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Immunology and Infection

एडीज एजिप्टी मच्छरों में पशु-व्युत्पन्न रक्त और कृत्रिम भोजन को खिलाना और मात्रा निर्धारित करना

Published: October 22, 2020 doi: 10.3791/61835
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2
1Laboratory of Neurogenetics and Behavior, The Rockefeller University, 2Department of Biological Sciences, Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक कृत्रिम झिल्ली फीडर के माध्यम से एडीज एजिप्टी मच्छरों को पशु-व्युत्पन्न और कृत्रिम रक्त भोजन वितरित करना है और भोजन की मात्रा को ठीक से निर्धारित करना है।

Abstract

कुछ मच्छर प्रजातियों की मादाएं अंडे के विकास के लिए आवश्यक प्रोटीन युक्त रक्त भोजन प्राप्त करने के लिए कशेरुकी मेजबानों को काटने के दौरान बीमारियों को फैला सकती हैं। प्रयोगशाला में, शोधकर्ता झिल्ली फीडर के माध्यम से मच्छरों को पशु-व्युत्पन्न और कृत्रिम रक्त भोजन वितरित कर सकते हैं, जो भोजन संरचना में हेरफेर के लिए अनुमति देते हैं। यहां, हम एडीज एजिप्टी मच्छरों को रक्त और कृत्रिम रक्त भोजन खिलाने और व्यक्तिगत महिलाओं द्वारा उपभोग की मात्रा की मात्रा निर्धारित करने के तरीके प्रस्तुत करते हैं।

कृत्रिम/रक्त भोजन के लक्षित भोजन और मात्राकरण में व्यापक उपयोग होते हैं, जिनमें मच्छर व्यवहार और शरीर विज्ञान पर भोजन घटकों के प्रभावों का परीक्षण करना, इंजेक्शन के बिना औषधीय यौगिकों को वितरित करना और विशिष्ट रोगजनकों के साथ मच्छरों को संक्रमित करना शामिल है । भोजन से पहले भोजन में फ्लोरोसेसिन डाई जोड़ना बाद के भोजन के आकार की मात्राकरण के लिए अनुमति देता है। मच्छरों द्वारा उपभोग किए जाने वाले भोजन की मात्रा को वजन से मापा जा सकता है, यदि मादाओं का उपयोग बाद में व्यवहार प्रयोगों के लिए किया जाना है, या 96-अच्छी प्लेटों में व्यक्तिगत महिलाओं को समरूप बनाकर और प्लेट रीडर का उपयोग करके फ्लोरेसेंस स्तर को अंतिम बिंदु परख के रूप में मापता है। भोजन के आकार की मात्रा का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि भोजन के घटकों को बदलने से भोजन की मात्रा में परिवर्तन होता है या यदि भोजन की खपत मच्छरों के उपभेदों के बीच अलग होती है। सटीक भोजन आकार मात्रा भी बहाव परख के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे मेजबान आकर्षण या fecundity पर प्रभाव को मापने के रूप में । यहां प्रस्तुत किए गए तरीकों को दिनों के दौरान भोजन पाचन को ट्रैक करने के लिए या एक मच्छर द्वारा प्रत्येक भोजन की खपत को निर्धारित करने के लिए विभिन्न भोजन (अमृत और रक्त की तरह) में जोड़े गए कई विशिष्ट मार्कर शामिल करने के लिए और अनुकूलित किया जा सकता है।

ये तरीके शोधकर्ताओं को सैकड़ों व्यक्तिगत मच्छरों द्वारा उपभोग किए गए भोजन की मात्रा की तुलना करने के लिए उच्च थ्रूपुट माप करने की अनुमति देते हैं। इसलिए ये उपकरण विविध जैविक सवालों का जवाब देने के लिए मच्छर शोधकर्ताओं के समुदाय के लिए मोटे तौर पर उपयोगी होंगे।

Introduction

हम एक कृत्रिम झिल्ली फीडर का उपयोग करके एडीज एजिप्टी मच्छरों को संशोधित रक्त भोजन खिलाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और प्रत्येक व्यक्ति मच्छर द्वारा उपभोग किए जाने वाले भोजन की मात्रा को ठीक से मापते हैं। इस प्रोटोकॉल को भोजन की सामग्री को बदलने या मच्छरों के विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों द्वारा उपभोग किए गए भोजन की मात्रा की तुलना करने के लिए लचीले ढंग से अनुकूलित किया जा सकता है।

एई एजिप्टी मच्छर रोगजनकों को फैलने से वैश्विक स्वास्थ्य को खतरा है जो पीले बुखार, डेंगू बुखार, चिकनगुनिया और ज़िका1,2,3,4, 5सहित बीमारियों का कारणबनताहै। एई. एजिप्टी मादाएं रक्त-फीडरों को बाध्य करती हैं; उन्हें अंडे के विकास के लिए आवश्यक प्रोटीन प्राप्त करने के लिए कशेरुकी रक्त का उपभोग करना चाहिए, और अंडे के प्रत्येक क्लच को कम से कम एक मेजबान6,7,8से पूर्ण रक्त भोजन की आवश्यकता होती है । मादा मच्छर पहले त्वचा को उसके स्टाइल के साथ छेदकर और लार का इंजेक्शन देकर काटती है, जिसमें यौगिक होते हैं जो मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया9को ट्रिगर करते हैं। वह तो उसे मिडगिट में उसके स्टाइल के माध्यम से रक्त पंप द्वारा खिलाती है । संक्रमित मेजबान से रक्त भोजन का उपभोग करते समय, वह रक्त जनित रोगजनकों6,8को निगल सकती है, जो मच्छर के मिडगुट से उसकी लार ग्रंथियों10में स्थानांतरित हो जाता है। इस तरीके से संक्रमित मादा मच्छर11,12के बाद के मेजबानों को काटने पर लार के साथ रोगजनकों को इंजेक्शन देकर बीमारी फैला सकते हैं । मच्छर जनित रोगों के संचरण को नियंत्रित करने में रक्त-आहार व्यवहार के तंत्र को समझना और मात्रा निर्धारित करना महत्वपूर्ण कदम हैं।

मच्छर पालन और प्रयोग के लिए कई प्रयोगशाला प्रोटोकॉल चूहों, गिनी सूअरों या मनुष्यों सहित जीवित जानवरों का उपयोग रक्त स्रोत के रूप में13,14,15, 16करतेहैं। जीवित जानवरों का उपयोग नैतिक चिंताओं के साथ-साथ कार्मिक प्रशिक्षण, पशु आवास और देखभाल, और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) नीतियों के अनुपालन के लिए जटिल आवश्यकताओं को लगाता है । यह मच्छरों को वितरित किए जा सकने वाले यौगिकों के प्रकारों को भी सीमित करता है, जो17किए जा सकने वाले अध्ययनों को बाधित करता है।

कृत्रिम रक्त-आहार उपकरण, जो आम तौर पर मेजबान त्वचा का अनुकरण करने के लिए झिल्ली प्रणाली का उपयोग करते हैं, रक्त-भोजन व्यवहार का अध्ययन करने के लिए उपयोगी उपकरण हैं जो लाइव मेजबानों के रखरखाव की आवश्यकता को दरकिनार करते हैं। पूरे रक्त को कई विक्रेताओं से खरीदा जा सकता है और गर्म, पानी-जैकेट वाले कृत्रिम झिल्ली फीडर या इसी तरह के उपकरणों18, 19का उपयोग करके मच्छरों को खिलाया जासकताहै। इस प्रोटोकॉल में, हम छोटे, डिस्पोजेबल झिल्ली फीडरों के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं जिसे "ग्लीट्यूब" कहा जाता है। इस झिल्ली फीडर, पहले कोस्टा-दा-सिल्वा एट अल द्वारा प्रकाशित ( २०१३)20,आसानी से मानक प्रयोगशाला उपकरणों से इकट्ठा किया जा सकता है, यह मच्छरों की मध्यम संख्या के लिए रक्त भोजन देने के लिए आदर्श बनाने और बड़े समूहों या कई भोजन योगों के परीक्षण के लिए पैमाने पर सीधा । ग्लीट्यूब अन्य वाणिज्यिक कृत्रिम फीडरों के लिए एक सस्ता और कुशल विकल्प है, जिसके लिए बड़े भोजन की मात्रा की आवश्यकता हो सकती है और एक ही भोजन निर्माण21पर मच्छरों के बड़े समूहों को खिलाने के लिए अधिक उपयुक्त हैं।

इस प्रोटोकॉल में दो खंड शामिल हैं: कृत्रिम भोजन तैयार करना/वितरित करना और खपत की मात्रा बताना । पहले खंड में, ग्लीट्यूब का उपयोग हेरफेर आहार देने के लिए एक कुशल साधन के रूप में किया जाता है। पूरे रक्त को रक्त भोजन के बदले रक्त विकल्प के प्रभावों की तुलना करने के लिए पूरी तरह से कृत्रिम भोजन के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। कोगन (1 99 0)22 से अनुकूलित एक नुस्खा यहां प्रस्तुत किया गया है, हालांकि कई कृत्रिम भोजन योगों को23,24विकसित किया गया है। इसके अलावा, इंजेक्शन की तुलना में औषधीय यौगिकों को पेश करने के लिए भोजन एक कम आक्रामक और कम श्रमसाध्य विधि है। प्रत्येक भोजन (1-2 एमसीएल) के लिए आवश्यक कम कुल मात्रा के कारण, यह प्रोटोकॉल महंगे अभिकर् म की मात्रा को कम करने के लिए एक आकर्षक वितरण विधि प्रदान करता है। एई एजिप्टी मादाएं आसानी से एडेनोसाइन 5'-ट्रिप्होस्फेट (एटीपी)25, 26के साथ नमकीन समाधान के प्रोटीन-मुक्त भोजन का उपभोग करती हैं, जो एकल भोजन घटकों के प्रभावों को मापने के लिए एक आधार रेखा प्रदान करती है। उदाहरण के लिए, एई में न्यूरोपेप्टाइड वाई-लाइक रिसेप्टर 7 (NPYLR7) एजिप्टी को प्रोटीन युक्त रक्त भोजन के बाद मेजबान-मांग दमन में मध्यस्थता करने के लिए जाना जाता है, और जब NPYLR7 agonists को प्रोटीन मुक्त खारा भोजन में जोड़ा जाता है, तो मादा मच्छर उन लोगों के समान मेजबान-मांग दमन प्रदर्शित करते हैं जिन्होंने पूरे रक्त का सेवन किया है7।

दूसरे खंड में, एक व्यक्तिगत मादा मच्छर द्वारा उपभोग किए जाने वाले प्रत्येक भोजन की मात्रा की मात्रा निर्धारित करने के लिए कदम प्रस्तुत किए जाते हैं। यह परख फ्लोरेसेंस-आधारित है और उन तरीकों की तुलना में उच्च संकल्प में फीडिंग की स्थिति को कैप्चर करता है जिनमें महिलाओं को अकेले पेट के तनाव के दृश्य मूल्यांकन के आधार पर "फेड" या "अनफेड" के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। भोजन से पहले भोजन में फ्लोरोसेइन जोड़कर, व्यक्तियों द्वारा किए जाने वाले भोजन की मात्रा को 96-अच्छी तरह से प्लेट में प्रत्येक मच्छर को समरूप बनाकर और एक रीडआउट के रूप में फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। यह परख भोजन संरचना या मच्छरों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि जैसे चर के जवाब में खिलाने की ताक़त में अंतर को माप सकती है। मध्यवर्ती भोजन के आकार के लिए सटीक मात्राकरण महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए जब महिलाओं को सबऑप्टिमल भोजन की पेशकश की जाती है जिसमें भोजन निवारक होते हैं या जब वे चर आकार27के सुक्रोज भोजन का उपभोग करते हैं। यदि भोजन के आकार के मात्राकरण के बाद बाद के व्यवहार परख के लिए खिलाया मच्छरों की आवश्यकता होती है, तो भोजन के आकार की गणना समूहों में एनेस्थेटाइज्ड मादाओं को तौलकर और प्रति व्यक्ति औसत वृद्धि द्रव्यमान का आकलन करके की जा सकती है। हालांकि फ्लोरोसेइन अंकन की तुलना में कम सटीक, वजन अभी भी भोजन की मात्रा का एक एकत्रित अनुमान प्रदान करता है और डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं पर भोजन के प्रभाव की जांच की अनुमति देता है, जैसे कि fecundity या बाद में मेजबान आकर्षण। जबकि रक्त भोजन का आकार परिवर्तनशील है और11,28,29के असंख्य कारकों से प्रभावित हो सकता है , यहां वर्णित तरीकों के साथ मापा गया भोजन का आकार पिछले मात्रा7, 30,31के अनुरूप है ।

Protocol

जीवित जानवरों या मानव मेजबानों का उपयोग करके रक्त-आहार प्रक्रियाओं का पालन नहीं किया गया और रॉकफेलर विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) और संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा निर्धारित दिशा-निर्देशों का पालन किया गया ।

1. भोजन की तैयारी

  1. फैगोस्टिमुलेंट, एडेनोसाइन 5'-ट्रिप्होस्फेट की तैयारी
    1. जलीय NaHCO3 (आणविक वजन, मेगावाट = 84.006 जी/मोल) का 25 mm समाधान तैयार करें। 25 एमएम एनएएचसीओ3के 100 मिलियन एमएल के लिए, एक वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में 210 मिलीग्राम नाएचसीओजोड़ें और 100 मिलीएल की कुल मात्रा में डबल-डिस्टिल्ड पानी (डीडीएच2ओ) से भरें। एक चुंबकीय हलचल बार का उपयोग करके, समाधान को अच्छी तरह से मिलाएं जब तक कि सभी नाएचसीओ3 भंग न हो जाए।
    2. जलीय 25 एमएम नाएचसीओ3 में एटीपी डिसोडियम साल्ट हाइड्रेट (एमडब्ल्यू = 551.14 ग्राम/मोल) का पुनर्गठन 200 एमएम एटीपी की अंतिम एकाग्रता के लिए। 25 एमएम एनएएचसीओ3 बफर में 200 एमएम एटीपी की कुल 10 मिलियन की मात्रा के लिए, एक वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में 1.1 ग्राम एटीपी डिसोडियम साल्ट हाइड्रेट जोड़ें और 25 एमएम नाएचसीओ3 बफर से 10 मिलियन की कुल मात्रा में भरें। एक चुंबकीय हलचल बार का उपयोग करना, अच्छी तरह से समाधान मिश्रण जब तक सभी एटीपी भंग कर दिया है ।
      नोट: एटीपी के हाइड्रोलिसिस को कम करने के लिए, इसे नाएचसीओ3जैसे नमक समाधान द्वारा बफर किया जाना चाहिए।
    3. अलीकोट एटीपी सॉल्यूशन और स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर।
      नोट: एटीपी के इस शेयर समाधान आम तौर पर हर छह महीने ताजा किया जाता है और सभी नीचे वर्णित भोजन के लिए प्रयोग किया जाता है । गिरावट को रोकने के लिए, एटीपी एलिकोट्स को कई फ्रीज-गल चक्रों से नहीं गुजरना चाहिए या अन्य भोजन घटकों के साथ गर्म नहीं किया जाना चाहिए।
  2. फ्लोरोसेंट ट्रेसर समाधान, फ्लोरोसेन की तैयारी
    1. जलीय फ्लोरोसिन का 2% (w/v) स्टॉक समाधान तैयार करें। 10 एमएल के कुल स्टॉक समाधान की मात्रा के लिए, कमरे के तापमान पर एल्यूमीनियम फॉयल में लिपटे 15 एमएल शंकु नली में डीडीएच2ओ के 10 एमएल के साथ फ्लोरोसेइन डिसोडियम नमक के 0.2 ग्राम मिलाएं। फ्लोरोसिन के इस स्टॉक समाधान का उपयोग नीचे वर्णित सभी भोजन में कमजोर पड़ने के लिए किया जा सकता है।
      नोट: फ्लोरोसिन के रूप में प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, एल्यूमीनियम पन्नी में कंटेनरों लपेटकर प्रकाश के संपर्क से बचें ।
  3. पशु-व्युत्पन्न रक्त भोजन की तैयारी
    1. सभी मच्छरों को खिलाने के लिए आवश्यक भोजन की संख्या की गणना करें; प्रत्येक ग्लाईट्यूब में 2 एमएल भोजन होता है और लगभग 25 मच्छरों को खिलाता है। फ्लोरेसेंस रीडिंग के लिए मानक वक्र को जांचने के लिए एक अतिरिक्त भोजन तैयार करें। जब तक अन्यथा नहीं कहा जाता है, इस खंड में सभी कदम 2 एमएल की अंतिम मात्रा के साथ एक भोजन तैयार करने के लिए आवश्यक अभिकर्मक राशि का वर्णन करते हैं।
    2. पशु-व्युत्पन्न रक्त भोजन के लिए, 1.98-2 एमएल डिफिब्रिनेड भेड़ रक्त को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें (रक्त की वांछित मात्रा के लिए चरण 3.3 देखें)।
      नोट: भेड़, गिनी सूअरों और मनुष्यों सहित कशेरुकी रक्त के व्यावसायिक रूप से डिफिब्रिनेट स्रोतों का उपयोग13किया जा सकता है । उपयोग करने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि खरीदे गए रक्त ने अपनी समाप्ति तिथि पारित नहीं की है और बोतल को उलटा करके इसे अच्छी तरह से मिलाएं, खासकर यदि रक्त घटकों का दृश्य अलगाव दिखाई दे रहा है।
    3. इष्टतम भोजन के लिए, पानी के स्नान में भेड़ के रक्त को 45 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के बाद 1-2 mm की अंतिम एकाग्रता में एटीपी जोड़ें। 1 एमएमएप एटीपी की अंतिम एकाग्रता के लिए, 200 एमएम एटीपी स्टॉक समाधान के 10 माइक्रोन को पूर्व-गर्म रक्त और मिश्रण के 1.99 मिलियन में जोड़ें। 2 एमएम एटीपी की अंतिम एकाग्रता के लिए, 200 एमएम एटीपी स्टॉक के 20 माइक्रोन को पूर्व-गर्म रक्त और मिश्रण के 1.98 मिलियन मिलियन में जोड़ें। यदि एटीपी को नहीं जोड़ा जाना है, तो डिफिब्रिनेट भेड़ रक्त के 2 मिलील गर्म करें।
    4. यदि भोजन के आकार का फ्लोरेसेंस-आधारित मात्राकरण बाद में किया जाना है, तो 2 एमएल कुल भोजन की मात्रा में 0.002% (2% फ्लोरोसेइन स्टॉक के 2 माइक्रोन) की अंतिम एकाग्रता में फ्लोरोसेइन समाधान जोड़ें। फ्लोरोसिन के रूप में एक ही राशि से रक्त की मात्रा को कम करें। संदर्भ मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए 0.002% फ्लोरोसेइन युक्त अंतिम भोजन निर्माण के 1 एमसीएल को बनाए रखें। मच्छरों को दिए जा रहे भोजन के समान बनाए गए वॉल्यूम का इलाज करें; प्रयोग की अवधि के दौरान एक ही प्रकाश और तापमान की स्थिति को बेनकाब करें, और बाद में वितरित भोजन के साथ इसे फ्रीज करें।
  4. कृत्रिम रक्त भोजन की तैयारी
    1. सभी मच्छरों को खिलाने के लिए आवश्यक भोजन की संख्या की गणना करें; प्रत्येक ग्लाईट्यूब में 2 एमएल भोजन होता है और लगभग 25 मच्छरों को खिलाता है। फ्लोरेसेंस रीडिंग के लिए मानक वक्र को जांचने के लिए एक अतिरिक्त भोजन तैयार करें। जब तक अन्यथा नहीं कहा जाता है, इस खंड में सभी कदम एक 2 एमएल भोजन तैयार करने के लिए आवश्यक अभिकर्मक राशि का वर्णन करते हैं।
    2. कृत्रिम रक्त (कोगन (1990)22से अनुकूलित) तैयार करने के लिए, तालिका 1के रूप में, पहले 400 mM NaHCO 3 का स्टॉक समाधानकरें। 400 m M NaHCO 3 (MW =84.006 g/मोल) के 10 मिलीएल की कुल मात्रा के लिए, एक वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में336 मिलीग्राम एनएएचसीओ 3 जोड़ें और डबल-डिस्टिल्ड पानी (डीडीएच2ओ) से 10 मिलीएल की कुल मात्रा में भरें। एक चुंबकीय हलचल बार का उपयोग करके, समाधान को अच्छी तरह से मिलाएं जब तक कि सभी नाएचसीओ3 भंग न हो जाए।
    3. कृत्रिम रक्त के प्रोटीन घटकों के लिए, 400 mm NaHCO3में γ-ग्लोबुलिन के 50 मिलीग्राम/एमएल के स्टॉक समाधान तैयार करें, डीएच 2 ओ में हीमोग्लोबिन के 35 मिलीग्राम/एमएल, और डीडीएच2ओ में एल्बुमिन के 300 मिलीग्राम/एमएल। प्रोटीन स्टॉक समाधान2महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। कृत्रिम रक्त में कुल मानव प्रोटीन की अंतिम सांद्रता 125 मिलीग्राम/एमएल है। इसमें 15 मिलीग्राम/एमएल γ-ग्लोबुलिन, 8 मिलीग्राम/एमएल हीमोग्लोबिन और १०२ मिलीग्राम/एमएल एल्बुमिन की अंतिम सांद्रता शामिल है ।
    4. प्रत्येक 2 मिली मील के भोजन के लिए, टेबल 1में सूचीबद्ध स्टॉक समाधानों से γ-ग्लोबुलिन के 600 माइक्रोन, हीमोग्लोबिन के 460 माइक्रोन, एल्बुमिन के 680 माइक्रोन, और डीडीएच 2 ओ के250माइक्रोन को मिलाएं। भोजन पेश करने से तुरंत पहले, भोजन को 45 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के बाद तक 200 mm एटीपी स्टॉक समाधान के 10 माइक्रोल जोड़ने के लिए प्रतीक्षा करें।
    5. यदि भोजन के आकार का फ्लोरेसेंस-आधारित मात्राकरण बाद में किया जाना है, तो 2 एमएल कुल भोजन की मात्रा में 0.002% (2% फ्लोरोसेइन स्टॉक के 2 माइक्रोन) की अंतिम एकाग्रता में फ्लोरोसेइन समाधान जोड़ें। फ्लोरोसिन के रूप में एक ही राशि से कदम 4.4 में DDH2O की मात्रा कम करें। संदर्भ मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए 0.002% फ्लोरोसेइन युक्त अंतिम भोजन निर्माण के कम से कम 1 एमएल बनाए रखें। मच्छरों को दिए जा रहे भोजन के समान बनाए गए वॉल्यूम का इलाज करें; प्रयोग की अवधि के दौरान एक ही प्रकाश और तापमान की स्थिति को बेनकाब करें, और बाद में वितरित भोजन के साथ इसे फ्रीज करें।
  5. उदाहरण प्रोटीन मुक्त खारा भोजन की तैयारी (Duvall एट अल से अनुकूलित( 2019)7)
    नोट: प्रोटीन मुक्त खारा भोजन कई मायनों में तैयार किया जा सकता है7,27,३२। यहां प्रस्तुत खारा भोजन ऊपर वर्णित कृत्रिम रक्त नुस्खा का एक प्रोटीन मुक्त संस्करण है ।
    1. सभी मच्छरों को खिलाने के लिए आवश्यक भोजन की संख्या की गणना करें; प्रत्येक ग्लिटब में 2 एमएल भोजन होता है और लगभग 25 मच्छरों को फ्लोरेसेंस माप के लिए मानक वक्र को जांचने के लिए एक अतिरिक्त भोजन तैयार करते हैं। जब तक अन्यथा नहीं कहा जाता है, इस खंड में सभी कदम एक 2 एमएल भोजन तैयार करने के लिए आवश्यक अभिकर्मक राशि का वर्णन करते हैं।
    2. खारा भोजन तैयार करने के लिए, 400 mM NaHCO3का एक स्टॉक समाधान बनाते हैं। 400 m M NaHCO 3 (MW =84.006 g/मोल) के 10 एमएल की कुल मात्रा के लिए, एक वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में336 मिलीग्राम एनएएचसीओ 3 जोड़ें और डीएच2ओ से कुल 10 मिलीएल की मात्रा में भरें। एक चुंबकीय हलचल बार का उपयोग करके, समाधान को अच्छी तरह से मिलाएं जब तक कि सभी नाएचसीओ3 भंग न हो जाए।
    3. प्रत्येक 2 मिली मील के भोजन के लिए, 15 एमएल शंकु नली में मिलाएं 600 μL 400 m M NaHCO3 के 1.39 मिलीएल के साथ ddH 2 O.200mM एटीपी स्टॉक समाधान के 10 μL जोड़ने के लिए रुको जब तक भोजन के बाद एक पानी स्नान में 45 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया गया है।
    4. यदि भोजन के आकार का फ्लोरेसेंस-आधारित मात्राकरण बाद में किया जाना है, तो कुल भोजन की मात्रा के 2 एमएल में 0.002% (2% फ्लोरोसेइन स्टॉक के 2% फ्लोरेसिन स्टॉक के 2 माइक्रोन) की अंतिम एकाग्रता में फ्लोरोसेइन समाधान जोड़ें। फ्लोरोसेइन के रूप में एक ही राशि से कदम 5.3 में DDH2O की मात्रा को कम करें। संदर्भ मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए 0.002% फ्लोरोसेइन युक्त अंतिम भोजन निर्माण के कम से कम 1 एमएल बनाए रखें। मच्छरों को दिए जा रहे भोजन के समान बनाए गए वॉल्यूम का इलाज करें; प्रयोग की अवधि के दौरान एक ही प्रकाश और तापमान की स्थिति को बेनकाब करें, और बाद में वितरित भोजन के साथ इसे फ्रीज करें।

2. मच्छरों को भोजन वितरण

  1. खिलाने के लिए मच्छर कंटेनरों की स्थापना
    नोट: मच्छरों को विभिन्न प्रकार के कंटेनरों में खिलाया जा सकता है जब तक कि निम्नलिखित मानदंड पूरे होते हैं। सुनिश्चित करें कि कंटेनर मच्छरों के चारों ओर उड़ने के लिए काफी बड़ा है, लेकिन इतना बड़ा नहीं है कि मच्छरों के लिए जाल की सतह का पता लगाना और खिलाना शुरू करना मुश्किल होगा। कंटेनर को कवर करने के लिए उपयोग किया जाने वाला जाल सामग्री और छेद आकार में भिन्न हो सकता है। छेद मादा मच्छर के स्टाइल के माध्यम से छेद करने के लिए काफी बड़ा होना चाहिए, लेकिन इतना बड़ा नहीं है कि मच्छर बच सकता है। जाल को मजबूती से सुरक्षित करें ताकि यह तना हुआ हो, और ग्लीट्यूब पूरे भोजन अवधि में इसकी सतह पर स्थिर रूप से आराम कर सके।
    1. एक उदाहरण कंटेनर(चित्रा 1)एक संशोधित 946 एमएल (32 ऑउंस) उच्च घनत्व पॉलीथीन (एचडीपीई) प्लास्टिक बाल्टी है। इस सेटअप को दोहराने के लिए, बाल्टी ढक्कन में ~ 10 सेमी व्यास के केंद्रीय छेद को काटने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें। मच्छरों द्वारा व्यवसाय के लिए कंटेनर को इकट्ठा करने के लिए, बाल्टी के शीर्ष पर सफेद 0.8 मिमी पॉलिएस्टर मच्छर जाल का ~ 400 सेमी2 वर्ग टुकड़ा सुरक्षित करें, सुरक्षित रूप से छिद्रित ढक्कन को कसकर स्नैप करने के लिए नीचे धकेल दें।
    2. मादा मच्छरों को इकट्ठा करें जो कम से कम 3 दिन बाद ईक्लोजिशन हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे रक्त फ़ीड के लिए पर्याप्त परिपक्व हैं। इष्टतम भोजन दर 7 दिनों के बाद देखी जाती है33.
    3. मादा मच्छरों को कंटेनर में रखें और जाल से ढक दें। यदि कंटेनर मच्छरों के साथ घनी आबादी वाला है, तो उपयोग किए जाने वाले ग्लाईट्यूब की संख्या बढ़ाएं। इष्टतम भोजन ~ 25 मच्छरों/ग्लीट्यूब के साथ हासिल किया जाता है। यह खिला झिल्ली तक पहुंच के लिए प्रतिस्पर्धा को कम करता है।
    4. अनफेड मच्छरों के एक नियंत्रण समूह को अलग करें जिसे भोजन की पेशकश नहीं की जाएगी। वजन माप प्रोटोकॉल में, अनफेड समूह को अलग से तौलें और भोजन पर खिलाए गए प्रयोगात्मक समूह में वजन बढ़ाने का अनुमान लगाने के लिए इस वजन का उपयोग करें। फ्लोरेसेंस-आधारित क्वांटिफिकेशन प्रोटोकॉल में, मानक वक्र गणना के लिए और नकारात्मक नियंत्रण के लिए कुओं में मच्छरों के अनफेड समूह को जोड़ें। प्रायोगिक समूह में बेसलाइन मच्छर ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस से मेल खाने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि मानक वक्र और नकारात्मक नियंत्रण कुओं में एक अनफेड मच्छर होता है।
  2. ग्लाइटब का निर्माण और स्थापना (कोस्टा-दा-सिल्वा एट अल से अनुकूलित( 2013)20)
    1. जैसा कि चित्र 1में दर्शाया गया है, गर्मी स्रोत उत्पन्न करने के लिए, 100% ग्लाइसरोल के 40 एमएल के साथ 50 एमएल शंकु नली भरें। पैराफिल्म के 5 सेमी × 5 सेमी के टुकड़े के साथ खुले शंकु नली को सील करें और रिसाव की संभावना को कम करने के लिए 5 सेमी × 5 सेमी पैराफिल्म के अतिरिक्त टुकड़े के साथ दोहराएं। वैकल्पिक रूप से, रबर बैंड का उपयोग करके पैराफिल्म को जगह में आयोजित किया जा सकता है। ट्यूब को उलटा यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई छेद या अंतराल नहीं हैं।
    2. भोजन वितरण उपकरण बनाने के लिए, एक तेज रेजर ब्लेड का उपयोग करके या बेहतर स्थिरता, एक खराद के लिए शंकु नली के स्क्रू कैप में 2.5 सेमी व्यास के एक केंद्रित छेद को काटें। पैराफिल्म के 5 सेमी × 5 सेमी टुकड़ा समान रूप से फैला दें ताकि यह आकार में लगभग दोगुना हो जाए। पैराफिल्म काफी पतली होनी चाहिए कि मच्छर आसानी से इसके माध्यम से छेद कर सकें, लेकिन कोई लीक नहीं होना चाहिए। पूरी तरह से छेद को कवर करने के लिए पेंच टोपी की बाहरी सतह पर सील और टोपी अलग सेट।
      नोट: Glytube के लिए आकर्षण बढ़ाने के लिए, पैराफिल्म खींच करने से पहले, यह मानव गंध के साथ इत्र धीरे से यह कोई सौंदर्य प्रसाधन लागू के साथ मानव त्वचा के एक पैच पर रगड़, ध्यान रखना है कि कोई छेद बना रहे हैं । यह सिफारिश की है अगर प्रयोग मच्छरों के लिए भोजन दृष्टिकोण के लिए आवश्यक संवेदी संकेतों की जांच करने के उद्देश्य से नहीं है ।
    3. कम से कम 15 मिनट के लिए 42-45 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में ग्लिसरोल की सीलबंद ट्यूब और भोजन (एटीपी को छोड़कर सभी घटकों के साथ) गर्म करें। एटीपी को प्री-हीट न करें; प्रयोग शुरू करने से तुरंत पहले इसे जोड़ें।
    4. गर्म भोजन और भंवर में एटीपी अच्छी तरह से जोड़ें। पिपेट 2 मिलीएल गरम भोजन को स्क्रू कैप के भीतरी कक्ष में रखें और धीरे-धीरे उल्टे, गर्म, ग्लिसरोल से भरे 50 एमएल शंकु नली को रखें। आंशिक रूप से ग्लिसेरोल से भरी ट्यूब पर भोजन के साथ टोपी पेंच-बस भोजन या ग्लिसरोल के रिसाव को रोकने के लिए पर्याप्त है ।
      नोट: उपयोग किए जाने वाले भोजन की मात्रा 1 एमएल और 2.5 एमएल के बीच हो सकती है। कम मात्रा विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब भोजन का उपयोग दुर्लभ या महंगे यौगिकों को वितरित करने के लिए किया जाता है। इस कदम पर जल्दी से काम करना महत्वपूर्ण है ताकि भोजन परिवेश के तापमान तक ठंडा न हो और अधिकतम भोजन की संभावना को कम कर सके। ठंडा करने की दर कमरे के परिवेश के तापमान पर निर्भर करेगी जहां ये कदम आयोजित किए जाते हैं, लेकिन उन्हें आम तौर पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के भीतर पूरा किया जाना चाहिए।
    5. मच्छर कंटेनर के शीर्ष पर इकट्ठे ग्लीट्यूब रखें और मच्छरों को अधिकतम भोजन दरों को प्राप्त करने के लिए कम से कम 15 मिनट तक खिलाने की अनुमति दें।
    6. इष्टतम भोजन के लिए, सीओ2 पैड से लैस कक्ष के अंदर मच्छर कंटेनर रखें, और भोजन देने से पहले 25-28 डिग्री सेल्सियस और 70-80% आर्द्रता पर कम से कम 15 मिनट की वृद्धि की अनुमति दें। यहां उपयोग किया जाने वाला परख कक्ष पहले प्रकाशित सेटअप16का सरल और कम लागत वाला संशोधन है । यह एक हटाने योग्य ढक्कन के साथ 36 सेमी एल × 31 सेमी डब्ल्यू × 32 सेमी एच आकार के पारदर्शी पॉलीप्रोपाइलीन स्टोरेज बॉक्स का उपयोग करता है। कक्ष की दीवार में बनाया गया 1.5 सेमी व्यास का छेद सिलिकॉन ट्यूबिंग के माध्यम से सीओ2 डिलीवरी की अनुमति देता है। सीओ2 प्रसार पैड शुद्ध हवा और सीओ 2 के वितरण के लिए ढक्कन के भीतरी केंद्र से चिपका है परीक्षण केदौरान चैंबर वातावरण शर्त ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि मेजबान संकेत (गर्मी और सीओ2,वैकल्पिक मेजबान गंध16के साथ) मौजूद हैं ताकि मच्छर झिल्ली फीडर की ओर आकर्षित हों। यदि ग्लीट्यूब के नीचे मच्छरों की भीड़ नहीं है, तो जांच लें कि सीओ2 ठीक से वितरित किया जाता है और भोजन और ग्लीट्यूब पर्याप्त रूप से गर्म होते हैं। यदि कोई बाहरी सीओ2 स्रोत उपलब्ध नहीं है, तो सीओ2 को मानव सांस के कश के माध्यम से वितरित किया जा सकता है।
    7. खिलाने के बाद, ग्लीट्यूब कैप को बायोहैजार्ड कचरे के रूप में छोड़ दिया जा सकता है या कम प्रतिशत ब्लीच समाधान में भिगोने और पानी में अच्छी तरह से कुल्ला करने के बाद पुन: इस्तेमाल किया जा सकता है।

3. उपभोग किए गए भोजन का मात्राकरण

  1. वजनी मच्छरों का उपयोग आगे के प्रयोगों के लिए किया जाएगा
    नोट: भोजन के आकार की मात्रा निर्धारित करने के लिए मच्छरों का वजन उन्हें आगे के लाइव प्रयोग के लिए उपयोग करने की अनुमति देता है, लेकिन इस विधि के लिए 5 मच्छरों के समूह से वजन माप लेने की आवश्यकता होती है। चूंकि व्यक्तिगत मच्छरों के वजन को अधिकांश प्रयोगशाला संतुलन का उपयोग करके ठीक से मापना मुश्किल होता है, इसलिए वजन को मापकर व्यक्तिगत भोजन के आकार में परिवर्तनशीलता को आसानी से मात्रा निर्धारित नहीं किया जा सकता है। वजन केवल उन स्थितियों के लिए अनुशंसित है जिनमें महिलाएं भोजन पर दिख रही हैं।
    1. कोल्ड एनेस्थेटाइज मच्छरों को अपने कंटेनर को 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में ले जाकर या बर्फ पर रखकर।
    2. अनफेड पलटन (यानी, मच्छरों कि एक भोजन की पेशकश कभी नहीं थे) से 5 महिलाओं के समूहों का वजन और "पूर्व खिला" वजन के अनुमान के रूप में अपने औसत वजन की गणना । एक अनफेड मच्छर का औसत वजन जीनोटाइप, सेक्स और पालन-पोषण की स्थितियों पर निर्भर करता है। अनफेड मादा एई. एजिप्टी मच्छरों को सुक्रोज तक विज्ञापन लिबिटम एक्सेस के साथ पाला जाता है, आमतौर पर प्रत्येक का वजन लगभग 2 मिलीग्राम होता है।
    3. प्रयोगात्मक पलटन से (यानी, मच्छरों कि एक भोजन की पेशकश की गई), "खिलाया" और "नहीं खिलाया" आंख 7 द्वारा नमूदार पेट के आधार पर बवासीर में महिलाओंकी तरह। वजन के लिए 5 मच्छरों के समूहों में क्रमशः "खिलाया" और "खिलाया नहीं" बवासीर में से प्रत्येक को विभाजित करें। 5 के प्रत्येक समूह के भीतर मच्छरों को समूह वजन माप लेने के लिए एक ही प्रयोगात्मक पलटन से प्राप्त किया जाना चाहिए। प्रयोगात्मक समूह के "फेड" और "खिलाया नहीं" बवासीर में से प्रत्येक से प्रति महिला औसत वजन की गणना करें।
  2. अंत बिंदु विश्लेषण के लिए फ्लोरेसेंस माप7,27,34
    नोट: अलग-अलग मच्छरों से सटीक भोजन आकार माप प्राप्त करने के लिए जो अब आगे के लाइव प्रयोग के लिए आवश्यक नहीं हैं, मच्छरों और भोजन के शेष 1 एमएल को -20 डिग्री सेल्सियस पर -20 डिग्री सेल्सियस पर-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यहां प्रयोग को रोका जा सकता है। इस विधि में उल्लिखित है अंक 2.
    1. एक संदर्भ मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए, मच्छरों के प्रयोगात्मक समूह को पेश किए गए 0.002% फ्लोरोसेइन वाले एक ही भोजन का एक धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करें। इसमें कुल 8 स्टैंडर्ड कर्व सॉल्यूशंस होंगे। इन समाधानों में से प्रत्येक में, 0.002% फ्लोरोसेइन युक्त भोजन की अंतिम मात्रा 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 होगी, 0.15625, 0.078125, या 0 माइक्रोल, और प्रत्येक 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 100 माइक्रोन (उदाहरण के लिए, 1xBS के 95 μl में 0.002% फ्लोरोसिन युक्त भोजन की 5 माइक्रोन) की कुल मात्रा के लिए होगा।
    2. मानक वक्र का पहला समाधान बनाने के लिए, 1x पीबीएस और भंवर के 950 माइक्रोन में 0.002% फ्लोरोसेइन युक्त भोजन के 50 माइक्रोन को अच्छी तरह से जोड़ें (अंतिम मात्रा: 1x पीबीएस के 95 Μl में 0.002% फ्लोरोसेइन युक्त भोजन का 5μl)। बाकी मानक वक्र समाधान बनाने के लिए, पिछले ट्यूब से 500 माइक्रोन लेकर प्रत्येक चरण के लिए 2 गुना कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें और इसे 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन युक्त एक नई ट्यूब में जोड़ दें। अगले 2 गुना कमजोर पड़ने की तैयारी से पहले भंवर अच्छी तरह से।
    3. एक संदर्भ मानक वक्र पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए कुओं को तैयार करने के लिए, एक ९६-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के पहले कॉलम में 8 कुओं में से प्रत्येक में मानक वक्र समाधान के प्रत्येक के १०० μL पिपेट । प्लेट के पहले कॉलम में समान 8 कुओं में से प्रत्येक में 1 अनफेड कंट्रोल मच्छर जोड़ें। एक दोहराने माप के लिए प्लेट के दूसरे कॉलम में दोहराएं।
      नोट: यदि प्रयोगात्मक समूहों को विभिन्न भोजन प्रकारों की पेशकश की जाती है, तो प्रत्येक भोजन प्रकार के लिए एक अलग संदर्भ मानक वक्र तैयार किया जाना चाहिए।
    4. अनफेड नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के लिए प्रत्येक शेष अच्छी तरह से 1x पीबीएस के 100 माइक्रोल जोड़ें। यदि ऊतक को बाद के चरणों में मनका मिल होमोजेनाइजर या भंवर का उपयोग करके बाधित किया जाना है, तो प्रत्येक अच्छी तरह से एक 3 मिमी बोरोसिलिकेट ठोस ग्लास मनका जोड़ें।
    5. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, प्लेट के अगले 2 स्तंभों में प्रत्येक कुएं में 1 अनफेड मच्छर जोड़ें। इस समूह में मापा फ्लोरेसेंस ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए खाते के लिए एक आधारभूत कटऑफ सेट करता है और यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि भोजन पर खिलाया गया प्रायोगिक समूह में एक मच्छर है या नहीं ।
    6. भोजन की पेशकश किए गए प्रायोगिक समूहों से शेष कुओं में प्रति अच्छी तरह से 1 मच्छर जोड़ें।
    7. प्लेट को ध्यान से सील करें और मैनुअल पीसकर टिश्यू को बाधित करें। भोजन छोड़ने के लिए पेट को अच्छी तरह से समरूप होना चाहिए। ऊतक को बाधित करने के तरीकों में 3 मिमी बोरोसिलिकेट ठोस ग्लास मोतियों (30 सेकंड के लिए 30 हर्ट्ज), 3 मिमी बोरोसिलिकेट ठोस ग्लास मोतियों के साथ भंवर मिक्सर, या मोतियों के बिना मूसल ग्राइंडर के साथ एक मनका मिल समरूप का उपयोग करना शामिल है।
    8. lysate इकट्ठा करने के लिए 1-2 मिनट के लिए 2000 आरपीएम पर प्लेट सेंट्रलाइज करें।
    9. प्रत्येक कुएं में 1x पीबीएस के 180 माइक्रोन के साथ एक काले 96-अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें।
    10. 1x पीबीएस के 180 माइक्रोन के साथ प्रत्येक कुएं में 20 माइक्रोन को स्थानांतरित करें और मिलाएं। यदि उपलब्ध है, तो बढ़ी हुई गति और बेहतर स्थिरता के लिए इस कदम पर एक बहु-चैनल पिपेट का उपयोग करें।
    11. 485/520 उत्तेजन/उत्सर्जन चैनल पर एक प्लेट रीडर का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापें । इसी फ्लोरेसेंस तीव्रता माप के खिलाफ भोजन की ज्ञात मात्रा की साजिश रचकर संदर्भ मानक वक्र उत्पन्न करें।
    12. उत्पन्न संदर्भ मानक वक्र का उपयोग करके, प्रत्येक प्रायोगिक समूह मच्छरों द्वारा भोजन की मात्रा को एक्सट्रपलेट करें। बेसलाइन ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए सही करने के लिए प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह व्यक्ति के फ्लोरेसेंस तीव्रता पढ़ने से अनफेड मच्छरों के नकारात्मक नियंत्रण समूह के औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता पढ़ने को घटाना।

Representative Results

चित्रा 1 ग्लीट्यूब को इकट्ठा करने के लिए एक योजनाबद्ध प्रस्तुत करता है, जबकि चित्रा 2 यहां वर्णित फ्लोरेसेंस-आधारित परख का उपयोग करके भोजन के आकार को मापने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन का अवलोकन दिखाता है। चित्रा 3 रक्त-आहार प्रयोग से प्रतिनिधि फ्लोरोसेइन भोजन आकार माप प्रदान करता है। चित्रा 4, चित्रा 5,और चित्रा 6 जैविक प्रश्नों का एक नमूना है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर संबोधित किया जा सकता है वर्णन । प्रोटोकॉल के अनुप्रयोग व्यापक हैं और इसमें रक्त भोजन संरचना में फेरबदल करना, औषधीय यौगिकों को खिलाना, उप-इष्टतम रक्त भोजन या छोटे अमृत भोजन की सटीक मात्रा बताना और मच्छर जीनोटाइप में खिला व्यवहार की तुलना करना शामिल है।

भोजन की मात्रा गणना के लिए एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए, फ्लोरेसेंस रीडिंग को नामित संदर्भ कुओं से प्लॉट किया जाता है जिसमें प्रत्येक अनफेड मच्छर होता है और भोजन की एक ज्ञात मात्रा 0.002% फ्लोरोसेसिन(चित्रा 3 ए)के साथ होती है। शेष कुओं से फ्लोरेसेंस रीडिंग, जिसमें या तो अनफेड मच्छरों के नकारात्मक नियंत्रण समूह या मच्छरों के प्रायोगिक समूह से भोजन की पेशकश की जाती है, की तुलना इस मानक वक्र से की जाती है ताकि प्रत्येक मच्छर(चित्रा 3B)द्वारा उपभोग किए जाने वाले भोजन की मात्रा (μL) की मात्रा निर्धारित की जा सके । इस परख में बेसलाइन रीडिंग को मान्य करने के लिए, यह पुष्टि की जानी चाहिए कि अनफेड निगेटिव कंट्रोल ग्रुप के मच्छरों को μL खपत(चित्रा 3B, बाएं)का सकारात्मक मूल्य नहीं सौंपा जाता है। यद्यपि प्रायोगिक समूह की सभी महिलाओं को रक्त भोजन की पेशकश की गई थी, लेकिन कुछ मच्छरों को खिलाया गया(चित्र 3बी, मध्य)और कुछ ने नहीं(चित्र 3बी, दाएं)। यह परिणाम दर्शाता है कि इस प्रोटोकॉल से दो प्रकार के डेटा प्राप्त किए जा सकते हैं: 1) कुल महिलाओं का प्रतिशत जो दिए गए भोजन पर फ़ीड करते हैं, और 2) दिए गए भोजन पर फ़ीड करने वाली महिलाओं द्वारा की जाने वाली मात्रा।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न प्रोटीन रचनाओं के साथ भोजन देने और निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। चित्रा 4ए, बी अतिरिक्त फ्लोरोसेइन के साथ भोजन का उपयोग करके एकत्र किए गए डेटा दिखाते हैं। मच्छरों के अनुपात है कि खिलाया और भोजन की मात्रा वे क्रमशः किया जाता है, फ्लोरेसेंस रीडिंग से गणना की गई । ये रीडिंग अत्यधिक संवेदनशील हैं और μL के सटीक मात्राकरण के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन सीमा है कि मच्छरों का उपयोग भविष्य के लाइव प्रयोगों के लिए नहीं किया जा सकता है। चित्रा 4सी, डी मच्छरों के साथ एक स्वतंत्र प्रयोग से एकत्र किए गए डेटा दिखाते हैं जिन्हें फ्लोरोसिन के बिना भोजन की पेशकश करने के बाद आंखों से खिलाया या अनफेड के रूप में रन बनाए गए थे। भोजन के आकार की गणना 5 मच्छरों के समूहों से औसत वजन/मादा के रूप में की गई थी । यद्यपि ये वजन माप फ्लोरेसेंस माप की तुलना में कम संवेदनशील होते हैं, वे महिलाओं को बरामद करने और आगे लाइव प्रयोग के लिए उपयोग करने की अनुमति देते हैं। मच्छरों का अनुपात जो फ़ीड करता है, विभिन्न प्रयोगात्मक दिनों में भिन्न हो सकता है, जैसा कि चित्रा 4A और चित्रा 4C में परिलक्षित होताहै।

चित्रा 5 मच्छर मेजबान की मांग व्यवहार को विनियमित करने वाली दवाओं वाले भोजन की मात्रा दिखाता है। इन प्रयोगों में, महिलाओं को मानव NPY Y2 रिसेप्टर एगोनिस्ट, TM30338 के 100 माइक्रोन के साथ रक्त, खारा + एटीपी, या नमकीन + एटीपी भोजन की पेशकश की गई थी। यह दवा एई. एजिप्टी एनपीआई-जैसे रिसेप्टर 7 की सक्रियण के माध्यम से मेजबान की मांग करने वाले व्यवहार को बदल देती है। भोजन के आकार को मापने के बाद रक्त खिला व्यवहार पर इस दवा के प्रभाव का आकलन करने के लिए प्रयोगों की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह शोधकर्ता प्रत्येक महिला द्वारा भस्म खुराक की गणना करने की अनुमति देता है ।

पिछले उदाहरणों में, महिलाओं को या तो रक्त या स्थानापन्न रक्त भोजन खिलाया गया था, जिनमें से सभी के परिणामस्वरूप 3-5 माइक्रोन भोजन(चित्र 3, चित्रा 4, चित्रा 5)हुआ। इस फ्लोरेसेंस आधारित परख भी छोटे और/या अधिक चर भोजन आकार है कि सही औसत समूह वजन माप से नहीं समझा जा सकता है मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चित्रा 6में, एक ही फ्लोरेसेंस क्वांटिफिकेशन प्रोटोकॉल का उपयोग 10% सुक्रोज युक्त 10% सुक्रोज के साथ संतृप्त कपास की गेंद के लिए ग्लिट्यूब का आदान-प्रदान करके अमृत-भोजन व्यवहार को मापने के लिए किया गया था जिसमें 0.002% फ्लोरोसेसिन था। अमृत शर्करा को ग्लाइंगट्यूब परख में प्रस्तुत नहीं किया जा सकता क्योंकि मादाएं स्टाइल के साथ अमृत शर्करा की उपस्थिति का पता नहीं लगा सकती हैं और27को खिलाने की शुरुआत नहीं करती हैं । इन आंकड़ों शोधकर्ता निर्धारित करने के लिए अनुमति देते है कि चीनी भोजन लगातार रक्त भोजन की तुलना में छोटे हैं, पिछले काम३४ (चित्रा 6)के साथ समझौते में ।

Figure 1
चित्रा 1: मच्छरों को भोजन खिलाने के लिए उपयोग की जाने वाले ग्लीट्यूब विधि का सेटअप। (क)एक डिकंस्ट्रक्टेड ग्लाइट्यूब की योजनाबद्ध जो मच्छरों को रक्त और अन्य भोजन खिलाने के लिए उपयोग किया जाता है। (ख)एक ग्लीट्यूब की योजनाबद्ध एक जाल ढक्कन के साथ मच्छरों के एक कंटेनर के ऊपर प्रस्तुत किया । मादा मच्छर खिलाने के लिए जाल ढक्कन के माध्यम से छेद कर सकते हैं। (ग)ग्लीट्यूब (ऊपर) की तस्वीरें, और मादा एडीज एजिप्टी मच्छरों से पहले, के दौरान, और खिलाने के बाद (नीचे, बाएं से दाएं) एक ग्लीट्यूब-वितरित भोजन पर। मच्छरों को झिल्ली फीडर तक पहुंचने के लिए अपने कंटेनर को कवर करने वाले जाल के माध्यम से भेदी दिखाया जाता है। (घ)मादा एई. एजिप्टी मच्छरों की उपस्थिति दिखाने वाली तस्वीरें जो अनफेड (बाएं) हैं और जो या तो कृत्रिम रक्त भोजन (दाएं, ऊपर) या एक खारा + एटीपी भोजन (दाएं, नीचे) पर संलग्न हैं। ग्लाइटू विधि पहले कोस्टा-दा-सिल्वा एट अल में प्रकाशित हुई थी । (२०१३)20। (सी)और(डी)में तस्वीरें एलेक्स वाइल्ड के सौजन्य से कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ग्लाइट्यूब रक्त-आहार प्रोटोकॉल के बाद भोजन के आकार की मात्रा निर्धारित करने के तरीके की योजनाबद्ध। (क)मच्छरों को फ्लोरोसेइन (शीर्ष, प्रायोगिक समूह) या कोई भोजन (नीचे, अनफेड नकारात्मक नियंत्रण समूह) के साथ भोजन की पेशकश की जाती है। (ख)फीडिंग प्रयोग को समाप्त करने के बाद 96-अच्छी प्लेट में अलग-अलग मच्छरों को जोड़ा जाता है। (ग)मानक वक्र 0.002% फ्लोरोसेसिन युक्त भोजन की ज्ञात मात्रा का उपयोग करके उत्पन्न होता है। (घ)मच्छरों को किसी भी सेवन वाले फ्लोरोसेइन को छोड़ने के लिए समरूप किया जाता है, और प्रत्येक कुएं में फ्लोरेसेंस के स्तर को प्लेट रीडर का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है। इस फ्लोरेसेंस क्वांटिफिकेशन विधि को लिच एट अल (2013)34से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: फ्लोरोसिन-आधारित क्वांटिफिकेशन के साथ ग्लिटूब रक्त-भोजन प्रयोग। (क)कुओं से प्राप्त मानक वक्र माप जहां अनफेड नियंत्रण समूह से एक मच्छर को भोजन की एक ज्ञात मात्रा में जोड़ा गया था जिसमें 0.002% फ्लोरोसेइन (वाई-एक्सिस स्केल = मनमाने ढंग से इकाइयां) थे। (ख)भोजन की मात्रा अनफेड नियंत्रण समूह (बाएं, काले, एन = 40), रक्त पर खिलाया गया प्रयोगात्मक समूह (मध्यम, लाल, एन = 37) और प्रायोगिक समूह में महिलाओं के लिए फ्लोरेसेंस रीडिंग का उपयोग करके गणना की जाती है जो रक्त पर फ़ीड नहीं करता था (दाएं, लाल, एन = 23)। प्रत्येक बिंदु एक व्यक्तिगत महिला से एक माप का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा को सीमा के साथ औसत के रूप में दिखाया जाता है। पत्र सांख्यिकीय रूप से अलग समूहों का संकेत देते हैं, डन की कई तुलना के साथ क्रुस्कल-वालिस परीक्षण, पीएंडटीटी;0.01। ये आंकड़े जोवे एट अल (2020)27में प्रकाशित हुए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: अलग प्रोटीन संरचना के साथ भोजन की मात्राकरण। महिलाओं को या तो भेड़ रक्त (लाल), मानव रक्त प्रोटीन (कोगन (१९९०)22)(नारंगी), या प्रोटीन मुक्त खारा + एटीपी भोजन (एक्वा)7के साथ कृत्रिम रक्त की पेशकश की गई । (क)फ्लोरेसेंस रीडिंग का उपयोग करके खिलाया गया महिलाओं का प्रतिशत । प्रत्येक बिंदु 12-16 महिलाओं के एक समूह का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा को पर्वतमाला के साथ मीडियन के रूप में दिखाया गया है, एन = 12। (ख)फ्लोरेसेंस रीडिंग का उपयोग करके भोजन की मात्रा की गणना की जाती है। प्रत्येक बिंदु चित्रा 4 एसे एक ही परीक्षण में एक व्यक्ति महिला से एक माप का प्रतिनिधित्व करता है । डेटा को पर्वतमाला के साथ मीडियन के रूप में दिखाया गया है, एन = 12। (ग)कृत्रिम झिल्ली खिलाने के बाद पूरी तरह से engorged महिलाओं का प्रतिशत, आंख से रन बनाए । प्रत्येक बिंदु 20-30 महिलाओं के समूहों से घिरा हुआ महिलाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा को पर्वतमाला के साथ मीडियन के रूप में दिखाया गया है, एन = 23। (घ)भोजन के आकार को खिलाने के बाद वजन/महिला के रूप में बनाया गया था आंख से रन बनाए गए । वजन की गणना 5 मच्छरों के समूहों के औसत के रूप में की गई थी। डेटा को पर्वतमाला के साथ मीडियन के रूप में दिखाया गया है, एन = 23। A-D:पत्र सांख्यिकीय रूप से अलग समूहों का संकेत देते हैं, क्रुस्कल-वालिस परीक्षण डन की कई तुलना, पीएंड एलटी; 0.05 के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: औषधीय यौगिकों के साथ भोजन का मात्राकरण। महिलाएं भेड़ रक्त (लाल), खारा + एटीपी (एक्वा), और नमकीन + एटीपी + 100 माइक्रोन खुराक के मानव NPY Y2 रिसेप्टर एगोनिस्ट TM30338 (गहरे नीले) के एक ही आकार के भोजन का उपभोग करती हैं। फ्लोरेसेंस रीडिंग का उपयोग करके भोजन की मात्रा की गणना की जाती है। प्रत्येक बिंदु एक व्यक्तिगत महिला से एक माप का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा को पर्वतमाला के साथ मीडियन के रूप में दिखाया गया है, एन = 12। पत्र सांख्यिकीय रूप से अलग समूहों का संकेत देते हैं, डन की कई तुलना, पीएंडटी;0.05 के साथ क्रुस्कल-वालिस परीक्षण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: छोटे अमृत भोजन का मात्राकरण। (A)अमृत-भोजन परख की योजनाबद्ध । (ख)भोजन की मात्रा जंगली प्रकार की महिलाओं के लिए फ्लोरेसेंस रीडिंग का उपयोग करके गणना की जाती है या तो पानी (नीला, एन = 36) या 10% सुक्रोज (हरा, एन = 53), प्रत्येक 0.002% फ्लोरोसेइन के साथ, अमृत-भोजन परख में भोजन की पेशकश की। प्रत्येक बिंदु एक व्यक्तिगत महिला से एक माप का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा को पर्वतमाला के साथ मीडियन के रूप में दिखाया जाता है। पत्र सांख्यिकीय रूप से अलग समूहों, मान-व्हिटनी परीक्षण, पीएंडटी;0.05 से संकेत देते हैं। ये आंकड़े जोवे एट अल (2020)27में प्रकाशित हुए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कृत्रिम रक्त भोजन
स्टॉक समाधान की एकाग्रता (मिलीग्राम/एमएल) भोजन में स्टॉक समाधान की मात्रा (μL/l) अंतिम भोजन एकाग्रता (मिलीग्राम/एमएल)
प्रोटीन घटक *
γ-ग्लोबुलिन्स 50 300 15
हीमोग्लोबिन 35 230 8
एल्बुमिन 300 340 102
कुल प्रोटीन - - 125
गैर-प्रोटीन घटक
स्टॉक समाधान की एकाग्रता (एमएमएम) भोजन में स्टॉक समाधान की मात्रा (μL/l) अंतिम भोजन एकाग्रता (mM)
नैक γ-ग्लोबुलिन स्टॉक में - 5-10
नाहको3 γ-ग्लोबुलिन स्टॉक में - 120
एटीपी 200 5 1
पानी - 125 -
* प्रोटीन घटक डबल-डिस्टिल्ड पानी के स्टॉक समाधान में तैयार किए जाते हैं, γ-ग्लोबुलिन को छोड़कर, जो 400 mM NaHCO3 में भंग होते हैं और इसमें एनएसीएल (2-4%) की चर राशि शामिल होती है उत्पाद में।

तालिका 1: कृत्रिम रक्त भोजन तैयार करने के लिए नुस्खा (कोगन (1990) 22 से अनुकूलित)। कृत्रिम रक्त में प्रोटीन और गैर-प्रोटीन घटक होते हैं जो नियमित रूप से मानव रक्त में पाए जाते हैं और इन घटकों के अनुपात को अलग करने का विकल्प प्रदान करते हैं। मच्छर कृत्रिम रक्त7,22को खिलाने के बाद अंडे पैदा करसकतेहैं .

खारा भोजन
घटक स्टॉक समाधान की एकाग्रता (एमएमएम) भोजन में स्टॉक समाधान की मात्रा (μL/l) अंतिम भोजन एकाग्रता (mM)
नैक - - -
नाहको3 400 300 120
एटीपी 200 5 1
पानी - 695 -

तालिका 2: एटीपी के साथ नमकीन भोजन के लिए नुस्खा (Duvall एट अल से अनुकूलित( २०१९)7)। प्रोटीन मुक्त खारा भोजन मच्छरों को ब्याज के यौगिकों को वितरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि अभी भी पेट के तनाव की नकल उतार रहा है कि रक्त खिलाने के बाद होता है, लेकिन अंडे के विकास को ट्रिगर किए बिना होता है कि जब प्रोटीन किया जाता है ।

Discussion

कई प्रयोगशाला अनुप्रयोगों के लिए, कृत्रिम झिल्ली फीडर शोधकर्ताओं को भोजन की सामग्री में सीधे हेरफेर करने की क्षमता की अनुमति देकर लाइव मेजबानों की तुलना में अलग लाभ प्रदान करते हैं। यद्यपि कृत्रिम झिल्ली खिलाने के लिए कई विधियां उपलब्ध हैं, यहां वर्णित विधि लचीलेपन, लागत और थ्रूपुट में लाभ प्रदान करती है। अन्य वाणिज्यिक झिल्ली फीडरों की तुलना में, ग्लीट्यूब परख के लिए एक छोटे भोजन की मात्रा की आवश्यकता होती है, जिससे यह दवाओं या रोगजनकों सहित महंगे अभिकर्मकों के लिए एक कुशल वितरण तंत्र बन जाता है, जिससे कुल मात्रा को कम करके7,35की आवश्यकता होती है। चूंकि प्रोटीन मुक्त खारा और कृत्रिम रक्त भोजन दोनों ही engorgement को बढ़ावा देते हैं, यौगिकों या रोगजनकों को इंजेक्शन के लिए एक उच्च थ्रूपुट और गैर-आक्रामक विकल्प के रूप में या तो भोजन में जोड़ा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, ग्लीट्यूब के प्रत्येक घटक को आसानी से धोया जा सकता है, बदला जा सकता है, या खिलाने वाले उपकरण के क्रॉस-संदूषण के बिना कई भोजन प्रकारों को वितरित करने और निर्धारित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

मच्छरों द्वारा उपभोग किए जाने वाले भोजन की मात्रा की मात्रा निर्धारित करने के लिए, फ्लोरेसेंस-आधारित विधि मच्छरों को खिलाने से पहले और बाद में वजन की तुलना में अधिक सटीक भोजन आकार मात्राकरण को सक्षम बनाती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह विधि एक अंत बिंदु परख है। इसके विपरीत, वजन मच्छरों को आगे के प्रयोग के लिए जीवित रखने की अनुमति देता है। एक प्लेट रीडर का उपयोग करके, फ्लोरेसेंस-आधारित विधि को सैकड़ों व्यक्तिगत महिलाओं द्वारा उपभोग किए गए भोजन के उच्च-थ्रूपुट मात्राकरण के लिए आसानी से बढ़ाया जा सकता है।

उच्च भोजन दरों को प्राप्त करने के लिए, महिला मेजबान की मांग व्यवहार को सक्रिय करने और फीडर के लिए महिलाओं को आकर्षित करने के लिए पर्याप्त मेजबान संकेतों का एक संयोजन मौजूद होना चाहिए। यदि ग्लीट्यूब के नीचे मच्छरों की भीड़ नहीं हो रही है, तो भोजन ठीक से गर्म नहीं हो सकता है, या सीओ2 डिलीवरी पर्याप्त नहीं हो सकती है। झिल्ली की सतह में मानव गंध के अलावा कृत्रिम झिल्ली का आकर्षण मज़बूती से बढ़ता है। यदि ग्लीट्यूब के नीचे मच्छरों को देखा जाता है लेकिन खिलाने में विफल रहते हैं, तो भोजन संरचना गलती पर हो सकती है। यदि भोजन गर्म नहीं है, तो महिलाएं फ़ीड नहीं कर सकती हैं, रक्त बहुत पुराना है, या यदि भोजन के लिए योजक आंतरिक रूप से प्रतिकूल हैं या अवांछनीय रासायनिक प्रतिक्रिया36का कारण बनते हैं। अतिरिक्त एटीपी भी मज़बूती से खिला दरों में वृद्धि करता है और प्रदान की व्यंजनों में से प्रत्येक में 2 mM की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचा जा सकता है। यदि पैराफिल्म को ग्लीट्यूब कैप में नहीं खींचा जाता है तो महिलाएं फ़ीड नहीं कर सकती हैं; पैराफिल्म समान रूप से पारदर्शी होना चाहिए और इसे बकसुआ नहीं करना चाहिए, क्योंकि यह महिला को अपने स्टाइल के साथ पैराफिल्म को प्रभावी ढंग से छेदने में सक्षम होने से रोकता है। यदि भोजन जाल पर ग्लीट्यूब के माध्यम से लीक होता है, तो पैराफिल्म खींचने की प्रक्रिया के दौरान फट सकता है और इसे प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए।

भोजन संरचना को बदलने से शोधकर्ताओं को मिडगुट से भोजन को साफ करने के साथ-साथ बाद में मेजबान की मांग करने वाले व्यवहार के लिए आवश्यक समय की लंबाई में हेरफेर करने की भी अनुमति मिल सकती है। यहां प्रस्तुत भोजन को पशु-व्युत्पन्न रक्त के समान पाचन 7 के लिए24-36 घंटे की आवश्यकता होती है। इनमें से किसी भी भोजन पर भोजन करने के बाद, महिलाएं पाचन समय खिड़की के दौरान मेजबान की मांग को दबा देंगी। चूंकि खारा भोजन प्रोटीन की कमी है, महिलाओं को मेजबान की मांग के बाद भोजन को मंजूरी दे दी है वापस । यदि एक तेज वापसी वांछनीय है, तो शोधकर्ता वैकल्पिक "त्वरित समाशोधन" नमकीन भोजन चुन सकते हैं जो लगभग 6 एच27में उत्सर्जित होते हैं। जबकि यहां प्रस्तुत खारा भोजन की संरचना सीधे कृत्रिम रक्त भोजन के साथ परिणामों की तुलना करने के लिए मिलान किया जाता है, "त्वरित समाशोधन" भोजन कशेरुकी रक्त में पाए जाने वाले शारीरिक नमक के स्तर से अधिक निकटता से मेल खाता है।

यहां वर्णित तरीकों की सीमाएं हैं जिन्हें शोधकर्ता के प्रयोगात्मक लक्ष्यों के लिए सबसे उपयुक्त परख का चयन करने से पहले माना जाना चाहिए। वर्णित फ्लोरोसेसिन माप मच्छरों को अतिरिक्त प्रयोग के लिए फिर से उपयोग करने की अनुमति नहीं देते हैं। हालांकि, फ्लोरोसिन परख का उपयोग करके भोजन के आकार क्वांटिफिकेशन से पहले वजन माप लिया जा सकता है। यदि वजन और भोजन का आकार किसी दिए गए भोजन के लिए कई परीक्षणों में सुसंगत है, तो वजन भविष्य के प्रयोगों में प्रॉक्सी के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल मेजबान-मांग बनाम रक्त-भोजन व्यवहार में घाटे के बीच अंतर नहीं करता है; झिल्ली फीडर को खोजने में हानि दिखाने वाले मच्छरों में भोजन दरों और/या भोजन के आकार में कमी आएगी । परख भर में व्यवहार रिकॉर्ड करने के लिए एक कैमरा जोड़कर, शोधकर्ताओं ने निर्धारित कर सकते है कि महिलाओं ग्लिकुट नहीं मिल सकता है, या कि क्या वे Glytube मिल जाए, लेकिन फ़ीड नहीं है ।

यहां वर्णित परख मच्छरों में खिलाने के व्यवहार से संबंधित कई बकाया सवालों का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कृत्रिम रक्त भोजन में घटक प्रोटीन या कुल प्रोटीन एकाग्रता के अनुपात में फेरबदल करके विशिष्ट रक्त प्रोटीन के योगदान का पता लगाया जा सकता है। कई भोजन की घटनाओं से भोजन के आकार का मूल्यांकन करने के लिए, अद्वितीय स्रोतों37से भोजन में अंतर करने के लिए अलग फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा वाले रंगों को जोड़ा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को आंतरिक मुंह के हिस्सों को अलग से उत्तेजित करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है जो रक्त का पता लगाते हैं और जिनका उपयोग घूस (यानी, स्टाइल) के लिए किया जाता है, और केमोसेन्सरी उपांग जो त्वचा (यानी, लेबियम, पैर) से संपर्क करते हैं क्योंकि मच्छर36रक्त खिलाने के लिए भूमि पर आते हैं। उदाहरण के लिए, यदि लिगांड को सीधे भोजन में जोड़ा जाता है, तो वे लेबियम और पैरों से संपर्क नहीं करते हैं, क्योंकि झिल्ली केवल स्टाइल द्वारा छेद की जाती है। यदि लिगांड के बजाय पैराफिल्म की बाहरी सतह में जोड़ा जाता है, तो वे भोजन से अलग रहते हैं और लेबियम औरपैरों 36से संपर्क किया जा सकता है। अंत में, रक्त-भोजन व्यवहार की विस्तृत गतिज को अच्छी तरह से समझ में नहीं आता है और यहां प्रस्तुत विधि को लोकोमोशन, मुद्रा और भोजन गतिशीलता38के व्यवहार readouts निकालने के लिए मशीन लर्निंग टूल के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन ट्रैकिंग को संयोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य उपयोगकर्ता के अनुकूल और लागत प्रभावी होना है, जिसमें मच्छर रक्त-भोजन और रक्त-भोजन व्यवहार का अध्ययन करने के लिए औषधीय और आनुवंशिक जोड़तोड़ को नियोजित करने वाले शोधकर्ताओं की सेवा करने की क्षमता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपियों पर टिप्पणी के लिए निपुन बसर, एड्रियाना के रोसास विल्लेगैस, नादव शाई और ट्रेवर सोरेल्स और तकनीकी सहायता के लिए झेंगयान गोंग और किरोलोस बार्सुम को धन्यवाद देते हैं। हम चित्रा 1में इस्तेमाल तस्वीरों के लिए एलेक्स वाइल्ड का शुक्रिया अदा करते हैं । केवी को बोहरिंगर इंगलहेम शौकीन्स पीएचडी फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था । वीजे को एनआईएच T32-MH095246 द्वारा भाग में समर्थन दिया गया था । इस काम को हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट से जेम्स एच गिलम फैलोशिप फॉर एडवांस्ड स्टडी प्रोग्राम के माध्यम से रॉकफेलर विश्वविद्यालय को वीजे को अनुदान देकर समर्थन दिया गया था । यह सामग्री ग्रांट नं. एनएसएफ की डीईई-1325261 से वीजे इस सामग्री में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष और निष्कर्ष या सिफारिशें लेखक (ओं) के हैं और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के विचारों को प्रतिबिंबित करें।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tubes Fisher Scientific 14-959-70C
3 mm diameter borosilicate solid-glass bead MilliporeSigma Z143928 For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder
32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup VWR 89009-668 Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used
50 mL conical tubes Fisher Scientific 14-959-49A
96-well black polystyrene plate ThermoFisher 12-566-09
96-well PCR plate sealing film Bio-Rad MSB1001 Alternate options can be used
96-well PCR plates Bio-Rad HSP9621 Alternate options can be used
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate MilliporeSigma A6419
Albumin (human serum) MilliporeSigma A9511
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213 Alternate options can be used to block light entering fluorescein container
Balance Fisher Scientific 01-911 Alternate options can be used
Bead mill homogenizer Qiagen 85300 Not required if using pellet pestle grinder
Cotton ball Fisher Scientific 22456880 For nectar-feeding; alternate options can be used
Defibrinated sheep blood Hemostat Laboratories DSB100 Alternate options can be used
Drosophila CO2 fly pad Tritech Research MINJ-DROS-FP Alternate options can be used
Fluorescein MilliporeSigma F6377
Fluorescence plate-reader ThermoFisher VL0000D0 Alternate options can be used
Gamma-globulin (human blood) MilliporeSigma H7379
Glycerol MilliporeSigma G7893
Hemoglobin (human) MilliporeSigma G4386
Laboratory wrapping film - parafilm Fisher Scientific 13-374
Magnetic stirrer Fisher Scientific 90-691 Alternate magnetic stirrers can be used
Microcentrifuge for 96-well plate VWR 80094-180 Alternate options can be used
Microcentrifuge Tubes MilliporeSigma 2236412 Alternate options can be used
Pellet pestle grinder VWR KT749521-1500 Not required if using bead mill homogenizer
Phosphate buffered solution (PBS) Fisher Scientific BW17-516F Optional
Razor blades Fisher Scientific 12-640 Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting
Rubber bands
Silicone tubing McMaster Carr Needed if using a fly pad for CO2 delivery
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific S233
Sodium chloride (NaCl) MilliporeSigma S9888
Stir bars Fisher Scientific 14-512 Alternate magnetic stir bars can be used
Translucent polypropylene storage box with removable lid Example box used for feeding assays shown
Vortex mixer
Water bath Alternate heating device may be used
White 0.8 mm polyester mosquito netting American Home & Habit Inc. F03A-PONO-MOSQ-M008-WT Alternate options can be used

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Jové, V., Venkataraman, K., Gabel, T. M., Duvall, L. B. Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes. J. Vis. Exp. (164), e61835, doi:10.3791/61835 (2020).

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