Мульти-кий биореактор для оценки воспалительной и регенеративной способности биоматериалов в потоке и растяжении

Summary

Целью этого протокола является выполнение динамической кокультуры макрофагов человека и миофибробластов в трубчатых электрораспыленных каркасах для исследования регенерации тканей, управляемой материалом, с использованием биореактора, который позволяет разъединять напряжение сдвига и циклическое растяжение.

Abstract

Использование рассасывающихся биоматериалов для индуцирования регенерации непосредственно в организме является привлекательной стратегией с трансляционной точки зрения. Такие материалы вызывают воспалительную реакцию при имплантации, которая является движущей силой последующего рассасывания материала и регенерации новой ткани. Эта стратегия, также известная как тканевая инженерия in situ, преследуется для получения сердечно-сосудистых замен, таких как тканеинженерные сосудистые трансплантаты. Как воспалительные, так и регенеративные процессы определяются локальными биомеханическими сигналами на каркасе (т. Е. Напряжение растяжения и сдвига). Здесь мы подробно описываем использование специально разработанного биореактора, который уникально позволяет разъединичивать напряжение растяжения и сдвига на трубчатом каркасе. Это позволяет проводить систематическую и стандартизированную оценку воспалительной и регенеративной способности трубчатых каркасов под воздействием хорошо контролируемых механических нагрузок, что мы демонстрируем на основе динамического эксперимента по кокультуре с использованием макрофагов и миофибробластов человека. Подробно обсуждаются ключевые практические шаги в этом подходе — строительство и настройка биореактора, подготовка строительных лесов и посев клеток, применение и поддержание растяжения и сдвигового потока, а также сбор проб для анализа.

Introduction

Сердечно-сосудистая тканевая инженерия (ТЭ) рассматривается в качестве альтернативного варианта лечения используемым в настоящее время постоянным сердечно-сосудистым протезам (например, сосудистым трансплантатам, заменам сердечных клапанов), которые являются неоптимальными для больших когорт пациентов^1,2,3,4. К числу востребованных применений относятся тканеинженерные сосудистые трансплантаты (TEVG)^5,6 и сердечные клапаны (TEHV)^7,8. Чаще всего сердечно-сосудистые методологии ТЭ используют резорбируемые биоматериалы (природные или синтетические), которые служат поучительным каркасом для формирования новой ткани. Образование новой ткани может быть либо полностью спроектировано in vitro, путем засева каркаса клетками и культивирования в биореакторе перед имплантацией (in vitro TE)^9,10,11,либо непосредственно in situ, в котором синтетический каркас имплантируется без предварительного культивирования, чтобы индуцировать образование^новойткани непосредственно в организме (in situ TE)^12,13,14. Как для in vitro, так и для in situ сердечно-сосудистого ПОДХОДА TE успешная функциональная регенерация в доминирующей степени зависит как от иммунного ответа хозяина на имплантированную конструкцию, так и от соответствующей биомеханической нагрузки.

Важность биомеханической нагрузки для сердечно-сосудистой ТЭ хорошо признана^15. В случае сердечно-сосудистых имплантатов клетки, которые заполняют каркас, подвергаются циклическому растяжению и сдвиговым напряжениям, которые возникают в результате гемодинамической среды. Многочисленные исследования сообщали о стимулирующем влиянии (циклического) растяжения на образование компонентов матрицы, таких как коллаген^16,17,18,19,гликозаминогликаны (GAGs)²⁰и эластин^21,22,различными типами клеток. Например, Huang et al. продемонстрировали, что двухосное растяжение повышает отложение и организацию коллагена и эластина в TEVG in vitro с помощью сосудистого биореактора^23. В то время как акцент обычно делается на растяжении в качестве доминирующей нагрузки, в этих исследованиях часто используются биореакторы, управляемые потоком, в которых образец также подвергается сдвиговому потоку. Хотя относительно мало известно об изолированном влиянии сдвиговых напряжений на формирование тканей и воспаление в 3D, некоторые данные доступны. Например, Hinderer et al. и Eoh et al. продемонстрировали, что сдвиговой поток, в дополнение к микроструктуре 3D-каркаса, был важен для образования зрелого эластина клетками гладкой мускулатуры сосудов человека в модельной системе in vitro^24,25. В целом, эти результаты иллюстрируют актуальность как циклического растяжения, так и сдвигового стресса для сердечно-сосудистой ТЭ.

Другим важным фактором, определяющим успех или неудачу имплантатов TE, является иммунный ответ хозяина на имплантированный трансплантат^26. Это особенно важно для управляемых материалом стратегий IN situ TE, которые фактически полагаются на острую воспалительную реакцию на каркас, чтобы запустить последующие процессы клеточного притока и эндогенного образования и ремоделирования тканей^27. Макрофаг является критическим инициатором функциональной регенерации тканей, что было показано многочисленными исследованиями^28,29,30. По аналогии с заживлением ран, регенерация ткани регулируется паракринными сигналами между макрофагами и тканепродуцирующими клетками, такими как фибробласты и миофибробласты^31,32,33. Помимо координации отложений новых тканей, макрофаги участвуют в активном рассасывательном рассасывание чужеродного каркасного материала^34,35. Таким образом, реакция макрофагов in vitro на биоматериал была идентифицирована как прогностический параметр успеха in vivo имплантатов^36,37,38.

Реакция макрофага на имплантированный каркас зависит от конструктивных особенностей каркаса, таких как состав материала и микроструктура^35,39,40. В дополнение к свойствам каркаса, реакция макрофагов на каркас и их перекрестные помехи с миофибробластами также подвержена влиянию гемодинамических нагрузок. Например, было показано, что циклическое растяжение является важным модулятором фенотипа макрофагов^41,42,43,44 и секреции цитокинов^43,44,45,46 в 3D электроотращенные каркасы. Используя систему кокультуры макрофагов и гладкомышечных клеток сосудов, Battiston et al. продемонстрировали, что присутствие макрофагов привело к повышению уровня эластина и ГАГ и что умеренные уровни циклического растяжения (1,07–1,10) стимулировали отложение коллагена I и эластина^47. В предыдущих работах мы продемонстрировали, что напряжение сдвига является важным фактором, определяющим рекрутирование моноцитов в 3D-электроспыляющие каркасы^48,49,и что как напряжение сдвига, так и циклическое растяжение влияют на паракринную сигнализацию между моноцитами человека и мезенхимальными стромальными клетками^50. Fahy et al. продемонстрировали, что сдвиговой поток увеличивает секрецию провоспалительных цитокинов моноцитами человека^51.

Взятые вместе, приведенные выше данные показывают, что адекватное понимание и контроль гемодинамических нагрузок имеет решающее значение для сердечно-сосудистого ТЭ, и что для достижения этого важно учитывать воспалительную реакцию. Многочисленные биореакторы были описаны ранее для культуры сердечно-сосудистых тканей invitro^{52, 53, 54,55, 56,57,58} или ex vivo^59,60,61. Однако все эти системы предназначены для того, чтобы максимально имитировать физиологические условия гемодинамической нагрузки. Хотя это очень ценно для целей создания сердечно-сосудистых тканей in vitro или поддержания культур ex vivo, такие системы не позволяют систематически проводить исследования индивидуальных эффектов отдельных сигналов. Это связано с тем, что применение как циклического растяжения, так и напряжения сдвига в этих биореакторах обусловлено тем же потоком под давлением, который неразрывно связывает их. В то время как микросистемы, которые позволяют точно манипулировать несколькими сигналами, были описаны для 2D-подложек⁶² или 3D-гидрогелевых установок^63,64,такие установки не позволяют включать эластомерные 3D-биоматериальные каркасы.

Здесь мы представляем применение системы трубчатого биореактора, которая уникально позволяет разъединить напряжение сдвига и циклическое растяжение и помогает механистически исследовать их индивидуальные и комбинированные эффекты. Эта система позволяет тестировать широкий спектр тканеинженерных сосудистых трансплантатов (например, синтетического или природного происхождения, различной микроамхитектуры, различной пористости). Чтобы эффективно разъединить применение напряжения сдвига и растяжения, ключевыми концепциями, которые использует биореактор, являются (1) разделение контроля напряжения сдвига и растяжения с использованием различных насосных систем и (2) стимуляция лесов «наизнанку» с вычислительными размерами. Поток подается на внешнюю поверхность трубчатого каркаса с помощью проточного насоса, тогда как окружное растяжение каркаса индуцируется путем расширения силиконовой трубки, на которой установлен каркас с помощью отдельного тензометрического насоса. Размеры силиконовой трубки и стеклянной трубки, содержащей конструкцию, тщательно выбираются и проверяются с использованием вычислительного моделирования гидродинамики, чтобы гарантировать, что напряжение сдвига на каркасе (из-за потока) и окружное растяжение (из-за расширения трубы) существенно не влияют друг на друга. Этот дизайн имеет несколько практических обоснований. Если растяжение применяется давлением просветной жидкости (аналогично физиологической нагрузке), это по своей сути требует, чтобы конструкция образца была безтекания. Кроме того, давление, необходимое для растяжения образца, будет полностью определяться жесткостью образца, которая может варьироваться между образцами и внутри образца с течением времени, что затрудняет контроль растяжения. Этот биореактор монтирует тканеинженерный трансплантат вокруг силиконовой трубки и позволяет наносить напряжение сдвига стенки (WSS) на внешнюю стенку трансплантата и создавать давление на трансплантат изнутри. Таким образом, могут быть обеспечены равные условия нагрузки между образцами и внутри образцов с течением времени, и, кроме того, образцы допускаются к протекающей, как это характерно для пористых сосудистых каркасов^19. Этот биореактор специально предназначен для систематических исследований эффектов сдвига и / или растяжения, а не для инженерии нативного кровеносного сосуда in vitro, для которого более подходят традиционные настройки сосудистого биореактора. См. рисунок 1A–B для проектных чертежей биореактора и соответствующую таблицу 1 для функционального описания и обоснования основных компонентов биореактора.

Применение биореактора продемонстрировано на основе серии недавних исследований нашей группы, в которых мы исследовали индивидуальные и комбинированные влияния сдвигового напряжения и циклического растяжения на воспаление и образование тканей в рассасывающихся электроспыляемых каркасах для сердечно-сосудистой ткани in situ^19,43,44. С этой целью мы использовали человеческие макрофаги и миофибробласты либо в моно-, либо в кокультуре для моделирования различных фаз регенеративного каскада in situ. Мы продемонстрировали, что на секрецию цитокинов макрофагами человека отчетливо влияют как циклическое растяжение, так и напряжение сдвига, влияя на отложение матрицы и организацию миофибробластов человека в этих каркасах, как через паракринную сигнализацию, так и через прямой контакт^19,43,44. Примечательно, что эти исследования показали, что в случае комбинированного применения напряжения сдвига и растяжения влияние на формирование тканей и воспаление либо преобладает одна из двух нагрузок, либо существуют синергетические эффекты обеих нагрузок. Эти результаты иллюстрируют актуальность разъединения обеих нагрузок для лучшего понимания вклада механической среды в процессы ТЭ. Это понимание может быть применено для систематической оптимизации конструктивных параметров каркасов в соответствующих режимах гемодинамической нагрузки. Кроме того, механистические данные из таких хорошо контролируемых сред могут служить исходными данными для численных моделей, которые разрабатываются для прогнозирования хода ремоделирования тканей in situ, как недавно сообщалось для TEVG⁶⁵ или TEHVs^66,для дальнейшего улучшения прогностической способности.

Protocol

В исследованиях, описанных в этом протоколе, использовались первичные макрофаги человека, выделенные из периферической крови, и миофибробласты человека, выделенные из подкожной вены после коронарной шунтирования^44. Пальто были получены от здоровых, анонимных добровольцев, которые предоставили письменное информированное согласие, которое было одобрено Научно-исследовательским комитетом по медицинской этике Санкуина. Использование клеток человеческой вены (HVSC) соответствовало «Кодексу надлежащего вторичного использования тканей человека», разработанного Федерацией медицинских обществ (FMWV) в Нидерландах.

1. Общие приготовления и необходимые действия перед установкой биореактора

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о соответствующих протоколах изоляции и культивирования, пожалуйста, обратитесь к более ранней работе^19,43,44. Все расчеты в протоколе приведены в качестве примеров для эксперимента с кокультурой с моноцитами и миофибробластами, засеянными в 8 гемодинамически нагруженных каркасах и 2 статических контроле (n=10).

1. Начните изоляцию клеток и культивиляцию клеток. Плотность посева совместно культивированных образцов моноцитов и миофибробластов (с соотношением посева 2:1) составляет 30 × 10⁶ моноцитов/см3 и¹⁵ × 10⁶ миофибробластов/см3 соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Электрораспыляемый материал имеет высокую пористость (>90%). Для оценки необходимого количества клеток на трансплантат рассчитывается объем каркаса по формуле объема полого цилиндра: π*(толщина)^2*длина≈ 0,04^см3. Общее количество клеток на трансплантат составляет 1,2 × 10⁶ моноцитов и 0,6 × 10⁶ миофибробластов. Для 10 образцов требуется не менее 12 ×^{10 6} моноцитов и 6 × 10⁶ миофибробластов; начните с ~10–15% больше ячеек, чтобы учесть возможные ошибки пипетирования.
2. Дегазировать среду клеточной культуры, которая будет использоваться для экспериментов с участием биореактора.
   1. Подготовьте среду для кокультур, которая состоит из RPMI-1640:aDMEM (1:1), дополненного 10% фетальной бычим сывороткой, 1% пенициллин-стрептомицином и 0,5% L-глутамином.
   2. Поместите среду на ночь (O/N) в инкубатор в колбу для клеточной культуры с фильтрующим колпачком для дегазации.
   3. Замените крышку фильтра герметичной крышкой и храните при 4 °C.
   4. Непосредственно перед использованием добавьте в среду 0,25 мг/мл L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата (витамина С).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчетов количество среды, требуемое на проточную культурную камеру, составляет 50 мл. Обновляйте носитель три раза в неделю; Старая среда 25 мл заменяется свежей средой объемом 25 мл. Для 10 образцов; после посева требуется в общей сложности 500 мл свежей среды, а для каждой последующей смены среды используется в общей сложности 250 мл свежей среды. Всегда готовьте среду свежей, особенно, витамин С следует добавлять непосредственно перед сменой среды.
3. Подготовьте изотропные электроотращенные каркасы (диаметр просвета 3 мм, толщина стенки 200 мкм), как описано Van Haaften et al.¹⁹ (рисунок 1G–I). Вкратце, трубчатые каркасы из поликапролактон бисмочевины (PCL-BU) производятся электроспиннингом из 15% (мас./мас.) хлороформ-полимерных растворов. Полимерные растворы представляют собой электроотверживаемость при комнатной температуре и 30% относительной влажности, при расходе 40 мкл/мин, расстоянии 16 см от вращающейся цилиндрической мишени (Ø 3 мм, 500 об/мин) и приложенном напряжении 16 кВ на электроспинизирующем сопле и -1 кВ на мишень.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя для этих экспериментов использовались трансплантаты PCL-BU, в этом биореакторе может быть установлено большое разнообразие эластомерных тканевых инженерных трансплантатов (например, различного синтетического или природного происхождения, различной микроархитектура, разной пористости)
   1. Снимите электрораскускамы с оправки.
      1. Сделайте небольшое отверстие в колпачке трубки 15 мл, чтобы «удерживать» оправку в центре и предотвращать ее касание стенки трубки.
      2. Поместите оправку с электрораскупеченным каркасом в соколиную трубку и заполните ее деионизированной водой.
      3. Заморозьте трубы O/N при -20 °C.
      4. Поместите трубки при комнатной температуре (RT) и вытащите оповорочные оздоровки через несколько минут, оставив электропрядные трансплантаты во льду.
      5. Дайте льду полностью оттаять, извлеките электропрядную трубку из талой воды и «повисните» вертикально в течение нескольких часов. Убедитесь, что строительные леса не «разрушаются» под собственным весом.
   2. Сухие строительные леса под вакуумом O/N.
   3. Изобразите небольшой образец электропрядных трансплантатов с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) для оценки их микроструктуры (например, морфологии волокна, диаметра волокна). Трансплантаты в примерах исследований имеют изотропную ориентацию волокна и диаметр волокна 5 мкм(Рисунок 1H–I).
4. За день до начала эксперимента поместите в инкубатор гидравлический резервуар, наполненный деионизированной водой. Закройте все восемь соединений для камер проточной культуры белыми колпачками Luer. Подключитесь к системе сжатого воздуха и вставьте датчик давления. Запустите тензометровый насос (см. шаг 5.6) O/N, чтобы обеспечить небольшое расширение сильфонового сильфона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все необходимые материалы и оборудование очищены и/или автоклавированы (см. Таблицу материалов,колонку «Комментарии/описание», для которой материалы разрешены к автоклаву), в соответствии с протоколом производителя или как описано в шагах 7.3–7.6.
5. Обеспечьте стерильные условия труда для остальной части протокола.
   1. Выполните шаги 2–5.3 (настройка системы), шаг 6.3 (изменение среды) и шаги 7.1–7.2 (сбор сосудистых конструкций) в стерильном ламинарной проточке.
   2. Поместите материалы, которые непосредственно не нужны для последующих этапов, в закрытую чашку Петри, чтобы все было как можно более чистым.
   3. Регулярно очищайте или сухие поверхности материала, замачив бумажную салфетку 70% этанолом, и протирайте поверхности компонентов биореактора и шкафа ламинарного потока.

2. Настройка биореактора

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаг 2 в ламинарной проточной шкафу.

