Summary
Il protocollo mira a introdurre l'uso di uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo per il monitoraggio a reazione multipla (MRM) di proteine provenienti da campioni clinici. Abbiamo fornito un flusso di lavoro sistematico a partire dalla preparazione dei campioni all'analisi dei dati per i campioni clinici con tutte le precauzioni necessarie da prendere.
Abstract
L'analisi proteomica del tessuto cerebrale umano nell'ultimo decennio ha notevolmente migliorato la nostra comprensione del cervello. Tuttavia, i disturbi legati al cervello continuano ad essere uno dei principali contributori di decessi in tutto il mondo, rendendo necessaria una comprensione ancora maggiore della loro patobiologia. Le tecniche tradizionali basate su anticorpi come il western blotting o l'immunoistochimica soffrono di bassa produttività oltre ad essere laboriose e qualitative o semi-quantitative. Anche gli approcci convenzionali basati sulla spettrometria di massa non riescono a fornire prove conclusive a sostegno di una certa ipotesi. Gli approcci proteomici mirati sono in gran parte guidati da ipotesi e differiscono dagli approcci convenzionali di proteomica del fucile da caccia che sono stati a lungo in uso. Il monitoraggio a reazione multipla è uno di questi approcci mirati che richiede l'uso di uno speciale spettrometro di massa chiamato spettrometro di massa a quadrupolo tandem o spettrometro di massa a triplo quadrupolo. Nel presente studio, abbiamo sistematicamente evidenziato i principali passi coinvolti nell'esecuzione di un flusso di lavoro proteomico basato sulla spettrometria di massa a quadrupolo tandem di successo utilizzando il tessuto cerebrale umano con l'obiettivo di introdurre questo flusso di lavoro a una più ampia comunità di ricerca.
Introduction
Durante l'ultimo decennio, i rapidi sviluppi della spettrometria di massa (SM) insieme a una maggiore comprensione delle tecniche di cromatografia hanno notevolmente aiutato nel progresso della proteomica basata sulla SM. Le tecniche basate sulla biologia molecolare come il western blotting e l'immunoistochimica hanno sofferto a lungo di problemi di riproducibilità, tempi di consegna lenti, variabilità inter-osservatore e la loro incapacità di quantificare accuratamente le proteine, per citarne alcuni. A tal fine, la sensibilità superiore degli approcci proteomici ad alto rendimento continua a offrire ai biologi molecolari uno strumento alternativo e più affidabile nella loro ricerca per comprendere meglio il ruolo delle proteine nelle cellule. Tuttavia, gli approcci di proteomica shotgun (Data dependent Acquisition o DDA) spesso non riescono a rilevare proteine a bassa abbondanza nei tessuti complessi oltre ad essere fortemente dipendenti dalla sensibilità e dalla risoluzione dello strumento. Negli ultimi due anni, i laboratori di tutto il mondo hanno sviluppato tecniche come Data Independent Acquisition (DIA) che richiedono una maggiore potenza di calcolo e un software affidabile in grado di gestire questi set di dati altamente complessi. Tuttavia, queste tecniche sono ancora un work in progress e non molto user friendly. Gli approcci proteomici mirati basati sulla SM forniscono un perfetto equilibrio tra la natura ad alto rendimento degli approcci SM e la sensibilità degli approcci di biologia molecolare come ELISA. Un esperimento mirato di proteomica basato sulla spettrometria di massa si concentra sulla rilevazione di proteine o peptidi guidati da ipotesi da esperimenti di proteomica basati sulla scoperta o attraverso la letteratura disponibile1,2. Il monitoraggio a reazione multipla (MRM) è uno di questi approcci mirati alla SM che utilizza uno spettrometro di massa a quadrupolo tandem per il rilevamento e la quantificazione accurati di proteine / peptidi da campioni complessi. La tecnica offre maggiore sensibilità e specificità nonostante richieda l'uso di uno strumento a bassa risoluzione.
Un quadrupolo è costituito da 4 aste parallele, con ogni asta collegata all'asta diagonalmente opposta. Un campo fluttuante viene creato tra le aste quadrupolo applicando tensioni RF e DC alternate. La traiettoria degli ioni all'interno del quadrupolo è influenzata dalla presenza delle stesse tensioni attraverso barre opposte. Applicando la tensione RF a CC, la traiettoria degli ioni può essere stabilizzata. È questa proprietà del quadrupolo che gli consente di essere utilizzato come filtro di massa in grado di far passare selettivamente ioni specifici. A seconda delle esigenze, un quadrupolo può essere azionato sia in modalità statica che in modalità di scansione. La modalità statica consente il passaggio solo di ioni con un m/z specificato, rendendo la modalità altamente selettiva e specifica per lo ione di interesse. La modalità di scansione, d'altra parte, consente il passaggio di ioni su tutta la gamma m / z. Pertanto, gli spettrometri di massa a quadrupolo tandem possono funzionare in 4 modi possibili: i) il primo quadrupolo che opera in modalità statica mentre il secondo opera in modalità di scansione; ii) il primo quadrupolo operante in modalità di scansione mentre il secondo operante in modalità statica; iii) entrambe le quadruffle che operano in modalità di scansione; e iv) entrambi i quadrupoli operanti in modalità statica3. In un tipico esperimento MRM, entrambi i quadruttori operano in modalità statica consentendo di monitorare specifici precursori e i loro prodotti risultanti dopo la frammentazione. Questo rende la tecnica molto sensibile e selettiva permettendo una quantificazione accurata.
Per i biologi molecolari, il tessuto cerebrale umano e le sue cellule sono un tesoro. Queste notevoli unità di un organo sempre interessante del corpo umano possono fornire informazioni molecolari e cellulari sul suo funzionamento. Le indagini proteomiche del tessuto cerebrale possono non solo aiutarci a capire il funzionamento sistemico di un cervello sano, ma anche i percorsi cellulari che si disregolano quando inflitti da qualche malattia4. Tuttavia, il tessuto cerebrale con tutta la sua eterogeneità è un organo molto complesso da analizzare e richiede un approccio concertato per una migliore comprensione dei cambiamenti a livello molecolare. Il lavoro che segue descrive l'intero flusso di lavoro a partire dall'estrazione di proteine dal tessuto cerebrale, creando e ottimizzando i metodi per il test MRM, fino alla convalida dei bersagli (Figura 1). Qui, abbiamo sistematicamente evidenziato i principali passi coinvolti in un esperimento basato sulla MRM di successo che utilizza tessuto cerebrale umano con l'obiettivo di introdurre la tecnica e le sue sfide a una comunità di ricerca più ampia.
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Protocol
Questo studio coinvolge campioni di tessuto cerebrale di partecipanti umani, esaminati e approvati da TMH e IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). I partecipanti hanno fornito il loro consenso informato e scritto a partecipare a questo studio.
1 Estrazione di proteine dal tessuto cerebrale
- Pesare circa 50 mg di tessuto cerebrale e lavare il tessuto con 300 μL di 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS) utilizzando una micropipetta.
NOTA: Questo passaggio viene eseguito per rimuovere il sangue sulla superficie esterna del tessuto e deve essere ripetuto se necessario. Si consiglia di rimuovere il più possibile il sangue dai tessuti in quanto interferisce con la stima e l'elaborazione delle proteine a valle. - Dopo i lavaggi con PBS, aggiungere 300 μL di tampone di lisi (Tampone A) al tubo contenente il tessuto. Il tampone A contiene 8 M di urea, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM di NaCl, 1 mM di MgCl2 e cocktail inibitore della proteasi (secondo le istruzioni del produttore).
NOTA: La resa proteica varia a seconda di diversi fattori che vanno dalle condizioni in cui vengono conservati i campioni, alla quantità di materiale di partenza e all'efficienza della gestione dei campioni durante la lavorazione. Ridurre il volume del tampone A proporzionalmente quando si lavora con quantità di tessuto inferiori a 50 mg. - Lisire il tessuto utilizzando un sonicatore a sonda mantenendo il tubo su un bagno di ghiaccio. Utilizzare i seguenti parametri per la sonicazione: ampiezza del 40%, ciclo di 5 secondi di on e off per 2:30 min.
- Continuare con l'omogeneizzazione dei tessuti utilizzando un battitore di perle per perlisi completare il tessuto.
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito a velocità media per 90 secondi seguito da incubazione su ghiaccio per 3-5 minuti. - Centrifugare il contenuto del tubo a 6.000 x g per 15 min a 4 °C. Trasferire il surnatante in un tubo fresco e mescolare in modo omogeneo.
NOTA: Fare aliquote del campione e conservare a -80°C fino a nuovo utilizzo.
2 Quantificazione delle proteine e controllo di qualità
- Quantificare i campioni prima della digestione utilizzando un grafico standard realizzato con concentrazioni note di BSA.
NOTA: Assicurarsi che il saggio utilizzato per la stima delle proteine sia compatibile con il tampone utilizzato per la produzione del lisirato proteico. Controllare la qualità del lasato proteico eseguendo un gel SDS-PAGE.
3 Digestione delle proteine
- Prendere 50 μg di proteine in un tubo di microcentrizzazione e ridurre le proteine aggiungendo Tris 2-carbossietilfosfina (TCEP) in modo tale che la concentrazione finale sia di 20 mM. Incubare il contenuto a 37 °C per 1 ora.
- Dopo l'incubazione, alchilare le proteine ridotte aggiungendo iodoacetammide (IAA) al tubo in modo tale che la sua concentrazione finale sia di 40 mM. Incubare il tubo al buio per 30 minuti.
NOTA: Preparare IAA appena prima della sua aggiunta al tubo. - Aggiungere il tampone B al tubo contenente le proteine ridotte e alchilate in modo tale che la concentrazione finale di urea nel tubo sia inferiore a 1 M.
NOTA: Il tampone B è composto da 25 mM Tris (pH 8,0) e 1 mM CaCl2 e viene utilizzato per diluire i campioni. Alla diluizione, assicurarsi che il contenuto del tubo abbia un pH di 8 per una digestione ottimale delle proteine dopo l'aggiunta di tripsina. - Aggiungere la tripsina in un rapporto enzima/proteina di 1:30 e incubare le provette durante la notte a 37 °C con agitazione costante.
- Dopo la digestione, concentrare il prodotto digerito in un concentratore sottovuoto. In questa fase, i peptidi possono essere ricostituiti e dissattati o conservati a -80 °C per un uso futuro.
4 Dissalitura e quantificazione peptidica
NOTA: la desalazione o la pulizia dei peptidi è essenziale prima di caricare i campioni per LC-MS/MS. Sali e altri contaminanti nel campione possono ostruire le colonne e causare danni allo strumento. Il processo può essere eseguito utilizzando punte o colonne C18 disponibili in commercio.
- Attivare la punta dello stadio con 20 μL di acetonitrile al 50% (ACN) in acido formico allo 0,1% (FA). Centrifugare il contenuto a 1.000 x g per 1 minuto ed eliminare il flusso.
NOTA: Le condizioni per la centrifugazione sono le stesse fino alla fine della procedura. - Aggiungere 20 μL di 100% ACN in 0,1% FA e centrifugare il contenuto come al punto 4.1.
NOTA: i passaggi di attivazione possono essere ripetuti un paio di volte. - Dopo l'attivazione, passare 20 μL di campione peptidico ricostituito attraverso la punta dello stadio e la centrifuga come eseguito nel passaggio 4.1.
NOTA: non scartare il flusso in questo passaggio. - Ripetere il passaggio 4.3 con il flusso attraverso almeno 5 volte per garantire il massimo legame peptidico alla punta dello stadio.
- Passare 20 μL dello 0,1% di FA attraverso la punta dello stadio ed eliminare il flusso.
NOTA: ripetere questo passaggio altre due volte per risultati migliori. - Eluire i peptidi legati in un tubo di microfuga fresco passando concentrazioni crescenti di ACN, cioè rispettivamente del 40%, 60% e 80%.
- Asciugare i peptidi in un concentratore di vuoto e procedere alla quantificazione del peptide.
- Ricostituire i peptidi essiccati in 0,1% FA e quantificare utilizzando il metodo Scopes5.
5 Preparazione della lista di transizione degli obiettivi finalizzati
NOTA: una transizione si riferisce alla coppia di precursori (Q1) ai valori m/z del prodotto (Q3) in un esperimento MRM. Un peptide può avere una o molte transizioni, con lo stesso valore Q1 ma diversi valori Q3. Uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo richiede informazioni sulle transizioni per i peptidi e i loro prodotti da rilevare. Quindi, prima di iniziare un esperimento mirato, è necessario preparare un elenco di transizione. Questo può essere fatto utilizzando il repository online di SRMAtlas6 (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) o un software open source chiamato Skyline7 (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view).
- Scarica il recente file del proteoma umano FASTA da UniProt (https://www.uniprot.org/) e crea un file proteoma di sfondo inserendolo in Skyline. Nelle impostazioni peptidiche, vai al menu a discesa Proteoma in background e fai clic su Aggiungi. Feed nel file di sequenza FASTA del proteoma umano. Assicurarsi che questo database sia selezionato e che il valore di scissione mancato consentito sia impostato su 0 prima di procedere al passaggio successivo.
- Ora, sotto la scheda Filtro in Impostazioni peptidi delimitare la lunghezza dei peptidi accettati da 8 a 25 amminoacidi.
- In Impostazioni di transizione, nella scheda Filtro impostare Le cariche precursori su 2,3, impostare Cariche ioniche su 1 e impostare Tipi ioni su y. Gli ioni prodotto possono essere selezionati in base alla scelta dell'utente. Selezionate N-terminale a prolina per ioni speciali e lasciate tutti gli altri parametri come predefiniti.
NOTA: le impostazioni del peptide e della transizione possono variare in base all'esperimento. - Inserire i peptidi o le proteine di interesse cliccando su Modifica e spostandosi su Inserisci. Per inserire proteine, copiare i loro id di adesione e inserire peptidi specifici, copiare le sequenze peptidiche. Il software mappa gli ID di adesione al proteoma di sfondo e l'elenco di transizione viene creato in base alle impostazioni peptidiche e di transizione.
- Esportare l'elenco di transizione. Assicurarsi che nel menu a discesa per Tipo di strumentosia selezionato lo strumento giusto. Per gli esperimenti di ottimizzazione, si può scegliere di dividere gli elenchi di transizione in numeri più piccoli impostando il numero desiderato di transizioni per file in Skyline. Ciò garantirà che lo strumento non sia sopraffatto per schermare troppe transizioni in una singola esecuzione. Il numero di transizioni deve essere ulteriormente ottimizzato per ottenere un unico metodo - questo lo menzioniamo d'ora in poi nella sezione di perfezionamento del metodo.
6 parametri LC
- Utilizzare un sistema a solvente binario con il solvente acquoso contenente lo 0,1% di FA (Solvente A) e il solvente organico contenente l'80% di ACN (Solvente B).
- Impostare la temperatura della colonna a 45 °C.
- Impostare un gradiente LC di 10 min con una portata di 450 μL/min (come mostrato nella Tabella S1).
7 parametri MS
NOTA: Il test spiegato è stato sviluppato e ottimizzato per lo spettrometro di massa a triplo quadrupolo TSQ Altis.
- Ottimizza i parametri di esecuzione come la risoluzione Q1 e Q3, il tempo di permanenza e il tempo di ciclo, un parametro alla volta. Troviamo che la risoluzione 0.7 per Q1 e Q3 funzioni meglio. Potrebbe essere necessario modificare il tempo di ciclo o il tempo di permanenza in base al numero di transizioni e alla larghezza media del picco dei peptidi monitorati.
- Utilizzare i parametri MS nella tabella S2 e nella tabella S3. La durata totale del metodo è di 10 min.
NOTA: i parametri rimangono gli stessi per tutte le esecuzioni durante e dopo il perfezionamento del metodo, se non diversamente specificato. Per un nuovo esperimento, potrebbe essere necessario modificare determinati parametri a seconda del tipo di campione e delle fasi di elaborazione del campione.
8 Sequenza di esecuzione e controllo di qualità dello strumento
- Preparare una miscela di acqua: metanolo: isopropanolo: acetonitrile in rapporto 1:1:1:1. Usa questa miscela come uno spazio vuoto.
- Preparare peptidi per qualsiasi campione standard che può essere utilizzato per monitorare costantemente le prestazioni dello strumento. Questo sarà usato come standard QC. Rileviamo peptidi da digest BSA che sono stati ottimizzati e diamo una risposta buona e coerente per diversi giorni (Figura 2).
- Per eseguire i campioni, la sequenza dovrebbe iniziare con un paio di spazi vuoti, seguiti dallo standard QC e dai campioni clinici. Assicurarsi sempre che ci sia uno spazio vuoto tra due campioni consecutivi.
- Per facilitare il confronto, assicurarsi che quantità e volumi uguali di ciascun campione vengano iniettati ogni volta.
9 Affinamento del metodo
- Analizza i dati preliminari ottenuti dai campioni raggruppati utilizzando Skyline. Cerca il picco, le transizioni e i parametri giusti come la forma e l'intensità del picco per selezionare i risultati migliori. Salvare il file come nuovo progetto Skyline.
- Utilizzare una libreria per trovare il picco corrispondente migliore e di conseguenza si consiglia la migliore lista di transizione possibile. Una libreria è un insieme di picchi MS/MS disponibili dalla letteratura o da esperimenti interni.
- Esporta un nuovo elenco di transizione dal progetto Skyline appena salvato e utilizza questo elenco di transizione per creare un nuovo metodo. Acquisisci i dati dal nuovo metodo creato e ripeti il processo di perfezionamento delle transizioni utilizzando Skyline.
- Una volta che l'elenco dei peptidi e delle transizioni è finalizzato dopo l'analisi dei dati utilizzando Skyline, perfeziona il metodo provando diverse permutazioni del tempo di ciclo e del tempo di permanenza.
NOTA: L'uso di peptidi sintetici marcati pesantemente e peptidi iRT (Indexed Retention Time) rende facile il perfezionamento del metodo8,9. È quindi consigliabile che la messa a punto del metodo venga eseguita utilizzando questi peptidi. - Utilizzando le informazioni sul tempo di conservazione degli esperimenti di perfezionamento, creare un metodo finale pianificato (con una finestra di acquisizione definita).
- Preparare campioni per singoli soggetti. I dati saranno acquisiti per questi campioni utilizzando il metodo finale programmato.
- Una volta acquisiti i dati, è possibile eseguire ulteriori analisi a valle e confronti di gruppo importando i file raw in Skyline.
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Representative Results
Abbiamo eseguito la quantificazione relativa di 3 proteine da 10 campioni, 5 campioni da ciascun gruppo di pazienti con anomalie nel cervello. Queste proteine includevano Apolipoproteina A-I (APOA-I), Vimentina (VIM) e Nicotinamide fosforibosiltransferasi (NAMPT) che sono noti per svolgere ruoli diversi nelle cellule cerebrali. L'analisi post-run dei dati è stata eseguita utilizzando Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). Sono stati monitorati un totale di 10 peptidi corrispondenti a 3 proteine. Questi includevano 3 peptidi per APOA-I, 4 peptidi per VIM e 3 peptidi per NAMPT. Il numero totale di transizioni da questi 10 peptidi ammontava a 57. I campioni sono stati raggruppati in uno dei due gruppi a seconda della condizione a cui appartenevano. Utilizzando la funzione di confronto di gruppo dello skyline, sono state confrontate le abbondanze di picco di questi peptidi e sono stati calcolati i relativi valori di quantificazione (Figura 3).
Figura 1: Una panoramica delle fasi coinvolte in un esperimento di monitoraggio a reazioni multiple. A. La preparazione del campione per un tipico esperimento di proteomica comporta l'estrazione di proteine (per esempio abbiamo mostrato un campione di tessuto) seguita dalla digestione con tripsina. I peptidi digeriti vengono infine dissattati e resi pronti per LC-MS. B. Le fasi coinvolte in un esperimento MRM includono la selezione degli ioni precursori e prodotti in base ai loro valori m/ z. Solo le transizioni che mostrano una buona risposta sono considerate per l'analisi. C. L'analisi dei dati in un esperimento MRM include un esame dettagliato delle forme di picco e delle aree di picco. Questo è in definitiva seguito da un'analisi statistica dei risultati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Coerenza nella risposta per BSA utilizzando un metodo MRM ottimizzato. A. Il cromatogramma per un peptide rappresentativo di BSA mostra una forma e un'intensità di picco coerenti durante i cinque giorni in cui è stato eseguito l'esperimento. B. Coerenza del tempo di ritenzione osservata per il peptide in tutti e cinque i giorni dell'esperimento C. Aree di picco per il peptide come visto nel corso di cinque giorni della settimana. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Regolazione differenziale di tre proteine in due gruppi di campioni tumorali GBM. A. Cromatogrammi rappresentativi per apolipoproteina A-I e area di picco cumulativa come visto dopo confronto tra gruppi. B. Cromatogrammi rappresentativi per Vimentina e area di picco cumulativa come visto dopo il confronto tra gruppi. C. Cromatogrammi rappresentativi per Nicotinamide fosforibosiltransferasi e area di picco cumulativa come visto dopo confronto tra gruppi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella S1: Dettagli del gradiente LC di 10 minuti da utilizzare per tutti i campioni. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella S2: Impostazioni dei parametri per la sorgente di ioni. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella S3: Impostazioni dei parametri per il metodo MRM. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Tecniche come l'immunoistochimica e il Western blotting sono state considerate come i gold standard per la convalida di bersagli proteici per molti anni. Questi metodi trovano uso ancora oggi con piccole modifiche nel protocollo e poca dipendenza dalla tecnologia che li rende molto ingombranti e noiosi. Oltre a questo, comportano anche l'uso di anticorpi costosi che non sempre mostrano la stessa specificità tra i lotti e richiedono una grande quantità di esperienza. Inoltre, solo una piccola frazione di proteine identificate utilizzando tecniche ad alto rendimento come la spettrometria di massa, hanno anticorpi compatibili disponibili, complicando ulteriormente l'intera procedura. Quindi i saggi proteomici mirati vengono lentamente adottati come il nuovo approccio per la convalida degli obiettivi10. Con la maggior parte della scoperta del target che avviene su piattaforme omiche ad alto throughput, vengono presi in considerazione anche pannelli di target convalidati per applicazioni di screening clinico11,12,13.
I risultati rappresentativi di questo articolo hanno convalidato l'espressione differenziale delle proteine Apolipoproteina A-I (APOA-I), Vimentina (VIM) e Nicotinamide fosforibosiltransferasi (NAMPT) in due condizioni (condizione 1 e condizione 2) del tessuto cerebrale. È stato riportato che l'apolipoproteina A-I svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'integrità cerebrovascolare e nella riduzione del rischio di malattia di Alzhiemer. Anche se ApoA-I non è sintetizzato nel cervello, la sua capacità di attraversare la barriera emato-encefalica (BBB) rende la sua presenza nel cervello vitale14. La proteina Vimentina è stata studiata in una serie di ruoli all'interno del cervello. Tuttavia, una delle funzioni chiave di Vimentin è il suo coinvolgimento nell'attivazione della microglia. La ridotta espressione di Vimentina è stata associata a compromissione dell'attivazionemicrogliale 15. La proteina NAMPT è stata segnalata per svolgere un ruolo chiave nell'invecchiamento correlato alla perdita di neuroni e disfunzioni endoteliali vascolari cerebrali16. Tutte e tre le proteine sono state segnalate per svolgere una moltitudine di ruoli nelle cellule cerebrali normali e tumori maligni correlati al cervello. Pertanto, la convalida basata sulla MRM per queste proteine e i loro peptidi può trovare grande uso nella diagnosi clinica correlata a vari disturbi legati al cervello.
Un test mirato completamente ottimizzato può essere facilmente utilizzato per il rilevamento e la quantificazione ad alto rendimento di un pannello target. La fase di limitazione della velocità è l'ottimizzazione iniziale del metodo che è noiosa e varia in base al tipo di campione, ai bersagli proteici / peptidici, allo strumento utilizzato e al bias di rilevamento di alcuni peptidi. È fondamentale che l'elenco di transizione sia ottimizzato per un test robusto. Qualsiasi utente interessato a sviluppare un tale test per campioni di tessuto cerebrale umano scoprirà che il protocollo sopra spiegato minimizza questi fattori variabili. Descrive un protocollo ottimizzato per l'estrazione peptidica da questo biospecimen tissutale unico e noioso e parametri ottimali da utilizzare nello strumento con particolare attenzione alle fasi cruciali del controllo di qualità in vari punti del protocollo. Come con qualsiasi nuova tecnologia, i ricercatori hanno fornito una serie di linee guida, che gli autori devono fornire o quali passi seguono durante l'esperimento. Su questo fronte, nel 2017, sono state stabilite le linee guida MCP per la segnalazione di saggi e dati di proteomica mirata17. Queste linee guida assicurano che lo studio/test riportato sia affidabile e riproducibile, aumentando così l'applicabilità del metodo. Prendendo le giuste precauzioni e utilizzando il vero potenziale di questo test, i ricercatori sarebbero presto in grado di elaborare saggi clinicamente rilevanti con un immenso potenziale nella diagnosi e nella terapia.
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Disclosures
Gli autori hanno ricevuto il sostegno di Thermofisher per la tassa di pubblicazione.
Acknowledgments
Riconosciamo mhrd-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), progetto #34_IITB a SS e MASSFIITB Facility presso IIT Bombay supportato dal Dipartimento di Biotecnologie (BT / PR13114 / INF / 22/206/ 2015) per effettuare tutti gli esperimenti relativi alla SM.
Estendiamo i nostri ringraziamenti speciali al signor Rishabh Yadav per la realizzazione e il montaggio dell'intero video e al signor Nishant Nerurkar per il suo lavoro nel montaggio dell'audio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC - Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
References
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