnet til å studere påvirkningen av hemodynamisk belastning på vekst og ombygging i en initu vaskulær TE-kontekst. Stadiene av in situ TE er hypoteset for å speile stadiene av den naturlige sårhelingsresponsen (Figur 4A). Co-kulturer av monocytt-avledede makrofager og myofibroblaster avledet fra menneskelige saphenous årer, som beskrevet her, ble etablert som en in vitro etterligning av spredningsfasen. Tre dager etter sådd viste immunfluorescensfarging en homogen fordeling av begge celletypene gjennom stillaset (figur 4B). Etter 20 dager med samkultur, syklisk strekk alene resulterte i avsetning av mer tallrike og tykkere kollagen type I fibre, mens i gruppen med kombinerte hemodynamiske belastninger ble denne effekten av syklisk strekk overstyrt av skjærspenning, noe som resulterte i mindre uttalt kollagentype I-avsetning, illustrert her ved immunfluorescence farging (Figur 4C). For vellykket in situ vev regenerering, er det nødvendig med en tett balanse mellom vevsproduksjon og stillasreorpsjon. I tillegg til vevsdannelse tillater bioreaktoren induksjon av celledrevet stillasresorpsjon. For eksempel, når man dyrker en monokultur av makrofager i 8 dager på elektrospuntransplantater, ble fibererosjon og fiberspalting observert i alle hemodynamiske lasteregimer, med den mest uttalt resorpsjonen i den statiske gruppen og minst uttalt resorpsjon i skjærstressgruppen (Figur 4D). Sammen viser disse resultatene virkningen av de ulike hemodynamiske lasteregimene på både vekst og ombygging. Denne innsikten er nyttig for å optimalisere designparametrene for nyutviklede in situ TEVG-er.

En annen viktig determinant for vevsregenereringsprosessen er tilstedeværelsen av pro- og antiinflammatoriske cytokiner. Siden bioreaktoren er et lukket sløyfesystem, vil cellene i systemet kontinuerlig bli utsatt for paracrine stimuli av utskilte faktorer. Cytokinsekresjonsprofilene i mediet av de dynamisk belastede samkulturene til humant perifert blodmonologcelle (PBMC)-avledede makrofager og humane myofibroblaster fra saphenøse årer ble analysert i tidlige og senere stadier (figur 5A). Disse representative resultatene illustrerer effekten av både syklisk strekk og skjærspenning på cytokinsekresjonsprofilen i samkulturoppsettet. Interessant nok viste de kombinerte effektene av begge belastningene enten dominans av en av de to belastningene (f.eks. syklisk strekk for interleukin-6 (IL-6) og monocytt kjemoattractant protein-1 (MCP-1)) eller synergistiske effekter av begge belastningene (f.eks. for IL-10) (Figur 5B). Disse innsiktene, samlet ved hjelp av denne in vitro-testplattformen, gir verdifull informasjon for utvikling av in situ TEVG-er som er basert på begrunnelsen for makrofagdrevet in situ vevregenerering.

Samkultureksperimenter av makrofager og myofibroblast viste at det mekaniske miljøet og de resulterende lastavhengige inflammatoriske miljøene modulerte fenotypen til myofibroblaster. Etter 20 dager med hemodynamisk lasting viste genuttrykk av myofibroblastmarkører klare forskjeller i den individuelle og kombinerte virkningen av lasten og i direkte og parakriminelle signalering av makrofager på myofibroblaster (figur 6A). Videre er genuttrykksmønstrene til kontraktilmarkør alfa glatt muskel actin korrelert med proteinsyntese (Figur 6B). Videre stimulerte syklisk strekk kollagen og elastisk matrisegenuttrykk og svekket matrisemetalloproteinase 1/vevsinhibitormatrise metalloproteinase 1-mediert kollagenoppussing, mens en stabiliserende effekt av skjærspenning ble observert i samkulturen (Figur 6C). Disse langsiktige samkultureksperimentene viser muligheten for å studere den senere fasen av vevsoppussingsfasen (figur 4A) i ulike hemodynamiske lasteregimer i vevskonstruerte vaskulære transplantater med denne bioreaktoren. Siden TEVG er montert "innvendig ut" på et silikonrør, kan den sirkulære strekningen og WSS brukes i lengre kulturperioder.

Figur 1: Design og oversikt over bioreaktoren. (A) Konstruksjonstegning av bioreaktorbasen og (B) eksploderte visning av væskekulturkammeret med alle deler angitt (trinn 2.4-2.8). Det øverste rommet i strømningskulturkammeret holder en strømnings rettetang. (C) Den sfærisk stumpe nesekjeglen er plassert etter strømnings rettetangen for å fordele strømmen gjennom ringkanalen (strømningsretning angitt i rosa). (D) Til sammen kontrollerer disse komponentene retningsretningen og føringsflytretningen. Se tabell 1 for en funksjonsbeskrivelse av de individuelt nevnte delene. (E) Fotografi av komplett bioreaktoroppsett (trinn 5.2) og (F) et nærbilde av strømningskulturkamrene og pneumatisk sylinder (trinn 5.6.1). (G) Brutto utseende på elektrospun PCL-BU stillas før såing (linjal flått 1 mm). Skanning elektron mikroskopiske bilder av rørformet elektrospun PCL-BU stillas med 3 mm indre diameter og 5 μm gjennomsnittlig fiberdiameter ved forskjellige forstørrelser, skalastenger (H) 100 μm og (I) 10 μm (trinn 1.3). (J) Skjematisk bilde av kulturkammeret bestående av et rørformet elektrospun stillas, med ytre radius (r₁) sentrert i et glassrør med indre radius (r₂). Strømningen (Q) innløp og uttak er koblet til ringringen, med kanalhøyde h for påføring av veggskjærspenning (t). Trykket/strekkinntaket (P) er koblet til det silikonmonterte stillaset for påføring av en omkretsstrekning (λ(t)) på de monterte elektrospunstillasene fra innsiden (trinn 6.1). Forkortelser: polycaprolactone bisurea (PCL-BU). Panel C, D og G-J ble tilpasset fra Van Haaften et al.¹⁹. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Bioreaktor deler	Funksjonell beskrivelse
Strekk applikasjon
Pneumatisk sylinder	Aktiverer Teflon-belgen.
Teflon belgen	Laster det hydrauliske reservoaret.
Hydraulisk reservoar	Kan kobles til opptil 8 strømningskulturkamre, er fylt med demi vann, legger press på silikonmonterte konstruksjoner.
Skruegjenge	Forbindelse mellom strømningskulturkammeret og hydraulikkreservoaret. Trykkinntaket for silikonmonterte konstruksjoner.
Hvit luer-kontakt	Brukes til å skru strømningskulturkammeret tett til en av de åtte skruegjengene på hydraulikkreservoaren/bioreaktorbasen.
Trykkrør med små hull	Direkte forbundet med vann i hydraulisk reservoar. Når det hydrauliske reservoaret er trykksatt, fyller trykkledningene rommet mellom silikonrøret (som er montert på trykkledningen) med vann, skyver silikonrørene utover, noe som resulterer i en omkretsstrekning på silikonmontert graft fra innsiden.
Silikon rør	For å montere elektrospuntransplantatet på trykkledningen. Silikonslangen strekkes omkrets fra innsiden.
Flytprogram
Pumpesystem for strømning	Brukes til å kontrollere strømmen i strømningskulturkamrene. (i vårt eksempel: et ibidi pumpesystem brukes.)
Topp- og bunnrom med strømningsinntak og -uttak	Kobler strømningskulturkammeret inn i strømningssløyfen.
Glassrør	Inneholder det trykksatte stillaset i midten og tillater perfusjon av stillasene.
Strømning rettetang	Stabiliserer strømmen i en relativt kort sedimenteringslengde.
Nese kjegle	Fordeler flyten jevnt.
Adapter foring	Fikser glassrøret.
Silikon O-ring	Forhindrer lekkasje av medium.

Tabell 1: Funksjonsbeskrivelse av bioreaktorens hovedtrekk tilsvarer angitte deler i figur 1A-D.