1. Разрежьте электрораскупись каркасов на трубки длиной около 25 мм и задокументируйте их перед использованием (например, сфотографируйте по длине, взвесьте с весами для начальной массы).
2. Обеззаражить электрораспись лесов.
   1. Поместите наклоненные электрораскушенные леса в колодезную пластину или чашку Петри с одним отверстием, обращенным к источнику ультрафиолетового (УФ) света, чтобы ультрафиолетовый свет (253,7 нм) освещал внутреннюю часть лесов.
   2. Подвергайте электрораскупягденные леса воздействию ультрафиолетового излучения в течение 5 минут.
   3. Поверните все строительные леса и повторите ультрафиолетовое освещение для другого отверстия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага прикасайтесь к электрорасписьму, когда это необходимо, только когда это необходимо. Всегда используйте чистый пинцет или чистые перчатки.
   4. Возьмите стеклянные трубки камер проточной культуры, которые хранятся в 70%, вымойте стеклянные трубки в сверхчистой воде, высушите и поместите в большую закрытую чашку Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги, особенно шаги 2.3–2.5, в идеале выполняются двумя экспериментаторами.
3. Установите электрораскрутные каркасы на силиконовую трубку.
   1. Прикрепите проленовый шов 5-0 к одному концу силиконовой трубки, взяв шов через одну сторону трубки и из другой, оставив два противоположных натянутых шва, охватывающих поперечное сечение трубки. Сделайте небольшой узел с обеих сторон трубки, сжимая трубку в локусе узлов и оставьте примерно 10 см проволоки на обоих узлах. Сделайте третий узел на конце двух оставшихся проводов по 10 см.
      1. Отрежьте шовную иглу и все свободные нити, которые могут торчать и повредить внутреннюю часть электрораскупясывного каркаса. Отрежьте края силиконовой трубки в треугольную форму, чтобы помочь в протягивании силиконовой трубки через электрораскуплавной каркас.
   2. Окуните электроспыляющий каркас в 30% этанол (это служит дополнительным этапом дезактивации и помогает скользить по электроплитым каркасам по силиконовой трубке) и поместите электроспыляющий каркас на свободный 10-сантиметровый провод. Экспериментатор А растягивает силиконовую трубку, осторожно натягивая как силиконовую трубку, так и узел 10-сантиметровой шовной проволоки, в то время как экспериментатор Б осторожно скользит электрораскушенным каркасом по силиконовой трубке с помощью пинцета с гладким внутренним наконечником, чтобы предотвратить повреждение лесов.
   3. Медленно отпустите растяжку на силиконовой трубке, одновременно сглаживая электрораскушенный каркас пинцетом. Окуните электрораспыляющийся каркас на силиконовую трубку в сверхчистую воду два раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, что происходит некоторое сморщивание электроспылявого каркаса. Это сморщивание исчезнет во время нанесенного предварительного растяжения непосредственно перед фиксацией каркасов на трубопроводах давления на этапе 2.5.3.
   4. Повторите шаги 2.3.2 и 2.3.3 для других электрораскуплавкиваных лесов. В зависимости от длины силиконовых труб на одной и той же силиконовой трубке могут быть установлены несколько электроплиновых каркасов.
   5. Когда все электрораскручиваемые каркасы установлены на силиконовых трубках, разрежьте силиконовые трубки вокруг лесов, все на одинаковую длину (5,5 см); с одной стороны, близко к концу электрораскунутого каркаса, с другой стороны, оставляя ~2–3 см свободной силиконовой трубки.
4. Постройте нижний отсек камеры проточной культуры(рис. 1А–В).
   1. Возьмите верхнюю часть нижнего отсека, содержащую выходное отверстие потока, и закройте выход потока пробкой Luer.
   2. Протолкните напорный трубопровод с отверстиями через нижний отсек и поместите силиконовое уплотнительное кольцо вокруг нижнего конца напорного трубопровода, чтобы предотвратить утечку. Прикрутите нижнюю часть нижнего отсека к верхней части нижнего отсека, чтобы закрепить напорный трубопровод. Убедитесь, что нижняя гравированная канавка напорного трубопровода находится примерно на 3–5 мм выше края переходной втулки нижнего отсека; это позже «удержит» плотный узел шовной проволоки, закрепив электрописьковый каркас над силиконовой трубкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если напорный трубопровод можно легко маневрировать вверх и вниз, это указывает на то, что нижний отсек плохо закреплен. Повторите шаг 2.4.2 для предотвращения утечки на более поздних стадиях(рисунок 2D).
5. Закрепите силиконовую трубку электрорасписьем к напорным трубопроводу.
   1. Потяните силиконовую трубку с электрораспущенным каркасом над напорным трубопроводом.
   2. Сделайте узел со шовной проволокой на нижнем конце электрораскупорного каркаса в месте расположения выгравированной канавки на нажимном трубопроводе. Сделайте второй узел на противоположной стороне, чтобы плотно закрепить силиконовую трубку электропрядным трансплантатом.
      ВНИМАНИЕ: Это критический шаг. Убедитесь, что узел точно «падает» в гравированную канавку напорного трубопровода, чтобы предотвратить утечку воды из гидравлического резервуара в камеры проточной культуры. Если вы не уверены, попробуйте затянуть шовную проволоку в нескольких положениях, выше или ниже ожидаемого расположения канавки, чтобы убедиться, что конечные узлы находятся точно на гравированной канавке(рисунок 2A).
   3. Поместите ножничный зажим на верхний конец силиконовой трубки и растяните силиконовую трубку вверх (это напрямую проверит первый узел, если есть возможность переместить силиконовую трубку с электроспыляющим каркасом над напорным трубопроводом, она не была затянута достаточно хорошо). С тяговым усилием силиконовая трубка предварительно растягивается. Чтобы силиконовые трубки соответствовали различным образцам, прикрепите линейку к ножничному зажиму. Потяните ножничный зажим вверх, пока нижний конец линейки не достигнет высоты нижнего конца леса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы предварительное растяжение в каждом образце было примерно одинаковым (~5%) по двум причинам: (1) если силиконовая трубка предварительно растягивается, это приведет к более однородному расширению по длине образца под давлением; (2) предварительное растяжение будет влиять на механические свойства силикона, поэтому оно должно быть одинаковым во всех образцах, чтобы обеспечить равные условия растяжения между образцами.
   4. Удалите морщины на электроспыливом каркасе, осторожно потянув за электроспыляемый каркас. Опять же, сделайте два узла с обеих сторон шовной проволокой на верхнем конце каркаса в месте расположения верхней гравированной канавки на напорном трубопроводе.
   5. Отпустите ножничный зажим и отрежьте ножом избыток силиконовой трубки, оставив 20–30% резьбы винта покрытой силиконовой трубкой, чтобы предотвратить утечку, когда носовой конус установлен на резьбе винта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите шаги 2.4 и 2.5 для всех динамических выборок.
   6. Для статических контрольных образцов закрепите электрораспись, установленную на силиконовой трубке, на напорных трубопроводах без отверстий. Эти трубопроводы могут храниться отдельно в трубке объемом 15 мл до посева (этап 4) и не должны быть установлены в отсеках камеры проточной культуры.
6. Обеззараживайте частично построенные камеры проточной культуры электрораспуклым каркасом, подвергая его воздействию ультрафиолетового излучения в течение 10 минут. Поверните камеры проточной культуры с электрораскручиваемыми каркасами на другую сторону и повторите воздействие ультрафиолетового света в течение 10 минут.
7. Прикрутите носовые конусы на винтовой резьбе нажимных трубопроводов с отверстиями для динамических образцов.
   1. Убедитесь, что верхний конец силиконовой трубки вписывается в носовой конус, чтобы предотвратить утечку на более поздних стадиях. Если силиконовых трубок слишком много, отрежьте излишки трубки ножом.
   2. Поместите частично построенные камеры проточной культуры в большую чашку Петри и направьте носовой конус к источнику ультрафиолетового света. Нанесите УФ-подсветку на 5 мин.
8. Полная конструкция камеры проточной культуры со стеклянной трубкой и верхним отсеком камеры проточной культуры(рисунок 1А–В).
   1. Предварительно смочите электрораспылительные каркасы, окунув напорный трубопровод с силиконовой трубкой и электроспыливым каркасом в 30% этанол, а затем дважды окунитесь в сверхчистую воду.
   2. Поместите стеклянную трубку над напорным трубопроводом, осторожно надавите на нижний отсек и аккуратно закрепите его.
   3. Возьмите верхний отсек, содержащий входное отверстие потока, поместите силиконовое уплотнительное кольцо, выпрямитель потока и втулку адаптера в правильномпорядке (рисунок 1A–B),поместите поверх открытого конца стеклянной трубки и аккуратно закрепите ее.
   4. Прикрутите белый колпачок Luer к входному отверстию верхнего отсека.
   5. Снимите мужскую пробку Luer с выходного отверстия из нижнего отсека и очистите поверхность вокруг нее с помощью пропитанной этанолом бумажной салфетки.
   6. Поместите шприц с 10 мл сверхчистой воды в выходное отверстие потока, откройте белый колпачок Luer в верхнем отсеке и наполните камеру сверхчистой водой. Снова закройте белый колпачок Luer, снимите шприц, снова очистите этанолом и закройте выход потока мужской пробкой Luer.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите шаги 2.6–2.8 для всех камер проточной культуры.
   7. Для статических элементов управления добавьте 10 мл сверхчистой воды в трубки 15 мл, в которые удерживаются образцы, установленные на напорных трубопроводах без отверстий.
9. Поместите все камеры проточной культуры в инкубатор. Замените сверхчистую воду питательной средой за день до посева клеток таким же образом, как описано в шагах 2.8.5 и 2.8.6 (убедитесь, что вы собрали «старую» сверхчистую воду с пропитанной этанолом бумажной салфеткой, помещенной непосредственно на выход потока).

[Протокол может быть приостановлен здесь]

3. Подготовка к настройке протокового насоса

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаг 3 в ламинарной проточной шкафу.

1. Соберите все материалы для настройки насоса и подготовьтесь к использованию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментаторы ссылаются на протокол производителя для подробного описания настройки насоса, жидкостных блоков и средних труб через клапаны жидкостного блока.
   1. Установите насос на мощность 200 мбар.
   2. Прикрутите держатели резервуаров для резервуаров по 60 мл к жидкостным блокам.
   3. Очистите многоразовые резиновые воздушные фильтры бумажной салфеткой, пропитанной этанолом, убедитесь, что воздушный фильтр остается сухим.
2. Поместите резервуары объемом 60 мл в держатели резервуаров и поместите стандартную среднюю трубку через клапаны жидкостного блока. Соедините среднюю трубку с большим внутренним диаметром с помощью муфт с замком Luer в закрытую петлю.
3. Зажмите среднюю трубку с помощью зажима шланга, непосредственно под резервуарами.
4. Заполните резервуары 25 мл питательной среды на 60 мл резервуара. Отпустите зажим шланга и впустите среду в трубку.
5. Закройте резервуары для среды резиновыми воздушными фильтрами и поместите установку протокового насоса в инкубатор до шага 4.

4. Посев клеток с использованием фибрина в качестве носителя клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаг 4 в ламинарной проточной шкафу.

1. Подготовьте фибриновый гель для этапа посева клеток. Для получения подробной информации см. Mol et al.⁶⁷ Для геля фибрина раствор фибриногена должен иметь конечную концентрацию 10 мг/мл (с точностью до чистоты белкового запаса), а раствор тромбина должен иметь конечную концентрацию 10 Ед/мл.
   1. Разморозить фибриноген до РТ, перед взвешиванием ~50 мг (достаточно для 10 образцов) в пластиковой таре с красной крышкой.
   2. Добавляют клеточную культурную среду для приготовления раствора фибриногена (в концентрации 10 мг/мл, скорректировать по чистоте белкового запаса). Хорошо перемешайте и процедините для стерилизации раствора фибриногена шприцевым фильтром 0,2 мкм в стерильную трубку 15 мл. Процедить отфильтрованный раствор фибриногена на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте приготовления раствора фибриногена слишком долго заранее, иначе фибриноген может сгущаться спонтанно.
   3. Разморозить тромбин и сделать раствор тромбина (в концентрации 10 Ед/мл) в клеточной культурной среде и поместить на лед. Готовят 20 мкл раствора тромбина + клеток на образец. Для n=10 образцов необходимо 200 мкл; поэтому приготовьте 250 мкл раствора тромбина для учета возможных ошибок пипетирования.
2. Соберите и подсчитайте клетки из колбы культуры. Смешайте клетки в нужном соотношении и количестве (1,2 × 10⁶ моноцитов и 0,6 × 10⁶ миофибробластов на каркас). Убедитесь, что для n+1 образцов достаточно ячеек для исправления ошибок пипетки. Центрифуга при 350 × г в течение 10 мин при РТ. Удалите супернатант.
3. Делают смесь взвешенных клеток и тромбина.
   1. Для каждого образца используют 20 мкл раствора тромбина. Для n=10 образцов добавьте 200 мкл тромбина в гранулу клетки и перемешайте. Измерьте объем клеточной суспензии (клетки + тромбин) и рассчитайте, как равномерно делить по всем 10 каркасам (например, если тромбин + клеточная суспензия имеет объем 260 мкл, каждый образец электроспыли получит 260 мкл / 10 образцов = 26 мкл тромбина + клеточная суспензия).
   2. Поскольку посев каркасов выполняется в два этапа, подготовьте две микрофьюж-трубки по 1,5 мл, которые будут удерживать половину клеточной суспензии для каждого каркаса (в примере расчета предыдущего этапа: подготовьте две трубки с 13 мкл тромбина + клеточная суспензия). Место на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги, особенно шаг 4.4, в идеале выполняются двумя экспериментаторами.
4. Высушите предварительно смачиваемые электрораспыливающиеся каркасы вакуумом, чтобы подготовиться к посеву клеток.
   1. Подключите стеклянную пипетку Пастера к вакуумной системе ламинарного протока и поместите в пустую трубку объемом 50 мл для стерильного временного хранения.
   2. Возьмите камеры для проточной культуры из инкубатора, извлеките мужскую пробку Luer из выходного отверстия потока и удалите среду после открытия белого колпачка Luer и размещения пропитанной этанолом бумажной салфетки перед выходом потока.
   3. Сняйте верхний отсек и стеклянную трубку, и поместите в стерильную чашку Петри для временного хранения.
   4. Поместите вакуумную пипетку Пастера на электрораспыливчатый каркас и удалите как можно больше среды.
      ВНИМАНИЕ: Очень осторожно высушите электропрядный каркас в вакууме. Вместо линейного движения вперед и назад над каркасом поместите вакуумную пипетку в нескольких местах. Зажмите вакуумную трубку поверх пипетки Пастера между пальцами для лучшего контроля.
   5. Смешайте раствор фибриногена в соотношении 1:1 с тромбином + клеточной суспензией (например, смешайте 13 мкл фибриногена с 13 мкл тромбина + клеточная суспензия). Чтобы убедиться, что фибрин полимеризуется в каркасе, а не в микрофьюжной трубке, пипетируйте фибриноген, поверните колесо пипетки для «дополнительного объема» суспензии тромбина + клетки и пипетируйте вверх и вниз один раз в микрофьюжной трубке с клеточной суспензией для смешивания.
   6. Непосредственно однородно капают раствор по всей длине электрораспыливного каркаса. Рекомендуется, чтобы экспериментатор А капнул смесь фибрина, в то время как экспериментатор В удерживает нижний отсек с электрораспыленным каркасом, установленным на напорном трубопроводе.
   7. После того, как фибрин с клетками капает на электрооткинутый каркас, экспериментатор В медленно перемещает каркас слева направо, вверх и вниз, чтобы еще больше разделить клетки равномерно по каркасу.
   8. Повторите шаг 4.4.5 - 4.4.7 на другой стороне электрораспыляемого каркаса.
   9. Снова установите камеру проточной культуры, осторожно поместив стеклянную трубку (предотвратите прилипание фибрина и свертывание на внутренней стороне стеклянной трубки), и отодвиньте верхний отсек камеры проточной культуры. Непосредственно поместите семенную конструкцию без какой-либо среды или фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в камеру проточной культуры в инкубаторе.
   10. Повторите шаги 4.4.1–4.4.9 для всех динамических образцов. Для статических образцов, установленных на трубопроводах под давлением без отверстий, семена в соответствии с этапами 4.4.1–4.4.8 и затем помещают в трубку 15 мл.
   11. Дайте фибрину полимеризоваться в течение 60 мин в инкубаторе.

[Протокол здесь можно приостановить на 30–60 минут.]

5. После полимеризации заполните камеры проточной культуры (динамические образцы) или трубки объемом 15 мл (статические образцы) средой.

5. Соединение биореактора и систем проточные насосы перед началом эксперимента

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 5.1–5.3 в ламинарной проточной шкафу.

1. Возьмите лоток, несущий камеры проточной культуры и жидкостные блоки с заполненными резервуарами для среды и подключенными средними трубками внутри ламинарных шкафов потока.
2. Расположите камеры проточной культуры на основании биореактора для экспериментальных групп, нагруженных циклическим растяжением и с комбинированными гемодинамическими нагрузками(рис. 1Е).
   1. Наклоните камеру проточной культуры вверх дном, а напорный трубопровод снизу заполните сверхчистой водой с помощью шприца с тонкой трубкой (это может быть любого типа, если она гибкая и тонкая, в этом эксперименте к игле была прикреплена проволока внутреннего диаметра 10 см, внутреннего диаметра 0,15 мм).
   2. Поместите тонкую трубку внутрь напорного трубопровода, и пока напорный трубопровод заполняется сверхчистой водой, постепенно выталкивая воду из шприца, одновременно вытяните проволоку из напорного трубопровода, чтобы убедиться, что внутри напорного трубопровода нет пузырьков воздуха.
   3. Поместите камеру проточной культуры на одну из восьми резьбовых винтов на основании биореактора. Поместите силиконовое уплотнительное кольцо между основанием биореактора и белым разъемом Luer, чтобы предотвратить возможную утечку, и затяните белый разъем Luer из нижнего отсека.
   4. Повторите шаги 5.2.2 и 5.2.3 для всех циклически растянутых образцов.
3. Подключите камеры проточной культуры для всех экспериментальных групп, кроме статического управления, к системе протокового насоса.
   1. Поместите зажим шланга на среднюю трубку. Снимите белый колпачок Luer, закрывающий входное отверстие верхнего отсека камеры проточной культуры. Снимите соединительную муфту Luer из средней трубки и соедините среднюю трубку с одной стороны с впускным отверстием в верхнем отсеке, а с другой стороны средней трубки с выходом потока в нижнем отсеке.
   2. Повторите шаг 5.3.1 для всех камер проточной культуры. В этот момент биореактор и камеры проточной культуры заполняются средой и подключаются к системам потока.
   3. Для статических контрольных образцов поместите образцы вертикально в колбу для клеточных культур с фильтрующим колпачком с помощью ножничного зажима. Наполните колбу для посева клеток средой и поместите в инкубатор.
4. Перенесите полную установку из ламинарного проточного шкафа в инкубатор и подключите жидкостные блоки к трубке давления воздуха и электрическому кабелю.
5. Запустите программное обеспечение и инициализируйте протоочиваемые насосы. Запустите поток среды для образцов один за другом.
   1. Проверьте, щелкают ли клапаны жидкостного блока.
   2. Снимите зажим шланга со средней трубки.
   3. Запустите протоку с 100 мбар и временем переключения 10 с.
   4. Тщательно проверьте направление потока на наличие возможных утечек или пузырьков воздуха. Любые захваченные пузырьки воздуха можно удалить, перевернув камеру проточной культуры вверх дном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что средние уровни в резервуарах среды сбалансированы, чтобы предотвратить всасывание воздуха в систему и пузырьки воздуха в камерах проточной культуры, и не дать резервуарам высохнуть(рисунок 2C).
   5. Повторите шаг 5.5 для всех жидкостных блоков по одному.
6. Инициализируйте тензометрный насос.
   1. Подключите пневматический приводной насос через воздухопускное отверстие пневматического цилиндра к сжатому воздуху. Соедините нижнее воздушное отверстие с синей трубкой для выхода воздуха(рисунок 1F).
   2. Откройте программное обеспечение LabVIEW, запустите скрипт LabVIEW и систему применения давления сжатого воздуха, как описано Van Kelle et al.^68,введите смещение и частоту (начните с низкой частоты 0,2 Гц). Приостановите работу насоса, когда сильфон тефлона находится на самом низком уровне.
   3. Поместите датчик давления во вход датчика давления на гидравлическом резервуаре.
7. Измените настройки насоса на нужные (для 1,5 Па, используйте 150 мбар, время переключения 10 с).
8. Запустите тензометрические насосы и примените предпочтительную настройку (например, 0,5 Гц, растяжение 1,05).

6. Запуск эксперимента в течение нескольких дней; Мониторинг сдвига и растяжения при посеве и замене среды

1. Рассчитайте WSS на стене строительных лесов.
   1. Записывайте величину потока через день (подробности см. в руководстве производителя протокового насоса). Короче говоря, наблюдайте за изменением уровня жидкости (в мл) в средних резервуарах между переключением резервуара жидкостного блока в течение 10 с. Проведите не менее пяти измерений, рассчитайте среднее значение и умножьте на 6, чтобы получить расход Q в мл/мин.
   2. Поток описывается потоком Пуазёйя через кольцевой канал. Предполагая, что культуральная среда является ньютоновской жидкостью, вычислите WSS на стенке каркаса, r_1,по уравнению 1.
      (1)
      где WSS τ_w на стенке каркаса(r1;здесь r1 = 1,7 мм), возникающий в результате постоянного потока, определяется приложенным давлением p и внутренним радиусом стеклянной трубки r2 (здесь r₂ = 2,3 мм). Предполагается, что градиент давления в осевом направлении является равномерным между входом и выходом потока и задается уравнением 2(рисунок 1J).
      (2)
      с μ динамической вязкости (здесь вязкость среды предполагалась постоянной, μ = 0,7 × 10^-3 Па∙с при 37 °С) и Q приложенного расхода.
2. Следите за растяжением, нанесенным на строительные леса через день.
   1. Поместите темный фон за камерой культуры потока, чтобы увеличить контраст между каркасом и фоном. Расположите светодиодные лампы, направленные на строительный лес, чтобы помочь визуализации строительных лесов.
   2. Сделайте покадровые фотографии строительных лесов на частоте 30 Гц в течение 6 с (т.е. 3 цикла растяжения) с помощью высокоскоростной камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более низкой частоты записи может быть достаточно, если камера позволяет. Однако минимально требуемая частота не была определена.
   3. Вручную определите минимальный и максимальный диаметр каркаса по изображениям.
   4. Рассчитайте минимальный и максимальный внешний диаметр электроплитного каркаса для расчета максимальных растяжек в соответствии с уравнением 3.
      (3)
      где окружное растяжение(λ_θ)задается отношением между внешним диаметром каркаса, d_1,и его начальным диаметром, d₀.
3. Корректировать среднее испарение и обновлять среду три раза в неделю.
   1. Остановите и разъедините кабели для проточных систем и тензометрового насоса.
   2. Поместите зажимы шлангов на среднюю трубку.
   3. Определить, сколько среды испарилась, исходя из оценок индикатора объема на средних резервуарах.
   4. Перенесите лоток с биореактором и жидкостными блоками в ламинарный проточный шкаф.
   5. Снимите резиновые воздушные фильтры из резервуаров среды; добавить автоклавную сверхчистую воду, чтобы компенсировать испаривённый объем среды. Снова закройте резервуары для среды и снова подключитесь к насосу, чтобы смешать среду со сверхчистой водой.
   6. Повторите шаги 6.3.1–6.3.5. Снова снимите резиновые воздушные фильтры, выньте 25 мл питательной среды и открутите при 300 × г в течение 5 мин при РТ.
      1. Собирают 1,5 мл супернатанта и хранят при -30 °C для анализа секреторных профилей (для анализа с помощью иммуноферментного анализа (ИФА)).
      2. Соберите желаемый объем супернатанта для паракринных сигнальных исследований, используя супернатант в качестве условной среды^43.
   7. Добавьте 25 мл свежей среды в резервуары среды.
   8. Поместите резиновые воздушные фильтры обратно на средние резервуары.
   9. Поместите полную настройку обратно в инкубатор; подключите все кабели и воздушные трубки к насосу и тензометру. Отпустите зажимы шланга и повторите шаги 5.4–5.8.
4. Проверьте, являются ли шарики для сушки кремнезема в сушильных бутылках, подключенных к насосу, влажными (белый вид), и замените их сухими кварцевыми шариками, если это необходимо (оранжевый вид).

7. Завершение эксперимента, сбор образцов, очистка и хранение оборудования

1. В последний день эксперимента скорректируйте испарение среды, как описано в шагах 6.3.1–6.3.5, и соберите образцы по одному.
   1. Чтобы собрать образцы один за другом, проточные насосы и тензометрические насосы необходимо несколько раз приостановить. Поместите зажим шланга на среднюю трубку. Временно остановите протоочный насос и тензометрный насос. Отсоедините одну камеру проточной культуры от основания биореактора; заменить белым колпачком Luer на основании биореактора. Отоберите камеру проточной культуры и жидкостный блок в ламинарную проточную камеру. Снова запустите проточные насосы и насос деформации, чтобы применить гемодинамическую нагрузку к другим образцам до сбора урожая.
   2. Соберите среду из резервуаров среды для анализа производства паракринных цитокинов с помощью ИФА.
2. Разъедвляйте проточные агрегаты и трубчатую конструкцию. Сечение по нужной схеме резки. Части конструкции могут храниться при 4 °C (после 15-минутной фиксации в 3,7% формальдегиде и 3 х 5 мин промывки в PBS) или -30 °C (после замораживания в жидком азоте) до дальнейшего анализа.
3. Очистите компоненты биореактора и насоса. Кроме того, рекомендуемый метод очистки каждого элемента указан в Таблице материалов.
   1. Очистите резиновые воздушные фильтры 70% этанолом. Будьте очень осторожны, чтобы не смочить внутренний фильтр!
   2. Соберите все отдельные компоненты: средние трубки, средние резервуары, стеклянные трубки, мужские заглушки Luer и женские замки Luer, белые колпачки Luer, напорные трубопроводы, носовые конусы, силиконовые уплотнители, втулки адаптера, выпрямители потока (за исключением насосов, жидкостных блоков, резиновых воздушных фильтров, основания биореактора) и промыть в проточной водопроводной воде.
   3. Поместите O/N в 0,1% додецилсульфата натрия в деионизированную воду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте сверхчистую воду, так как детали могут ржаветь.
   4. Смойте водопроводной водой и мылом для мытья посуды.
   5. Погрузите в деионизированную воду, затем 70% этанол два раза, а затем деионизированную воду.
   6. Поместите все материалы отдельно на бумажные салфетки и дайте им высохнуть. Используйте напорный воздух для сушки трубок.
   7. Очистите все неавтоклавируемые материалы бумажной салфеткой, пропитанной 70% этанолом. Это включает в себя резиновый воздушный фильтр (имейте в виду, что воздушный фильтр должен оставаться сухим) и основание биореактора (тефлоновый сильфон и пневматический цилиндр).
   8. Автоклав компонентов жидкостной камеры (включая силиконовое уплотнительное кольцо), средней трубки, резервуаров среды (без резинового воздушного фильтра), мужских пробок Luer и женских муфт Luer, белых колпачков Luer, зажимов для шлангов и стандартного оборудования (например, пинцет, зажимные ножницы)
   9. Для удобства использования во время следующих экспериментов объедините отдельные компоненты для одной полной жидкостной камеры в автоклавируемой коробке.
4. Удалите воду из гидравлического резервуара. Очищают 70% этанолом, а затем деионизированной водой. Дайте высохнуть. Заправляйте деионизированной водой и несколькими каплями водозащищающего дезинфицирующего средства.
5. Храните стеклянные трубки для камеры проточной культуры в 70% этаноле.
6. Поместите влажные шарики для сушки кремнезема (белый вид) в духовку O/N при 120 °C, чтобы они высохли (оранжевый вид), и храните в герметичной колбе.

Representative Results

Этот биореактор был разработан для изучения индивидуальных и комбинированных эффектов сдвигового стресса и циклического растяжения на рост и ремоделирование сосудистой ткани в 3D-каркасах биоматериала. Конструкция биореактора позволяет культивировать до восьми сосудистых конструкций при различных условиях нагрузки(рисунок 1А). Сосудистые конструкции расположены в камере проточной культуры(рисунок 1B),в которой можно независимо контролировать как окружное растяжение, так и WSS. Верхний отсек камеры проточной культуры содержит выпрямитель потока для стабилизации потока в относительно короткой длине осаждения(рисунок 1C). Непосредственно после выпрямителя потока носовой конус равномерно распределяет поток через кольцевой канал(рисунок 1D). Когда все этапы протокола выполнены правильным образом, сосудистые каркасы в камере проточной культуры могут подвергаться непрерывному однонаправленному потоку через кольцевой канал между каркасом и стеклянной стенкой и по окружности растягиваются пневматическим насосом(рисунок 1E–F). Перед установкой каркаса электрораскрушенная трубка должна быть разрезана на трубки диаметром 25 мм(рисунок 1G)и может быть исследована с помощью SEM для анализа микроархитектуры(рисунок 1H–I). Важно отметить, что трансплантаты PCL-BU в этом примере могут быть заменены любыми другими эластомерными тканевыми инженерными трансплантатами (естественного или синтетического происхождения, различной микроархитектуры или пористости). Конструкция с выходом наизнанку позволяет тестировать высокопористые трансплантаты, поскольку она не обязательно должна быть безтекательной. Схематическое изображение камеры культуры потока показывает физическую интерпретацию параметров, используемых в уравнениях для описания WSS (уравнение 1), градиента давления (уравнение 2) и окружного растяжения (уравнение 3)(рисунок 1J).

Неправильное выполнение критических шагов протокола может привести к нескольким сценариям. Например, утечка из гидравлического резервуара может произойти в результате неправильно смонтированных узлов, приводящих к утечке гидравлической жидкости из напорных трубопроводов с отверстиями, проходящими через силиконовую трубку и поступающими в камеру проточной культуры(рисунок 2А). Утечка гидравлической жидкости при соединении между резьбой винта и основанием биореактора также может произойти, когда силиконовое кольцо не очень хорошо расположено или если тефлоновой сильфон не позволили слегка расширить O/N за день до эксперимента(рисунок 2B). Кроме того, когда среда не дегазируется или если средние уровни в резервуарах среды не сбалансированы и один резервуар среды высыхает, в результате чего воздух всасывается в систему, в камере проточной культуры могут возникать пузырьки воздуха(рисунок 2C),что нарушает паттерны WSS, ставя под угрозу жизнеспособность клеток и последующий рост тканей. Наконец, когда силиконовое уплотнительное кольцо в нижнем отсеке размещено неправильно, может наблюдаться разлив среды ниже камеры культивирований потока(рисунок 2D).

Поскольку эта установка биореактора позволяет применять индивидуальные и комбинированные гемодинамические нагрузки, в один эксперимент могут быть включены несколько гемодинамически нагруженных экспериментальных групп(рисунок 3А). Ранее различные гемодинамические нагрузки (т.е. два режима напряжения сдвига и два режима растяжения) проверялись путем применения различных возможных системных настроек(рисунок 3B). Когда растяжение(рисунок 3C)и WSS(рисунок 3D)контролировались в течение долгосрочных периодов культивации, было подтверждено, что они могут поддерживаться на относительно постоянных уровнях в течение периода до 20 дней.

Биореактор особенно хорошо подходит для изучения влияния гемодинамической нагрузки на рост и ремоделирование в контексте IN situ сосудистого ТЭ. Предполагается, что стадии IN situ TE отражают стадии естественной реакции заживления ран(рисунок 4A). Кокультуры макрофагов, полученных из моноцитов, и миофибробластов, полученных из подкожно-подкожных вен человека, как описано здесь, были созданы как имитация in vitro пролиферативной фазы. Через три дня после посева иммунофлуоресцентное окрашивание показало однородное распределение обоих типов клеток по всему каркасу(рисунок 4B). После 20 дней совместной культивирования циклическое растяжение само по себе приводило к отложению более многочисленных и толстых коллагеновых волокон типа I, в то время как в группе с комбинированными гемодинамическими нагрузками этот эффект циклического растяжения был преодолен сдвиговым напряжением, что привело к менее выраженной отложению коллагена типа I, проиллюстрированному здесь иммунофлуоресцентным окрашиванием(рисунок 4C). Для успешной регенерации тканей in situ требуется жесткий баланс между производством тканей и рассасыванием каркаса. В дополнение к образованию тканей, биореактор позволяет индукционировать резорбцию клеточного каркаса. Например, при культивировании монокультуры макрофагов в течение 8 дней на электропрядных трансплантатах наблюдалась эрозия волокон и расщепление волокон во всех режимах гемодинамической нагрузки, причем наиболее выраженная резорбция в статической группе и наименее выраженная резорбция в группе сдвиговых напряжений(рисунок 4D). Вместе эти результаты показывают влияние различных режимов гемодинамической нагрузки как на рост, так и на ремоделирование. Эти идеи полезны для оптимизации параметров проектирования для недавно разработанных INSITU TEVG.

Другим важным фактором, определяющим процесс регенерации тканей, является наличие про- и противовоспалительных цитокинов. Поскольку биореактор представляет собой замкнутую систему, клетки в системе будут постоянно подвергаться воздействию паракринных стимулов секретируемых факторов. На ранних и поздних стадиях были проанализированы профили секреции цитокинов в среде динамически нагруженных кокультур мононуклеарных клеток периферической крови человека (ПБМК) макрофагов и миофибробластов человека из подкожной вены(рисунок 5А). Эти репрезентативные результаты иллюстрируют влияние как циклического растяжения, так и сдвигового напряжения на профиль секреции цитокинов в кокультурной установке. Интересно, что комбинированные эффекты обеих нагрузок показали либо доминирование одной из двух нагрузок (например, циклическое растяжение для интерлейкина-6 (IL-6) и моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (MCP-1)), либо синергетические эффекты обеих нагрузок (например, для IL-10)(рисунок 5B). Эти идеи, собранные с помощью этой платформы тестирования in vitro, дают ценную информацию для разработки TEVG in situ, которые основаны на обосновании регенерации тканей in situ, управляемой макрофагами.

Кокультурные эксперименты макрофагов и миофибробластов показали, что механическая среда и результирующая нагрузкозависимая воспалительная среда модулируют фенотип миофибробластов. После 20 дней гемодинамической нагрузки экспрессия генов маркеров миофибробластов показала явные различия в индивидуальном и комбинированном воздействии нагрузки и в прямой и паракринной сигнализации макрофагов на миофибробласты(рис. 6А). Кроме того, паттерны экспрессии генов сократительного маркера альфа-гладкомышеского актина коррелируют с синтезом белка(рисунок 6B). Кроме того, циклическое растяжение стимулировало экспрессию генов коллагена и эластического матрикса и ослабленную матриксную металлопротеиназу 1/тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1-опосредованного коллагена ремоделирование, тогда как стабилизирующее действие сдвигового напряжения наблюдалось в кокультуре(рисунок 6C). Эти долгосрочные эксперименты с кокультурой показывают возможность изучения фазы ремоделирования тканей на более поздней стадии(рисунок 4А)в различных режимах гемодинамической нагрузки в тканеинженерных сосудистых трансплантатах с помощью этого биореактора. Поскольку TEVG установлены «наизнанку» на силиконовой трубке, круговое растяжение и WSS могут применяться в течение более длительных периодов культивирования.

Рисунок 1: Проектирование и обзор биореактора. (A)Строительный чертеж основания биореактора и(B)взорванного вида камеры для культивированной жидкости со всеми указанными частями (этапы 2.4–2.8). Верхний отсек камеры проточной культуры содержит выпрямитель потока. (C)Сферически притупленный носовой конус расположен после выпрямителя потока для распределения потока через кольцевой канал (направление потока указано розовым цветом). (D)Вместе эти компоненты контролируют и направляют направленность потока. Функциональное описание отдельно упомянутых частей см. в таблице 1. (E)Фотография полной установки биореактора (этап 5.2) и(F)крупный план камер проточной культуры и пневматического цилиндра (этап 5.6.1). (G) Грубый внешний вид электроплитного каркаса PCL-BU перед посевом (линейка клещей 1 мм). Сканируются электронно-микроскопические изображения трубчатых электроплит PCL-BU каркасов с внутренним диаметром 3 мм и средним диаметром волокна 5 мкм при различных увеличениях, шкале стержней(H)100 мкм и(I)10 мкм (шаг 1.3). (J)Схематическое изображение культурального зала, состоящего из трубчатого электрооткипящегося каркаса, с наружным радиусом_(r1),центрированного в стеклянной трубке внутреннегорадиуса (r_2). Проточные(Q)входы и выходы соединены с кольцевым кольцом, с высотой канала h для применения напряжения сдвига стенки(t). Вход давления/растяжения(P)соединен с силиконовым каркасом для нанесения окружного растяжения(λ(t))на установленные электрорасщепляющиеся леса изнутри (шаг 6.1). Сокращения: поликапролактон бисмочевина (PCL-BU). Панели C, D и G–J были адаптированы из Van Haaften et al.^19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Детали биореактора	Функциональное описание
Растяжение
Пневматический цилиндр	Приводит в действие тефлоновый мех.
Сильфон тефлоновая	Загружает гидравлический резервуар.
Гидравлический резервуар	Может быть соединен с 8 проточными культуральными камерами, заполнен полуводоувлажниной водой, оказывает давление на силиконовые конструкции.
Резьбой	Соединение между камерой проточной культуры и гидравлическим резервуаром. Напорное отверстие для силиконовых конструкций.
Белый разъем luer	Используется для привинчивки камеры проточной культуры, плотно прижатой к одной из восьми резьбовых нитей на основании гидравлического резервуара/биореактора.
Напорный трубопровод с небольшими отверстиями	Напрямую связан с водой в гидравлическом резервуаре. Когда гидравлический резервуар находится под давлением, напорные трубопроводы заполняют пространство между силиконовой трубкой (которая установлена на напорном трубопроводе) водой, выталкивая силиконовую трубку наружу, что приводит к окружному растяжению на силиконовом трансплантате изнутри.
Силиконовые трубки	Для установки электрорасплавного трансплантата на напорный трубопровод. Силиконовая трубка по окружности растянута изнутри.
Применение потока
Система протокового насоса	Используется для управления потоком в камерах проточной культуры. (в нашем примере: используется насосная система ibidi.)
Верхний и нижний отсек с входом и выходом потока	Соединяет камеру проточной культуры с проточной петлей.
Стеклянная трубка	Содержит каркас под давлением в центре и позволяет перфузию лесов.
Выпрямитель потока	Стабилизирует поток в относительно короткой длине оседания.
Носовой конус	Равномерно распределяет поток.
Втулка адаптера	Фиксирует стеклянную трубку.
Силиконовое уплотнительное кольцо	Предотвращает утечку среды.

Таблица 1: Функциональное описание основных признаков биореактора, соответствует указанным частям на фиг.1А-D.

Рисунок 2: Результаты неточного выполнения критических шагов в протоколе. Фотографии некоторых явлений, которые можно наблюдать в установке биореактора, когда критические шаги выполняются неправильно. (A)Если узел недостаточно плотной или не точно помещен в гравированную канавку (обозначен стрелкой), может произойти небольшая утечка гидравлической жидкости в камеру проточной культуры(этап 2.5). (B)Если тефлоновой сильфон не был допущен к расширению O/N за день до эксперимента или когда силиконовое кольцо не было хорошо размещено, может произойти утечка гидравлической жидкости из гидравлической жидкости при соединении между резьбой винта и основанием биореактора (обозначено стрелкой) (этапы 1.4 и 5.2.3). (C) Пузырьки воздуха в камере проточной культуры (обозначенные стрелкой) приведут к нарушению структуры напряжения сдвига. Всегда размещайте питательную среду и убедитесь, что уровни среды в резервуарах среды сбалансированы, чтобы предотвратить пересыхание одного резервуара и всасывание воздуха в систему проточные камеры (этапы 1.2 и 5.5.4). (D)Если силиконовое кольцо в нижнем отсеке размещено неправильно, может наблюдаться просыпательное вещество (обозначено стрелкой) (этап 2.4.2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Контроль напряжения сдвига и растяжения. Поскольку биореактор позволяет независимо и комбинированно применять растяжение и сдвиг,(А)в один эксперимент могут быть включены несколько экспериментальных групп. (B)Примеры вариаций максимальных растяжений и напряжений сдвига в конкретный момент времени, испытанные в рамках четырех различных системных настроек (обозначенных цветами). Черные прямоугольники представляют собой среднее ± стандартное отклонение измерений для каждого параметра. Пунктирные линии вычисляются как среднее значение растяжек(горизонтальная линия)и напряжений сдвига(вертикальная линия)для указания четырех различных условий нагрузки. (C)Циклические окружные растяжки в циклических растяжениях и комбинированных группах в течение эксперимента 20 дней, основанные на измерениях внешнего диаметра конструкций каркаса, контролируемых с помощью таймлапс высокоскоростной камеры (шаг 6.2). (D)Контролируемые напряжения сдвига стенки в группах напряжения сдвига и комбинированных группах в ходе эксперимента, основанные на изменяющихся уровнях среды в шприце (этап 6.1). Панели A, C и D были адаптированы из Van Haaften and Wissing et al.^44; панель B была адаптирована из Van Haaften et al.^19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Концепция in situ сосудистой тканевой инженерии, распределения клеток, производства тканей и деградации каркаса. (A) Схематическая иллюстрация, изображающая гипотетические фазы регенерации тканей, управляемой каркасом, в функциональном месте хозяина. Показанные результаты получены из экспериментов, которые были сосредоточены на пролиферативной фазе, в которой макрофаги и клетки, продуцирующие ткани, колонизировали материал каркаса. (B) Распределение миофибробластов из подкожной вен человека(красный)и макрофагов, полученных из PBMC(зеленый),на внешней стороне электроспытого каркаса(серый)на 3-й день. Шкала 200 мкм. (C) Поперечное сечение конструкции кокультуры на 20 день окрашивается для коллагена типа I(зеленый),коллагена типа III(красный)и DAPI(белый). Шкала 100 мкм, *обозначает внешнюю сторону конструкции, соответствующую стороне потока. (D)SEM изображения децеллюляризованных трансплантатов 8-дневной монокультуры макрофагов, показывающие деградацию макрофагов; шкала бар 20 мкм. Сокращения: подкожно-венозные клетки человека (HVSC); мононуклеарная клетка периферической крови (ПБМК); 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI); сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Группа А была адаптирована из Wissing and Bonito et al.^27; панели B и C были адаптированы из Van Haaften и Wissing et al.^44; и панель D была адаптирована из Wissing et al.^43. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Воспалительная среда в гемодинамически нагруженных кокультурных конструкциях через 3 дня и 20 дней. Кокультура макрофагов человека, полученных из ПБМК, и миофибробластов человека из подкожной вены. (A)Тепловая карта общей секреции цитокинов, измеренная в надводном агенте с помощью мультиплексной ИФА. (B) Бокс-сюжеты для отбора цитокинов на 20 день, нормализованные до общего содержания ДНК. P-значения были рассчитаны с использованием теста Крускала-Уоллиса с помощью множественного сравнительного теста Данна; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** Сокращения: тканевый ингибитор металлопротеиназы (TIMP), матриксная металлопротеиназа (MMP), интерлейкин (IL), моноцитарный хемоаттрактантный белок 1 (MCP-1), трансформирующий фактор роста бета 1 (TGF-β1), фактор роста соединительной ткани (CTGF), фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), статический (ST), циклическое растяжение (CS), сдвиговой стресс (SS). Панели A и B были адаптированы из Van Haaften and Wissing et al.^44. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Изменения фенотипа миофибробластов и маркеров роста и ремоделирования матрикса в ответ на гемодинамическую нагрузку в сосудистых конструкциях на 20 день. (A) Относительная экспрессия генов миофибробласт-специфических фенотипических маркеров. (B) Поперечные сечения окрашены для αSMA(зеленый)и DAPI(синий),шкала 100 мкм. Относительнаяэкспрессия генов, связанных с коллагеновой матрицей, эластическая матрица, протеогликанами и генами ремоделирования. P-значения были рассчитаны с использованием теста Крускала-Уоллиса с помощью множественного сравнительного теста Данна; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Сокращения: S100 кальций-связывающий белок A4 (S100A4), альфа-гладкомышечный актин (αSMA или ACTA2), кальпонин 1 (CNN1), смлюзелин (SMTN), виментин (VIM), коллаген I (COL1A1), эластин (ELN), версикан (VCAN), матриксная металлопротеиназа (MMP), тканевой ингибитор металлопротеиназы (TIMP), статический (ST), циклическое растяжение (CS), сдвиговое напряжение (SS), 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). # измеряется на пределе обнаружения или ниже. Панели A, B и C были адаптированы из Van Haaften and Wissing et al.^44. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок S1: Экспрессия белка миофибробласт- и макрофагов-монокультур, подвергаемых индивидуальным и комбинированным гемодинамическим нагрузкам. (A)Репрезентативные конфокальные изображения миофибробластов, культивируемых в течение 10 дней с актиновыми волокнами(зеленый),ядрами(красным)и каркасом(синий),показывают четкую ориентацию актиновых волокон в загруженных образцах по сравнению со статическими образцами, в которых не наблюдается предпочтительного направления актиновых волокон. Шкала 50 мкм. (B) Конфокальные изображения той же монокультуры миофибробластов, окрашенных для коллагена(зеленый)и ядер/каркас(белый). Шкала бар 50 мкм.(C)Boxplots профилей секреции белка статически и динамически культивируемых макрофагов, полученных из THP1, в течение 8 дней, с расчетными соотношениями M1/M2 на основе уровней секреции цитокинов IL-6, TNF-α, MCP-1 (провоспалительный) и IL-10, IL-13, MMP-9 (противовоспалительный). Точка на графике MCP-1 представляет собой статистический выброс. ДанныеИФА об относительных уровнях секреции белка статически и динамически культивируемых макрофагов на 8-й день по сравнению со средней секрецией провоспалительных, противовоспалительных, растущих и ремоделируемых белков (уровни белка были скорректированы на среднее содержание ДНК в группе). Точки и затененные области указывают, соответственно, на 50-й и^25-75-йпроцентили. Сокращения: моноцитарный хемоаттрактантный белок 1 (MCP-1), интерлейкин (IL), трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), матриксная металлопротеиназа (MMP), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста соединительной ткани (CTGF), фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), иммуноферментный анализ (ELISA).* p < 0,05; ** p < 0,01, *** p < 0,001. Панели A и B были адаптированы из Van Haaften et al.^19. Панели C и D были адаптированы из Wissing et al.^43. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.

Discussion

Биореактор, описанный в настоящем описании, позволяет систематически оценить вклад индивидуальных и комбинированных эффектов напряжения сдвига и циклического растяжения на воспаление и регенерацию тканей в трубчатых рассасывающихся каркасах. Этот подход также позволяет проводить большое разнообразие анализов сосудистых конструкций, как покажлено в разделе репрезентативных результатов. Эти результаты показывают различное влияние различных режимов гемодинамической нагрузки (т.е. различных комбинаций сдвига и растяжения) как на рост, так и на ремоделирование конструкции TEVG. Эти идеи, собранные с помощью этой платформы in vitro, помогают оптимизировать параметры проектирования строительных лесов для недавно разработанных TEVG in situ. Для обеспечения надлежащего экспериментального рабочего процесса важно понимание критических шагов и ограничений этого протокола.

Наиболее важные шаги в протоколе связаны с применением растяжения к образцам. Для применения стрейч важно, чтобы установка не была герметичной. В системе есть два слабых места: узлы, крепящие электрорасщеплянные трансплантаты к напорным трубопроводам, и соединение между основанием биореактора и камерами проточной культуры. Как описано в этапах 2.5.2 и 2.5.4, несколько плотных узлов должны быть расположены точно в гравированной канавке. Если узел недостаточно плотный или расположен немного выше или ниже канавки, может произойти небольшая утечка гидравлической жидкости в камеру проточной культуры. Эта утечка может быть обнаружена как падение давления в гидравлическом резервуаре и неуклонно растущее напряжение на тензометрическом насосе для достижения заданного значения давления. Кроме того, это приводит к нарушению потока в камере проточной культуры, повышенному риску загрязнения клеточной культуры, разбавлению среды. Как только это произойдет, камеру проточной культуры необходимо вытащить из эксперимента, а резьбу винта на гидравлическом резервуаре закрыть белым колпачком Luer. Эта важная мера по удалению полного образца, которая необходима для обеспечения надлежащего продолжения эксперимента для других семи камер проточной культуры, подчеркивает важность точного размещения плотных узлов именно в гравированных канавках. Только тогда может быть обеспечено надлежащее разделение между водой в гидравлическом резервуаре и средой в камерах проточной культуры. Для повышения надежности монтажа строительных лесов канавки в напорных трубопроводах будут сделаны немного глубже в пересмотренной версии биореактора, что позволит упростить и улучшить размещение узлов и, таким образом, обеспечить безопасное отделение гидравлической жидкости от среды.

Другим потенциальным источником утечки является резьба винтового ряда основания биореактора и белые соединители Luer камеры проточной культуры. Из-за возможного износа тефлонового материала может быть добавлено дополнительное силиконовое уплотнительное кольцо для предотвращения утечки (шаг 5.2.3). Более того, тефлоновой сильфон тензометрового насоса следует дать немного расширить O/N за день до эксперимента (шаг 1.4). Если происходит утечка, потерянную гидравлическую жидкость следует компенсировать добавлением небольшого количества сверхчистой воды через одну из восьми винтовых резьб (используйте шприц с иглой и гибкой проволокой). Поместите камеру проточной культуры обратно с небольшим кусочком парапленки между резьбой винта и белым соединителем Luer в нижнем отсеке камеры проточной культуры. Чтобы преодолеть эту проблему утечки в будущих экспериментах, текущие тефлоновые резьбы на основании биореактора будут заменены резьбой из нержавеющей стали в версии биореактора следующего поколения для предотвращения износа системы.

Вариация растяжки(рисунок 3C)больше, чем вариация в WSS(рисунок 3D),так как растяжение труднее контролировать. Тем не менее, помимо мер по предотвращению утечки, существуют и другие меры, ограничивающие изменение растяжения: i) предотвращение пузырьков воздуха в флейте (этап 1.4 и 5.2.1),ii) обеспечение последовательного предварительного растяжения между различными образцами (этап 2.5.3) и iii) обеспечение согласованных свойств каркаса среди различных образцов (этап 1.3).

Наконец, необходима особая осторожность при монтаже электроплитого каркаса на силиконовую трубку (шаг 2.3). В частности, когда хрупкий электроспышный каркас необходимо натянуть на растянутую силиконовую трубку, важно не прикладывать слишком много силы, чтобы предотвратить повреждение электроспылнутого трансплантата, особенно на внутренней стороне электроспылнего трансплантата. Если повреждение происходит на внутренней стороне электропрядного трансплантата, либо от силового вытягивания, либо от слишком слабого растяжения силиконовой трубки, степень повреждения электропрядных волокон становится видимой только после того, как конструкция собрана и проанализирована. В нынешних условиях успех посева может быть подтвержден только после иммунофлуоресценции или иммуногистохимического анализа, после жертвоприношения образца. Однако процедура посева с фибрином в качестве носителя клеток является хорошо заявитым способом^67, который обычно приводит к однородном распределению клеток для каркасов с достаточно большим размером пор. Одним из наиболее важных аспектов в отношении клеточного посева является обеспечение того, чтобы каркас был как можно более сухим до посева (этап 4.4),чтобы предотвратить прохождение фибринового геля с клетками через влажный каркас, что приводит к неоднородному посеву. Наконец, хотя метод дезактивации электроспылудного трансплантата УФ-излучением и погружения в 30% этанол не такой строгий, как стерилизация электроспылнущих трансплантатов, подготовленных для исследований in vivo, которые часто стерилизуются окисью этилена или гамма-облучением, этого достаточно для экспериментов in vitro, которые могут длиться до 20 дней без каких-либо признаков загрязнения (например, см. Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6и Ван Хаафтен и Виссинг (2020)^44). Более того, материал PCL-BU, который здесь используется, не допускает длительного воздействия высоких концентраций этанола. Наиболее подходящий метод стерилизации может быть выбран в зависимости от используемого материала.

В дополнение к результатам ранее выполненных совместных исследований, более широкий спектр исследований может быть выполнен с одной и той же системой. Система ранее использовалась для выполнения динамических монокультур миофибробластов(дополнительный рисунок 1A–B)и макрофагов(дополнительный рисунок 1C–D)для исследования влияния гемодинамической нагрузки на отдельные типы клеток и их паракринные передачи сигналов^19,43. Различные режимы гемодинамической нагрузки приводили к четкой ориентации актиновых волокон в миофибробластах(дополнительный рисунок 1А)и отчетливо различному отложению коллагена(дополнительный рисунок 1B)через 10 дней. Производство цитокинов макрофагами, полученными из THP1, резко различалось между различными гемодинамическими нагрузками(дополнительный рисунок 1C)и показало более провоспалительный профиль принагрузке (дополнительный рисунок 1D). Другие проверенные возможности включают применение колебательного потока с использованием дополнительного насоса и жидкостного блока. Вязкость среды может быть увеличена в сторону диапазона вязкости крови (например, путем добавления ксантановой камеди)^69. Модуляция вязкости среды представляет собой дополнительную переменную для расширения диапазона применимых напряжений сдвига. Наконец, хотя в описанном протоколе используется установка кондиционирования потока «Ibidi», могут также использоваться установки других производителей, если могут применяться аналогичные режимы потока.

Одним из основных преимуществ использования этой системы биореактора является относительно большая конструкция (приблизительно 15 мм х 10,5 мм), которая может быть гемодинамически загружена, что позволяет извлекать широкий спектр возможных параметров считывания из одного образца. В то же время размер конструкции также может рассматриваться как ограничение, поскольку эта установка требует относительно большого количества (иногда дорогостоящего) материала, особенно если используются первичные клетки или если культуральная среда требует дорогостоящих добавок. Кроме того, пропускная способность установки относительно низкая. Следовательно, нынешняя установка особенно подходит для исследований, основанных на гипотезах, в которых всесторонне проверяется ограниченное число переменных, а не для скрининга большого количества переменных с ограниченным считыванием. Для будущих экспериментов вносятся небольшие улучшения в текущую установку, чтобы обеспечить возможность монтажа меньших лесов и уменьшения размера средних резервуаров. Что касается последнего, то текущий объем резервуаров среды необходим для обеспечения достаточных объемных скоростей потока для достижения желаемых напряжений сдвига. Требуемые скорости потока, а вместе с тем и объем резервуаров среды, могут быть уменьшены за счет увеличения вязкости среды (например, путем добавления ксантановой камеди, как было установлено^{ранее 69).}

В заключение, этот биореактор позволяет количественно оценить индивидуальное и комбинированное воздействие напряжения сдвига и циклического растяжения на рост и ремоделирование тканей на широком спектре эластомерных 3D-биоматериальных каркасов. Биореактор может культивировать до восьми сосудистых конструкций при различных условиях нагрузки. Благодаря своей конструкции биореактор особенно подходит для изучения взаимодействия между гемодинамикой и процессами IN situ сосудистого ТЭ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM)	Gibco	12491-015	cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil	Julabo	8940012	prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin	Sigma	T4648	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge	Eppendorf	5804	to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor - "kelly forceps"	Almedic	P-422	clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators	Sanyo	MCO-170AIC-PE	for cell culturing
Compressed air reservoir	Festo	CRVZS-5	smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches	Matlab	R2017. The Mathworks, Natick, MA	calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board	National Instruments	BNC-2090	data processing in between amplifier system and computer
Ethanol	VWR	VWRK4096-9005	to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS)	Greiner	758087	cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet	Assistant	HE40567002	apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber	Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology	n.a.	part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax	Gibco	35050061	cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera	MotionScope	M-5	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens	Nikon	JAA616AB	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip	ibidi GmbH	10821	block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads	ibidi GmbH	10902	set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)	Swann Morton	0301; 0933	to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software	National Instruments	version 2018	to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light	Labconco	302310001	to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes	Greiner	664-160	for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)	Sigma	A8960	cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500	Zeiss	Schott AG	to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps	ibidi GmbH	various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)	to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS)	PEEKEL instruments B.V.	n.a.	to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders	ibidi GmbH	10974	medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter	Rubber BV	1805	to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software	Idtvision	2.15.00	to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G)	BD Microlance	301700	together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver	Adson	2429218	to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues	Kleenex	38044001	for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S)	Lonza	DE17-602E	cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps	Greiner	206202	to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder	Festo	AEVC-20-10-I-P	to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length)	SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands	n.a.	produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control)	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer	BD	TC-XX and P 10 EZ	the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor	Festo	MPPES-3-1/8-2-010, 159596	provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)	Gibco	A1049101	cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)	Eppendorf	30120086	multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20%	Sigma	5030	Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.
Silicone O-rings	Technirub	1250S	to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)	Rubber BV	1805	to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL)	Falcon	352095	multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle	Ethicon, Johnson&Johnson	EH7404H	Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL)	B. Braun Melsungen AG	2057932	to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm)	Satorius	17597-K	to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap	Nunc	178983	to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap	Nunc	156499	to culture static control samples
Teflon bellow	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel)	PolarWare	15-248	for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers	Wironit	4910	sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water	Stakpure	Omniapure UV 18200002	to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light	Philips	TUV 30W/G30 T8	for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding