Summary
Die unterschiedlichen Auswirkungen unterschiedlicher Unterkühlungsgrade auf den Myokardschutz wurden nicht gründlich bewertet. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Konzentration des Zelltodes nach verschiedenen Hypothermie-Behandlungen in einem auf humanem Kardiomyozyten basierenden Modell zu quantifizieren und damit den Grundstein für zukünftige vertiefte molekulare Forschung zu legen.
Abstract
Ischämie/Reperfusion abgeleitete Myokardfunktionsstörung ist ein häufiges klinisches Szenario bei Patienten nach einer Herzoperation. Insbesondere ist die Empfindlichkeit von Kardiomyozyten gegenüber ischämischen Verletzungen höher als bei anderen Zellpopulationen. Derzeit bietet Unterkühlung erheblichen Schutz vor einer erwarteten ischämischen Beleidigung. Untersuchungen zu komplexen Hypothermie-induzierten molekularen Veränderungen halten sich jedoch in Grenzen. Daher ist es wichtig, einen Kulturzustand ähnlich wie in vivo-Bedingungen zu identifizieren, die schäden ähnlich denen im klinischen Zustand in einer reproduzierbaren Weise verursachen können. Um Ischämie-ähnliche Bedingungen in vitro nachzuahmen, wurden die Zellen in diesen Modellen durch Sauerstoff-/Glukoseentzug (OGD) behandelt. Darüber hinaus haben wir ein Standard-Zeittemperaturprotokoll angewendet, das während der Herzchirurgie verwendet wird. Darüber hinaus schlagen wir einen Ansatz vor, um eine einfache, aber umfassende Methode für die quantitative Analyse von Myokardverletzungen zu verwenden. Apoptose und Expressionsniveaus von Apoptose-assoziierten Proteinen wurden durch Durchflusszytometrie und mit einem ELISA-Kit bewertet. In diesem Modell haben wir eine Hypothese über die Auswirkungen unterschiedlicher Temperaturbedingungen auf die Kardiomyozytenapoptose in vitro getestet. Die Zuverlässigkeit dieses Modells hängt von einer strengen Temperaturregelung, kontrollierbaren experimentellen Verfahren und stabilen experimentellen Ergebnissen ab. Darüber hinaus kann dieses Modell verwendet werden, um den molekularen Mechanismus des hypothermischen Kardioschutzes zu untersuchen, was wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von ergänzenden Therapien zur Verwendung mit Hypothermie haben kann.
Introduction
Ischämie/Reperfusion abgeleitete Myokardfunktionsstörung ist ein häufiges klinisches Szenario bei Patienten nach Herzoperationen1,2. Während der nichtpulsatilen Durchflussdurchblutung und Perioden des gesamten Kreislaufstillstands treten immer noch Schäden bei allen Arten von Herzzellen auf. Insbesondere ist die Empfindlichkeit von Kardiomyozyten gegenüber ischämischen Verletzungen höher als bei anderen Zellpopulationen. Derzeit bietet die therapeutische Unterkühlung (TH) einen erheblichen Schutz gegen eine erwartete ischämische Beleidigung bei Patienten, die sich einer Herzoperation unterziehen3,4. TH ist definiert als eine Kernkörpertemperatur von 14-34 °C, obwohl es keinen Konsens über eine Definition der Kühlung während der Herzchirurgie5,6,7gibt. Im Jahr 2013 schlug eine internationale Expertengruppe ein standardisiertes Meldesystem vor, um verschiedene Temperaturbereiche des systemischen hypothermischen Kreislaufstillstands8zu klassifizieren. Basierend auf Elektroenzephalographie- und Stoffwechselstudien des Gehirns teilten sie die Hypothermie in vier Ebenen auf: tiefe Hypothermie (≤ 14 °C), tiefe Hypothermie (14,1-20 °C), moderate Unterkühlung (20,1-28 °C) und leichte Hypothermie (28,1-34 °C). Der Expertenkonsens bot eine klare und einheitliche Klassifizierung, die es ermöglicht, dass Studien vergleichbarer sind und klinisch relevantere Ergebnisse liefern. Dieser Schutz durch TH basiert auf seiner Fähigkeit, die metabolische Aktivität von Zellen zu reduzieren, was ihre Rate des verbrauchshöchstenergetischen Phosphatverbrauchs weiter begrenzt9,10. Jedoch, die Rolle der TH im Myokardschutz ist umstritten und kann mehrere Auswirkungen haben, je nach Grad der Unterkühlung.
Myokardi/R ist bekannt, dass sie von erhöhter Zellapoptisis11begleitet wird. Jüngste Berichte haben beobachtet, dass programmierte KardiomyozytenTod steigt während der Operation am offenen Herzen, und kann mit Nekrose zusammenfallen, wodurch die Zahl der toten Myokardzellen12erhöht. Daher ist die Verringerung der Kardiomyozytenapoptose ein nützlicher therapeutischer Ansatz in der klinischen Praxis. Im Maus-Atrial-HL-1-Kardiomyozytenmodell wurde gezeigt, dass die therapeutische Hypothermie die mitochondriale Freisetzung von Cytochrom c und Apoptose-induzierendem Faktor (AIF) während der Reperfusion13reduziert. Jedoch, die Wirkung der Temperatur bei der Regulierung der Apoptose ist umstritten und scheint vom Grad der Unterkühlung abhängen. Cooper und Kollegen beobachteten, dass im Vergleich zu einer normothermen kardiopulmonalen Bypass-Kontrollgruppe die Apoptoserate des Myokardgewebes von Schweinen mit dem tiefen hypothermen Kreislaufstillstandum 14erhöht wurde. Darüber hinaus haben die Ergebnisse einiger Studien darauf hindeutet, dass tiefe Hypothermie den Apoptose-Weg aktivieren kann, während weniger aggressive Hypothermie den Weg zu hemmen scheint12,15,16. Der Grund für dieses Ergebnis kann auf verwirrende Effekte im Zusammenhang mit ischämischen Verletzungen und ein Mangelndes Verständnis der Mechanismen, durch die Temperatur wirkt sich auf Myokardgewebe. Daher sollten die Temperaturgrenzwerte, bei denen die Apoptose erhöht oder abgeschwächt wird, genau definiert werden.
Um ein besseres Verständnis der Mechanismen zu gewinnen, die mit der Wirksamkeit der Hypothermie verbunden sind, und eine rationale Grundlage für ihre Umsetzung beim Menschen zu schaffen, ist es wichtig, einen Kulturzustand ähnlich wie in vivo-Bedingungen zu identifizieren, die Schäden ähnlich denen für den klinischen Zustand in reproduzierbarer Weise verursachen können. Ein wesentlicher Schritt zur Erreichung dieses Ziels ist die Schaffung der optimalen Bedingungen für die Induktion von Kardiomyozyten-Apoptose. Dementsprechend untersuchten wir in der vorliegenden Studie die methodischen Details zu Sauerstoff-Glukose-Entzugsexperimenten mit kultivierten Zellen, einem einfachen In-vitro-Modell der Ischämie-Reperfusion. Darüber hinaus haben wir die Wirkung verschiedener hypoxisch-ischämischer Zeiten auf die Kardiomyozytenapoptose bewertet und unsere Hypothese über die Wirkung unterschiedlicher Temperaturbedingungen auf die Zellapoptose in vitro überprüft.
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Protocol
Informationen zu kommerziellen Reagenzien und Instrumenten sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
Die AC16 humane Kardiomyozyten-Zelllinie wurde aus der Fusion von Primärzellen aus adultem ventrikulärem Herzgewebe mit SV40-transformierten menschlichen Fibroblasten17abgeleitet, die von BLUEFBIO (Shanghai, China) gekauft wurden. Die Zelllinie entwickelt viele biochemische und morphologische Merkmale, die für Kardiomyozyten charakteristisch sind. Darüber hinaus ist die Zelllinie weit verbreitet verwendet, um Myokardschäden und Myokardfunktion in vitro18,19zu bewerten.
1. Zellkultur
HINWEIS: Das Basalkulturmedium besteht aus dem serumfreien Dulbecco-modifizierten Eagle-Medium (DMEM), 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Herzmyozytenwachstumsergänzung und 1% Penicillin/Streptomycin-Lösung. Das Medium bei 4 °C aufbewahren und vor Gebrauch auf 37 °C vorwärmen.
- Entfernen Sie die kryokonservierten menschlichen Kardiomyozytenzellen (HCM) aus flüssigem Stickstoff und tauen Sie sie in einem Wasserbad bei 37 °C auf.
- Die Durchstechflasche (<1 Minute) in einem 37 °C-Wasserbad vorsichtig schütteln, bis nur noch ein kleines Stück Eis in der Durchstechflasche verbleibt.
- Die Durchstechflasche in eine sterile laminare Durchflusshaube übertragen. Wischen Sie die Außenseite der Durchstechflasche mit einer In 70% Alkohol getauchten Wattekugel ab.
- Transfer 4 ml vorgewärmtes komplettes Wachstumsmedium tropfenweise in das Zentrifugenrohr, das die aufgetauten Zellen enthält.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 × g für 10 Minuten. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet in 5 ml komplettem Medium wieder aufhängen.
- Bewahren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator unter einer Atmosphäre mit 95% Luft und 5%CO2auf.
HINWEIS: Vor der Ernte der Zellen für Experimente dürfen die Zellen wachsen, bis sie etwa 60-70% Konfluenz erreichen.
2. Erstellung eines Sauerstoff-Glukose-Entzugsmodells (OGD)
HINWEIS: Ersetzen Sie zwei Stunden vor der Studienzeit das Wachstumsmedium durch ein serumfreies Medium, und die Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator für 2 h bei 37 °C unter einer Atmosphäre mit 5%CO2wieder inkubiert.
- Das Medium von einer 6-Well-Platte absaugen und die Zellen dreimal mit Phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) vorsichtig waschen.
- Fügen Sie 2 ml frisches zuckerfreies DMEM pro Brunnen hinzu.
- Kultur die Zellen bei konstanter Temperatur in einem Drei-Gas-Inkubator unter einer Atmosphäre mit einem Gemisch von 95%N2,5%CO2und 0,1%O2 bei 37 °C für 1, 2, 4, 8, 12 oder 16 h.
- Nach der Hypoxie-Behandlung das Medium von der 6-Well-Platte ansaugen und die Zellen dreimal mit PBS (pH 7.4) waschen.
- Fügen Sie 2 ml komplette DMEM pro Brunnen hinzu.
- Bewahren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator unter einer Atmosphäre mit 95% Luft und 5%CO2auf.
3. Zeit-Temperatur-Protokoll
HINWEIS: Ein Standard-Zeittemperaturprotokoll wird während der Herzchirurgie verwendet, wie zuvor von anderen20,21beschrieben. Behandeln Sie HCMs nach dem folgenden Protokoll (Abbildung 1): Der Zeitpunkt 1 (T1) gibt das Ende der Induktion an, der Zeitpunkt 2 (T2) gibt das Ende der Wartung an und der Zeitpunkt 3 (T3) gibt das Ende der Rewarminganuktion an. Analysieren Sie Kontrollzellen, die unter kontinuierlichen normothermischen Bedingungen (37 °C) gehalten werden. Die Temperaturbedingungen werden mit einem Tri-Gas-Inkubator erzeugt, der eine präzise Temperaturregelung ermöglicht.
- Zwei Stunden vor den Experimenten das Kulturmedium von einer 6-Well-Platte ansaugen und 2 ml frisches serumfreies DMEM pro Brunnen hinzufügen.
- Die Zellen in einem befeuchteten Inkubator für 2 h bei 37 °C unter einer Atmosphäre mit 5%CO2wieder inkubieren.
- Nach 2 h das Medium von der 6-Well-Platte absaugen und die Zellen dreimal mit PBS (pH 7.4) waschen.
- Fügen Sie 2 ml frisches serumfreies DMEM pro Brunnen hinzu.
- Reinkubieren Sie die Zellen im Trigas-Inkubator.
HINWEIS: Ersetzen Sie das Medium, um nicht angeschlossene Zellen und Schmutz zu entfernen. - Ändern Sie sofort die Temperatur, indem Sie die Kulturgerichte einen Tri-Gas-Inkubator platzieren.
- Nach 1 h Abkühlung das Medium schnell von der 6-Well-Platte absaugen und 2 ml frisches, zuckerfreies DMEM pro Brunnen hinzufügen.
- Kultur die Zellen in einem Tri-Gas-Inkubator unter einer Atmosphäre, die 95%N2, 5%CO2und 0,1%O2 bei 37 °C für 12 h zur Etablierung von Hypoxie.
- Stellen Sie die Temperatur wie unten beschrieben ein.
HINWEIS: Das Protokoll beginnt mit 10 h einer Niedertemperaturbehandlung, gefolgt von einer Aufwärmphase für 2 h bis 37 °C und 24 h Normothermie (37 °C). Zu jedem Zeitpunkt werden drei Petrischalen zur Analyse entfernt. - Nach der Niedertemperaturbehandlung das Medium von der 6-Well-Platte absaugen und dreimal mit PBS (pH 7.4) waschen.
- Fügen Sie 2 ml komplette DMEM pro Brunnen hinzu.
- Bewahren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator unter einer Atmosphäre mit 95% Luft und 5%CO2auf.
4. CCK-8-Fähigkeitstest
- Die 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung und PBS vor der Anwendung auf 37 °C erwärmen.
- Saugen Sie das Medium, spülen Sie die Zellen mit 1 ml PBS und fügen Sie dann 0,5 ml von 0,25% Trypsin entlang der Wand des Brunnens hinzu. Bei 37 °C inkubieren, bis fast alle HCMs abgelöst sind (ca. 1 min).
- Fügen Sie 1 ml DMEM-Gesamtmedium in die Brunnen ein, um das Trypsin zu neutralisieren.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenrohr und pellet die HCMs durch Zentrifugation bei 500 × g für 3 min. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
- Geben Sie 100 L Aliquots der Zellsuspension (5000 Zellen/Well) in eine 96-Well-Platte. Die Platte für 24 h in einem befeuchteten Inkubator (bei 37 °C) vorinkubieren
- Verwenden Sie die kultivierten Zellen in den 96-Well-Platten, um verschiedene Behandlungsgruppen zu erzeugen.
- Inkubieren Sie die Platte für eine angemessene Zeitdauer (16 h) in einem Inkubator.
- Fügen Sie jeder Bohrung der Platte 10 L CCK-8-Lösung hinzu.
- Inkubieren Sie die Platte für 1 Stunde im Inkubator.
- Messen Sie die Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplattenleser.
VORSICHT: Achten Sie darauf, keine Blasen in die Brunnen einzuführen, da sie die OD-Messwerte stören.
5. Durchflusszytometrie zur Apoptoseanalyse
- Führen Sie Trypsinisierungs- und Zentrifugationsschritte durch, indem Sie die Schritte 4.2-4.4 befolgen.
HINWEIS: Zellen werden mit Trypsin ohne EDTA geerntet. Um die Apoptose zu bewerten, werden sowohl schwimmende als auch anhimante Zellen gesammelt. - Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 1000 × g. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml PBS wieder auf.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Übertragen Sie mit einer Pipette 100 l Trypan Blue-treated Cell Suspension auf ein Hämozytometer. Zählen Sie mit einem Handzähler die lebenden, ungefärbten Zellen in einem Satz von 16 Quadraten und verwenden Sie dann PBS, um eine Zellsuspension bei 1×107 Zellen/ml zu erzeugen.
- Erhalten Sie 200 l der Zellsuspension (5 × 105 -1 × 106 Zellen).
- Zentrifuge für 5 min bei 1000 × g und das Pellet in der Annexin V-FITC-Bindungslösung wieder aufsetzen.
- Fügen Sie 5 L Von Annexin V-FITC hinzu, um die Zellen zu färben.
- Fügen Sie der Zellsuspension 10 L Propidiumjodid hinzu.
- Mischen Sie die Zellen vorsichtig und bebrüten Sie sie 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
HINWEIS: Die Zellen werden während der Inkubation 2-3 Mal resuspendiert, um die Färbung zu verbessern. - Starten Sie das Durchflusszytometer, und stellen Sie sicher, dass die Software ordnungsgemäß funktioniert.
- Öffnen Sie zwei Punktdiagrammfenster in der Flow-Zytometrie-Software.
- Wählen Sie Vorwärtsstreulicht (FSC) auf der X-Achse und seitengestreutes Licht (SSC) auf der Y-Achse aus, um Zellablagerungen bzw. Klumpen hinsichtlich ihrer Größe bzw. Granularität auszuschließen.
- Wählen Sie den PE (590 mm) Detektionskanal und FITC (530 mm), der verwendet wird, um die Fluoreszenzintensität der Zellen zu messen.
- Legen Sie das leere (HCMs, die nicht gefärbt wurden) Probenrohr auf das Durchflusszytometer.
- Klicken Sie auf Aufzeichnen, um Partikel aus der Suspension im leeren Probenrohr zu sammeln, und dann die Zellpopulation zur weiteren Analyse im ersten Punktdiagramm zu beaufnehmen.
- Legen Sie die eingefärbten Proben auf den Rohrträgerarm. Klicken Sie auf Aufzeichnen, um Partikel aus der Suspension zu sammeln, und dann die Zellpopulation zur weiteren Analyse im ersten Punktdiagramm zu beorchen.
- Sammeln Sie die HCMs in anderen Probenröhren und optimieren Sie die Messung, indem Sie die Spannungen der Fluoreszenzkanäle anpassen.
HINWEIS: Ungefärbte und eingefärbte Proben werden während des Experiments als Kompensationskontrollen verwendet. - Zeigen Sie die Statistiken der einzelnen Probenröhrchen an und berechnen Sie die Apoptoserate jeder Probe.
6. Mitochondriale Depolarisationsbewertung
- Führen Sie Trypsinisierung und Zentrifugation durch die folgenden Schritte 4.2-4.4 durch.
- Setzen Sie die Zellen in 500 l des gesamten Mediums wieder auf, und passen Sie dann die Zelldichte an 1 × 105 - 6 × 106 Zellen an
- Fügen Sie 0,5 ml JC-1 Arbeitslösung zu jedem Rohr hinzu.
- Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellinkubator bei 37 °C für 20 Minuten.
HINWEIS: Während der Inkubationszeit 1 ml 5× JC-1 Färbepuffer zu 4 ml destilliertem Wasser hinzufügen, um den JC-1-Färbepuffer vorzubereiten. - Zentrifugieren Sie die Zellen nach der Inkubation bei 600 × g für 3 min bei 4 °C.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml JC-1-Färbepuffer wieder auf.
- Wiederholen Sie die Schritte 6.5 bis 6.6 dreimal.
- Setzen Sie die HCMs in 1 ml eiskalten Färbepuffer in einem 1,5 ml Zentrifugenrohr aus und verwenden Sie die Zellen für die Analyse innerhalb von 30 min.
- Wählen Sie den PE (590 nm) Detektionskanal und FITC (530 nm) aus, um die Fluoreszenzintensität des JC-1-Farbstoffs in den Zellen zu messen.
HINWEIS: Richten Sie das Durchflusszytometer mit den folgenden Schritten 5.10-5.17 ein.
7. Reaktive Sauerstoffspezies Assay
- Führen Sie Trypsinisierung und Zentrifugation durch die folgenden Schritte 4.2-4.4 durch.
- Stainieren Sie die Zellen im Kulturmedium mit 10 M DCFDA und passen Sie die Zelldichte auf 1 × 106 - 1 × 107 Zellen an
- 30 Minuten bei 37 °C inkubieren.
- Pipette die Zellen alle 3-5 min nach oben/unten.
- Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal mit serumfreiem Zellkulturmedium.
- Analysieren Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer, indem Sie die Schritte 5.10-5.17 ausführen.
HINWEIS: DCF wird bei 488 nm angeregt und die Emissionsintensität bei 530 nm gemessen.
8. Messung von Caspase 3/ Caspase 8 Aktivität
- Führen Sie die Trypsinisierung durch die folgenden Schritte 4.2-4.4 aus.
- Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 600 × g bei 4 °C für 5 Minuten.
- Fügen Sie 100 l Lysatpuffer pro 2 × 106 Zellen hinzu.
- Lyse die Zellen für 15 Minuten auf Eis.
- Nach 15 min Inkubation in einem Eisbad zentrieren Sie die Probe bei 1,6 × 104 x g bei 4 °C 15 Minuten lang.
- Übertragen Sie den Überstand zur Verwendung in ein eiskaltes Zentrifugenrohr.
HINWEIS: Die Proteinkonzentration in der Probe sollte mindestens 1-3 mg/ml betragen. - Entfernen Sie Ac-DEVD-pNA (2 mM) und legen Sie es auf ein Eisbad für den Einsatz.
- Fügen Sie der enzymbeschriftten Platte eine Pufferlösung von 40 l genau hinzu, fügen Sie 80 l der Probe hinzu und fügen Sie schließlich 10 l Ac-DEVD-pNA (2 mM) hinzu.
- Inkubieren Sie die Probe bei 37 °C für 120 Minuten.
- Gemessen den A405-Wert auf einem Mikroplattenleser gemäß den Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Die von der pNA erzeugte Absorption wird durch Subtraktion des A405-Wertes des Rohlingssteuerelements von dem der Probe berechnet.
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Representative Results
Die Wirkung der OGD-Exposition auf die Lebensfähigkeit von HCM wurde durch CCK-8-Assay bestimmt. Im Vergleich zu der in der Kontrollgruppe beobachteten wurde die Zelllebensfähigkeit zeitabhängig signifikant verringert (Abbildung 2A). Die Apoptoseraten von HCM zu unterschiedlichen Zeiten nach der Reperfusion zeigten einen spezifischen Trend, bei dem die Apoptoseraten allmählich stiegen und die Höchstrate zum 16-Stunden-Zeitpunkt erreichten(Abbildung 2B). Da OGD für 12 h die Zellaktivität um 50 % reduzierte, wurde 12 h OGD verwendet, um Zellschäden in nachfolgenden Experimenten zu induzieren.
Anschließend untersuchten wir die Auswirkungen der Temperatur auf den Prozess der Apoptose. Im Vergleich zu dem in der OGD-Gruppe beobachteten war der Anteil lebensfähiger Zellen in den drei mit Unterkühlung behandelten Gruppen höher(Abbildung 3B). Darüber hinaus hatten Zellen in der Gruppe der tiefen Hypothermie die höchste Lebensfähigkeit (>92%), 2,1-mal höher als in der OGD-Gruppe beobachtet. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse der Durchflusszytometrie, dass Hypothermie die Apoptose von HCM unter OGD-Bedingungen verhinderte (Abbildung 3A&3C). Da mitochondriale Dysfunktion mit Apoptose verbunden ist, erhielten wir zusätzliche Daten, um mitochondriale Störungen zu bewerten. Die intrazellulären ROS-Spiegel wurden mit einem DCFH-DA-Assay bestimmt. Im Vergleich zu der in der OGD-Gruppe beobachteten verringerte die Hypothermie-Behandlung die intrazellulären ROS-Spiegel bei HCMs (Abbildung 4A). Darüber hinaus wurde mitochondriales Membranpotenzial mit JC-1-Färbung nachgewiesen. Nach der OGD-Behandlung wurde die rote Fluoreszenz von JC-1 signifikant reduziert und die grüne Fluoreszenz signifikant erhöht. Im Gegensatz dazu hemmte die Hypothermie-Behandlung den OGD-induzierten Effekt signifikant und erhöhte das rot-grüne Verhältnis um einen großen Rand (Abbildung 4B). Darüber hinaus wurde die Abnahme von Caspase 3/Caspase-8 auch in den Zellen beobachtet, die mit Hypothermie-Behandlungen behandelt wurden (Abbildung 4C,4D)
Abbildung 1: Flussdiagramm des experimentellen Verfahrens. HCMs wurden nach folgendem Protokoll behandelt: Zeitpunkt 1 (T1) zeigt das Ende der Induktion an (Kühlung für 2h); Zeitpunkt 2 (T2) zeigt das Ende der Wartung an (Hypothermie für 10h bei der gewünschten Temperatur); und Zeitpunkt 3 (T3) zeigt das Ende der Rewarming (Rewarming für zwei h bis 37 °C). Die Temperatur wurde bei der gewünschten Temperatur gehalten: 34 °C bei leichter Unterkühlung, 31 °C bei mäßiger Unterkühlung und 17 °C bei schwerer Unterkühlung. Es wurden Kontrollzellen analysiert, die unter kontinuierlichen normothermischen Bedingungen (37 °C) gehalten wurden. Die Temperaturbedingungen wurden mit einem Tri-Gas-Inkubator geschaffen, der eine präzise Temperaturregelung ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bewertung der Zelllebensfähigkeit und Apoptose durch die Assays CCK-8 und Annexin V/PI. (A) Die Zelllebensfähigkeit wurde mit Hilfe eines Zelllebensfähigkeits-Assays gemessen. (B) Die Apoptose wurde durch Durchflusszytometrie analysiert. *p < 0.05,***p < 0.001 versus Normale Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bewertung der Zelllebensfähigkeit und Apoptose nach Hypothermie-Behandlungen. (A) Zellapoptose wurde durch Durchflusszytometrie nachgewiesen. (B) Quantitative Analyse der Apoptose. (C) Die Zelllebensfähigkeit wurde mit Hilfe eines Zelllebensfähigkeits-Assays gemessen. **p < 0.01,***p < 0.001 versus Normale Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Analyse der mitochondrialen Funktion und Caspase-3-Caspase-8-Aktivität. Ein intrazellulärer ROS-Spiegel. B Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials. (C&D) Die Caspase-8/caspase-3-Aktivität wurde mit einem ELISA-Kit geschätzt. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 versus OGD-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Komplexität intakter Tiere, einschließlich der Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen, verhindert häufig detaillierte Untersuchungen spezifischer Komponenten von I/R-Verletzungen. Daher ist es notwendig, ein In-vitro-Zellmodell zu etablieren, das die molekularen Veränderungen nach Ischämie in vivo genau reflektieren kann. Forschung an OGD-Modelle wurde bereits berichtet13,22, und viele ausgeklügelte Methoden wurden etabliert23,24. Der Vorbereitungsprozess von OGD-Modellen umfasst zwei wichtige Schritte: Sauerstoffentzug und Glukoseentzug. In der vorliegenden Studie wurde Glukoseentzug durch Kultivierung von Zellen in glukosefreiem Medium durchgeführt, und Sauerstoffmangel wurde durch Substitution mit Stickstoff erreicht, das derzeit eine etablierte Methode zur Herstellung der OGD-Modelle25,26ist. Je nach Zelltyp müssen jedoch zwei Faktoren berücksichtigt werden, darunter:1) Zellsädichte und 2) Dauer der OGD-Exposition. Je größer die Anzahl der angeschlossenen Zellen, desto stärker ist der Widerstand gegen OGD-Spannung, so dass die Dauer der Aussaat vor OGD entscheidend ist. HCMs (2 × 105 Zellen/Brunnen) wurden vor OGD in 6-Well-Platten für 30-34h gesät, zu diesem Zeitpunkt waren die Zellen etwa 65% konfluent. Eine höhere Zelldichte wird die Auswirkungen von OGD auf Zellen reduzieren. Darüber hinaus ist es entscheidend, das Verlustpotenzial der Zellen während der Waschschritte zu minimieren. Die Wirkung der Dauer der OGD-Exposition ist ein weiterer wichtiger Faktor bei der Bewertung der Wirksamkeit des OGD-Modells. Zum Beispiel, um die schützende Wirkung von Medikamenten zu untersuchen, ist es angemessen, eine Dauer zu wählen, die 40-50% Zelltod ohne Behandlung verursacht. Wenn der Zelltod zu extrem ist, z. B. 80%, dann wird es schwierig sein, die schützende Wirkung des analysierten Reagenzes zu quantifizieren. Bei HCMs führte die 12-stündige Exposition gegenüber OGD zu 42 % zelldeatht. Daher wurde in den folgenden Experimenten eine 12-stündige OGD-Behandlung eingesetzt, um Zellschäden zu induzieren.
Aufgrund der unterschiedlichen hypothermischen Kinetik zwischen In-vivo- und In-vitro-Umgebungen bleibt der optimale Ansatz und die Mechanismen der Hypothermie-Induktion für das Kardiomyozytenmodell unklar. In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere In-vitro-Modelle entwickelt, um Kardiomyozyten bei niedrigen Temperaturen zu untersuchen. Zum Beispiel, Jana Krech et al. etabliert ein moderates Hypothermie-Zell-Modell, um die Wirkung der Temperatur auf Myokard-Apoptose nach Ischämie-Reperfusion13zu studieren. Obwohl viele Studien auf die physiologischen Auswirkungen der Kühlung konzentriert haben, Gibt es auch eine große Anzahl von schädlichen Nebenwirkungen, die während der Rewarming27auftreten. Die Ergebnisse früherer Studien haben gezeigt, dass rewarming kontraktile Dysfunktion in den isolierten Kardiomyozyten induzieren kann27,28. Daher ist die Temperatur und Geschwindigkeit des Wiederaufwärmens besonders wichtig. Um die Wirkung der Temperatur streng zu kontrollieren, haben wir das Standard-Zeittemperaturprotokoll angewendet, das während der Herzchirurgie verwendet wird, wie bereits erwähnt20,21. In diesem Modell wird die Temperatur im erforderlichen Temperaturbereich genau gesteuert, einschließlich drei Stufen: 1) die Kühlzeit (1 h); 2) die Temperaturhaltedauer (10 h); und 3) die Temperatur-Wiedererwärmungszeit (2 h). Darüber hinaus sind die in dieser Studie verwendeten Temperaturen typisch für milde (34° C), moderate (31 °C) und schwere (17 °C) niedrige Temperaturen, vergleichbar mit denen in früheren Veröffentlichungen29,30,31. Schließlich haben wir auch unsere Hypothese über die Auswirkungen unterschiedlicher Temperaturbedingungen auf die Kardiomyozytenapoptose in vitro getestet. Wie erwartet zeigten die Ergebnisse, dass die Temperatur die ROS-Spiegel signifikant reduzierte, MMP wiederherstellte und die Caspase-8 / Caspase-3-Aktivität verringerte.
Wir sind uns bewusst, dass diese Studie sowohl mit einer nicht-kontraktilen Zelllinie als auch mit einem In-vitro-Modell durchgeführt wurde, das von keiner Körperflüssigkeit beeinflusst wurde. Trotz dieser Einschränkungen unterstreicht die signifikante Verbesserung der Zellapoptose infolge der Hypothermiebehandlung die Bedeutung weiterer Untersuchungen, einschließlich In-vivo-Studien. Daher kann dieses Modell verwendet werden, um den molekularen Mechanismus des hypothermischen Kardioschutzes zu untersuchen, was wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von ergänzenden Therapien zur Verwendung mit Hypothermie haben kann.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil von der National Natural Science Foundation of China (81970265, 81900281,81700288), der China Postdoctoral Science Foundation (2019M651904) finanziert. und das National Key Research and Development Program of China (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit | Bio-Technology,China | C1062M | |
| Cardiac myocyte growth supplement | Sciencell,USA | 6252 | |
| Caspase 3 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1115 | |
| Caspase 8 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1151 | |
| DMEM, no glucose | Gibco,USA | 11966025 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco,USA | 11960044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco,USA | 16140071 | |
| Flow cytometry | CytoFLEX,USA | B49007AF | |
| Human myocardial cells | BLUEFBIO,China | BFN60808678 | |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Bio-Technology,China | C2006 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco,USA | 10378016 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Bio-Technology,China | S0033S | |
| Three-gas incubator | Memmert,Germany | ICO50 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco,USA | 25200056 |
References
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