Een multi-cue bioreactor om de inflammatoire en regeneratieve capaciteit van biomaterialen onder flow en stretch te evalueren

Summary

Het doel van dit protocol is om een dynamische co-cultuur van menselijke macrofagen en myofibroblasten in buisvormige elektrospunsteigers uit te voeren om materiaalgestuurde weefselregeneratie te onderzoeken, met behulp van een bioreactor die het ontkoppelen van schuifspanning en cyclische rek mogelijk maakt.

Abstract

Het gebruik van resorbeerbare biomaterialen om regeneratie direct in het lichaam te induceren is een aantrekkelijke strategie vanuit een translationeel perspectief. Dergelijke materialen induceren een ontstekingsreactie bij implantatie, die de oorzaak is van daaropvolgende resorptie van het materiaal en de regeneratie van nieuw weefsel. Deze strategie, ook bekend als in situ tissue engineering, wordt nagestreefd om cardiovasculaire vervangingen zoals weefsel-engineered vasculaire grafts te verkrijgen. Zowel de ontstekings- als de regeneratieve processen worden bepaald door de lokale biomechanische signalen op de steiger (d.w.z. rek- en schuifspanning). Hier beschrijven we in detail het gebruik van een op maat ontwikkelde bioreactor die op unieke wijze het ontkoppelen van rek- en schuifspanning op een buisvormige steiger mogelijk maakt. Dit maakt een systematische en gestandaardiseerde evaluatie mogelijk van het ontstekings- en regeneratieve vermogen van buisvormige steigers onder invloed van goed gecontroleerde mechanische belastingen, wat we aantonen op basis van een dynamisch co-cultuurexperiment met menselijke macrofagen en myofibroblasten. De belangrijkste praktische stappen in deze aanpak - de bouw en het opzetten van de bioreactor, de voorbereiding van de steigers en het zaaien van cellen, het aanbrengen en onderhouden van rek- en afschuifstroom en het oogsten van monsters voor analyse - worden in detail besproken.

Introduction

Cardiovasculaire weefseltechniek (TE) wordt nagestreefd als een alternatieve behandelingsoptie voor de momenteel gebruikte permanente cardiovasculaire prothesen (bijv. vasculaire grafts, hartklepvervangingen), die suboptimaal zijn voor grote cohorten van patiënten^1,2,3,4. Veelgevraagde toepassingen zijn weefselgeïnjeneerde vasculaire grafts (TEVGs)^5,6 en hartkleppen (TEHVs)^7,8. Meestal maken cardiovasculaire TE-methodieken gebruik van resorbeerbare biomaterialen (natuurlijk of synthetisch) die dienen als een leerzame steiger voor het nieuwe weefsel dat moet worden gevormd. De vorming van nieuw weefsel kan volledig in vitro worden ontworpen, door de steiger met cellen te zaaien en te cultiveren in een bioreactor voorafgaand aan implantatie (in vitro TE)^9,10,11, of direct in situ, waarbij de synthetische steiger wordt geïmplanteerd zonder voorkweek om de vorming van nieuw weefsel rechtstreeks in het lichaam te induceren (in situ TE)^12,13,14. Voor zowel in vitro als in situ cardiovasculaire TE-benaderingen is succesvolle functionele regeneratie dominant afhankelijk van zowel de immuunrespons van de gastheer op de geïmplanteerde constructie als de juiste biomechanische belasting.

Het belang van biomechanische belasting voor cardiovasculaire TE wordt algemeen erkend¹⁵. In het geval van cardiovasculaire implantaten worden de cellen die de steiger bevolken blootgesteld aan cyclische rek- en schuifspanningen die ontstaan als gevolg van de hemodynamische omgeving. Talrijke studies hebben het stimulerende effect van (cyclische) rek op de vorming van matrixcomponenten, zoals collageen^{16, 17,18,19,}glycosaminoglycanen (GAGs)²⁰, en elastine^21,22, door verschillende celtypen gerapporteerd. Huang et al. toonden bijvoorbeeld aan dat biaxiale stretch de afzetting en organisatie van collageen en elastine in in vitro TEVGs verhoogde met behulp van een vasculaire bioreactor²³. Hoewel de nadruk meestal ligt op rek als dominante belasting, maken deze studies vaak gebruik van door debiet aangedreven bioreactoren waarin het monster ook wordt blootgesteld aan afschuifstroom. Hoewel er relatief weinig bekend is over de geïsoleerde invloed van afschuifspanningen op weefselvorming en ontsteking in 3D, zijn er enkele gegevens beschikbaar. Zo toonden Hinderer et al. en Eoh et al. aan dat afschuifstroom, naast een 3D steigermicrostructuur, belangrijk was voor de vorming van volwassen elastine door menselijke vasculaire gladde spiercellen in een in vitro modelsysteem^24,25. Al met al illustreren deze bevindingen de relevantie van zowel cyclische rek- als afschuifspanning voor cardiovasculaire TE.

Een andere belangrijke bepalende factor voor het succes of falen van TE-implantaten is de immuunrespons van de gastheer op de geïmplanteerde^{ent 26}. Dit is met name belangrijk voor materiaalgestuurde TE-strategieën in situ, die eigenlijk afhankelijk zijn van de acute ontstekingsreactie op de steiger om de daaropvolgende processen van cellulaire instroom en endogene weefselvorming en remodellering op gang te brengen²⁷. De macrofaag is een kritische initiator van functionele weefselregeneratie, wat is aangetoond door meerdere studies^28,29,30. Analoog aan wondgenezing wordt de regeneratie van weefsel geregeld door paracrinesignalering tussen macrofagen en weefselproducerende cellen zoals fibroblasten en myofibroblasten^31,32,33. Naast het coördineren van nieuwe weefseldepositie zijn macrofagen betrokken bij de actieve resorptie van vreemd steigermateriaal^34,35. Als zodanig is de in vitro macrofaagrespons op een biomateriaal geïdentificeerd als een voorspellende parameter voor het in vivo succes van implantaten^36,37,38.

De macrofaagrespons op een geïmplanteerde steiger is afhankelijk van steigerontwerpkenmerken zoals materiaalsamenstelling en microstructuur^35,39,40. Naast steigereigenschappen wordt ook de macrofaagrespons op een steiger en hun overspraak met myofibroblasten beïnvloed door hemodynamische belastingen. Cyclische stretch bleek bijvoorbeeld een belangrijke modulator te zijn van macrofaagfenotype^41,42,43,44 en de afscheiding van cytokinen^43,44,45,46 in 3D-elektrospunsteigers. Battiston et al. toonden met behulp van een co-kweeksysteem van macrofagen en vasculaire gladde spiercellen aan dat de aanwezigheid van macrofagen leidde tot verhoogde niveaus van elastine en GAG's en dat matige niveaus van cyclische stretch (1,07-1,10) de afzetting van collageen I en elastine⁴⁷stimuleerden . In eerdere werken hebben we aangetoond dat schuifspanning een belangrijke determinant is voor monocytwerving in 3D-elektrospunsteigers^48,49, en dat zowel schuifspanning als cyclische rek de paracrinesignalering tussen menselijke monocyten en mesenchymale stromale cellen^{beïnvloeden 50}. Fahy et al. toonden aan dat de afschuifstroom de afscheiding van pro-inflammatoire cytokinen door menselijke monocyten verhoogde⁵¹.

Al met al toont het bovenstaande bewijs aan dat een adequaat begrip van en controle over hemodynamische belastingen cruciaal is voor cardiovasculaire TE, en dat het belangrijk is om de ontstekingsreactie te overwegen om dit te bereiken. Talrijke bioreactoren zijn eerder beschreven voor de in vitro^{52,53,54,55,56,57,58} of ex vivo^59,60,61 kweek van cardiovasculaire weefsels. Al deze systemen zijn echter ontworpen om de fysiologische hemodynamische belastingsomstandigheden zoveel mogelijk na te bootsen. Hoewel dit zeer waardevol is voor het creëren van cardiovasculaire weefsels in vitro of het handhaven van ex vivo-culturen, maken dergelijke systemen geen systematisch onderzoek naar de individuele effecten van individuele signalen mogelijk. Dit komt omdat de toepassing van zowel cyclische rek- als schuifspanning in deze bioreactoren wordt aangedreven door dezelfde drukstroom, die ze intrinsiek verbindt. Hoewel microsystemen die nauwkeurige multi-cue mechanische manipulatie mogelijk maken, zijn beschreven voor 2D-substraten⁶² of 3D-hydrogelopstellingen^63,64, maken dergelijke opstellingen het niet mogelijk om elastomeer 3D-biomateriaalsteigers op te zetten.

Hier presenteren we de toepassing van een buisvormig bioreactorsysteem dat op unieke wijze de ontkoppeling van schuifspanning en cyclische rek mogelijk maakt en helpt om hun individuele en gecombineerde effecten mechanistisch te onderzoeken. Dit systeem maakt het mogelijk om een breed scala aan weefselgeënskundig vasculaire grafts te testen (bijv. synthetische of natuurlijke oorsprong, verschillende micro-architectuur, verschillende porositeiten). Om de toepassing van afschuifspanning en rek effectief los te ontkoppelen, zijn de belangrijkste concepten die de bioreactor gebruikt (1) scheiding van de controle van schuifspanning en rek met behulp van verschillende pompsystemen en (2) stimulatie van de steigers op een 'inside-out' manier met rekengestuurde afmetingen. Debiet wordt aangebracht op het buitenoppervlak van de buissteiger door het gebruik van een stromingspomp, terwijl de omtrek van de steiger wordt veroorzaakt door het uitzetten van een siliconenbuis waarop de steiger is gemonteerd door het gebruik van een aparte stampomp. De afmetingen van de siliconenbuis en de glazen buis die de constructie bevat, worden zorgvuldig gekozen en gevalideerd met behulp van computationele vloeistofdynamicasimulaties, om ervoor te zorgen dat de schuifspanning op de steiger (als gevolg van stroming) en de omtrekspanning (als gevolg van buisuitbreiding) elkaar niet significant beïnvloeden. Dit inside-out ontwerp heeft verschillende praktische redenen. Als stretch wordt toegepast door de lichtgevende vloeistofdruk (vergelijkbaar met fysiologische belasting), vereist dit inherent dat het monsterontwerp lekvrij is. Bovendien zou de druk die nodig is om het monster uit te rekken volledig worden bepaald door de stijfheid van het monster, die in de loop van de tijd tussen de monsters en binnen een monster kan variëren, waardoor het moeilijk is om de rek te controleren. Deze bioreactor monteert het weefsel ontworpen transplantaat rond een siliconenbuis en maakt het mogelijk om muurschaarspanning (WSS) aan te brengen op de buitenwand van de graft en zet de ent van binnenuit onder druk. Op deze manier kunnen gelijke belastingsomstandigheden tussen monsters en binnen monsters in de loop van de tijd worden gegarandeerd, en bovendien mogen de monsters lekken, zoals gebruikelijk is voor poreuze vasculaire steigers¹⁹. Deze inside-out bioreactor is specifiek bedoeld voor systematisch onderzoek naar de effecten van afschuiven en/of rekken, in plaats van de engineering van een native-achtig bloedvat in vitro, waarvoor traditionele vasculaire bioreactoropstellingen geschikter zijn. Zie figuur 1A–B voor de ontwerptekeningen van de bioreactor en de bijbehorende tabel 1 voor een functionele beschrijving en motivering achter de belangrijkste componenten van de bioreactor.

Het gebruik van de bioreactor wordt aangetoond op basis van een reeks recente studies van onze groep waarin we de individuele en gecombineerde invloeden van schuifspanning en cyclische rek op ontsteking en weefselvorming in resorbeerbare elektrospunsteigers voor in situ cardiovasculair weefsel^19,43,44onderzochten . Daartoe gebruikten we menselijke macrofagen en myofibroblasten in mono- of in co-cultuur om de verschillende fasen van de regeneratieve cascade in situ te simuleren. We hebben aangetoond dat cytokinesecretie door menselijke macrofagen duidelijk wordt beïnvloed door zowel cyclische rek- als schuifspanning, die de matrixdepositie en organisatie door menselijke myofibroblasten in deze steigers beïnvloedt, zowel via paracrinesignalering als direct contact^19,43,44. Met name deze studies toonden aan dat in het geval van gecombineerde toepassing van afschuifspanning en rek, de effecten op weefselvorming en ontsteking worden gedomineerd door een van de twee belastingen, of dat er synergetische effecten van beide belastingen zijn. Deze bevindingen illustreren de relevantie van het ontkoppelen van beide belastingen om een beter inzicht te krijgen in de bijdrage van de mechanische omgeving aan TE-processen. Dit begrip kan worden toegepast om steigerontwerpparameters systematisch te optimaliseren in relevante hemodynamische belastingsregimes. Bovendien kunnen de mechanistische gegevens uit dergelijke goed gecontroleerde omgevingen dienen als input voor numerieke modellen die worden ontwikkeld om het verloop van in situ weefselremodellering te voorspellen, zoals onlangs gerapporteerd voor TEVGs⁶⁵ of TEHVs⁶⁶, om de voorspellende capaciteit verder te verbeteren.

Protocol

In de studies die in dit protocol worden beschreven, zijn primaire menselijke macrofagen geïsoleerd uit perifere bloedpoeljassen en menselijke myofibroblasten geïsoleerd uit de sapheneuze ader na coronaire omleidingsoperaties gebruikt⁴⁴. De buffy jassen werden verkregen van gezonde, geanonimiseerde vrijwilligers die schriftelijke geïnformeerde toestemming gaven, die werd goedgekeurd door de Sanquin Research Institutional Medical Ethical Committee. Het gebruik van menselijke vena saphena cellen (HVSC's) was in overeenstemming met de "Code Proper Secondary Use of Human Tissue" ontwikkeld door de Federatie van Medische Verenigingen (FMWV) in Nederland.

1. Algemene voorbereidingen en vereiste acties voor het opzetten van de bioreactor

OPMERKING: Voor meer informatie over de respectieve isolatie- en cultiveringsprotocollen verwijzen wij u naar eerder werk^19,43,44. Alle berekeningen in het protocol worden gegeven als voorbeelden voor een co-kweekexperiment met monocyten en myofibroblasten, gezaaid in 8 hemodynamisch geladen steigers en 2 statische controles (n=10).

1. Start celisolatie en celkweek. De zaaidichtheden voor de co-gekweekte monsters van monocyten en myofibroblasten (met een zaaiverhouding van 2:1) zijn respectievelijk 30 × 10⁶ monocyten/cm³ en 15 × 10⁶ myofibroblasten/cm^3.
   OPMERKING: Het elektrospunmateriaal heeft een hoge porositeit (>90%). Om het vereiste aantal cellen per ent te schatten, wordt het volume van de steiger berekend met de formule voor het volume van een holle cilinder: π *(dikte)²*lengte ≈ 0,04 cm³. De totale hoeveelheid cellen per ent is 1,2 × 10⁶ monocyten en 0,6 × 10⁶ myofibroblasten. Voor 10 monsters zijn ten minste 12 × 10⁶ monocyten en 6 × 10⁶ myofibroblasten vereist; start met maximaal ~10-15% meer cellen om rekening te houden met mogelijke pipetteerfouten.
2. Ontgast het celkweekmedium dat zal worden gebruikt voor experimenten met de bioreactor.
   1. Bereid het medium voor op coculturen, dat bestaat uit RPMI-1640:aDMEM (1:1), aangevuld met 10% foetale runderserum, 1% penicilline-streptomycine en 0,5% L-glutamine.
   2. Plaats het medium 's nachts (O/N) in een incubator in een celkweekkolf met filterdop om te ontgassen.
   3. Vervang de filterdop door een luchtdichte dop en bewaar deze bij 4 °C.
   4. Voeg vlak voor gebruik 0,25 mg/ml L-ascorbinezuur 2-fosfaat (vitamine C) toe aan het medium.
      OPMERKING: Voor berekeningen is de benodigde hoeveelheid medium per debietkkamer 50 ml. Ververs het medium drie keer per week; 25 ml oud medium wordt vervangen door 25 ml vers medium. Voor 10 monsters; na het zaaien is in totaal 500 ml vers medium vereist en voor elke volgende mediumverandering wordt in totaal 250 ml vers medium gebruikt. Bereid medium altijd vers, vooral vitamine C moet worden toegevoegd net voordat het medium wordt vervangen.
3. Bereid isotrope elektrospunsteigers (3 mm luminal diameter, 200 μm wanddikte) voor zoals beschreven door Van Haaften et al.¹⁹ (Figuur 1G–I). Kortom, buisvormige polycaprolacton bisurea (PCL-BU) steigers worden geproduceerd door elektrospinning van 15% (m/w) chloroform-polymeer oplossingen. De polymeeroplossingen zijn elektrospun bij kamertemperatuur en 30% relatieve vochtigheid, bij een debiet van 40 μL/min, 16 cm afstand van het roterende cilindrische doel (Ø 3 mm, 500 tpm), en een toegepaste spanning van 16 kV op het elektrospinningmondstuk en -1 kV op het doel.
   OPMERKING: Hoewel PCL-BU-grafts voor deze experimenten werden gebruikt, kan in deze bioreactor een grote verscheidenheid aan elastomeerweefsel-engineered grafts worden gemonteerd (bijv. van verschillende synthetische of natuurlijke oorsprong, verschillende microarchitectuur, verschillende porositeiten)
   1. Verwijder de elektrospunsteigers van de doorn.
      1. Maak een klein gaatje in de dop van een buis van 15 ml om de doorn in het midden te 'houden' en te voorkomen dat deze de wand van de buis raakt.
      2. Plaats de doorn met de elektrospunsteiger in de valkbuis en vul deze met gedeioneerd water.
      3. Vries de buizen O/N in bij -20 °C.
      4. Plaats de buizen op kamertemperatuur (RT) en trek de mandrels na een paar minuten eruit, waarbij de elektrospuntransplantaten in het ijs achterblijven.
      5. Laat het ijs volledig ontdooien, haal de elektrospunbuis uit het ontdooide water en 'hang' om enkele uren verticaal te drogen. Zorg ervoor dat de steigers niet onder hun eigen gewicht 'instorten'.
   2. Droge steigers onder vacuüm O/N.
   3. Afbeelding van een klein monster van de elektrospuntransplantaten met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) om hun microstructuur te beoordelen (bijv. vezelmorfologie, vezeldiameter). De grafts in de voorbeeldstudies hebben een isotrope vezeloriëntatie en een vezeldiameter van 5 μm (figuur 1H–I).
4. Plaats een dag voor aanvang van het experiment het hydraulische reservoir gevuld met gedeioneerd water in de incubator. Sluit alle acht aansluitingen voor flowcultuurkamers met witte Luer caps. Sluit aan op het persluchtsysteem en plaats de druksensor. Laat de trekpomp draaien (zie stap 5.6) O/N om een kleine uitzetting van de Teflon balg mogelijk te maken.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat alle benodigde materialen en apparatuur worden gereinigd en/of geautoclaveerd (zie tabel met materialen, opmerkingen/beschrijving kolom voor welke materialen mogen worden geautoclaveerd), volgens het protocol van de fabrikant of zoals beschreven in stap 7.3–7.6.
5. Zorg voor steriele werkomstandigheden voor de rest van het protocol.
   1. Voer stap 2–5.3 (het opzetten van het systeem), stap 6.3 (medium change) en stap 7.1–7.2 (oogst van vasculaire constructies) uit in een steriele laminaire stroomkast.
   2. Plaats materialen die niet direct nodig zijn voor de volgende stappen in gesloten Petrischalen om alles zo schoon mogelijk te houden.
   3. Reinig of droog materiaaloppervlakken regelmatig door een papieren tissue te weken met 70% ethanol en veeg de oppervlakken van de bioreactorcomponenten en de laminaire stroomkast af.

2. Het opzetten van de bioreactor

OPMERKING: Voer stap 2 uit in een laminaire stromingskast.

1. Snijd de elektrospunsteigers in buizen met een lengte van ongeveer 25 mm en documenteer ze voor gebruik (bijv. foto voor de lengte, weeg met balans voor de beginmassa).
2. Ontsmet de elektrospun steigers.
   1. Plaats de elektrospunsteigers gekanteld in een putplaat of petrischaal, met één opening naar de ultraviolette (UV) lichtbron gericht, zodat UV-licht (253,7 nm) de binnenkant van de steigers kan verlichten.
   2. Stel de elektrospunsteigers gedurende 5 minuten bloot aan UV-licht.
   3. Draai alle steigers en herhaal de UV-verlichting voor de andere opening.
      OPMERKING: Raak na deze stap alleen de elektrospunsteiger aan wanneer dat nodig is. Gebruik altijd een schoon pincet of schone handschoenen.
   4. Neem de glazen buizen van de stromingscultuurkamers die voor 70% zijn opgeslagen, was de glazen buizen in ultrapure water, droog en plaats ze in een grote, gesloten petrischaal.
      OPMERKING: De volgende stappen, met name de stappen 2.3–2.5, worden idealiter uitgevoerd door twee experimenteerders.
3. Monteer de elektrospun steigers op de siliconen slang.
   1. Bevestig de 5-0 proleen hechtdraad aan het ene uiteinde van de siliconenslang door de hechtdraad door de ene kant van de buis en de andere kant te halen, waardoor twee tegenover elkaar liggende strakke hechtingen over de doorsnede van de slang blijven. Maak een kleine knoop aan beide zijden van de buis terwijl u de buis op de locus van de knopen samendrukt en laat ongeveer 10 cm draad achter op beide knopen. Maak een derde knoop aan het einde van de twee overgebleven draden van 10 cm.
      1. Snijd de hechtnaald en alle vrije draden af die kunnen uitsteken en de binnenkant van de elektrospunsteiger kunnen beschadigen. Snijd de randen van de siliconenslang weg in een driehoekige vorm om te helpen bij het trekken van de siliconenslang door de elektrospunsteiger.
   2. Dompel de elektrospunsteiger in 30% ethanol (dit dient als extra ontsmettingsstap en helpt bij het schuiven van de elektrospunsteiger over de siliconenslang) en plaats de elektrospunsteiger over de vrije draad van 10 cm. Experimenteerder A rekt de siliconenslang uit door zachtjes aan zowel de siliconenslang als de knoop van de hechtdraad van 10 cm te trekken, terwijl experimenteerder B de elektrospunsteiger voorzichtig over de siliconenslang schuift met een pincet met een gladde binnentip om beschadiging van de steigers te voorkomen.
   3. Laat de stretch op de siliconenslang langzaam los, terwijl tegelijkertijd de elektrospunsteiger met een pincet wordt gladgestreken. Dompel de electrospun steiger twee keer in ultrapure water op de siliconen slang.
      OPMERKING: Het is mogelijk dat er wat rimpels van de elektrospunsteiger optreden. Dit rimpelen verdwijnt tijdens de aangebrachte pre-stretch vlak voordat de steigers aan de drukleidingen bij stap 2.5.3 worden bevestigd.
   4. Herhaal stap 2.3.2 en 2.3.3 voor de andere elektrospun steigers. Afhankelijk van de lengte van de siliconenslang kunnen meerdere elektrospun steigers op dezelfde siliconen buizen worden gemonteerd.
   5. Wanneer alle elektrospunsteigers op de siliconenslang zijn gemonteerd, snijdt u de siliconenslang rond de steigers, allemaal op dezelfde lengte (5,5 cm); aan de ene kant, dicht bij het einde van de elektrospun steiger, aan de andere kant, waardoor ~ 2-3 cm gratis siliconen buizen achterblijven.
4. Bouw het onderste compartiment van de stromingscultuurkamer (afbeelding 1A–B).
   1. Neem het bovenste deel van het onderste compartiment met het stroomuitlaat en sluit het stroomuitlaat met een mannelijke Luer-stekker.
   2. Duw de drukleiding met gaten door het onderste compartiment en plaats een siliconen O-ring rond het onderste uiteinde van de drukleiding om lekkage te voorkomen. Schroef het onderste deel van het onderste compartiment op het bovenste deel van het onderste compartiment om de drukleiding vast te zetten. Zorg ervoor dat de onderste gegraveerde groef van de drukleiding zich ongeveer 3-5 mm boven de rand van de adapterbus van het onderste compartiment bevindt; dit zal later de strakke knoop van de hechtdraad 'vasthouden' en de elektrospunsteiger over de siliconenslang bevestigen.
      OPMERKING: Als de drukleiding gemakkelijk op en neer kan worden gemanoeuvreerd, geeft dit aan dat het onderste compartiment niet goed is vastgezet. Herhaal stap 2.4.2 om lekkage in latere stadia te voorkomen (figuur 2D).
5. Bevestig de siliconen slang met de elektrospun steiger aan de drukleiding.
   1. Trek de siliconenbuis met de elektrospunsteiger over de drukleiding.
   2. Maak een knoop met de hechtdraad aan de onderkant van de elektrospunsteiger op de plaats van de gegraveerde groef op de drukleiding. Maak een tweede knoop aan de andere kant om de siliconen slang stevig vast te zetten met de elektrospuntransplantaat.
      LET OP: Dit is een cruciale stap. Zorg ervoor dat de knoop precies in de gegraveerde groef van de drukleiding 'valt' om lekkage van het water van het hydraulische reservoir naar de stromingscultuurkamers te voorkomen. Als u het niet zeker weet, probeer dan de hechtdraad op verschillende posities, boven of onder de verwachte locatie van de groef, aan te draaien om ervoor te zorgen dat de laatste knopen zich precies op de gegraveerde groef bevinden (figuur 2A).
   3. Plaats de schaarklem aan de bovenkant van de siliconenbuis en strek de siliconenslang naar boven (dit zal de eerste knoop direct testen, als het mogelijk is om de siliconenslang met de elektrospunsteiger over de drukleiding te bewegen, werd deze niet goed genoeg vastgedraaid). Met de trekkracht wordt de siliconen slang voorgespannen. Om ervoor te zorgen dat de siliconenslang consistent is tussen de verschillende monsters, bevestigt u een liniaal aan de schaarklem. Trek de schaarklem omhoog totdat het onderste uiteinde van de liniaal de hoogte van het onderste uiteinde van de steiger bereikt.
      OPMERKING: Het is belangrijk om de pre-stretch in elk monster ongeveer hetzelfde te houden (~ 5%) om twee redenen: (1) als siliconenbuizen vooraf worden uitgerekt, zal dit resulteren in een homogenere uitzetting over de lengte van het monster wanneer het onder druk staat; (2) de pre-stretch zal van invloed zijn op de mechanische eigenschappen van de siliconen, daarom moet deze voor alle monsters hetzelfde zijn om gelijke rekomstandigheden tussen de monsters te garanderen.
   4. Verwijder rimpels in de elektrospun steiger door voorzichtig aan de elektrospun steiger te trekken. Nogmaals, maak twee knopen aan beide zijden met een hechtdraad aan de bovenkant van de steiger op de plaats van de bovenste gegraveerde groef op de drukleiding.
   5. Laat de schaarklem los en snijd het teveel aan siliconenslangen weg met een mes, waarbij 20-30% van de schroefdraad bedekt is met siliconenslangen, om lekkage te voorkomen wanneer de neuskegel op de schroefdraad is gemonteerd.
      OPMERKING: Herhaal stap 2.4 en 2.5 voor alle dynamische monsters.
   6. Voor de statische controlemonsters bevestigt u de elektrospunsteiger die op de siliconenslang is gemonteerd op drukleidingen zonder gaten. Deze leidingen kunnen tot het zaaien (stap 4) apart in een buis van 15 ml worden bewaard en hoeven niet in de compartimenten van de stromingscultuurkamer te worden gemonteerd.
6. Ontsmet de gedeeltelijk geconstrueerde stromingscultuurkamers met elektrospunsteiger door deze gedurende 10 minuten aan UV-licht bloot te stellen. Draai de stromingscultuurkamers met elektrospunsteigers naar de andere kant en herhaal de blootstelling aan UV-licht gedurende 10 minuten.
7. Schroef de neuskegels op de schroefdraad van de drukleidingen met gaten voor de dynamische monsters.
   1. Zorg ervoor dat de bovenkant van de siliconenslang in de neuskegel past om lekkage in latere stadia te voorkomen. Als er te veel siliconenslangen zijn, snijdt u het teveel aan slangen weg met een mes.
   2. Plaats de deels geconstrueerde stromingscultuurkamers in een grote petrischaal en richt de neuskegel naar de UV-lichtbron. Breng UV-verlichting gedurende 5 minuten aan.
8. Volledige constructie van de stromingscultuurkamer met de glazen buis en het bovenste compartiment van de stromingscultuurkamer (afbeelding 1A–B).
   1. Maak de elektrospunsteigers voorbespookt door de drukleiding met de siliconenslang en de elektrospunsteiger in 30% ethanol te dompelen, gevolgd door een duik in ultrapure water twee keer.
   2. Plaats de glazen buis over de drukbuis en duw voorzichtig in het onderste compartiment en zet deze voorzichtig vast.
   3. Neem het bovenste compartiment met de stroominlaat, plaats een siliconen O-ring, de stromingsser en de adapterbus in de juiste volgorde (afbeelding 1A–B), en plaats deze over het open uiteinde van de glazen buis en zet deze voorzichtig vast.
   4. Schroef een witte Luer dop op de flow inlaat van het bovenste compartiment.
   5. Verwijder de mannelijke Luer-stekker uit de stroomuitlaat van het onderste compartiment en reinig het oppervlak eromheen met een met ethanol doordrenkt papierweefsel.
   6. Plaats een spuit met 10 ml ultrapure water in de stroomuitlaat, open de witte Luer-dop op het bovenste compartiment en vul de kamer met ultrapure water. Sluit de witte Luer-dop opnieuw, verwijder de spuit, reinig opnieuw met ethanol en sluit de stroomuitlaat met een mannelijke Luer-stekker.
      OPMERKING: Herhaal stap 2.6–2.8 voor alle stromingscultuurkamers.
   7. Voeg voor de statische regelaars 10 ml ultrapure water toe aan de buizen van 15 ml die de monsters op de drukleidingen zonder gaten houden.
9. Plaats alle flow kweekkamers in de incubator. Vervang het ultrapure water een dag voor het zaaien van cellen door kweekmedium op dezelfde manier als beschreven in stap 2.8.5 en 2.8.6 (zorg ervoor dat u het 'oude' ultrapure water opvangt met een met ethanol doordrenkt papierweefsel dat direct op de stroomuitlaat wordt geplaatst).

[Het protocol kan hier worden onderbroken]

3. Voorbereidingen voor de installatie van de debietpomp

OPMERKING: Voer stap 3 uit in een laminaire stromingskast.

1. Verzamel alle pompopstellingsmaterialen en bereid u voor op gebruik.
   OPMERKING: Experimenteerders worden verwezen naar het protocol van de fabrikant voor een gedetailleerde beschrijving van het instellen van de pomp, de vloeistofeenheden en de medium tubing door de kleppen van de vloeistofeenheid.
   1. Stel de pomp in op 200 mbar capaciteit.
   2. Schroef de reservoirhouders voor reservoirs van 60 ml op de vloeistofunits.
   3. Reinig de herbruikbare rubberen luchtfilters met een papierdoekje gedrenkt in ethanol, zorg ervoor dat het luchtfilter droog blijft.
2. Plaats de reservoirs van 60 ml in de reservoirhouders en plaats de standaard medium slang door de kleppen van de vloeistofeenheid. Verbind de medium slang met een grotere binnendiameter met vrouwelijke Luer slotkoppelingen in een gesloten lus.
3. Klem de medium slang vast met een slangklem, direct onder de reservoirs.
4. Vul de reservoirs met 25 ml kweekmedium per reservoir van 60 ml. Laat de slangklem los en laat het medium in de slang komen.
5. Sluit de medium reservoirs met de rubberen luchtfilters en plaats de stromingspompopstelling in de incubator tot stap 4.

4. Cel zaaien met behulp van Fibrin als celdrager

OPMERKING: Voer stap 4 uit in een laminaire stromingskast.

1. Bereid de fibrinegel voor op de celzadingstap. Zie Mol et al.⁶⁷ Voor de fibrinegel moet de fibrinogeenoplossing een eindconcentratie van 10 mg/ml hebben (correct voor de zuiverheid van de eiwitvoorraad) en moet de trombineoplossing een eindconcentratie van 10 U/ml hebben.
   1. Ontdooi fibrinogeen tot RT, voordat u ~50 mg (genoeg voor 10 monsters) weegt in een plastic container met een rood deksel.
   2. Voeg celkweekmedium toe om de fibrinogeenoplossing te bereiden (bij een concentratie van 10 mg/ml, correct voor de zuiverheid van de eiwitvoorraad). Meng goed en filtreer om de fibrinogeenoplossing te steriliseren met een spuitfilter van 0,2 μm in een steriele buis van 15 ml. Houd de gefilterde fibrinogeenoplossing op ijs.
      OPMERKING: Vermijd het te lang van tevoren bereiden van de fibrinogeenoplossing, anders kan het fibrinogeen spontaan stollen.
   3. Ontdooi trombine en maak een trombineoplossing (bij een concentratie van 10 U/ml) in celkweekmedium en plaats op ijs. Bereid 20 μL trombine + cellenoplossing per monster. Voor n=10 monsters is 200 μL nodig; bereid daarom 250 μL trombineoplossing voor om mogelijke pipetfouten te verklaren.
2. Verzamel en tel de cellen uit de kweekkolven. Meng de cellen in de gewenste verhouding en hoeveelheid (1,2 × 10⁶ monocyten en 0,6 × 10⁶ myofibroblasten per steiger). Zorg ervoor dat er voldoende cellen zijn voor n+1-monsters om te corrigeren voor pipetfouten. Centrifugeer op 350 × g gedurende 10 min bij RT. Verwijder het supernatant.
3. Maak een mengsel van de gesuspendeerde cellen en trombine.
   1. Gebruik voor elk monster 20 μL van de trombineoplossing. Voeg voor n=10 monsters 200 μL trombine toe aan de celkorrel en meng. Meet het volume van de celsuspensie (cellen + trombine) en bereken hoe de cel gelijkmatig over alle 10 steigers moet worden verdeeld (bijv. als de trombine + celsuspensie een volume van 260 μL heeft, ontvangt elk elektrospunmonster 260 μL/10 monsters = 26 μL trombine + celsuspensie).
   2. Terwijl het zaaien van de steigers in twee stappen wordt uitgevoerd, bereidt u twee microfugebuizen van 1,5 ml voor die de helft van de celophanging voor elke steiger bevatten (in de voorbeeldberekening van de vorige stap: bereid twee buizen voor met 13 μL trombine + celsuspensie). Plaats op ijs.
      OPMERKING: De volgende stappen, met name stap 4.4, worden idealiter uitgevoerd door twee experimenteerders.
4. Droog de voorge bevochtigde elektrospunsteigers met vacuüm om zich voor te bereiden op het zaaien van cellen.
   1. Sluit een glazen Pasteur-pipet aan op het vacuümsysteem van de laminaire stromingskast en plaats deze in een lege buis van 50 ml voor steriele tijdelijke opslag.
   2. Haal de stromingskweekkamers uit de incubator, verwijder de mannelijke Luer-stekker uit de stroomuitlaat en verwijder het medium na het openen van de witte Luer-dop en het plaatsen van een met ethanol doordrenkt papierweefsel voor de stroomuitlaat.
   3. Haal het bovenste compartiment en de glazen buis eraf en plaats het in een steriele petrischaal voor tijdelijke opslag.
   4. Plaats de vacuüm Pasteur pipet op de elektrospun steiger en verwijder zoveel mogelijk medium.
      LET OP: Droog de elektrospun steiger zeer voorzichtig. Plaats de vacuümpijp op meerdere plaatsen in plaats van een heen en weer lineaire beweging over de steiger. Klem de vacuümslang bovenop de pipet van de Pasteur tussen de vingers voor een betere controle.
   5. Meng de fibrinogeenoplossing in een verhouding van 1:1 met de trombine + celsuspensie (meng bijvoorbeeld 13 μL fibrinogeen met 13 μL trombine + celsuspensie). Om ervoor te zorgen dat de fibrine polymeriseert in de steiger en niet in de microfuge buis, pipet de fibrinogeen, draai het pipet wiel voor het 'extra volume' van de trombine + cel suspensie, en pipet op en neer een keer in de microfuge buis met cel suspensie te mengen.
   6. Druppel de oplossing direct homogeen over de volledige lengte van de elektrospunsteiger. Het wordt geadviseerd dat Experimenter A het fibrinemengsel druppelt, terwijl experimenteerder B het onderste compartiment vasthoudt met de elektrospunsteiger gemonteerd op de drukleiding.
   7. Nadat de fibrine met de cellen over de elektrospunsteiger is gedruppeld, beweegt Experimenter B de steiger langzaam, van links naar rechts en op en neer, om de cellen verder gelijkmatig over de steiger te verdelen.
   8. Herhaal stap 4.4.5 - 4.4.7 aan de andere kant van de elektrospun steiger.
   9. Monteer de stromingscultuurkamer opnieuw door de glazen buis zorgvuldig te plaatsen (voorkom dat fibrine blijft plakken en stollen aan de binnenkant van de glazen buis) en duw het bovenste compartiment van de stromingscultuurkamer terug. Plaats de gezaaide constructie zonder medium of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) direct in de stromingscultuurkamer in de incubator.
   10. Herhaal stap 4.4.1–4.4.9 voor alle dynamische monsters. Voor de statische monsters die op drukleidingen zonder gaten zijn gemonteerd, moet u volgens de stappen 4.4.1-4.4.8 zaaien en daarna in een buis van 15 ml plaatsen.
   11. Laat de fibrine polymeriseren gedurende 60 minuten in de incubator.

[Het protocol kan hier 30-60 minuten worden onderbroken.]

5. Vul na polymerisatie de stromingscultuurkamers (dynamische monsters) of de 15 ml buizen (statische monsters) met medium.

5. Koppeling van de bioreactor- en debietpompsystemen voordat met het experiment wordt begonnen

OPMERKING: Voer stap 5.1–5.3 uit in een laminaire stromingskast.

1. Neem de lade met de stromingscultuurkamers en de vloeistofeenheden met gevulde medium reservoirs en aangesloten medium slangen in de laminaire stromingskasten.
2. Plaats de stromingskweekkamers op de bioreactorbasis voor de experimentele groepen die zijn geladen met cyclische rek en met gecombineerde hemodynamische belastingen (figuur 1E).
   1. Kantel de stromingscultuurkamer ondersteboven en vul de drukleiding van onderaf met ultrapure water met behulp van een spuit met dunne buizen (dit kan van elk type zijn, zolang deze flexibel en dun is, in dit experiment werd een 10 cm lange draad met een binnendiameter van 0,15 mm aan de naald bevestigd).
   2. Plaats de dunne slang in de drukleiding en terwijl de drukleiding is gevuld met ultrapure water door het water geleidelijk uit de spuit te duwen, trekt u de draad tegelijkertijd uit de drukleiding om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de drukleiding zitten.
   3. Plaats de stromingscultuurkamer op een van de acht schroefdraden op de bioreactorbasis. Plaats een siliconen O-ring tussen de bioreactorbasis en de witte Luer-connector om mogelijke lekkage te voorkomen en draai de witte Luer-connector vanuit het onderste compartiment vast.
   4. Herhaal stap 5.2.2 en 5.2.3 voor alle cyclisch uitgerekt monsters.
3. Sluit de stromingscultuurkamers voor alle experimentele groepen, met uitzondering van de statische regeling, aan op het stromingspompsysteem.
   1. Plaats een slangklem op de medium slang. Verwijder de witte Luer-dop die de stromingsinlaat van het bovenste compartiment van de stromingscultuurkamer bedekt. Verwijder de vrouwelijke Luer-koppeling van de medium slang en verbind de medium slang aan de ene kant met de stroominlaat aan de bovenkant van het compartiment en de andere kant van de medium slang met stroomuitlaat in het onderste compartiment.
   2. Herhaal stap 5.3.1 voor alle stromingscultuurkamers. Op dit punt worden de bioreactor en de stromingskweekkamers gevuld met medium en verbonden met de stroomsystemen.
   3. Plaats de monsters voor statische besturing verticaal in een celkweekkolf met filterdop met behulp van de schaarklem. Vul de celkweekkolf met medium en plaats deze in de incubator.
4. Breng de volledige installatie over van de laminaire stromingskast naar de incubator en sluit de vloeistofeenheden aan op de luchtdrukslang en de elektrische kabel.
5. Start de software en initialiseer de flowpompen. Start de medium flow voor de samples één voor één.
   1. Controleer of de kleppen van de vloeistofeenheid klikken.
   2. Verwijder de slangklem van de medium slang.
   3. Start de debietpomp met 100 mbar en 10 s schakeltijd.
   4. Controleer de stromingsrichting zorgvuldig op mogelijke lekkage of luchtbellen. Eventuele ingesloten luchtbellen kunnen worden verwijderd door de stromingscultuurkamer ondersteboven te draaien.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de gemiddelde niveaus in de middelgrote reservoirs in evenwicht zijn, om te voorkomen dat er lucht in het systeem en luchtbellen in de stromingscultuurkamers wordt aangezogen en om de reservoirs niet droog te laten lopen (Figuur 2C).
   5. Herhaal stap 5.5 voor alle vloeistofeenheden één voor één.
6. Initialiseer de stampomp.
   1. Sluit de pneumatisch bediende pomp via de luchtinlaat op de pneumatische cilinder aan op de perslucht. Sluit de onderste luchtuitlaat aan op de blauwe slang voor lucht uit (Afbeelding 1F).
   2. Open LabVIEW software, voer het LabVIEW script en persluchtdruk applicatie systeem, zoals beschreven door Van Kelle et al.⁶⁸, voer verplaatsing en frequentie in (start met lage frequentie van 0,2 Hz). Pauzeer de pomp wanneer de Teflon balg op het laagste niveau is.
   3. Plaats de druksensor in de druksensorinlaat op het hydraulische reservoir.
7. Verander de pompinstellingen in de gewenste instellingen (gebruik voor 1,5 Pa 150 mbar, 10 s schakeltijd).
8. Start de stampomp en pas de gewenste instelling toe (bijv. 0,5 Hz, 1,05 stretch).

6. Experiment meerdere dagen uitvoeren; Bewaking van afschuiving en rek tijdens cultuur en mediumvervanging

1. Bereken de WSS bij de steigerwand.
   1. Noteer de debietgrootte om de andere dag (zie de handleiding van de fabrikant van de debietpomp voor meer informatie). Kortom, let op de verandering in vloeistofniveaus (in ml) in de middelgrote reservoirs tussen het schakelen van het reservoir van de vloeistofeenheid gedurende 10 s. Voer ten minste vijf metingen uit, bereken de gemiddelde waarde en vermenigvuldig met 6 om het debiet Q in ml/min te krijgen.
   2. De stroom wordt beschreven door een Poiseuille-stroom door een ringvormig kanaal. Uitgaande van cultuurmedium als newtoniaanse vloeistof, bereken de WSS bij de steigerwand, r₁, door vergelijking 1.
      (1)
      waarbij de WSS τ_w bij de steigerwand (r₁; hier r₁ = 1,7 mm), als gevolg van een steady state flow, wordt bepaald door de uitgeoefende druk p en de binnenradius van de glazen buis r₂ (hier r₂ = 2,3 mm). De drukgradiënt in de axiale richting wordt verondersteld uniform te zijn tussen de stroominlaat en de stroomuitlaat en wordt gegeven door vergelijking 2 (figuur 1J).
      (2)
      met μ de dynamische viscositeit (hier werd de gemiddelde viscositeit verondersteld constant, μ = 0,7 × 10^-3 Pa∙s bij 37 °C) en Q het toegepaste debiet.
2. Controleer de rek die om de dag op de steigers wordt aangebracht.
   1. Plaats een donkere achtergrond achter de stromingscultuurkamer om het contrast tussen de steiger en de achtergrond te vergroten. Plaats de LED-lichtlampen, wijzend naar de steiger, om de visualisatie van de steiger te helpen.
   2. Maak timelapsefoto's van de steiger met een frequentie van 30 Hz gedurende 6 s (d.w.z. 3 stretchcycli) met een hogesnelheidscamera.
      OPMERKING: Een lagere opnamefrequentie kan voldoende zijn als de camera het toelaat. De minimaal vereiste frequentie werd echter niet bepaald.
   3. Bepaal handmatig de minimale en maximale diameter van de steiger op de afbeeldingen.
   4. Bereken de minimale en maximale buitendiameter van de elektrospun steiger om de maximale rek te berekenen volgens vergelijking 3.
      (3)
      wanneer de omtrek (λ_θ) wordt gegeven door de verhouding tussen de buitendiameter van de steiger, d₁, en de begindiameter, d₀.
3. Corrigeer voor gemiddelde verdamping en ververs medium drie keer per week.
   1. Stop en ontkoppel de kabels voor de stromingssystemen en de stampomp.
   2. Plaats slangklemmen op de medium slang.
   3. Bepaal hoeveel medium verdampt op basis van de volume-indicatormarkeringen op de medium reservoirs.
   4. Breng de lade met de bioreactor en de vloeistofeenheden over in de laminaire stromingskast.
   5. Verwijder de rubberen luchtfilters van de medium reservoirs; voeg autoclaaf ultrapure water toe om het verdampte volume medium te compenseren. Sluit de medium reservoirs opnieuw en sluit opnieuw aan op de pomp om het medium te mengen met het ultrapure water.
   6. Herhaal stap 6.3.1–6.3.5. Verwijder de rubberen luchtfilters opnieuw, haal 25 ml kweekmedium eruit en draai 5 minuten naar beneden bij RT op 300 × g.
      1. Verzamel 1,5 ml supernatant en bewaar bij -30 °C voor analyse van secretoire profielen (voor analyse met enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA)).
      2. Verzamel het gewenste volume supernatant voor paracrinesignaleringsstudies, door het supernatant te gebruiken als geconditioneerd medium⁴³.
   7. Voeg 25 ml vers medium toe aan de middelgrote reservoirs.
   8. Plaats rubberen luchtfilters terug op de medium reservoirs.
   9. Plaats de volledige installatie terug in de incubator; sluit alle kabels en luchtslangen aan op de pomp en de stampomp. Laat de slangklemmen los en herhaal de stappen 5.4–5.8.
4. Controleer of silicadroogparels in de droogflessen die op de pomp zijn aangesloten vochtig zijn (wit uiterlijk) en vervang indien nodig door droge silicaparels (oranje uiterlijk).

7. Experiment, monsterverzameling en reiniging en opslag van apparatuur beëindigen

1. Corrigeer op de laatste dag van het experiment voor gemiddelde verdamping zoals beschreven in stap 6.3.1–6.3.5 en oogst de monsters één voor één.
   1. Om de monsters één voor één te oogsten, moeten de stromingspomp en de stampomp meerdere keren worden gepauzeerd. Plaats een slangklem op middelzware slangen. Stop tijdelijk de debietpomp en de spanningspomp. Koppel één stromingscultuurkamer los van de bioreactorbasis; vervangen door een witte Luer dop op de bioreactorbasis. Breng de stromingscultuurkamer en de vloeistofeenheid naar de laminaire stromingskast. Start de debietpomp en de stampomp opnieuw om de hemodynamische belasting op de andere monsters toe te passen tot het oogsten.
   2. Verzamel medium uit de medium reservoirs voor paracrine cytokine productie analyse via ELISA.
2. Ontkoppel stroomeenheden en oogst buisvormige constructie. Sectie volgens het gewenste snijschema. Delen van de constructie kunnen worden bewaard bij 4 °C (na 15 minuten fixatie in 3,7% formaldehyde en 3 x 5 minuten wassen in PBS) of -30 °C (na snap-freezing in vloeibare stikstof) tot verdere analyse.
3. Reinig de bioreactor en pompcomponenten. Bovendien wordt de geadviseerde reinigingsmethode per item vermeld in de tabel met materialen.
   1. Reinig de rubberen luchtfilters met 70% ethanol. Pas op dat u het binnenfilter niet bevochtigt!
   2. Verzamel alle afzonderlijke componenten: medium buizen, middelgrote reservoirs, glazen buizen, mannelijke Luer-pluggen en vrouwelijke Luer-sloten, witte Luer-doppen, drukleidingen, neuskegels, siliconen O-ringen, adapterbusjes, flow straighteners (exclusief pompen, vloeistofeenheden, rubberen luchtfilters, de bioreactorbasis) en spoel af in stromend leidingwater.
   3. Plaats O/N in 0,1% natriumdodecylsulfaat in gedeioneerd water.
      OPMERKING: Gebruik geen ultrapure water, omdat de onderdelen kunnen roesten.
   4. Afspoelen met kraanwater en afwaszeep.
   5. Dompel onder in gedeioneerd water, gevolgd door 70% ethanol twee keer, gevolgd door gedeioneerd water.
   6. Leg alle materialen apart op papieren zakdoekjes en laat ze drogen. Gebruik lucht onder druk om slangen te drogen.
   7. Reinig alle niet-autoclaveerbare materialen met een papierweefsel gedrenkt in 70% ethanol. Dit omvat het rubberen luchtfilter (houd er rekening mee dat het luchtfilter droog moet blijven) en de bioreactorbasis (Teflon balg en pneumatische cilinder).
   8. Autoclaaf de componenten van de vloeistofkamer (inclusief de siliconen O-ring), de medium slang, de medium reservoirs (zonder het rubberen luchtfilter), mannelijke Luer-pluggen en vrouwelijke Luer-koppelingen, witte Luer-doppen, slangklemmen en standaarduitrusting (bijv. pincet, klemschaar)
   9. Voor handig gebruik tijdens de volgende experimenten, combineert u de afzonderlijke componenten voor één complete vloeistofkamer in een autoclaveerbare doos.
4. Verwijder water uit het hydraulische reservoir. Reinig met 70% ethanol, gevolgd door gedeioneerd water. Laat het drogen. Vul bij met gedeioneerd water en een paar druppels water-bad-conserverend ontsmettingsmiddel.
5. Bewaar de glazen buizen voor de stromingskweekkamer in 70% ethanol.
6. Plaats de vochtige silicadroogparels (wit uiterlijk) op 120 °C in de oven O/N om ze te laten drogen (oranje uiterlijk) en bewaar ze in een luchtdichte kolf.

Representative Results

Deze bioreactor is ontwikkeld om de individuele en gecombineerde effecten van afschuifspanning en cyclische rek op vasculaire weefselgroei en remodellering in 3D-biomateriaalsteigers te bestuderen. Het ontwerp van de bioreactor maakt het mogelijk om tot acht vasculaire constructies onder verschillende belastingsomstandigheden te cultiveren (figuur 1A). De vasculaire constructies bevinden zich in een stromingscultuurkamer (figuur 1B) waarin zowel de omtrek als WSS onafhankelijk kunnen worden gecontroleerd. Het bovenste compartiment van de stromingscultuurkamer bevat een stromingsser om de stroom in een relatief korte bezinkingslengte te stabiliseren (figuur 1C). Direct stroomafwaarts van de stromingsseer verdeelt de neuskegel de stroom gelijkmatig door het ringvormige kanaal (figuur 1D). Wanneer alle stappen van het protocol op de juiste manier worden uitgevoerd, kunnen de vasculaire steigers in de stromingscultuurkamer worden onderworpen aan een continue eenrichtingsstroom door het ringvormige kanaal tussen de steiger en de glazen wand en worden ze om omtrek uitgerekt door de pneumatische pomp (figuur 1E-F). Voordat de steiger wordt gemonteerd, moet de elektrospunbuis in buizen van 25 mm worden gesneden (figuur 1G) en kan deze met SEM worden onderzocht om de microarchitectuur te analyseren (figuur 1H–I). Het is belangrijk op te merken dat de PCL-BU-grafts in dit voorbeeld kunnen worden vervangen door andere elastomeerweefsel ontworpen grafts (natuurlijke of synthetische oorsprong, verschillende microarchitectuur of porositeit). Het binnenstebuiten ontwerp maakt het mogelijk om zeer poreuze grafts te testen, omdat het niet noodzakelijkerwijs lekvrij hoeft te zijn. Het schematische beeld van de stroomcultuurkamer toont de fysische interpretatie van de parameters die in de vergelijkingen worden gebruikt om de WSS (vergelijking 1), de drukgradiënt (vergelijking 2) en de omtrekrek (vergelijking 3) (Figuur 1J) te beschrijven.

Onjuiste uitvoering van de kritieke stappen van het protocol kan resulteren in een paar scenario's. Lekkage uit het hydraulische reservoir kan bijvoorbeeld optreden als gevolg van verkeerd gemonteerde knopen, wat leidt tot lekkage van hydraulische vloeistof uit de drukleidingen met gaten die de siliconenbuis passeren en de stromingscultuurkamer binnenkomen (figuur 2A). Lekkage van de hydraulische vloeistof bij de verbinding tussen de schroefdraden en de bioreactorbasis kan ook optreden wanneer de siliconenring niet goed is geplaatst of als de Teflon-balg een dag voor het experiment niet lichtjes mocht uitzetten (figuur 2B). Bovendien kunnen er luchtbellen ontstaan in de stromingscultuurkamer (figuur 2C), wat de WSS-patters verstoort, waardoor de levensvatbaarheid van de cel en de daaropvolgende weefselgroei in gevaar komen wanneer het medium niet wordt ontgast, of als de gemiddelde niveaus in de middelgrote reservoirs niet goed in balans zijn en één medium reservoir droogloopt, waardoor lucht in het systeem wordt gezogen. Ten slotte, wanneer de siliconen O-ring in het onderste compartiment niet correct is geplaatst, kan een gemiddelde lekkage onder de stromingscultuurkamer worden waargenomen (figuur 2D).

Aangezien deze bioreactoropstelling de toepassing van individuele en gecombineerde hemodynamische belastingen mogelijk maakt, kunnen meerdere hemodynamisch geladen experimentele groepen in één experiment worden opgenomen (figuur 3A). Voorheen werden verschillende hemodynamische belastingen (d.w.z. twee afschuifspanningsregimes en twee rekregimes) gevalideerd door verschillende mogelijke systeeminstellingen toe te passen (figuur 3B). Toen stretch (Figuur 3C) en WSS (Figuur 3D) gedurende lange periodes werden gemonitord, werd gevalideerd dat deze gedurende een periode van maximaal 20 dagen op relatief constante niveaus kunnen worden gehouden.

De bioreactor is bijzonder geschikt om de invloed van hemodynamische belasting op groei en remodellering in een in situ vasculaire TE-context te bestuderen. De stadia van in situ TE worden verondersteld de stadia van de natuurlijke wondgenezingsrespons te weerspiegelen (figuur 4A). De coculturen van monocyt-afgeleide macrofagen en myofibroblasten afgeleid van menselijke sapheneuze aderen, zoals hier beschreven, werden vastgesteld als een in vitro nabootsing van de proliferatieve fase. Drie dagen na het zaaien vertoonden immunofluorescentiekleuring een homogene verdeling van beide celtypen over de steiger (figuur 4B). Na 20 dagen co-cultuur resulteerde cyclische stretch alleen al in de afzetting van talrijkere en dikkere collageen type I vezels, terwijl in de groep met gecombineerde hemodynamische belastingen dit effect van cyclische stretch werd overruled door afschuifspanning, wat resulteerde in minder uitgesproken collageen type I-afzetting, hier geïllustreerd door immunofluorescentiekleuring (Figuur 4C). Voor een succesvolle weefselregeneratie in situ is een strakke balans tussen weefselproductie en steigerresorptie vereist. Naast weefselvorming maakt de bioreactor de inductie van celgestuurde steigerresorptie mogelijk. Bijvoorbeeld, bij het cultiveren van een monocultuur van macrofagen gedurende 8 dagen op de elektrospuntransplantaten, werden vezelerosie en vezelsplitsing waargenomen in alle hemodynamische belastingsregimes, met de meest uitgesproken resorptie in de statische groep en de minst uitgesproken resorptie in de afschuifspanningsgroep (Figuur 4D). Samen laten deze resultaten de impact zien van de verschillende hemodynamische beladingsregimes op zowel groei als remodellering. Deze inzichten zijn nuttig bij het optimaliseren van de ontwerpparameters voor nieuw ontwikkelde TEVG's in situ.

Een andere belangrijke determinant van het weefselregeneratieproces is de aanwezigheid van pro- en ontstekingsremmende cytokinen. Omdat de bioreactor een gesloten systeem is, zullen de cellen in het systeem continu worden blootgesteld aan de paracrineprikkels van afgescheiden factoren. De cytokinesecretieprofielen in het medium van de dynamisch geladen coculturen van menselijke perifere bloedmononucleaire cel (PBMC)-afgeleide macrofagen en menselijke myofibroblasten uit sapheneuze aderen werden in vroege en latere stadia geanalyseerd (Figuur 5A). Deze representatieve resultaten illustreren de impact van zowel cyclische rek- als afschuifspanning op het cytokinesecretieprofiel in de co-kweekopstelling. Interessant is dat de gecombineerde effecten van beide belastingen ofwel dominantie van een van de twee belastingen vertoonden (bijv. cyclische rek voor interleukine-6 (IL-6) en monocyt chemoattractant eiwit-1 (MCP-1)) of synergetische effecten van beide belastingen (bijv. voor IL-10) (Figuur 5B). Deze inzichten, verzameld met behulp van dit in vitro testplatform, geven waardevolle informatie voor de ontwikkeling van in situ TEVGs die zijn gebaseerd op de beweegredenen van macrofaag-gedreven in situ weefselregeneratie.

Co-cultuur experimenten van macrofagen en myofibroblast toonden aan dat de mechanische omgeving en de resulterende belastingsafhankelijke ontstekingsomgevingen het fenotype van de myofibroblasten moduleerden. Na 20 dagen hemodynamisch laden vertoonde de genexpressie van myofibroblastmarkers duidelijke verschillen in de individuele en gecombineerde impact van de belasting en in directe en paracrinesignalering van macrofagen op myofibroblasten (figuur 6A). Bovendien correleerden de genexpressiepatronen van contractiele marker alfa gladde spier actine met eiwitsynthese (Figuur 6B). Bovendien stimuleerde cyclische stretch de collageen- en elastische matrixgenexpressie en verzwakte matrix metalloproteinase 1/weefselremmermatrix metalloproteinase 1-gemedieerde collageenremodellering, terwijl een stabiliserend effect van afschuifspanning werd waargenomen in de co-cultuur (Figuur 6C). Deze langetermijnexperimenten met co-cultuur tonen de mogelijkheid aan om de latere fase weefselremodelleringsfase (figuur 4A) te bestuderen in verschillende hemodynamische belastingsregimes in weefselgeïnrichte vasculaire grafts met deze bioreactor. Omdat de TEVG "binnenstebuiten" op een siliconenbuis is gemonteerd, kunnen de cirkelvormige stretch en WSS voor langere kweekperioden worden toegepast.

Figuur 1: Ontwerp en overzicht van de bioreactor. (A) Constructietekening van de bioreactorbasis en (B) geëxplodeerd zicht op de vloeistofkweekkamer met alle aangegeven delen (stappen 2.4–2.8). Het bovenste compartiment van de stromingscultuurkamer bevat een stromingsser. (C) De bolvormig stompe neuskegel wordt na de stromingss straightener geplaatst om de stroom door het ringvormige kanaal te verdelen (stroomrichting aangegeven in roze). (D) Samen regelen en geleiden deze componenten de richting van de stroming. Zie tabel 1 voor een functionele beschrijving van de afzonderlijk genoemde onderdelen. (E) Foto van de volledige installatie van de bioreactor (stap 5.2) en (F) een close-up van de stromingscultuurkamers en pneumatische cilinder (stap 5.6.1). (G) Bruto uiterlijk van de electrospun PCL-BU steiger voor het zaaien (liniaal tikt 1 mm). Scanning elektronenmicroscopische beelden van buisvormige elektrospun PCL-BU steiger met 3 mm binnendiameter en 5 μm gemiddelde vezeldiameter bij verschillende vergrotingen, schaalstaven (H) 100 μm en (I) 10 μm (stap 1.3). (J) Schematisch beeld van de kweekkamer bestaande uit een buisvormige elektrospunsteiger, met buitenradius (r₁) gecentreerd in een glazen buis van binnenradius (r₂). De in- en uitgangen van de stroming (Q) zijn verbonden met de ringvormige ring, met kanaalhoogte h voor het aanbrengen van wandschaarspanning (t). De druk/rek (P) inlaat is verbonden met de op siliconen gemonteerde steiger voor het aanbrengen van een omtrekrek (λ(t)) op de gemonteerde elektrospunsteigers van binnenuit (stap 6.1). Afkortingen: polycaprolacton bisurea (PCL-BU). De panelen C, D en G–J zijn overgenomen uit Van Haaften e.a.¹⁹. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Bioreactor onderdelen	Functionele beschrijving
Stretch-applicatie
Pneumatische cilinder	Actuates Teflon balg.
Teflon balg	Laadt het hydraulische reservoir.
Hydraulisch reservoir	Kan worden aangesloten met maximaal 8 flow kweekkamers, is gevuld met demi water, oefent druk uit op de siliconen gemonteerde constructies.
Schroefdraad	Verbinding tussen de stromingscultuurkamer en het hydraulische reservoir. De drukinlaat voor de siliconen gemonteerde constructies.
Witte luer connector	Wordt gebruikt om de stromingscultuurkamer vast te schroeven op een van de acht schroefdraden op de hydraulische reservoir/bioreactorbasis.
Drukleiding met kleine gaatjes	Direct verbonden met water in hydraulisch reservoir. Wanneer het hydraulische reservoir onder druk staat, vullen de drukleidingen de ruimte tussen de siliconenbuis (die op de drukleiding is gemonteerd) met water, waardoor de siliconenslang naar buiten wordt geduwd, wat resulteert in een omtrekrek op de op siliconen gemonteerde ent van binnenuit.
Siliconen buizen	Om de elektrospuntransplantaat op de drukleiding te monteren. De siliconen slang is van binnenuit omtrek uitgerekt.
Flow-applicatie
Flow pompsysteem	Wordt gebruikt om de stroom in de stromingscultuurkamers te regelen. (in ons voorbeeld: er wordt gebruik gemaakt van een ibidi pompsysteem.)
Boven- en ondervak met flow inlaat en uitlaat	Verbindt de stromingscultuurkamer met de stromingslus.
Glazen buis	Bevat de steiger onder druk in het midden en maakt perfusie van de steigers mogelijk.
Flow stijltang	Stabiliseert de stroming in een relatief korte bezinklengte.
De kegel van de neus	Verdeelt de stroom gelijkmatig.
Adapter bus	Repareert de glazen buis.
Siliconen O-ring	Voorkomt lekkage van medium.

Tabel 1: Functionele beschrijving van de belangrijkste kenmerken van de bioreactor, komt overeen met de aangegeven delen in figuur 1A-D.

Figuur 2: Resultaten van onnauwkeurige uitvoering van de kritieke stappen in het protocol. Foto's van sommige voorvallen die kunnen worden waargenomen in de bioreactoropstelling wanneer kritieke stappen niet op de juiste manier worden uitgevoerd. (A) Als de knoop niet strak genoeg is of niet precies in de gegraveerde groef is geplaatst (aangegeven met een pijl), kan een lichte lekkage van hydraulische vloeistof in de stromingscultuurkamer optreden (stap 2.5). (B) Als de Teflon balg een dag voor het experiment of wanneer de siliconenring niet goed geplaatst is, O/N niet mocht uitzetten, kan hydraulische vloeistoflekkage uit de hydraulische vloeistof bij de verbinding tussen de schroefdraden en de bioreactorbasis optreden (aangegeven met pijl) (stap 1.4 en 5.2.3). (C) Luchtbellen in de stromingscultuurkamer (aangegeven met pijl) zullen resulteren in verstoorde schuifspanningspatronen. Ontgast altijd het kweekmedium en zorg ervoor dat de gemiddelde niveaus in de middelgrote reservoirs in evenwicht zijn om te voorkomen dat één reservoir droogloopt en lucht in het stroomkamersysteem wordt gezogen (stappen 1.2 en 5.5.4). (D) Wanneer de siliconenring in het onderste compartiment niet correct is geplaatst, kan morsen van het medium worden waargenomen (aangegeven met pijl) (stap 2.4.2). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: Controle van schuifspanning en rek. Omdat de bioreactor een onafhankelijke en gecombineerde toepassing van stretch en shear mogelijk maakt, kunnen (A) meerdere experimentele groepen in één experiment worden opgenomen. (B) Voorbeelden van variaties in maximale rek- en afschuifspanningen op een specifiek punt in de tijd getest onder vier verschillende systeeminstellingen (aangegeven door de kleuren). Zwarte rechthoeken vertegenwoordigen gemiddelde ± standaardafwijking van de metingen voor elke instelling. De stippellijnen worden berekend als het gemiddelde van de stretches (horizontale lijn) en de afschuifspanningen (verticale lijn) om de vier verschillende belastingsomstandigheden aan te geven. (C) Cyclische omtrekstrekken in de cyclische rek en gecombineerde groepen in de loop van het experiment van 20 dagen, op basis van metingen van de buitendiameter van de steigerconstructies die worden bewaakt met een time-lapse van hogesnelheidscamera 's (stap 6.2). (D) Bewaakte wandschaarspanningen in de afschuifspanning en gecombineerde groepen in de loop van het experiment, op basis van de veranderende gemiddelde niveaus in de spuit (stap 6.1). De panelen A, C en D zijn overgenomen van Van Haaften en Wissing et al.⁴⁴; paneel B is overgenomen uit Van Haaften et al.¹⁹. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4: Concept van in situ vasculaire weefseltechniek, celverdeling, weefselproductie en steigerdegradatie. (A) Een schematische illustratie die de veronderstelde fasen van steiger-gedreven weefselregeneratie op de functionele plaats van de gastheer afschildert. De getoonde resultaten zijn afgeleid van experimenten die gericht waren op de proliferatieve fase, waarin macrofagen en weefselproducerende cellen het steigermateriaal hebben gekoloniseerd. (B) Myofibroblasten van menselijke sapheneuze ader (rood) en PBMC-afgeleide macrofaag (groen) verdeling aan de buitenzijde van de elektrospun steiger (grijs) op dag 3. Schaalbalk 200 μm. (C) Doorsnede van de co-cultuurconstructie op dag 20 gekleurd voor collageen type I(groen),collageen type III (rood) en DAPI (wit). Schaalbalk 100 μm, *geeft de buitenzijde van de constructie aan, overeenkomend met de stroomzijde. (D) SEM-afbeeldingen van gedecellulariseerde grafts van 8 dagen macrofaagmonocultuur die macrofaagdegradatie vertonen; schaalbalk 20 μm. Afkortingen: menselijke sapheneuze veneuze cellen (HVSC); perifere bloedmononucleaire cel (PBMC); 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI); scanning elektronenmicroscopie (SEM). Paneel A is overgenomen uit Wissing en Bonito et al.²⁷; panelen B en C zijn aangepast van Van Haaften en Wissing et al.⁴⁴; en paneel D werd aangepast van Wissing et al.⁴³. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5: Ontstekingsomgeving in hemodynamisch geladen co-cultuurconstructies op 3 dagen en 20 dagen. Co-cultuur van menselijke PBMC-afgeleide macrofagen en menselijke myofibroblasten uit sapheneuze aderen. (A) Warmtekaart van de totale cytokinesecretie gemeten in supernatant via multiplex ELISA. (B) Boxplots voor een selectie van cytokinen op dag 20, genormaliseerd tot totaal DNA-gehalte. P-waarden werden berekend met behulp van kruskal-Wallis-test met een meervoudige vergelijkingstest van Dunn; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** Afkortingen: weefselremmer van metalloproteinase (TIMP), matrix metalloproteinase (MMP), interleukine (IL), monocyt chemoattractant eiwit 1 (MCP-1), transformerende groeifactor beta 1 (TGF-β1), bindweefselgroeifactor (CTGF), tumornecrosefactor alfa (TNF-α). Panelen A en B zijn aangepast van Van Haaften en Wissing et al.⁴⁴. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6: Veranderingen in myofibroblastfenotype en markers van matrixgroei en -remodellering als reactie op hemodynamische belasting in de vasculaire constructies op dag 20. (A) Relatieve genexpressie van myofibroblast-specifieke fenotypische markers. (B) Doorsneden gekleurd voor αSMA (groen) en DAPI (blauw), schaalbalk 100 μm. (C) Relatieve expressie van genen gerelateerd aan collageenmatrix, elastische matrix, proteoglycanen en remodelleringsgenen. P-waarden werden berekend met behulp van kruskal-Wallis-test met een meervoudige vergelijkingstest van Dunn; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Afkortingen: S100 calciumbindend eiwit A4 (S100A4), alfa-gladde spier actine (αSMA of ACTA2), calponine 1 (CNN1), smoothelin (SMTN), vimentine (VIM), collageen I (COL1A1), elastine (ELN), versican (VCAN), matrix metalloproteinase (MMP), weefselremmer van metalloproteinase (TIMP), statisch (ST), cyclisch # gemeten op of onder de detectielimiet. De panelen A, B en C zijn overgenomen uit Van Haaften en Wissing et al.⁴⁴. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Eiwitexpressie myofibroblast- en macrofaagmonoculturen onderworpen aan individuele en gecombineerde hemodynamische belastingen. (A) Representatieve confocale beelden van myofibroblasten, gedurende 10 dagen gekweekt met actinevezels(groen),kernen(rood)en steiger(blauw),tonen een duidelijke actinevezeloriëntatie in de geladen monsters, in vergelijking met de statische monsters waarin geen voorkeursactinevezelrichting kan worden waargenomen. Schaalbalk 50 μm. (B) Confocale afbeeldingen van dezelfde myofibroblast monocultuur gekleurd voor collageen (groen) en kernen/steiger (wit). Schaalstaaf 50 μm. (C) Boxplots van eiwitsecretieprofielen van statisch en dynamisch gekweekte THP1-afgeleide macrofagen gedurende 8 dagen, met berekende M1/M2-verhoudingen op basis van de cytokinesecretieniveaus van IL-6, TNF-α, MCP-1 (pro-inflammatoir) en IL-10, IL-13, MMP-9 (ontstekingsremmend). De stip in de MCP-1 grafiek vertegenwoordigt een statistische uitschieter. (D) ELISA-gegevens van de relatieve eiwitsecretieniveaus van statisch en dynamisch gekweekte macrofagen op dag 8 in vergelijking met de gemiddelde secretie van pro-inflammatoire, ontstekingsremmende, groei- en remodelleringseiwitten (eiwitniveaus werden gecorrigeerd voor het gemiddelde DNA-gehalte per groep). De stippen en gearceerde gebieden geven respectievelijk de 50e en^25e-75e percentielen aan. Afkortingen: monocyt chemoattractant protein 1 (MCP-1), interleukine (IL), transformerende groeifactor bèta (TGF-β), matrix metalloproteinase (MMP), bloedplaatjes-afgeleide groeifactor (PDGF), bindweefselgroeifactor (CTGF), tumornecrosefactor alfa (TNF-α), enzym-gebonden immunosorbent assay (ELISA).* p < 0,05; ** p < 0,01, *** p < 0,001. Panelen A en B zijn overgenomen uit Van Haaften e.a.¹⁹. Panelen C en D werden aangepast van Wissing et al.⁴³. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.

Discussion

De hierin beschreven bioreactor maakt een systematische evaluatie mogelijk van de bijdragen van de individuele en gecombineerde effecten van schuifspanning en cyclische rek op ontsteking en weefselregeneratie in buisvormige resorbeerbare steigers. Deze aanpak maakt het ook mogelijk om een grote verscheidenheid aan analyses uit te voeren op vasculaire constructies, zoals geïllustreerd in de sectie representatieve resultaten. Deze resultaten tonen de onderscheidende impact van de verschillende hemodynamische belastingsregimes (d.w.z. verschillende combinaties van afschuiving en rek) op zowel de groei als de remodellering van de TEVG-constructie. Deze inzichten, verzameld via dit in vitro platform, helpen bij het optimaliseren van steigerontwerpparameters voor nieuw ontwikkelde in situ TEVGs. Om een goede experimentele workflow te garanderen, is inzicht in de kritieke stappen en de beperkingen van dit protocol belangrijk.

De meest kritieke stappen in het protocol zijn gerelateerd aan de toepassing van stretch op de samples. Voor stretch-toepassingen is het essentieel dat de installatie lekvrij is. Er zijn twee zwakke punten in het systeem: de knopen die de elektrospuntransplantaten op de drukleidingen monteren en de verbinding tussen de bioreactorbasis en de stromingscultuurkamers. Zoals beschreven in stap 2.5.2 en 2.5.4, moeten meerdere, strakke knopen precies op de gegraveerde groef worden geplaatst. Als de knoop niet strak genoeg is of iets boven of onder de groef wordt geplaatst, kan een lichte lekkage van hydraulische vloeistof in de stromingscultuurkamer optreden. Deze lekkage kan worden gedetecteerd als een drukval in het hydraulische reservoir en een gestaag toenemende spanning op de spanningspomp om de ingestelde drukwaarde te bereiken. Bovendien leidt dit tot een verstoorde stroom in de stromingscultuurkamer, een verhoogd risico op besmetting van de celkweek en een verdunning van het medium. Zodra dit gebeurt, moet de stromingscultuurkamer uit het experiment worden gehaald en moet de schroefdraad op het hydraulische reservoir worden gesloten met een witte Luer-dop. Deze belangrijke maatregel voor het nemen van een volledig monster, dat nodig is om een goede voortzetting van het experiment voor de andere zeven stroomcultuurkamers te garanderen, benadrukt het belang van het nauwkeurig plaatsen van strakke knopen, precies in de gegraveerde groeven. Alleen dan kan een goede scheiding tussen het water in het hydraulische reservoir en het medium in de stromingscultuurkamers worden gegarandeerd. Om de robuustheid van de montage van de steigers te verbeteren, worden de groeven in de drukleidingen iets dieper gemaakt in een herziene versie van de bioreactor, waardoor een gemakkelijkere en betere knoopplaatsing mogelijk is en zo de hydraulische vloeistof van het medium kan worden gescheiden.

Een andere mogelijke bron van lekkage is tussen de schroefdraden van de bioreactorbasis en de witte Luer-connectoren van de stromingscultuurkamer. Door mogelijke slijtage van het Teflon materiaal kan een extra siliconen O-ring worden toegevoegd om lekkage te voorkomen (stap 5.2.3). Bovendien moet de Teflon-balg van de stampomp een dag voor het experiment lichtjes kunnen uitzetten (stap 1.4). Als lekkage optreedt, moet de verloren hydraulische vloeistof worden gecompenseerd door een kleine hoeveelheid ultrapure water toe te voegen via een van de acht schroefdraden (gebruik een spuit met naald en flexibele draad). Plaats de stromingscultuurkamer terug met een klein stukje parafilm tussen de schroefdraad en de witte Luer-connector op het onderste compartiment van de stromingscultuurkamer. Om dit lekkageprobleem in toekomstige experimenten op te lossen, zullen de huidige Teflon-schroefdraden op de bioreactorbasis worden vervangen door roestvrijstalen draden in de volgende generatie versie van de bioreactor om slijtage van het systeem te voorkomen.

De variatie in stretch (figuur 3C) is groter dan de variatie in WSS (figuur 3D), omdat stretch moeilijker te controleren is. Naast de maatregelen om lekkage te voorkomen, zijn er echter nog andere maatregelen die de variatie in rek beperken: i) het vermijden van luchtbellen in de fluit (stap 1.4 en 5.2.1), (ii) het waarborgen van consistente pre-stretch tussen de verschillende monsters (stap 2.5.3) en (iii) het waarborgen van consistente steigereigenschappen tussen verschillende monsters (stap 1.3).

Tot slot is extra voorzichtigheid geboden bij het monteren van de elektrospunsteiger op de siliconenslang (stap 2.3). Met name wanneer de fragiele elektrospunsteiger over de uitgerekte siliconenslang moet worden getrokken, is het belangrijk om niet te veel kracht uit te brengen om te voorkomen dat de elektrospuntransplantaat wordt beschadigd, vooral aan de binnenkant van de elektrospuntransplantaat. Als er schade optreedt aan de binnenkant van het elektrospuntransplantaat, hetzij door krachtig trekken of door te zwakke rek van de siliconenbuis, wordt de omvang van de schade aan de elektrospunvezels pas zichtbaar nadat de constructie is geoogst en geanalyseerd. In de huidige opstelling kan het succes van het zaaien alleen worden bevestigd bij immunofluorescentie of immunohistochemische analyse, na het opofferen van het monster. De zaaiprocedure met fibrine als celdrager is echter een gevestigde methode⁶⁷ die meestal leidt tot een homogene celverdeling voor steigers met een voldoende grote poriegrootte. Een van de belangrijkste aspecten met betrekking tot celzaden is ervoor te zorgen dat de steiger zo droog mogelijk is voorafgaand aan het zaaien (stap 4.4),om te voorkomen dat de fibrinegel met de cellen door de natte steiger gaat, wat resulteert in inhomogene seeding. Ten slotte is de ontsmettingsmethode van het elektrospuntransplantaat door UV-straling en het onderdompelen in 30% ethanol niet zo streng als de sterilisatie van elektrospuntransplantaten die zijn voorbereid voor in vivo studies, die vaak worden gesteriliseerd door ethyleenoxide of gammastraling, maar het is voldoende voor in vitro kweekexperimenten die tot 20 dagen kunnen duren zonder tekenen van besmetting (zie bijvoorbeeld figuur 3, figuur4 , figuur 5, figuur 6, en Van Haaf ). Bovendien laat het PCL-BU-materiaal dat hier wordt gebruikt geen lange blootstelling aan hoge ethanolconcentraties toe. Afhankelijk van het gebruikte materiaal kan de meest geschikte sterilisatiemethode worden gekozen.

Naast de resultaten van eerder uitgevoerde co-cultuurstudies, kan een bredere verscheidenheid aan studies met hetzelfde systeem worden uitgevoerd. Het systeem werd voorheen gebruikt om dynamische monoculturen van myofibroblasten (aanvullend figuur 1A–B) en macrofagen (aanvullend figuur 1C–D) uit te voeren om de effecten van hemodynamische belasting op individuele celtypen en hun paracrinesignalering^19,43te onderzoeken . Verschillende hemodynamische belastingsregimes resulteerden in een duidelijke actinevezeloriëntatie in myofibroblasten (aanvullend figuur 1A) en duidelijk verschillende collageendepositie (aanvullend figuur 1B) na 10 dagen. De cytokineproductie door THP1-afgeleide macrofagen was drastisch verschillend tussen de verschillende hemodynamische belastingen (Aanvullend figuur 1C) en vertoonde een meer pro-inflammatoir profiel bij belasting (Aanvullend Figuur 1D). Andere gevalideerde mogelijkheden zijn de toepassing van oscillatiestroom, met behulp van een extra pomp en vloeistofeenheid. De viscositeit van het medium kan worden verhoogd naar het bereik van de bloedviscositeit (bijv. door toevoeging van xanthaangom)⁶⁹. Het moduleren van de gemiddelde viscositeit vertegenwoordigt een extra variabele om het bereik van de toepasselijke schuifspanningen te verbreden. Ten slotte, hoewel het beschreven protocol de 'Ibidi'-stroomconditioneringsinstelling gebruikt, kunnen opstellingen van andere fabrikanten ook worden gebruikt, zolang vergelijkbare stroomregimes kunnen worden toegepast.

Een van de grote voordelen van het gebruik van dit bioreactorsysteem is de relatief grote constructie (ongeveer 15 mm x 10,5 mm) die hemodynamisch geladen kan worden, waardoor een breed scala aan mogelijke uitleesparameters uit één monster kan worden geëxtraheerd. Tegelijkertijd kan de constructiegrootte ook als een beperking worden beschouwd, omdat deze opstelling een relatief grote hoeveelheid (soms kostbaar) materiaal vereist, vooral als primaire cellen worden gebruikt of als het kweekmedium dure additieven vereist. Bovendien is de doorvoer van de setup relatief laag. Bijgevolg is de huidige opzet bijzonder geschikt voor hypothesegestuurd onderzoek waarbij een beperkt aantal variabelen uitgebreid wordt getest, in plaats van het screenen van een groot aantal variabelen met beperkte uitlezing. Voor toekomstige experimenten worden kleine verbeteringen aangebracht aan de huidige opstelling om de optie voor het monteren van kleinere steigers en downscaling van de grootte van de middelgrote reservoirs mogelijk te maken. Met betrekking tot dit laatste is het huidige volume van de middelgrote reservoirs vereist om voldoende volumetrische debieten mogelijk te maken om de gewenste schuifspanningen te bereiken. De vereiste debieten - en daarmee het volume van de middelgrote reservoirs - kunnen worden verminderd door de viscositeit van het medium te verhogen (bijvoorbeeld door xanthaangom toe te voegen, zoals eerder vastgesteld⁶⁹).

Concluderend, deze bioreactor maakt het mogelijk om de individuele en gecombineerde effecten van afschuifspanning en cyclische rek op weefselgroei en remodellering op een breed scala aan elastomeer 3D-biomateriaalsteigers te kwantificeren. De bioreactor kan tot acht vasculaire constructies gekweekt onder verschillende belastingsomstandigheden. Door het ontwerp is de bioreactor bijzonder geschikt om het samenspel tussen hemodynamica en in situ vasculaire TE-processen te bestuderen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM)	Gibco	12491-015	cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil	Julabo	8940012	prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin	Sigma	T4648	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge	Eppendorf	5804	to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor - "kelly forceps"	Almedic	P-422	clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators	Sanyo	MCO-170AIC-PE	for cell culturing
Compressed air reservoir	Festo	CRVZS-5	smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches	Matlab	R2017. The Mathworks, Natick, MA	calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board	National Instruments	BNC-2090	data processing in between amplifier system and computer
Ethanol	VWR	VWRK4096-9005	to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS)	Greiner	758087	cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet	Assistant	HE40567002	apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber	Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology	n.a.	part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax	Gibco	35050061	cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera	MotionScope	M-5	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens	Nikon	JAA616AB	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip	ibidi GmbH	10821	block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads	ibidi GmbH	10902	set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)	Swann Morton	0301; 0933	to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software	National Instruments	version 2018	to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light	Labconco	302310001	to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes	Greiner	664-160	for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)	Sigma	A8960	cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500	Zeiss	Schott AG	to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps	ibidi GmbH	various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)	to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS)	PEEKEL instruments B.V.	n.a.	to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders	ibidi GmbH	10974	medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter	Rubber BV	1805	to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software	Idtvision	2.15.00	to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G)	BD Microlance	301700	together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver	Adson	2429218	to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues	Kleenex	38044001	for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S)	Lonza	DE17-602E	cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps	Greiner	206202	to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder	Festo	AEVC-20-10-I-P	to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length)	SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands	n.a.	produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control)	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer	BD	TC-XX and P 10 EZ	the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor	Festo	MPPES-3-1/8-2-010, 159596	provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)	Gibco	A1049101	cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)	Eppendorf	30120086	multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20%	Sigma	5030	Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.
Silicone O-rings	Technirub	1250S	to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)	Rubber BV	1805	to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL)	Falcon	352095	multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle	Ethicon, Johnson&Johnson	EH7404H	Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL)	B. Braun Melsungen AG	2057932	to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm)	Satorius	17597-K	to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap	Nunc	178983	to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap	Nunc	156499	to culture static control samples
Teflon bellow	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel)	PolarWare	15-248	for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers	Wironit	4910	sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water	Stakpure	Omniapure UV 18200002	to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light	Philips	TUV 30W/G30 T8	for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding