Summary
De verschillende effecten van verschillende graden van onderkoeling op myocardbescherming zijn niet grondig geëvalueerd. Het doel van deze studie was om de niveaus van celdood na verschillende hypothermiebehandelingen te kwantificeren in een op humane cardiomyocyten gebaseerd model, dat de basis legde voor toekomstig diepgaand moleculair onderzoek.
Abstract
Ischemie/reperfusie-afgeleide myocarddisfunctie is een veel voorkomend klinisch scenario bij patiënten na een hartoperatie. Met name de gevoeligheid van cardiomyocyten voor ischemisch letsel is hoger dan die van andere celpopulaties. Op dit moment biedt onderkoeling een aanzienlijke bescherming tegen een verwachte ischemische belediging. Het onderzoek naar complexe door onderkoeling veroorzaakte moleculaire veranderingen blijft echter beperkt. Daarom is het essentieel om een kweektoestand te identificeren die vergelijkbaar is met in vivo omstandigheden en die schade kan veroorzaken die vergelijkbaar is met die waargenomen in de klinische toestand op een reproduceerbare manier. Om ischemie-achtige aandoeningen in vitro na te bootsen, werden de cellen in deze modellen behandeld met zuurstof/glucosedeprivatie (OGD). Daarnaast hebben we een standaard tijd-temperatuurprotocol toegepast dat wordt gebruikt tijdens hartchirurgie. Verder stellen wij een aanpak voor om een eenvoudige maar alomvattende methode te gebruiken voor de kwantitatieve analyse van myocardletsel. Apoptose en expressieniveaus van apoptose-geassocieerde eiwitten werden beoordeeld door flowcytometrie en met behulp van een ELISA-kit. In dit model hebben we een hypothese getest met betrekking tot de effecten van verschillende temperatuuromstandigheden op cardiomyocyt apoptose in vitro. De betrouwbaarheid van dit model hangt af van strikte temperatuurregeling, controleerbare experimentele procedures en stabiele experimentele resultaten. Bovendien kan dit model worden gebruikt om het moleculaire mechanisme van hypothermische cardioprotectie te bestuderen, wat belangrijke implicaties kan hebben voor de ontwikkeling van complementaire therapieën voor gebruik met hypothermie.
Introduction
Ischemie/reperfusie-afgeleide myocarddisfunctie is een veel voorkomend klinisch scenario bij patiënten na hartchirurgie1,2. Tijdens niet-pulserende lage stroomperfusie en perioden van totale bloedsomloopstilstand treedt nog steeds schade op waarbij alle soorten hartcellen betrokken zijn. Met name de gevoeligheid van cardiomyocyten voor ischemisch letsel is hoger dan die van andere celpopulaties. Op dit moment biedt therapeutische hypothermie (TH) een aanzienlijke bescherming tegen een verwachte ischemische belediging bij patiënten die een hartoperatie ondergaan3,4. TH wordt gedefinieerd als een kernlichaamstemperatuur van 14-34 °C , hoewel er geen consensus bestaat over een definitie van koeling tijdens hartchirurgie5,6,7. In 2013 stelde een internationaal panel van deskundigen een gestandaardiseerd rapportagesysteem voor om verschillende temperatuurbereiken van systemische hypothermische bloedsomloopstilstand te classificeren8. Op basis van elektro-encefalografie en metabolismestudies van de hersenen verdeelden ze hypothermie in vier niveaus: diepe onderkoeling (≤ 14 °C), diepe onderkoeling (14,1-20 °C), matige onderkoeling (20,1-28 °C) en milde hypothermie (28,1-34 °C). De consensus van deskundigen zorgde voor een duidelijke en uniforme classificatie, waardoor studies beter vergelijkbaar konden zijn en meer klinisch relevante resultaten konden opleveren. Deze door TH geboden bescherming is gebaseerd op haar vermogen om de metabolische activiteit van cellen te verminderen, waardoor hun hoge-energetische fosfatenverbruik verder wordt beperkt9,10. De rol van TH in myocardbescherming is echter controversieel en kan meerdere effecten hebben, afhankelijk van de mate van onderkoeling.
Myocard I/R staat erom bekend dat het gepaard gaat met verhoogde cel apoptisis11. Recente rapporten hebben waargenomen dat geprogrammeerde cardiomyocytdood toeneemt tijdens openhartchirurgie en kan samenvallen met necrose, waardoor het aantal dode myocardcellentoeneemt 12. Daarom is het verminderen van cardiomyocyt apoptose een nuttige therapeutische benadering in de klinische praktijk. In het muisatriale HL-1 cardiomyocytmodel werd aangetoond dat therapeutische hypothermie de mitochondriale afgifte van cytochroom c en apoptose-inducerende factor (AIF) tijdens reperfusie13vermindert. Het effect van temperatuur bij het reguleren van apoptose is echter controversieel en lijkt afhankelijk te zijn van de mate van onderkoeling. Cooper en collega's merkten op dat in vergelijking met een normothermische cardiopulmonale bypass-controlegroep, de apoptosesnelheid van myocardweefsel van varkens met de diepe onderkoelde bloedsomloopstilstand werd verhoogdmet 14. Bovendien hebben de resultaten van sommige studies gesuggereerd dat diepe onderkoeling de apoptoseroute kan activeren, terwijl minder agressieve onderkoeling de route12,15,16lijkt te remmen . De reden voor dit resultaat kan te wijten zijn aan verstorende effecten geassocieerd met ischemisch letsel en een gebrek aan begrip van de mechanismen waarmee temperatuur myocardweefsel beïnvloedt. Daarom moeten de temperatuurgrenzen waarmee apoptose wordt versterkt of verzwakt nauwkeurig worden gedefinieerd.
Om een beter begrip te krijgen van de mechanismen die verband houden met de werkzaamheid van onderkoeling en een rationele basis te bieden voor de implementatie ervan bij de mens, is het essentieel om een cultuurtoestand te identificeren die vergelijkbaar is met in vivo omstandigheden die schade kan veroorzaken die vergelijkbaar is met die waargenomen voor de klinische aandoening op een reproduceerbare manier. Een essentiële stap in de richting van het bereiken van dit doel is het vaststellen van de optimale omstandigheden voor het induceren van cardiomyocyt apoptose. Dienovereenkomstig onderzochten we in deze studie de methodologische details met betrekking tot zuurstof-glucose deprivatie-experimenten met gekweekte cellen, een facile in vitro model van ischemie-reperfusie. Verder evalueerden we het effect van verschillende hypoxisch-ischemische tijden op cardiomyocyt apoptose, en verifieerden we onze hypothese met betrekking tot het effect van verschillende temperatuuromstandigheden op celapoptose in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Informatie over commerciële reagentia en instrumenten is opgenomen in de tabel met materialen.
De AC16 menselijke cardiomyocytencellijn is afgeleid van de fusie van primaire cellen uit volwassen ventriculair hartweefsel met SV40-getransformeerde menselijke fibroblasten17, die werden gekocht van BLUEFBIO (Shanghai, China). De cellijn ontwikkelt veel biochemische en morfologische kenmerken die kenmerkend zijn voor cardiomyocyten. Bovendien wordt de cellijn veel gebruikt om myocardschade en myocardfunctie in vitro te evalueren18,19.
1. Celcultuur
OPMERKING: Het basale kweekmedium bestaat uit serumvrij Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM), 10% foetale runderserum (FBS), 1% cardiale myocytgroeisupplement en 1% penicilline/streptomycineoplossing. Bewaar het medium bij 4 °C en verwarm voor gebruik tot 37 °C.
- Verwijder de cryopreserved human cardiomyocyte (HCM) cellen uit vloeibare stikstof en ontdooi ze in een waterbad bij 37 °C.
- Schud de flacon voorzichtig (<1 minuut) in een waterbad van 37 °C totdat er slechts een klein stukje ijs in de flacon achterblinkt.
- Breng de flacon over in een steriele laminaire stromingskap. Veeg de buitenkant van de flacon af met een wattenbolletje gedrenkt in 70% alcohol.
- Breng 4 ml voorverwarmd volledig groeimedium druppelgewijs over in de centrifugebuis met de ontdooide cellen.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 minuten op 200 × g. Gooi na centrifugeren het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 5 ml volledig medium.
- Houd de cellen op 37 °C in een bevochtigde incubator onder een atmosfeer met 95% lucht en 5% CO2.
OPMERKING: Voordat de cellen worden geoogst voor experimenten, mogen de cellen groeien tot ongeveer 60-70% samenvloeiing.
2. Vaststelling van een zuurstof-glucose deprivatie (OGD) model
OPMERKING: Vervang twee uur voor de onderzoeksperiode het groeimedium door een serumvrij medium en de cellen werden gedurende 2 uur bij 37 °C opnieuw opgenomen in een bevochtigde incubator onder een atmosfeer met 5% CO2.
- Aspireer het medium uit een 6-put plaat en was de cellen voorzichtig drie keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 2 ml verse suikervrije DMEM per put toe.
- Kweek de cellen op een constante temperatuur in een incubator met drie gassen onder een atmosfeer met een mengsel van 95% N2,5% CO2en 0,1% O2 bij 37 °C gedurende 1, 2, 4, 8, 12 of 16 uur.
- Na de hypoxiebehandeling het medium uit de 6-putplaat aspireren en de cellen driemaal wassen met PBS (pH 7,4).
- Voeg 2 ml complete DMEM per put toe.
- Houd de cellen op 37 °C in een bevochtigde incubator onder een atmosfeer met 95% lucht en 5% CO2.
3. Tijd-temperatuur protocol
OPMERKING: Een standaard tijd-temperatuurprotocol wordt gebruikt tijdens hartchirurgie, zoals eerder beschreven door anderen20,21. Behandel HCM's volgens het volgende protocol (Figuur 1): tijdpunt 1 (T1) geeft het einde van de inductie aan, tijdpunt 2 (T2) geeft het einde van het onderhoud aan en tijdpunt 3 (T3) geeft het einde van de herwarming aan. Analyseer controlecellen die onder continue normothermische omstandigheden (37 °C) worden gehouden. De temperatuuromstandigheden worden gecreëerd met behulp van een tri-gas incubator, die nauwkeurige temperatuurregeling mogelijk maakt.
- Twee uur voor de experimenten, aspireer het kweekmedium van een 6-well plaat en voeg 2 ml verse serumvrije DMEM per put toe.
- Incubeer de cellen opnieuw in een bevochtigde incubator gedurende 2 uur bij 37 °C onder een atmosfeer met 5% CO2.
- Aspireer na 2 uur het medium uit de 6-putplaat en was de cellen driemaal met PBS (pH 7,4).
- Voeg 2 ml verse serumvrije DMEM per put toe.
- Herkauw de cellen in de tri-gas incubator.
OPMERKING: Vervang het medium om niet-vastgemaakte cellen en vuil te verwijderen. - Verander onmiddellijk de temperatuur door de kweekschotels een tri-gas incubator te plaatsen.
- Na 1 uur koelen, snel aspireren het medium van de 6-well plaat en voeg 2 ml verse suikervrije DMEM per put.
- Kweek de cellen in een tri-gas incubator onder een atmosfeer bestaande uit 95% N2,5% CO2en 0,1% O2 bij 37 °C gedurende 12 uur om hypoxie vast te stellen.
- Stel de temperatuur in zoals hieronder beschreven.
OPMERKING: Het protocol begint met 10 uur van een lagetemperatuurbehandeling, gevolgd door een herwarmfase van 2 uur tot 37 °C en 24 uur normothermie (37 °C). Op elk moment worden drie Petrischalen verwijderd voor analyse. - Na een behandeling op lage temperatuur het medium uit de 6-putplaat aspireren en driemaal wassen met PBS (pH 7,4).
- Voeg 2 ml complete DMEM per put toe.
- Houd de cellen op 37 °C in een bevochtigde incubator onder een atmosfeer met 95% lucht en 5% CO2.
4. Levensvatbaarheidstest CCK-8
- Verwarm de 0,25% trypsine-ethyleenaminetetraazijnzuur (EDTA) oplossing en PBS tot 37 °C voor gebruik.
- Aspireer het medium, spoel de cellen af met 1 ml PBS en voeg vervolgens 0,5 ml 0,25% trypsine toe langs de wand van de put. Incubeer bij 37 °C totdat bijna alle HCM's zijn losgekoppeld (ongeveer 1 min).
- Voeg 1 ml DMEM compleet medium toe aan de putten om de trypsine te neutraliseren.
- Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 ml en pellet de HCM's door centrifugeren bij 500 × g gedurende 3 minuten. Aspireer de supernatant zonder de pellet te verstoren.
- Verdeel 100 μL aliquots van de celsuspensie (5000 cellen/put) in een plaat van 96 putjes. Pre-incubate de plaat gedurende 24 uur in een bevochtigde incubator (bij 37 °C.)
- Gebruik de gekweekte cellen in de 96-putplaten om verschillende behandelingsgroepen te genereren.
- Incubeer de plaat gedurende een geschikte tijdsduur (16 uur) in een incubator.
- Voeg 10 μL CCK-8-oplossing toe aan elke put van de plaat.
- Incubeer de plaat gedurende 1 uur in de incubator.
- Meet de absorptie op 450 nm met behulp van een microplaatlezer.
LET OP: Zorg ervoor dat u geen bellen in de putten introduceert, omdat deze de OD-aflezingsmetingen verstoren.
5. Flow cytometrie voor apoptose analyse
- Voer trypsinisatie- en centrifugeerstappen uit door de stappen 4.2-4.4 te volgen.
OPMERKING: Cellen worden geoogst met trypsine zonder EDTA. Om apoptose te beoordelen, worden zowel zwevende als aanhechtingscellen verzameld. - Centrifugeer de cellen gedurende 5 min op 1000 × g. Gooi het supernatant weg en resuspend de pellet in 1 ml PBS.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Breng met behulp van een pipet 100 μL met Trypan Blue behandelde celsuspensie over naar een hemocytometer. Tel met behulp van een handtellingsteller de levende, niet-aangetaste cellen in één set van 16 vierkanten en gebruik pbs om een celsuspensie te genereren bij 1×107 cellen/ml.
- Verkrijg 200 μL van de celsuspensie (5 × 105 -1 × 106 cellen).
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1000 × g en resuspend de pellet in bijlage V-FITC bindingsoplossing.
- Voeg 5 μL annexine V-FITC toe om de cellen te verven.
- Voeg 10 μL propidiumjodide toe aan de celsuspensie.
- Meng de cellen voorzichtig en incubeer ze gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
OPMERKING: De cellen worden tijdens de incubatie 2-3 keer geresuspendeerd om de kleuring te verbeteren. - Start de flowcytometer en zorg ervoor dat de software op de juiste manier werkt.
- Open twee puntplotvensters in de flowcytometriesoftware.
- Selecteer voorwaarts verstrooid licht (FSC) op de X-as en zijverstrooid licht (SSC) op de Y-as om celresten en/of klonten uit te sluiten in termen van respectievelijk hun grootte en granulariteit.
- Selecteer het PE -detectiekanaal (590 mm) en fitc (530 mm), dat wordt gebruikt om de fluorescentie-intensiteit van de cellen te meten.
- Plaats de lege (HCMs die niet geverfd zijn) monsterbuis op de flow cytometer.
- Klik op Opnemen om deeltjes uit de suspensie in de lege monsterbuis te verzamelen en vervolgens de celpopulatie te gaten voor verdere analyse in de eerste puntplot.
- Plaats de enkelbevlekte monsters op de steunarm van de buis. Klik op Opnemen om deeltjes uit de suspensie te verzamelen en poort vervolgens de celpopulatie voor verdere analyse in de eerste puntplot.
- Verzamel de HCM's in andere monsterbuizen en optimaliseer de meting door de spanningen van de fluorescentiekanalen aan te passen.
OPMERKING: Niet-bevlekte en enkelbevlekte monsters worden gebruikt als compensatieregelaars tijdens het experiment. - Geef de statistieken van elke monsterbuis weer en bereken de snelheid van apoptose van elk monster.
6. Mitochondriale depolarisatie beoordeling
- Voer trypsinisatie en centrifugeren uit door de stappen 4.2-4.4 te volgen.
- Resuspend de cellen in 500 μL volledig medium, en pas vervolgens de celdichtheid aan 1 × 105 - 6 × 106 cellen
- Voeg 0,5 ml JC-1 werkoplossing toe aan elke buis.
- Incubeer de cellen gedurende 20 minuten in een celincubator bij 37 °C.
OPMERKING: Voeg tijdens de incubatieperiode 1 ml 5× JC-1-kleurbuffer toe aan 4 ml gedestilleerd water om de JC-1-kleurbuffer voor te bereiden. - Centrifugeer de cellen na incubatie bij 600 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
- Gooi het supernatant weg en resuspend de pellet in 1 ml JC-1 kleurbuffer.
- Herhaal stap 6.5 tot 6.6 driemaal.
- Resuspendeer de HCM's in 1 ml ijskoude kleuringsbuffer in een centrifugebuis van 1,5 ml en gebruik de cellen voor analyse binnen 30 minuten.
- Selecteer het PE (590 nm) detectiekanaal en FITC (530 nm) om de fluorescentie-intensiteit van JC-1 kleurstof in de cellen te meten.
OPMERKING: Stel de flowcytometer in door de stappen 5.10-5.17 te volgen.
7. Reactieve zuurstofsoorttest
- Voer trypsinisatie en centrifugeren uit door de stappen 4.2-4.4 te volgen.
- Bevlek de cellen in kweekmedium met 10 μM DCFDA en pas de celdichtheid aan op 1 × 106 - 1 × 107 cellen
- Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Pipetteer de cellen voorzichtig elke 3-5 minuten omhoog/omlaag.
- Was de cellen na de incubatie drie keer met een serumvrij celkweekmedium.
- Analyseer de cellen op een flowcytometer door de stappen 5.10-5.17 te volgen.
OPMERKING: DCF wordt opgewekt bij 488 nm en de emissie-intensiteit gemeten bij 530 nm.
8. Meting van Caspase 3/ Caspase 8 Activiteit
- Voer trypsinisatie uit door de stappen 4.2-4.4 te volgen.
- Verzamel de cellen door centrifugeren bij 600 × g bij 4 °C gedurende 5 minuten.
- Voeg 100 μL lysaatbuffer toe per 2 × 106 cellen.
- Lyse de cellen gedurende 15 minuten op ijs.
- Centrifugeer het monster na 15 minuten in een ijsbad op 1,6 × 104 x g bij 4 °C gedurende 15 minuten.
- Breng het supernatant over in een ijskoude centrifugebuis voor gebruik.
OPMERKING: De eiwitconcentratie in het monster moet ten minste 1-3 mg/ml zijn. - Verwijder Ac-DEVD-pNA (2 mM) en plaats deze op een ijsbad voor gebruik.
- Voeg nauwkeurig 40 μL bufferoplossing toe aan de enzym-gelabelde plaat, voeg 80 μL van het monster toe en voeg ten slotte 10 μL Ac-DEVD-pNA (2 mM) toe.
- Incubeer het monster gedurende 120 minuten bij 37 °C.
- Meet de A405-waarde op een microplaatlezer volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: De absorptie die wordt geproduceerd door de door caspase-3/caspase-8 gegenereerde pNA wordt berekend door de A405-waarde van de blancoregelaar af te trekken van die van het monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het effect van ogd-blootstelling op de levensvatbaarheid van HCM's werd bepaald door middel van een CCK-8-test. In vergelijking met die waargenomen in de controlegroep was de levensvatbaarheid van cellen significant afgenomen op een tijdsafhankelijke manier (Figuur 2A). De apoptosepercentages van HCM's op verschillende tijdstippen na reperfusie vertoonden een specifieke trend, waarbij van 0 tot 16 uur de apoptosepercentages geleidelijk stegen en de maximale snelheid bereikten op het tijdstip van 16 uur (figuur 2B). Omdat OGD gedurende 12 uur de celactiviteit met ~ 50% verminderde, werd 12 uur OGD gebruikt om celschade op te wekken in latere experimenten.
Vervolgens onderzochten we het effect van temperatuur op het proces van apoptose. Vergeleken met het percentage levensvatbare cellen in de OGD-groep was het percentage levensvatbare cellen hoger in de drie groepen die met onderkoeling werden behandeld (figuur 3B). Bovendien hadden cellen in de groep met diepe onderkoeling de hoogste levensvatbaarheid (>92%), 2,1 maal hoger dan die in de OGD-groep. Bovendien toonden de resultaten van de flowcytometrie aan dat onderkoeling de apoptose van HCM's onder OGD-omstandigheden voorkwam (figuur 3A&3C). Omdat mitochondriale disfunctie geassocieerd is met apoptose, hebben we aanvullende gegevens verkregen om mitochondriale aandoeningen te beoordelen. De intracellulaire ROS-spiegels werden bepaald met behulp van een DCFH-DA-test. Vergeleken met die waargenomen in de OGD-groep, verlaagde de hypothermiebehandeling de intracellulaire ROS-niveaus in HCM's (Figuur 4A). Bovendien werd mitochondriaal membraanpotentieel gedetecteerd met JC-1-kleuring. Na ogd-behandeling werd de rode fluorescentie van JC-1 aanzienlijk verminderd en de groene fluorescentie aanzienlijk verhoogd. Hypothermiebehandeling daarentegen remde het ogd-geïnduceerde effect aanzienlijk en verhoogde de rode tot de groene verhouding met een grote marge (figuur 4B). Bovendien werd de afname van caspase 3/caspase-8 ook waargenomen in de cellen die werden behandeld met hypothermiebehandelingen (Figuur 4C,4D)
Figuur 1: Stroomschema van de experimentele procedure. HCM's werden behandeld volgens het volgende protocol: tijdspunt 1 (T1) geeft het einde van de inductie aan (koeling gedurende 2 uur); tijdspunt 2 (T2) geeft het einde van het onderhoud aan (onderkoeling gedurende 10 uur bij de gewenste temperatuur); en tijdspunt 3 (T3) geeft het einde van de herwarming aan (twee uur opwarmen tot 37 °C). De temperatuur werd op de gewenste temperatuur gehouden: 34 °C voor milde onderkoeling, 31 °C voor matige onderkoeling en 17 °C voor ernstige onderkoeling. Controlecellen die onder continue normothermische omstandigheden (37 °C) werden gehouden, werden geanalyseerd. De temperatuuromstandigheden zijn gecreëerd met behulp van een tri-gas incubator, die nauwkeurige temperatuurregeling mogelijk maakt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen en apoptose door middel van de CCK-8- en annexin V/PI-tests. (A) De levensvatbaarheid van cellen werd gemeten aan de hand van een cel levensvatbaarheidstest. (B) Apoptose werd geanalyseerd door flowcytometrie. *p < 0,05,***p < 0,001 versus Normale groep. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen en apoptose na hypothermiebehandelingen. (A) Celapoptose werd gedetecteerd door flowcytometrie. (B) Kwantitatieve analyse van apoptose. (C) De levensvatbaarheid van cellen werd gemeten aan de hand van een cel levensvatbaarheidstest. **p < 0,01,***p < 0,001 versus normale groep. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Analyse van mitochondriale functie en caspase-3 caspase-8 activiteit. Een intracellulair ROS-gehalte. B Kwantificering van het potentieel van het mitochondriale membraan. (C&D) De caspase-8/caspase-3 activiteit werd geschat met behulp van een ELISA kit. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus OGD-groep. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De complexiteit van intacte dieren, met inbegrip van de interacties tussen verschillende soorten cellen, verhinderen vaak gedetailleerde studies van specifieke componenten van I/R-letsel. Daarom is het noodzakelijk om een in vitro celmodel vast te stellen dat de moleculaire veranderingen na ischemie in vivo nauwkeurig kan weergeven. Onderzoek naar OGD-modellen is eerder gerapporteerd13,22, en vele geavanceerde methoden zijn vastgesteld23,24. Het voorbereidingsproces van OGD-modellen omvat twee belangrijke stappen: zuurstoftekort en glucosetekort. In deze studie werd glucosetekort uitgevoerd door cultiveringscel in glucosevrij medium, en zuurstoftekort werd bereikt door substitutie met stikstof, wat momenteel een gevestigde methode is om OGD-modellen25,26voor te bereiden . Afhankelijk van het celtype moet echter rekening worden gehouden met twee factoren, waaronder:1) celzadendichtheid en 2) duur van ogd-blootstelling. Hoe groter het aantal aange gehechte cellen, hoe sterker de weerstand tegen OGD-stress, zodat de duur van het zaaien voorafgaand aan OGD cruciaal is. HCM's (2 ×10 5 cellen/putten) werden 30-34 uur vóór OGD in 6-putplaat gezaaid, waarna cellen ongeveer 65% samenvloeiden. Een hogere celdichtheid vermindert de impact van OGD op cellen. Bovendien is het cruciaal om het potentieel van verlies van de cellen tijdens de wasstappen te minimaliseren. Het effect van de duur van ogd-blootstelling is een andere belangrijke factor bij het evalueren van de werkzaamheid van het OGD-model. Om bijvoorbeeld de beschermende effecten van geneesmiddelen te bestuderen, is het passend om een duur te kiezen die 40-50% celdood veroorzaakt zonder behandeling. Als celdood te extreem is, bijvoorbeeld 80%, dan zal het een uitdaging zijn om het beschermende effect van het te analyseren reagens te kwantificeren. Voor HCM's resulteerde blootstelling aan OGD gedurende 12 uur in 42% celdood. Daarom werd in de daaropvolgende experimenten een 12-uur durende OGD-behandeling gebruikt om celschade op te wekken.
Vanwege het verschil in hypotherme kinetiek tussen in vivo en in vitro omgevingen, blijft de optimale aanpak en mechanismen van hypothermie inductie voor cardiomyocyt model onduidelijk. In de afgelopen decennia zijn verschillende in vitro modellen ontwikkeld om cardiomyocyten bij lage temperaturen te bestuderen. Jana Krech et al. stelden bijvoorbeeld een matig hypothermiecelmodel vast om het effect van temperatuur op myocardapoptose na ischemie-reperfusiete bestuderen 13. Hoewel veel studies zich hebben gericht op de fysiologische effecten van koeling, zijn er ook een groot aantal schadelijke bijwerkingen die optreden tijdens het opwarmen27. De resultaten van eerdere studies hebben aangetoond dat rewarming contractiele disfunctie kan veroorzaken in de geïsoleerde cardiomyocyten27,28. Daarom is de temperatuur en snelheid van het opwarmen bijzonder essentieel. Om het effect van temperatuur strikt te controleren, pasten we het standaard tijd-temperatuurprotocol toe dat wordt gebruikt tijdens hartchirurgie, zoals eerder vermeld20,21. In dit model wordt de temperatuur nauwkeurig geregeld binnen het vereiste temperatuurbereik, inclusief drie fasen: 1) de koelperiode (1 uur); 2) de temperatuur handhaven periode (10 uur); en 3) de temperatuurherwarmingsperiode (2 uur). Bovendien zijn de temperaturen die in deze studie worden gebruikt typisch voor milde (34 ° C), matige (31 ° C) en ernstige (17 ° C) lage temperaturen, vergelijkbaar met die gebruikt in eerdere publicaties29,30,31. Tot slot hebben we ook onze hypothese getest met betrekking tot de effecten van verschillende temperatuuromstandigheden op cardiomyocyt apoptose in vitro. Zoals verwacht toonden de resultaten aan dat de temperatuur de ROS-niveaus aanzienlijk verlaagde, MMP herstelde en de caspase-8 / caspase-3-activiteit verminderde.
We zijn ons ervan bewust dat deze studie werd uitgevoerd met behulp van zowel een niet-contractiele cellijn als een in vitro model, dat niet werd beïnvloed door lichaamsvloeistoffen. Ondanks deze beperkingen benadrukt de significante verbetering van celapoptose als gevolg van hypothermiebehandeling het belang van verder onderzoek, inclusief in vivo studies. Daarom kan dit model worden gebruikt om het moleculaire mechanisme van hypothermische cardioprotectie te bestuderen, wat belangrijke implicaties kan hebben voor de ontwikkeling van complementaire therapieën voor gebruik met onderkoeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (81970265, 81900281,81700288), de China Postdoctoral Science Foundation (2019M651904); en het National Key Research and Development Program of China (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit | Bio-Technology,China | C1062M | |
| Cardiac myocyte growth supplement | Sciencell,USA | 6252 | |
| Caspase 3 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1115 | |
| Caspase 8 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1151 | |
| DMEM, no glucose | Gibco,USA | 11966025 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco,USA | 11960044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco,USA | 16140071 | |
| Flow cytometry | CytoFLEX,USA | B49007AF | |
| Human myocardial cells | BLUEFBIO,China | BFN60808678 | |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Bio-Technology,China | C2006 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco,USA | 10378016 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Bio-Technology,China | S0033S | |
| Three-gas incubator | Memmert,Germany | ICO50 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco,USA | 25200056 |
References
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).
- Klein, P., et al. Less invasive ventricular reconstruction for ischaemic heart failure. EUROPEAN JOURNAL OF HEART FAILURE. 21 (12), 1638-1650 (2019).
- Otto, K. A. Therapeutic hypothermia applicable to cardiac surgery. VETERINARY ANAESTHESIA AND ANALGESIA. 42 (6), 559-569 (2015).
- Wang, X., et al. Safety of Hypothermic Circulatory Arrest During Unilateral Antegrade Cerebral Perfusion for Aortic Arch Surgery. CANADIAN JOURNAL OF CARDIOLOGY. 35 (11), 1483-1490 (2019).
- Leshnower, B. G., et al. Moderate Versus Deep Hypothermia With Unilateral Selective Antegrade Cerebral Perfusion for Acute Type A Dissection. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 100 (5), 1563-1568 (2015).
- Vallabhajosyula, P., et al. Moderate versus deep hypothermic circulatory arrest for elective aortic transverse hemiarch reconstruction. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 99 (5), 1511-1517 (2015).
- Keeling, W. B., et al. Safety of Moderate Hypothermia With Antegrade Cerebral Perfusion in Total Aortic Arch Replacement. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 105 (1), 54-61 (2018).
- Yan, T. D., et al. Consensus on hypothermia in aortic arch surgery. Annals of Cardiothoracic Surgery. 2 (2), 163-168 (2013).
- Zhou, J., Empey, P. E., Bies, R. R., Kochanek, P. M., Poloyac, S. M. Cardiac arrest and therapeutic hypothermia decrease isoform-specific cytochrome P450 drug metabolism. DRUG METABOLISM AND DISPOSITION. 39 (12), 2209-2218 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Inhibition of the mitochondrial fission protein dynamin-related protein 1 improves survival in a murine cardiac arrest model. CRITICAL CARE MEDICINE. 43 (2), 38-47 (2015).
- Zhu, W. S., et al. Hsp90aa1: a novel target gene of miR-1 in cardiac ischemia/reperfusion injury. Sci Rep. 6, 24498 (2016).
- Castedo, E., et al. Influence of hypothermia on right atrial cardiomyocyte apoptosis in patients undergoing aortic valve replacement. Journal of Cardiothoracic Surgery. 2, 7 (2007).
- Krech, J., et al. Moderate therapeutic hypothermia induces multimodal protective effects in oxygen-glucose deprivation/reperfusion injured cardiomyocytes. Mitochondrion. 35, 1-10 (2017).
- Cooper, W. A., et al. Hypothermic circulatory arrest causes multisystem vascular endothelial dysfunction and apoptosis. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 69 (3), 696-702 (2000).
- Kajimoto, M., et al. Selective cerebral perfusion prevents abnormalities in glutamate cycling and neuronal apoptosis in a model of infant deep hypothermic circulatory arrest and reperfusion. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM. 36 (11), 1992-2004 (2016).
- Liu, Y., et al. Deep Hypothermic Circulatory Arrest Does Not Show Better Protection for Vital Organs Compared with Moderate Hypothermic Circulatory Arrest in Pig Model. Biomed Research International. 2019, 1420216 (2019).
- Davidson, M. M., et al. Novel cell lines derived from adult human ventricular cardiomyocytes. JOURNAL OF MOLECULAR AND CELLULAR CARDIOLOGY. 39 (1), 133-147 (2005).
- Khan, K., Makhoul, G., Yu, B., Schwertani, A., Cecere, R. The cytoprotective impact of yes-associated protein 1 after ischemia-reperfusion injury in AC16 human cardiomyocytes. EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE. 244 (10), 802-812 (2019).
- Pan, J. A., et al. miR-146a attenuates apoptosis and modulates autophagy by targeting TAF9b/P53 pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Discovery. 10 (9), 668 (2019).
- Schmitt, K. R., et al. S100B modulates IL-6 release and cytotoxicity from hypothermic brain cells and inhibits hypothermia-induced axonal outgrowth. NEUROSCIENCE RESEARCH. 59 (1), 68-73 (2007).
- Tong, G., et al. Deep hypothermia therapy attenuates LPS-induced microglia neuroinflammation via the STAT3 pathway. Neuroscience. 358, 201-210 (2017).
- Yu, Z. P., et al. Troxerutin attenuates oxygenglucose deprivation and reoxygenationinduced oxidative stress and inflammation by enhancing the PI3K/AKT/HIF1alpha signaling pathway in H9C2 cardiomyocytes. Molecular Medicine Reports. 22 (2), 1351-1361 (2020).
- Drescher, C., Diestel, A., Wollersheim, S., Berger, F., Schmitt, K. R. How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia. European journal of cardiothoracic surgery. 40 (2), 352-359 (2011).
- Diestel, A., Drescher, C., Miera, O., Berger, F., Schmitt, K. R. Hypothermia protects H9c2 cardiomyocytes from H2O2 induced apoptosis. Cryobiology. 62 (1), 53-61 (2011).
- Zhang, Y., et al. HIF-1alpha/BNIP3 signaling pathway-induced-autophagy plays protective role during myocardial ischemia-reperfusion injury. BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY. 120, 109464 (2019).
- An, W., et al. Exogenous IL-19 attenuates acute ischaemic injury and improves survival in male mice with myocardial infarction. BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY. 176 (5), 699-710 (2019).
- Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling. EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).
- Yarbrough, W. M., et al. Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure. Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).
- Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals. AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).
- Bobi, J., et al. Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management. Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).
- Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation & Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).