Figur 2: Resultater av unøyaktig kjøring av de kritiske trinnene i protokollen. Fotografier av noen forekomster som kan observeres i bioreaktoroppsettet når kritiske trinn ikke utføres på riktig måte. (A) Hvis knuten ikke er stram nok eller ikke akkurat plassert i det graverte sporet (indikert med pil), kan det oppstå en liten lekkasje av hydraulikkvæske i strømningskulturkammeret (trinn 2.5). (B) Hvis Teflon-belgen ikke fikk utvide O/N en dag før eksperimentet eller når silikonringen ikke er godt plassert, kan det oppstå hydraulisk væskelekkasje fra hydraulikkvæsken ved forbindelsen mellom skruegjengene og bioreaktorbasen (indikert med pil) (trinn 1.4 og 5.2.3). (C) Luftbobler i strømningskulturkammeret (indikert med pil) vil resultere i forstyrrede skjærspenningsmønstre. Avfett alltid kulturmediet og sørg for at middels nivåer i de mellomstore reservoarene er balansert for å forhindre at ett reservoar går tørt og luft suges inn i strømningskammersystemet (trinn 1.2 og 5.5.4). (D) Når silikonringen i det nederste rommet ikke er riktig plassert, kan det observeres søl av mediet (indikert med pil) (trinn 2.4.2). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Kontroll av skjærspenning og strekk. Ettersom bioreaktoren tillater uavhengig og kombinert påføring av strekk og skjær, kanflereeksperimentelle grupper inkluderes i ett eksperimentelt eksperimentelt. (B) Eksempler på variasjoner i maksimale strekk og skjærspenninger på et bestemt tidspunkt testet under fire forskjellige systeminnstillinger (angitt av fargene). Svarte rektangler representerer gjennomsnitt ± standardavvik for målene for hver innstilling. De stiplede linjene beregnes som gjennomsnittet av strekningene (vannrett linje) og skråstillingsspenningene (loddrett linje) for å angi de fire distinkte innlastingsforholdene. (C) Sykliske omkretsstrekninger i den sykliske strekningen og kombinerte grupper i løpet av eksperimentet på 20 dager, basert på målinger av stillasets ytre diameter som overvåkes med et tidsforløp for høyhastighetskamera (trinn 6.2). (D) Overvåket veggskjærspenninger i skjærspenningen og kombinerte grupper i løpet av eksperimentet, basert på de skiftende middels nivåene i sprøyten (trinn 6.1). Panelene A, C og D ble tilpasset fra Van Haaften og Wissing et al.⁴⁴; panel B ble tilpasset fra Van Haaften et al.¹⁹. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Begrep om in situ vaskulær vevsteknikk, cellefordeling, vevsproduksjon og nedbrytning av stillas. (A) En skjematisk illustrasjon som viser de hypotetiske fasene av stillasdrevet vevregenerering på vertens funksjonelle sted. Resultatene som vises er avledet fra eksperimenter som fokuserte på spredningsfasen, der makrofager og vevsproduserende celler har kolonisert stillasmaterialet. (B) Myofibroblaster fra human saphenous vene (rød) og PBMC-avledet makrofag (grønn) distribusjon på yttersiden av elektrospun stillaset (grå) på dag 3. Skalalinje 200 μm. (C) Tverrsnitt av samkulturkonstruksjonen på dag 20 farget for kollagen type I (grønn), kollagen type III (rød) og DAPI (hvit). Skalastang 100 μm, * indikerer ytre side av konstruksjonen, som tilsvarer strømningssiden. (D) SEM bilder av decellulariserte grafts av 8 dager makrofag monokultur som viser makrofag nedbrytning; skala bar 20 μm. Forkortelser: humane saphenous venøse celler (HVSC); perifer blod mononukleær celle (PBMC); 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI); skanning elektronmikroskopi (SEM). Panel A ble tilpasset fra Wissing og Bonito et al.²⁷; paneler B og C ble tilpasset fra Van Haaften og Wissing et al.⁴⁴; og panel D ble tilpasset fra Wissing et al.⁴³. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Inflammatorisk miljø i hemodynamisk ladede samkulturkonstruksjoner på 3 dager og 20 dager. Co-kultur av menneskelige PBMC-avledede makrofager og menneskelige myofibroblaster fra saphenous årer. (A) Varmekart over total cytokinsekresjon målt i supernatant via multipleks ELISA. (B) Boxplots for et utvalg cytokiner på dag 20, normalisert til totalt DNA-innhold. P-verdier ble beregnet ved hjelp av Kruskal-Wallis test med en Dunns multipareringstest; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** Forkortelser: vevshemmer av metalloproteinase (TIMP), matrisemetalloproteinase (MMP), interleukin (IL), monocytt kjemoattractant protein 1 (MCP-1), transformerende vekstfaktor beta 1 (TGF -β1), bindevevsvekstfaktor (CTGF), tumornekrosefaktor alfa (TNF-α), blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF), statisk (ST), syklisk strekk (CS), skjærspenning (SS). Panelene A og B ble tilpasset fra Van Haaften og Wissing et al.⁴⁴. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Endringer i myofibroblastfenotype og markører for matrisevekst og ombygging som svar på hemodynamisk belastning i de vaskulære konstruksjonene på dag 20. (A) Relativ genuttrykk av myofibroblastspesifikke fenotypiske markører. (B) Tverrsnitt farget for αSMA (grønn) og DAPI (blå), skalastang 100 μm. (C) Relativt uttrykk for gener relatert til kollagenholdig matrise, elastisk matrise, proteoglykaner og ombygging av gener. P-verdier ble beregnet ved hjelp av Kruskal-Wallis test med en Dunns multipareringstest; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Forkortelser: S100 kalsiumbindende protein A4 (S100A4), alfa-glatt muskel actin (αSMA eller ACTA2), calponin 1 (CNN1), smoothelin (SMTN), vimentin (VIM), kollagen I (COL1A1), elastin (ELN), versican (VCAN), matrisemetalloproteinase (MMP), vevshemmer av metalloproteinase (TIMP), statisk (ST), syklisk stretch (CS), skjærspenning (SS), 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). # målt ved eller under deteksjonsgrensen. Panelene A, B og C ble tilpasset fra Van Haaften og Wissing et al.⁴⁴. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur S1: Proteinuttrykk myofibroblast- og makrofag-monokulturer utsatt for individuelle og kombinerte hemodynamiske belastninger. (A) Representative konfokale bilder av myofibroblaster, dyrket i 10 dager med aktinfibre (grønn), nuklei (rød) og stillas (blå), viser en klar aktinfiberretning i de lastede prøvene, sammenlignet med de statiske prøvene der ingen fortrinnsrett actin fiberretning kan observeres. Skalastang 50 μm. (B) Konfokale bilder av samme myofibroblastmonokultur farget for kollagen (grønn) og nuklei / stillas (hvit). Skala bar 50 μm. (C) Boxplots av protein sekresjon profiler av statisk og dynamisk dyrket THP1-avledet makrofager i 8 dager, med beregnede M1/M2 forhold basert på cytokin sekresjon nivåer av IL-6, TNF-α, MCP-1 (pro-inflammatorisk) og IL-10, IL-13, MMP-9 (antiinflammatorisk). Prikken i MCP-1-grafen representerer en statistisk outlier. (D) ELISA-data fra de relative proteinsekresjonsnivåene av statiske og dynamisk dyrkede makrofager på dag 8 sammenlignet med gjennomsnittlig sekresjon av proinflammatoriske, antiinflammatoriske, vekst- og ombyggingsproteiner (proteinnivåer ble korrigert for gjennomsnittlig DNA-innhold per gruppe). Prikkene og de skyggelagte områdene indikerer henholdsvis 50. Forkortelser: monocytt kjemoattractant protein 1 (MCP-1), interleukin (IL), transformerende vekstfaktor beta (TGF-β), matrisemetalloproteinase (MMP), blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF), muskelvevsvekstfaktor (CTGF), tumornekrosefaktor alfa (TNF-α), enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA).* p < 0,05; ** p < 0,01, *** p < 0,001. Panel A og B ble tilpasset fra Van Haaften et al.¹⁹. Panel C og D ble tilpasset fra Wissing et al.⁴³. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Discussion

Bioreaktoren som er beskrevet her, muliggjør systematisk evaluering av bidragene fra individet og kombinerte effekter av skjærspenning og syklisk strekk på betennelse og vevregenerering i rørformede resorberbare stillaser. Denne tilnærmingen gjør det også mulig å utføre et stort utvalg av analyser på vaskulære konstruksjoner, som eksemplifisert i den representative resultatseksjonen. Disse resultatene viser den særegne effekten av de ulike hemodynamiske lasteregimene (dvs. forskjellige kombinasjoner av skjær og strekk) på både vekst og ombygging av TEVG-konstruksjonen. Denne innsikten, samlet via denne in vitro-plattformen, bidrar til optimalisering av stillasdesignparametere for nyutviklede in situ TEVG-er. For å sikre en riktig eksperimentell arbeidsflyt er det viktig å forstå de kritiske trinnene og begrensningene i denne protokollen.

De mest kritiske trinnene i protokollen er relatert til anvendelsen av strekk til prøvene. For stretchapplikasjon er det viktig at oppsettet er lekkasjefritt. Det er to svake punkter i systemet: knutene som monterer elektrospuntransplantater til trykkledningene og forbindelsen mellom bioreaktorbasen og strømningskulturkamrene. Som beskrevet i trinn 2.5.2 og 2.5.4, må flere, tette knuter plasseres nøyaktig ved det graverte sporet. Hvis knuten ikke er stram nok eller er plassert litt over eller under sporet, kan det oppstå en liten lekkasje av hydraulisk væske i strømningskulturkammeret. Denne lekkasjen kan oppdages som et trykkfall i hydraulikkbeholderen og en stadig økende spenning på strekkpumpen for å nå den innstilte trykkverdien. Dessuten fører dette til en forstyrret strømning i strømningskulturkammeret, økt risiko for forurensning av cellekulturen og en fortynning av mediet. Når dette skjer, må strømningskulturkammeret tas ut av eksperimentet, og skruegjengen på hydraulikkbeholderen skal lukkes med en hvit Luer-hette. Dette store tiltaket for å ta ut en komplett prøve, som er nødvendig for å sikre riktig videreføring av eksperimentet for de andre syv strømningskulturkamrene, understreker viktigheten av å plassere tette knuter nøyaktig i de graverte sporene. Først da kan riktig separasjon sikres mellom vannet i hydraulikkreservoaret og mediet i strømningskulturkamrene. For å forbedre robustheten av monteringen av stillasene, vil sporene i trykkledningene bli gjort litt dypere i en revidert versjon av bioreaktoren, noe som gir enklere og bedre knuteplassering og dermed sikker separasjon av hydraulikkvæsken fra mediet.

En annen potensiell kilde til lekkasje er mellom skruegjengene til bioreaktorbasen og de hvite Luer-kontaktene i strømningskulturkammeret. På grunn av mulig slitasje på Teflon-materialet kan en ekstra silikon O-ring legges til for å forhindre lekkasje (trinn 5.2.3). Videre bør Teflon-belgen til strekkpumpen få lov til å utvide O / N litt en dag før eksperimentet (trinn 1.4). Hvis det oppstår lekkasje, bør den tapte hydrauliske væsken kompenseres ved å tilsette en liten mengde ultrapure vann via en av de åtte skruegjengene (bruk en sprøyte med nål og fleksibel ledning). Plasser strømningskulturkammeret tilbake med et lite stykke parafilm mellom skruegjengen og den hvite Luer-kontakten på det nederste rommet i strømningskulturkammeret. For å overvinne dette lekkasjeproblemet i fremtidige eksperimenter, vil de nåværende Teflon-skruegjengene på bioreaktorbasen bli erstattet av tråder i rustfritt stål i neste generasjons versjon av bioreaktoren for å forhindre slitasje i systemet.

Variasjonen i strekk (figur 3C) er større enn variasjonen i WSS (figur 3D), siden strekk er vanskeligere å kontrollere. Likevel, i tillegg til tiltakene for å forhindre lekkasje, er det andre tiltak som begrenser variasjonen i strekk: (i) unngå luftbobler i fløyten (trinn 1.4 og 5.2.1), (ii) sikre konsekvent pre-stretch blant de forskjellige prøvene (trinn 2.5.3), og (iii) sikre konsistente stillasegenskaper blant forskjellige prøver (trinn 1.3).

Til slutt er det nødvendig med ekstra forsiktighet når du monterer elektrospunstillaset på silikonslangen (trinn 2.3). Spesielt når det skjøre elektrospun stillaset må trekkes over den strakte silikonslangen, er det viktig å ikke bruke for mye kraft for å forhindre at elektrospuntransplantatet blir skadet, spesielt på innsiden av elektrospuntransplantatet. Hvis det oppstår skade på innsiden av elektrospuntransplantatet, enten fra kraftig trekking eller fra for svak strekking av silikonrøret, blir omfanget av skaden på elektrospunfibrene bare synlig etter at konstruksjonen er høstet og analysert. I det nåværende oppsettet kan seedingens suksess bare bekreftes ved immunfluorescens eller immunhiistokjemisk analyse, etter å ha ofret prøven. Imidlertid er såddprosedyren med fibrin som cellebærer en veletablert metode⁶⁷ som vanligvis fører til en homogen cellefordeling for stillaser med tilstrekkelig stor porestørrelse. Et av de viktigste aspektene med hensyn til cellesåing er å sikre at stillaset er så tørt som mulig før sådd (trinn 4.4), for å forhindre at fibringelen med cellene passerer gjennom det våte stillaset, noe som resulterer i inhomogen såing. Til slutt, selv om dekontamineringsmetoden til elektrospuntransplantatet ved UV-stråling og dypping i 30% etanol ikke er så streng som sterilisering av elektrospuntransplantater forberedt på in vivo-studier, som ofte steriliseres av etylenoksid eller gammabestråling, er det tilstrekkelig for in vitrokultureksperimenter som kan vare opptil 20 dager uten tegn på forurensning (se for eksempel Figur 3, Figur 4, Figur 5, Figur 6og Van Haaften og Wissing (2020)⁴⁴). Videre tillater PCL-BU-materialet som brukes her, ikke lang eksponering for høye etanolkonsentrasjoner. Den mest passende steriliseringsmetoden kan velges avhengig av materialet som brukes.

I tillegg til resultatene fra tidligere utførte samkulturstudier, kan et bredere utvalg av studier utføres med samme system. Systemet ble tidligere brukt til å utføre dynamiske monokulturer av myofibroblaster (Supplementary Figure 1A–B) og makrofager (Supplementary Figure 1C–D) for å undersøke effekten av hemodynamisk lasting på individuelle celletyper og deres parakrinesignalering^19,43. Ulike hemodynamiske lasteregimer resulterte i klar aktinfiberorientering i myofibroblaster (Supplerende figur 1A) og tydelig forskjellig kollagenavsetning (Supplerende figur 1B) etter 10 dager. Cytokinproduksjonen av THP1-avledede makrofager var drastisk forskjellig mellom de forskjellige hemodynamiske belastningene (Supplerende figur 1C) og viste en mer proinflammatorisk profil når den ble lastet (Supplerende figur 1D). Andre validerte muligheter inkluderer anvendelse av oscillatorisk strømning, ved å bruke en ekstra pumpe og fluidisk enhet. Viskositeten til mediet kan økes mot spekteret av blodviskositet (f.eks. ved å tilsette xanthan tyggegummi)⁶⁹. Modulering av middels viskositet representerer en ekstra variabel for å utvide spekteret av gjeldende skjærspenninger. Til slutt, selv om den beskrevne protokollen bruker 'Ibidi' strømningskondisjoneringsoppsett, kan oppsett fra andre produsenter også brukes, så lenge lignende strømningsregimer kan brukes.

En av de viktigste fordelene ved å bruke dette bioreaktorsystemet er den relativt store konstruksjonen (ca. 15 mm x 10,5 mm) som kan hemodynamisk lastes, slik at et bredt utvalg av mulige avlesningsparametere kan trekkes ut fra en enkelt prøve. Samtidig kan konstruksjonsstørrelsen også ses på som en begrensning, da dette oppsettet krever en relativt stor mengde (noen ganger kostbart) materiale, spesielt hvis primærceller brukes, eller hvis kulturmediet krever kostbare tilsetningsstoffer. Videre er gjennomstrømningen av oppsettet relativt lav. Derfor er det nåværende oppsettet spesielt egnet for hypotesedrevet forskning der et begrenset antall variabler er grundig testet, i stedet for screening av et stort antall variabler med begrenset avlesning. For fremtidige eksperimenter gjøres det små forbedringer på det nåværende oppsettet for å muliggjøre muligheten for montering av mindre stillaser og nedskalering av størrelsen på de mellomstore reservoarene. Når det gjelder sistnevnte, er det nødvendig med dagens volum av de mellomstore reservoarene for å muliggjøre tilstrekkelig volumetrisk strømningshastighet for å oppnå de ønskede skjærspenningene. De nødvendige strømningshastighetene – og med det volumet av de mellomstore reservoarene – kan reduseres ved å øke viskositeten til mediet (f.eks. ved å tilsette xanthan tyggegummi, som tidligere etablert⁶⁹).

For å konkludere, tillater denne bioreaktoren kvantifisering av de individuelle og kombinerte effektene av skjærspenning og syklisk strekk på vevsvekst og ombygging på et bredt utvalg av elastomeriske 3D biomateriale stillaser. Bioreaktoren kan dyrke opptil åtte vaskulære konstruksjoner under ulike lasteforhold. På grunn av sin design er bioreaktoren spesielt egnet til å studere samspillet mellom hemodynamikk og in situ vaskulære TE-prosesser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM)	Gibco	12491-015	cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil	Julabo	8940012	prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin	Sigma	T4648	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge	Eppendorf	5804	to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor - "kelly forceps"	Almedic	P-422	clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators	Sanyo	MCO-170AIC-PE	for cell culturing
Compressed air reservoir	Festo	CRVZS-5	smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches	Matlab	R2017. The Mathworks, Natick, MA	calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board	National Instruments	BNC-2090	data processing in between amplifier system and computer
Ethanol	VWR	VWRK4096-9005	to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS)	Greiner	758087	cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet	Assistant	HE40567002	apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber	Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology	n.a.	part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax	Gibco	35050061	cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera	MotionScope	M-5	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens	Nikon	JAA616AB	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip	ibidi GmbH	10821	block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads	ibidi GmbH	10902	set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)	Swann Morton	0301; 0933	to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software	National Instruments	version 2018	to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light	Labconco	302310001	to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes	Greiner	664-160	for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)	Sigma	A8960	cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500	Zeiss	Schott AG	to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps	ibidi GmbH	various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)	to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS)	PEEKEL instruments B.V.	n.a.	to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders	ibidi GmbH	10974	medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter	Rubber BV	1805	to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software	Idtvision	2.15.00	to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G)	BD Microlance	301700	together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver	Adson	2429218	to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues	Kleenex	38044001	for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S)	Lonza	DE17-602E	cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps	Greiner	206202	to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder	Festo	AEVC-20-10-I-P	to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length)	SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands	n.a.	produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control)	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer	BD	TC-XX and P 10 EZ	the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor	Festo	MPPES-3-1/8-2-010, 159596	provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)	Gibco	A1049101	cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)	Eppendorf	30120086	multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20%	Sigma	5030	Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.
Silicone O-rings	Technirub	1250S	to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)	Rubber BV	1805	to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL)	Falcon	352095	multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle	Ethicon, Johnson&Johnson	EH7404H	Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL)	B. Braun Melsungen AG	2057932	to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm)	Satorius	17597-K	to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap	Nunc	178983	to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap	Nunc	156499	to culture static control samples
Teflon bellow	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel)	PolarWare	15-248	for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers	Wironit	4910	sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water	Stakpure	Omniapure UV 18200002	to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light	Philips	TUV 30W/G30 T8	for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding