Summary

Uveítis autoinmune experimental: un modelo de ratón inflamatorio intraocular

Published: January 12, 2022
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Summary

En este informe presentamos un protocolo que permite al investigador generar un modelo murino de uveítis intraocular. Más comúnmente conocida como uveítis autoinmune experimental (EAU), este modelo establecido captura muchos aspectos de la enfermedad humana. Aquí, describiremos cómo inducir y monitorear la progresión de la enfermedad utilizando varias lecturas.

Abstract

La uveítis autoinmune experimental (EAU) es impulsada por células inmunes que responden a los autoantígenos. Muchas características de este modelo de enfermedad inflamatoria intraocular no infecciosa recapitulan el fenotipo clínico de la uveítis posterior que afecta a los humanos. EAU se ha utilizado de manera confiable para estudiar la eficacia de nuevas terapias inflamatorias, su modo de acción y para investigar más a fondo los mecanismos que sustentan la progresión de la enfermedad de los trastornos intraoculares. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado sobre la inducción de EAU en el ratón C57BL / 6J, el organismo modelo más utilizado con susceptibilidad a esta enfermedad. La evaluación clínica de la gravedad y progresión de la enfermedad se demostrará mediante fundoscopia, examen histológico y angiografía con fluoresceína. El procedimiento de inducción consiste en la inyección subcutánea de una emulsión que contiene un péptido (IRBP1-20) de la proteína ocular interfotorreceptora de la proteína de unión retinoide (también conocida como proteína de unión al retinol 3), adyuvante completo de Freund (CFA) y suplementado con Mycobacterium tuberculosis muerta. La inyección de esta emulsión viscosa en la parte posterior del cuello es seguida por una sola inyección intraperitoneal de toxina Bordetella pertussis . Al inicio de los síntomas (día 12-14) y bajo anestesia general, se toman imágenes fundoscópicas para evaluar la progresión de la enfermedad a través del examen clínico. Estos datos se pueden comparar directamente con los de los puntos temporales posteriores y el pico de la enfermedad (día 20-22) con las diferencias analizadas. Al mismo tiempo, este protocolo permite al investigador evaluar las posibles diferencias en la permeabilidad y el daño de los vasos mediante angiografía con fluoresceína. La EAU puede ser inducida en otras cepas de ratón, tanto de tipo salvaje como genéticamente modificadas, y combinada con nuevas terapias que ofrecen flexibilidad para estudiar la eficacia de los medicamentos y / o los mecanismos de la enfermedad.

Introduction

Este protocolo demostrará cómo inducir Uveítis Autoinmune Experimental (EAU) en el ratón C57BL / 6J mediante una sola inyección subcutánea de un antígeno retiniano en un adyuvante emulsionado. Los métodos para monitorear y evaluar la progresión de la enfermedad se detallarán a través de imágenes fundoscópicas y examen histológico, con parámetros de medición descritos dentro. Además, se discutirá la angiografía con fluoresceína, una técnica para examinar la estructura y permeabilidad de los vasos sanguíneos de la retina.

Este modelo EAU recapitula las características centrales de la uveítis posterior no infecciosa en humanos con respecto a las características clínico-patológicas y los mecanismos celulares y moleculares básicos que impulsan la enfermedad. La EAU está mediada por subconjuntos Th1 y/o Th17 de linfocitos T CD4+ autorreactivos, como se muestra en experimentos de transferencia adoptiva y con ratones sin IFNγ1. Gran parte de nuestra comprensión de las funciones potenciales de estas células en la uveítis proviene del estudio de EAU2, donde se detectan células Th1 y Th17 dentro de los tejidos de la retina3. A menudo, la EAU se utiliza como modelo preclínico para evaluar la utilidad de nuevas terapias para atenuar la enfermedad. Los enfoques terapéuticos que han modulado con éxito la enfermedad EAU han demostrado cierta eficacia en la clínica y han alcanzado el estado aprobado por la FDA. Ejemplos de estos son grupos de medicamentos inmunorreguladores como las terapias dirigidas a células T: ciclosporina, FK-506 y rapamicina 4,5,6. Recientemente, las intervenciones dirigidas a nuevas vías también se han explorado en este modelo para investigar tanto el mecanismo como el efecto sobre el resultado de la enfermedad. Estos incluyen la regulación transcripcional dirigida a través del lector de cromatina Bromodomain Extra-Terminal (BET) proteínas e inhibidores de P-TEFb3. Además, enfoques más convencionales, como un inhibidor de VLA-4, han demostrado recientemente la supresión en EAU a través de la modulación de células T CD4 + efectoras7. Además, también se ha encontrado que dirigirse a las células Th17 con TMP778, un agonista inverso de RORγt, suprime significativamente EAU8. Además, este modelo ofrece la oportunidad de estudiar la inflamación autoinmune crónica en la retina y los mecanismos subyacentes que lo acompañan, como el cebado de linfocitos.

Las lecturas primarias para los estudios preclínicos de EAU son la evaluación clínica mediante la realización de imágenes de fundoscopia de retina y, con menos frecuencia, mediante la evaluación de la integridad de la retina mediante tomografía de coherencia óptica (OCT). La evaluación histopatológica de la retina y el inmunofenotipado de las células de la retina mediante citometría de flujo se llevan a cabo al finalizar. La fundoscopia es un sistema de imágenes en vivo fácil de usar que permite una evaluación clínica rápida y reproducible de toda la retina. Para las evaluaciones inmunohistoquímicas, las técnicas se basan en la preparación de secciones retinianas que nos permiten estudiar la arquitectura tisular para el grado de inflamación y daño estructural9. Los criterios de evaluación y los sistemas de puntuación convencionales, para todas las técnicas utilizadas, se perfilarán dentro de este protocolo. La extensión del daño registrado mediante imágenes fundoscópicas a menudo se correlaciona estrechamente con los cambios histológicos. Este enfoque dual para monitorear y evaluar la gravedad de la enfermedad ofrece una mayor sensibilidad y resultados de medición más confiables.

EAU es un modelo bien establecido y comúnmente utilizado para pruebas preclínicas e investigación de enfermedades oculares inmunomediadas. Este modelo es confiable y reproducible con una incidencia de enfermedad del >95% y genera datos completos que pueden usarse para validar o repudiar nuevas terapias para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intraocular que representa una causa importante de ceguera en edad laboral en todo el mundo10.

Protocol

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986 y las directrices institucionales del Organismo de Revisión Ética y de Bienestar Animal (AWERB). 1. Carcasa de ratones C57BL/6J Alojar ratones en un ambiente específico libre de patógenos, en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y alimentos y agua disponibles ad libitum. Realizar todos los experimentos en mujeres adultas C57BL / 6J (las …

Representative Results

En este protocolo, describimos un método paso a paso para inducir un modelo de uveítis autoinmune experimental (EAU) mediante la inmunización de ratones con un péptido retiniano uveitogénico derivado del IRBP. La evaluación de la enfermedad empleando enfoques ampliamente utilizados y de fácil acceso están cubiertos, aunque estos no son exclusivos y pueden ser añadidos o reemplazados parcialmente por otras técnicas de imagen. Los primeros signos de EAU en ratones C57BL / 6J se pueden detectar dos semanas despué…

Discussion

Los modelos animales experimentales son herramientas necesarias para estudiar la patogénesis de la enfermedad y las pruebas preclínicas de nuevos paradigmas terapéuticos. En el protocolo actual, hemos discutido una metodología para inducir, monitorear y puntuar EAU, un modelo experimental de uveítis inflamatoria intraocular. Este modelo EAU tiene más del 95% de incidencia de enfermedad cuando todos los procedimientos se realizan de acuerdo con el protocolo descrito en este documento, y da como resultado el desarrol…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JG recibió una beca UCL Impact Studentship y fondos de Rosetrees Trust para apoyar a CB. VC recibió una subvención de colaboración en investigación de Akari Therapeutics Inc. Nos gustaría agradecer al Instituto de Oftalmología de UCL, Unidad de Servicio Biológico, especialmente a la Sra. Alison O’Hara y su equipo por su apoyo técnico.

Materials

antisedan ZOETIS, USA for waking up
Complete Freund’s Adjuvant; CFA Sigma, UK F5881 for immunisation 
Domitor Orion Pharma, Finland for anesthesia
Flourescein Sigma, UK F2456 for Angiography
IRBP1-20 Chamberidge peptide, UK peptide;antigen 
Ketamine Orion Pharma, Finland for anesthesia
Micron III Phoenix Research, USA for fundoscopy
Mouse Serum Sigma, UK M5905 for immunisation 
Mycobacterium terberculosis Sigma, UK 344289 for immunisation 
Pertussis Toxin Sigma, UK P2980 for immunisation 
phenylephrine hydrochloride 2.5%  Bausch & Lomb UK  PHEN25 for dilation 
Tropicamide 1% SANDOZ for dilation 
Viscotears WELDRICKS Pharmacy, UK 2082642 for eye lubrication

References

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Cite This Article
Bowers, C. E., Calder, V. L., Greenwood, J., Eskandarpour, M. Experimental Autoimmune Uveitis: An Intraocular Inflammatory Mouse Model. J. Vis. Exp. (179), e61832, doi:10.3791/61832 (2022).

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