Summary
Gli effetti distinti dei diversi gradi di ipotermia sulla protezione del miocardio non sono stati valutati a fondo. L'obiettivo del presente studio era quantificare i livelli di morte cellulare a seguito di diversi trattamenti di ipotermia in un modello umano a base di cardiomiociti, gettando le basi per una futura ricerca molecolare approfondita.
Abstract
La disfunzione miocardica derivata da ischemia/riperfusione è uno scenario clinico comune nei pazienti dopo la cardiochirurga. In particolare, la sensibilità dei cardiomiociti alle lesioni ischemiche è superiore a quella di altre popolazioni cellulari. Attualmente, l'ipotermia offre una notevole protezione contro un atteso insulto ischemico. Tuttavia, le indagini sui complessi cambiamenti molecolari indotti dall'ipotermia rimangono limitate. Pertanto, è essenziale identificare una condizione di coltura simile a condizioni in vivo che possono indurre danni simili a quello osservato nella condizione clinica in modo riproducibile. Per imitare le condizioni simili all'ischemia in vitro, le cellule in questi modelli sono state trattate con privazione di ossigeno / glucosio (OGD). Inoltre, abbiamo applicato un protocollo standard di temperatura del tempo utilizzato durante la cardiochirururga. Inoltre, proponiamo un approccio per utilizzare un metodo semplice ma completo per l'analisi quantitativa delle lesioni del miocardio. L'apoptosi e i livelli di espressione delle proteine associate all'apoptosi sono stati valutati dalla citometria del flusso e utilizzando un kit ELISA. In questo modello, abbiamo testato un'ipotesi riguardante gli effetti delle diverse condizioni di temperatura sull'apoptosi cardiomiocita in vitro. L'affidabilità di questo modello dipende da un rigoroso controllo della temperatura, procedure sperimentali controllabili e risultati sperimentali stabili. Inoltre, questo modello può essere utilizzato per studiare il meccanismo molecolare della cardioprotezione ipotermica, che può avere importanti implicazioni per lo sviluppo di terapie complementari per l'uso con ipotermia.
Introduction
La disfunzione miocardica derivata da ischemia/riperfusione è uno scenario clinico comune nei pazienti dopo la cardiochirurga1,2. Durante la perfusione non obbligatoria a basso flusso e i periodi di arresto circolatorio totale, si verificano ancora danni che coinvolgono tutti i tipi di cellule cardiache. In particolare, la sensibilità dei cardiomiociti alle lesioni ischemiche è superiore a quella di altre popolazioni cellulari. Attualmente, l'ipotermia terapeutica (TH) offre una protezione sostanziale contro un insulto ischemico previsto nei pazienti sottoposti a cardiochirurga3,4. Il TH è definito come una temperatura corporea interna di 14-34 °C, sebbene non esista consenso su una definizione di raffreddamento durante la cardiochirur5,6,7. Nel 2013, un gruppo internazionale di esperti ha proposto un sistema di segnalazione standardizzato per classificare vari intervalli di temperatura dell'arresto circolatorio ipotermicosistemico 8. Sulla base di studi di elettroencefalografia e metabolismo del cervello, hanno diviso l'ipotermia in quattro livelli: ipotermia profonda (≤ 14 °C), ipotermia profonda (14,1-20 °C), ipotermia moderata (20,1-28 °C) e ipotermia lieve (28,1-34 °C). Il consenso degli esperti ha fornito una classificazione chiara e uniforme, consentendo agli studi di essere più comparabili e fornire risultati più clinicamente rilevanti. Questa protezione offerta dalla TH si basa sulla sua capacità di ridurre l'attività metabolica delle cellule, limitando ulteriormente il loro tasso di consumo di fosfati ad altaenergia 9,10. Tuttavia, il ruolo della TH nella protezione del miocardio è controverso e può avere effetti multipli a seconda del grado di ipotermia.
L'I/R miocardico è noto per essere accompagnato da un aumento dell'apoptisicellulare 11. Recenti rapporti hanno osservato che la morte cardiomiocitaria programmata aumenta durante l'intervento a cuore aperto e può coincidere con la necrosi, aumentando così il numero di cellule miocardiche morte12. Pertanto, ridurre l'apoptosi cardiomiocita è un utile approccio terapeutico nella pratica clinica. Nel modello cardiomiocitario atriale del topo HL-1, è stata dimostrata che l'ipotermia terapeutica riduce il rilascio mitocondriale del citocromo c e del fattore che induce l'apoptosi (AIF) durante la riperfusione13. Tuttavia, l'effetto della temperatura nella regolazione dell'apoptosi è controverso e sembra dipendere dal grado di ipotermia. Cooper e colleghi hanno osservato che rispetto a un gruppo di controllo del bypass cardiopolmonare normotermico, il tasso di apoptosi del tessuto miocardico dei suini con l'arresto circolatorio ipotermico profondo è statoaumentato di 14. Inoltre, i risultati di alcuni studi hanno suggerito che l'ipotermia profonda può attivare la via dell'apoptosi, mentre l'ipotermia meno aggressiva sembrainibire la via 12,15,16. La ragione di questo risultato può essere dovuta a effetti confondenti associati a lesioni ischemiche e alla mancanza di comprensione dei meccanismi con cui la temperatura influisce sul tessuto miocardico. Pertanto, i limiti di temperatura ai quali l'apoptosi è migliorata o attenuata devono essere definiti con precisione.
Per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi associati all'efficacia dell'ipotermia e fornire una base razionale per la sua implementazione nell'uomo, è essenziale identificare una condizione di coltura simile a condizioni in vivo che possono produrre danni simili a quello osservato per la condizione clinica in modo riproducibile. Un passo essenziale verso il raggiungimento di questo obiettivo è stabilire le condizioni ottimali per indurre l'apoptosi cardiomiocitaria. Di conseguenza, nel presente studio, abbiamo esplorato i dettagli metodologici riguardanti gli esperimenti di privazione ossigeno-glucosio con cellule coltivate, un facile modello in vitro di ischemia-riperfusione. Inoltre, abbiamo valutato l'effetto di diversi tempi ipossico-ischemici sull'apoptosi cardiomiocitaria e verificato la nostra ipotesi riguardante l'effetto delle diverse condizioni di temperatura sull'apoptosi cellulare in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le informazioni relative ai reagenti e agli strumenti commerciali sono elencate nella tabella dei materiali.
La linea cellulare cardiomiocitaria umana AC16 è stata derivata dalla fusione di cellule primarie dal tessuto cardiaco ventricolare adulto con fibroblasti umani trasformati in SV4017, che sono stati acquistati da BLUEFBIO (Shanghai, Cina). La linea cellulare sviluppa molte caratteristiche biochimiche e morfologiche caratteristiche dei cardiomiociti. Inoltre, la linea cellulare è ampiamente utilizzata per valutare i danni del miocardio e la funzione miocardica in vitro18,19.
1. Coltura cellulare
NOTA: Il mezzo di coltura basale è costituito dal mezzo di coltura dell'aquila modificato (DMEM) modificato di Dulbecco senza siero, dal 10% dal siero bovino fetale (FBS), dall'1% da integratore per la crescita di miociti cardiaci e dall'1% da penicillina/streptomicina. Conservare il mezzo a 4 °C e prevenirsi a 37 °C prima dell'uso.
- Rimuovere le cellule cardiomiocitari umane crioconservate (HCM) dall'azoto liquido e scongelarle in un bagno d'acqua a 37 °C.
- Agitare delicatamente il flaconcino (<1 minuto) in un bagno d'acqua a 37 °C fino a quando nella fiala rimane solo un piccolo pezzo di ghiaccio.
- Trasferire il flaconcino in una cappa sterile a flusso laminare. Pulire l'esterno della fiala con un batuffolo di cotone immerso nel 70% di alcol.
- Trasferire 4 ml di crescita completa prebellica in senso medio dropwise nel tubo di centrifuga contenente le celle scongelate.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 200 × g per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 5 mL di mezzo completo.
- Mantenere le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato sotto un'atmosfera con il 95% di aria e il 5% di CO2.
NOTA: Prima di raccogliere le cellule per esperimenti, le cellule possono crescere fino a raggiungere circa il 60-70% di confluenza.
2. Definizione di un modello di deprivazione ossigeno-glucosio (OGD)
NOTA: Due ore prima del periodo di studio, sostituire il mezzo di crescita con un mezzo privo di siero e le cellule sono state reincubate in un incubatore umidificato per 2 ore a 37 °C sotto un'atmosfera con il 5% di CO2.
- Aspirare il mezzo da una piastra a 6 pozzi e lavare delicatamente le cellule tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Aggiungere 2 mL di DMEM fresco senza zucchero per pozzo.
- Coltura delle cellule a temperatura costante in un incubatore di tre gas in un'atmosfera con una miscela di 95% N2, 5% CO2e 0,1% O2 a 37 °C per 1, 2, 4, 8, 12 o 16 ore.
- Dopo il trattamento con ipossia, aspirare il mezzo dalla piastra a 6 pozzi e lavare le cellule con PBS (pH 7.4) tre volte.
- Aggiungere 2 mL di DMEM completo per pozzo.
- Mantenere le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato sotto un'atmosfera con il 95% di aria e il 5% di CO2.
3. Protocollo di temperatura del tempo
NOTA: Durante la cardiochirururga viene utilizzato un protocollo standard di temperatura-tempo, come descritto inprecedenza da altri 20,21. Trattare gli HMM secondo il seguente protocollo (Figura 1): il punto di tempo 1 (T1) indica la fine dell'induzione, il punto di tempo 2 (T2) indica la fine della manutenzione e il punto di tempo 3 (T3) indica la fine del riscaldamento. Analizzare le celle di controllo mantenute in condizioni normotermiche continue (37 °C). Le condizioni di temperatura vengono create utilizzando un incubatore di tri-gas, che consente una regolazione precisa della temperatura.
- Due ore prima degli esperimenti, aspirare il mezzo di coltura da una piastra da 6 porri e aggiungere 2 mL di DMEM fresco senza siero per pozzo.
- Ridi incubare le cellule in un incubatore umidificato per 2 ore a 37 °C in un'atmosfera con 5% di CO2.
- Dopo 2 ore, aspirare il mezzo dalla piastra a 6 pozzi e lavare le celle con PBS (pH 7.4) tre volte.
- Aggiungere 2 mL di DMEM fresco senza siero per pozzo.
- Reincubare le cellule nell'incubatore di tri-gas.
NOTA: Sostituire il mezzo per rimuovere celle e detriti non attaccati. - Cambiare immediatamente la temperatura posizionando i piatti di coltura un incubatore di tri-gas.
- Dopo 1 h di raffreddamento, aspirare rapidamente il mezzo dalla piastra a 6 porri e aggiungere 2 mL di DMEM fresco senza zucchero per pozzo.
- Coltura delle cellule in un incubatore di tri-gas in un'atmosfera composta per il 95% da N2,per il 5% da CO2e per lo 0,1% O2 a 37 °C per 12 ore per stabilire l'ipossia.
- Impostare la temperatura come descritto di seguito.
NOTA: Il protocollo inizia con 10 ore di un trattamento a bassa temperatura, seguito da una fase di riscaldamento per 2 h fino a 37 °C e 24 ore di normotermia (37 °C). In ogni momento, tre piastre di Petri vengono rimosse per l'analisi. - Dopo un trattamento a bassa temperatura, aspirare il mezzo dalla piastra a 6 pozzi e lavare con PBS (pH 7.4) tre volte.
- Aggiungere 2 mL di DMEM completo per pozzo.
- Mantenere le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato sotto un'atmosfera con il 95% di aria e il 5% di CO2.
4. Saggio di fattibilità CCK-8
- Riscaldare la soluzione di acido tritaside-etilendiamminatetraacetico (EDTA) allo 0,25% e pbs a 37 °C prima dell'uso.
- Aspirare il mezzo, sciacquare le cellule con 1 mL di PBS e quindi aggiungere 0,5 mL di 0,25% di tripside lungo la parete del pozzo. Incubare a 37 °C fino a quando quasi tutti gli HMM non sono staccati (circa 1 min).
- Aggiungere 1 mL di supporto completo DMEM ai pozzi per neutralizzare la tripina.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga da 15 ml e pelletare gli HMM mediante centrifugazione a 500 × g per 3 min. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet.
- Distribuire aliquote di 100 μL della sospensione cellulare (5000 celle/pozzo) in una piastra da 96 po' . Preincubare la piastra per 24 ore in un incubatore umidificato (a 37 °C.)
- Utilizzare le cellule coltivate nelle piastre a 96 pozzi per generare diversi gruppi di trattamento.
- Incubare la piastra per un periodo di tempo appropriato (16 ore) in un'incubatrice.
- Aggiungere 10 μL di soluzione CCK-8 ad ogni pozza della piastra.
- Incubare il piatto per 1 ora nell'incubatrice.
- Misurare l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastra.
ATTENZIONE: Fare attenzione a non introdurre bolle nei pozzi, in quanto interferiscono con le misurazioni di lettura OD.
5. Citometria del flusso per l'analisi dell'apoptosi
- Eseguire i passaggi di tripsinizzazione e centrifugazione seguendo i passaggi 4.2-4.4.
NOTA: Le cellule vengono raccolte con tripina senza EDTA. Per valutare l'apoptosi, vengono raccolte sia le cellule galleggianti che le cellule aderenti. - Centrifugare le cellule per 5 minuti a 1000 × g. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 1 mL di PBS.
- Contare le cellule usando un emocitometro. Utilizzando una pipetta, trasferire 100 μL di sospensione cellulare trattata con Tripano Blue in un emocitometro. Utilizzando un contatore di conteggio delle mani, contare le celle vive e non contaminate in un set di 16 quadrati e quindi utilizzare PBS per generare una sospensione cellulare a 1×107 celle/ml.
- Ottenere 200 μL della sospensione cellulare (5 × 105 -1 × 106 cellule).
- Centrifugare per 5 min a 1000 × g e rimorsi il pellet nella soluzione legatura V-FITC annexin.
- Aggiungere 5 μL di annexin V-FITC per tingere le cellule.
- Aggiungere 10 μL di ioduro di propidio nella sospensione cellulare.
- Mescolare delicatamente le cellule e incubarle per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
NOTA: Le cellule vengono rimorsipendate 2-3 volte durante l'incubazione per migliorare la colorazione. - Avviare il citometro di flusso e assicurarsi che il software funzioni in modo appropriato.
- Aprire due finestre di plottaggio a punti nel software di citometria a flusso.
- Selezionare la luce diffusa in avanti (FSC) sull'asse X e la luce diffusa laterale (SSC) sull'asse Y per escludere detriti cellulari e/o grumi in termini di dimensioni e granularità, rispettivamente.
- Selezionare il canale di rilevamento PE (590 mm) e FITC (530 mm), utilizzato per misurare l'intensità di fluorescenza delle cellule.
- Posizionare il tubo campione vuoto (HHCM che non sono stati tinti) sul citometro di flusso.
- Fate clic su Registra (Record) per raccogliere particelle dalla sospensione nel tubo campione vuoto, quindi selezionate la popolazione cellulare per ulteriori analisi nel primo grafico a punti.
- Posizionare i campioni macchiati singoli sul braccio di supporto del tubo. Fate clic su Registra (Record) per raccogliere particelle dalla sospensione, quindi gate della popolazione cellulare per ulteriori analisi nel primo grafico a punti.
- Raccogliere gli HMM in altri tubi campione e ottimizzare la misurazione regolando le tensioni dei canali di fluorescenza.
NOTA: i campioni non macchiati e macchiati singoli vengono utilizzati come controlli di compensazione durante l'esperimento. - Visualizzare le statistiche di ciascun tubo campione e calcolare il tasso di apoptosi di ciascun campione.
6. Valutazione della depolarizzazione mitocondriale
- Eseguire la tripsinizzazione e la centrifugazione seguendo i passaggi 4.2-4.4.
- Rimosoppo le cellule in 500 μL di mezzo completo, quindi regolare la densità cellulare regolata a 1 × 105 - 6 × 106 cellule
- Aggiungere 0,5 ml di soluzione di lavoro JC-1 a ciascun tubo.
- Incubare le cellule in un'incubatrice cellulare a 37 °C per 20 minuti.
NOTA: Durante il periodo di incubazione, aggiungere 1 mL di tampone di colorazione JC-1 da 5× a 4 mL di acqua distillata per preparare il tampone di colorazione JC-1. - Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule a 600 × g per 3 minuti a 4 °C.
- Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 1 mL di tampone di colorazione JC-1.
- Ripetere i passaggi da 6,5 a 6,6 tre volte.
- Resuspend gli HCM in 1 ml di tampone di colorazione ghiacciato in un tubo di centrifuga da 1,5 ml e utilizzare le celle per l'analisi entro 30 minuti.
- Selezionare il canale di rilevamento PE (590 nm) e FITC (530 nm) per misurare l'intensità di fluorescenza del colorante JC-1 nelle cellule.
NOTA: Impostare il citometro di flusso seguendo i passaggi 5.10-5.17.
7. Saggio reattivo delle specie di ossigeno
- Eseguire la tripsinizzazione e la centrifugazione seguendo i passaggi 4.2-4.4.
- Modificare le cellule nel mezzo di coltura con 10 μM DCFDA e regolare la densità cellulare a 1 × 106 - 1 × 107 cellule
- Incubare per 30 minuti a 37 °C.
- Pipettare delicatamente le celle su / giù ogni 3-5 minuti.
- Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte con un mezzo di coltura cellulare privo di siero.
- Analizzare le cellule su un citometro di flusso seguendo i passaggi 5.10-5.17.
NOTA: DCF è eccitato a 488 nm e l'intensità di emissione misurata a 530 nm.
8. Misurazione dell'attività della Caspasi 3/ Caspasi 8
- Eseguire la tripsinizzazione seguendo i passaggi 4.2-4.4.
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 600 × g a 4 °C per 5 minuti.
- Aggiungere 100 μL di tampone di glisato per 2 × 106 cellule.
- Lyse le cellule per 15 minuti sul ghiaccio.
- Dopo aver incubato per 15 minuti in un bagno di ghiaccio, centrifugare il campione a 1,6 × 104 x g a 4 °C per 15 minuti.
- Trasferire il supernatante in un tubo di centrifuga ghiacciato per l'uso.
NOTA: La concentrazione proteica nel campione deve essere di almeno 1-3 mg/mL. - Rimuovere Ac-DEVD-pNA (2 mM) e posizionarlo su un bagno di ghiaccio per l'uso.
- Aggiungere con precisione 40 μL di soluzione tampone alla piastra etichettata enzimatica, aggiungere 80 μL del campione e infine aggiungere 10 μL di Ac-DEVD-pNA (2 mM).
- Incubare il campione a 37 °C per 120 minuti.
- Misurato il valore A405 su un lettore di micropiatte secondo le istruzioni del produttore.
NOTA: L'assorbanza prodotta dal pNA generato dalla caspasi-3/caspasi-8 viene calcolata sottraendo il valore A405 del controllo vuoto da quello del campione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'effetto dell'esposizione all'OGD sulla vitalità degli HMM è stato determinato dal saggio CCK-8. Rispetto a quella osservata nel gruppo di controllo, la vitalità cellulare è stata significativamente diminuita in modo dipendente dal tempo (figura 2A). I tassi di apoptosi degli HMM in momenti diversi dopo la riperfusione hanno mostrato una tendenza specifica, dove da 0 a 16 ore, i tassi di apoptosi sono gradualmente aumentati e hanno raggiunto il tasso massimo al momento di 16 ore(figura 2B). Poiché l'OGD per 12 h ha ridotto l'attività cellulare di ~50%, 12 h OGD sono stati usati per indurre danni alle cellule negli esperimenti successivi.
Successivamente abbiamo esaminato l'effetto della temperatura sul processo di apoptosi. Rispetto a quella osservata nel gruppo OGD, la percentuale di cellule vitali era più elevata nei tre gruppi trattati con ipotermia(figura 3B). Inoltre, le cellule del gruppo dell'ipotermia profonda avevano la più alta vitalità (>92%), 2,1 volte superiore a quella osservata nel gruppo OGD. Inoltre, i risultati della citometria del flusso hanno mostrato che l'ipotermia impediva l'apoptosi degli HMM in condizioni OGD(Figura 3A&3C). Poiché la disfunzione mitocondriale è associata all'apoptosi, abbiamo ottenuto dati aggiuntivi per valutare i disturbi mitocondriali. I livelli di ROS intracellulare sono stati determinati utilizzando un test DCFH-DA. Rispetto a quello osservato nel gruppo OGD, il trattamento con ipotermia ha diminuito i livelli di ROS intracellulare negli HMM (Figura 4A). Inoltre, il potenziale della membrana mitocondriale è stato rilevato con la colorazione JC-1. Dopo il trattamento OGD, la fluorescenza rossa del JC-1 è stata significativamente ridotta e la fluorescenza verde è stata significativamente aumentata. Al contrario, il trattamento con ipotermia ha inibito significativamente l'effetto indotto dall'OGD e ha aumentato il rapporto rosso/verde di un ampio margine (Figura 4B). Inoltre, la diminuzione della caspasi 3/caspasi-8 è stata osservata anche nelle cellule che sono state trattate con trattamenti di ipotermia(Figura 4C,4D)
Figura 1: Diagramma di flusso della procedura sperimentale. Gli HMM sono stati trattati secondo il seguente protocollo: il punto di tempo 1 (T1) indica la fine dell'induzione (raffreddamento per 2h); il punto di tempo 2 (T2) indica la fine del mantenimento (ipotermia per 10h alla temperatura desiderata); e il punto di tempo 3 (T3) indica la fine del riscaldamento (riscaldamento per due h fino a 37 °C). La temperatura è stata mantenuta alla temperatura desiderata: 34 °C per ipotermia lieve, 31 °C per ipotermia moderata e 17 °C per ipotermia grave. Sono state analizzate le celle di controllo mantenute in condizioni normotermiche continue (37 °C). Le condizioni di temperatura sono state create utilizzando un incubatore di tri-gas, che consente una regolazione precisa della temperatura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Valutazione della vitalità cellulare e dell'apoptosi da parte dei saggi CCK-8 e Annexin V/PI. (A) La vitalità cellulare è stata misurata utilizzando un saggio di vitalità cellulare. (B) L'apoptosi è stata analizzata dalla citometria del flusso. *p < 0,05,***p < 0,001 rispetto al gruppo Normale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Valutazione della vitalità cellulare e dell'apoptosi a seguito di trattamenti di ipotermia. (A) L'apoptosi cellulare è stata rilevata dalla citometria del flusso. (B)Analisi quantitativa dell'apoptosi. (C) La vitalità cellulare è stata misurata utilizzando un saggio di vitalità cellulare. **p < 0,01,***p < 0,001 rispetto al gruppo Normale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi della funzione mitocondriale e dell'attività della caspasi-3 caspasi-8. Livelli ros intracellulari. B Quantificazione del potenziale della membrana mitocondriale. (C&D) L'attività caspasi-8/caspasi-3 è stata stimata utilizzando un kit ELISA. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 rispetto al gruppo OGD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le complessità degli animali intatti, comprese le interazioni tra diversi tipi di cellule, spesso impediscono studi dettagliati su componenti specifici della lesione da I/R. Pertanto, è necessario stabilire un modello cellulare in vitro in grado di riflettere accuratamente i cambiamenti molecolari dopo l'ischemia in vivo. La ricerca sui modelli OGD è stataprecedentemente riportata 13,22e molti metodi sofisticati sono stati stabiliti23,24. Il processo di preparazione dei modelli OGD include due fasi chiave: privazione di ossigeno e privazione di glucosio. Nel presente studio, la privazione di glucosio è stata eseguita coltivando cellule in mezzo privo di glucosio e la privazione di ossigeno è stata ottenuta con la sostituzione con azoto, che è attualmente un metodo consolidato per preparare i modelli OGD25,26. Tuttavia, a seconda del tipo di cellula, devono essere considerati due fattori, tra cui:1) la densità di semina cellulare e 2) la durata dell'esposizione all'OGD. Maggiore è il numero di cellule attaccate, maggiore è la resistenza allo stress OGD, in modo che la durata della semina prima dell'OGD sia cruciale. Gli HMM (2 × 105 cellule/pozzi) sono stati seminati in lamiera a 6 pozzi per 30-34 ore prima dell'OGD, quando le cellule erano circa il 65% confluenti. Una maggiore densità cellulare ridurrà l'impatto dell'OGD sulle cellule. Inoltre, è fondamentale ridurre al minimo il potenziale di perdita delle cellule durante le fasi di lavaggio. L'effetto della durata dell'esposizione all'OGD è un altro fattore importante nella valutazione dell'efficacia del modello OGD. Ad esempio, per studiare gli effetti protettivi dei farmaci, è opportuno scegliere una durata che causi la morte cellulare del 40-50% senza trattamento. Se la morte cellulare è troppo estrema, ad esempio l'80%, allora sarà difficile quantificare l'effetto protettivo del reagente analizzato. Per gli HHCM, l'esposizione all'OGD per 12 ore ha provocato il 42% di morte cellulare. Pertanto, negli esperimenti successivi, è stato utilizzato un trattamento OGD di 12 ore per indurre danni alle cellule.
A causa della differenza nella cinetica ipotermica tra ambienti in vivo e in vitro, l'approccio ottimale e i meccanismi di induzione dell'ipotermia per il modello di cardiomiocita rimangono poco chiari. Negli ultimi decenni, diversi modelli in vitro sono stati sviluppati per studiare i cardiomiociti a basse temperature. Ad esempio, Jana Krech et al. Sebbene molti studi si siano concentrati sugli effetti fisiologici del raffreddamento, ci sono anche un gran numero di effetti collaterali dannosi che si verificano durante il riscaldamento27. I risultati di studi precedenti hanno dimostrato che il riscaldamento può indurre disfunzione contrattile nei cardiomiocitiisolati 27,28. Pertanto, la temperatura e la velocità di riscaldamento sono particolarmente essenziali. Per controllare rigorosamente l'effetto della temperatura, abbiamo applicato il protocollo standard tempo-temperatura utilizzato durante la cardiochirurur,come accennato in precedenza 20,21. In questo modello, la temperatura viene accuratamente controllata entro l'intervallo di temperatura richiesto, compresi tre stadi: 1) il periodo di raffreddamento (1 h); 2) il periodo di mantenimento della temperatura (10 h); e 3) il periodo di riscaldamento della temperatura (2 h). Inoltre, le temperature utilizzate in questo studio sono tipiche delle basse temperature miti (34°C), moderate (31 °C) e severe (17 °C), paragonabili a quelle utilizzate nelle pubblicazioni precedenti29,30,31. Infine, abbiamo anche testato la nostra ipotesi sugli effetti delle diverse condizioni di temperatura sull'apoptosi cardiomiocita in vitro. Come previsto, i risultati hanno mostrato che la temperatura ha ridotto significativamente i livelli di ROS, ripristinato MMP e ridotto l'attività della caspasi-8 / caspasi-3.
Sappiamo che questo studio è stato condotto utilizzando sia una linea cellulare non contrattile che un modello in vitro, che non è stato influenzato da alcun fluido corporeo. Nonostante questi limiti, il significativo miglioramento dell'apoptosi cellulare derivante dal trattamento con ipotermia sottolinea l'importanza di eseguire ulteriori indagini, compresi studi in vivo. Pertanto, questo modello può essere utilizzato per studiare il meccanismo molecolare della cardioprotezione ipotermica, che può avere importanti implicazioni per lo sviluppo di terapie complementari per l'uso con ipotermia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato in parte dalla National Natural Science Foundation of China (81970265, 81900281,81700288), dalla China Postdoctoral Science Foundation (2019M651904); e il National Key Research and Development Program of China (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit | Bio-Technology,China | C1062M | |
| Cardiac myocyte growth supplement | Sciencell,USA | 6252 | |
| Caspase 3 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1115 | |
| Caspase 8 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1151 | |
| DMEM, no glucose | Gibco,USA | 11966025 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco,USA | 11960044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco,USA | 16140071 | |
| Flow cytometry | CytoFLEX,USA | B49007AF | |
| Human myocardial cells | BLUEFBIO,China | BFN60808678 | |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Bio-Technology,China | C2006 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco,USA | 10378016 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Bio-Technology,China | S0033S | |
| Three-gas incubator | Memmert,Germany | ICO50 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco,USA | 25200056 |
References
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).
- Klein, P., et al. Less invasive ventricular reconstruction for ischaemic heart failure. EUROPEAN JOURNAL OF HEART FAILURE. 21 (12), 1638-1650 (2019).
- Otto, K. A. Therapeutic hypothermia applicable to cardiac surgery. VETERINARY ANAESTHESIA AND ANALGESIA. 42 (6), 559-569 (2015).
- Wang, X., et al. Safety of Hypothermic Circulatory Arrest During Unilateral Antegrade Cerebral Perfusion for Aortic Arch Surgery. CANADIAN JOURNAL OF CARDIOLOGY. 35 (11), 1483-1490 (2019).
- Leshnower, B. G., et al. Moderate Versus Deep Hypothermia With Unilateral Selective Antegrade Cerebral Perfusion for Acute Type A Dissection. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 100 (5), 1563-1568 (2015).
- Vallabhajosyula, P., et al. Moderate versus deep hypothermic circulatory arrest for elective aortic transverse hemiarch reconstruction. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 99 (5), 1511-1517 (2015).
- Keeling, W. B., et al. Safety of Moderate Hypothermia With Antegrade Cerebral Perfusion in Total Aortic Arch Replacement. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 105 (1), 54-61 (2018).
- Yan, T. D., et al. Consensus on hypothermia in aortic arch surgery. Annals of Cardiothoracic Surgery. 2 (2), 163-168 (2013).
- Zhou, J., Empey, P. E., Bies, R. R., Kochanek, P. M., Poloyac, S. M. Cardiac arrest and therapeutic hypothermia decrease isoform-specific cytochrome P450 drug metabolism. DRUG METABOLISM AND DISPOSITION. 39 (12), 2209-2218 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Inhibition of the mitochondrial fission protein dynamin-related protein 1 improves survival in a murine cardiac arrest model. CRITICAL CARE MEDICINE. 43 (2), 38-47 (2015).
- Zhu, W. S., et al. Hsp90aa1: a novel target gene of miR-1 in cardiac ischemia/reperfusion injury. Sci Rep. 6, 24498 (2016).
- Castedo, E., et al. Influence of hypothermia on right atrial cardiomyocyte apoptosis in patients undergoing aortic valve replacement. Journal of Cardiothoracic Surgery. 2, 7 (2007).
- Krech, J., et al. Moderate therapeutic hypothermia induces multimodal protective effects in oxygen-glucose deprivation/reperfusion injured cardiomyocytes. Mitochondrion. 35, 1-10 (2017).
- Cooper, W. A., et al. Hypothermic circulatory arrest causes multisystem vascular endothelial dysfunction and apoptosis. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 69 (3), 696-702 (2000).
- Kajimoto, M., et al. Selective cerebral perfusion prevents abnormalities in glutamate cycling and neuronal apoptosis in a model of infant deep hypothermic circulatory arrest and reperfusion. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM. 36 (11), 1992-2004 (2016).
- Liu, Y., et al. Deep Hypothermic Circulatory Arrest Does Not Show Better Protection for Vital Organs Compared with Moderate Hypothermic Circulatory Arrest in Pig Model. Biomed Research International. 2019, 1420216 (2019).
- Davidson, M. M., et al. Novel cell lines derived from adult human ventricular cardiomyocytes. JOURNAL OF MOLECULAR AND CELLULAR CARDIOLOGY. 39 (1), 133-147 (2005).
- Khan, K., Makhoul, G., Yu, B., Schwertani, A., Cecere, R. The cytoprotective impact of yes-associated protein 1 after ischemia-reperfusion injury in AC16 human cardiomyocytes. EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE. 244 (10), 802-812 (2019).
- Pan, J. A., et al. miR-146a attenuates apoptosis and modulates autophagy by targeting TAF9b/P53 pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Discovery. 10 (9), 668 (2019).
- Schmitt, K. R., et al. S100B modulates IL-6 release and cytotoxicity from hypothermic brain cells and inhibits hypothermia-induced axonal outgrowth. NEUROSCIENCE RESEARCH. 59 (1), 68-73 (2007).
- Tong, G., et al. Deep hypothermia therapy attenuates LPS-induced microglia neuroinflammation via the STAT3 pathway. Neuroscience. 358, 201-210 (2017).
- Yu, Z. P., et al. Troxerutin attenuates oxygenglucose deprivation and reoxygenationinduced oxidative stress and inflammation by enhancing the PI3K/AKT/HIF1alpha signaling pathway in H9C2 cardiomyocytes. Molecular Medicine Reports. 22 (2), 1351-1361 (2020).
- Drescher, C., Diestel, A., Wollersheim, S., Berger, F., Schmitt, K. R. How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia. European journal of cardiothoracic surgery. 40 (2), 352-359 (2011).
- Diestel, A., Drescher, C., Miera, O., Berger, F., Schmitt, K. R. Hypothermia protects H9c2 cardiomyocytes from H2O2 induced apoptosis. Cryobiology. 62 (1), 53-61 (2011).
- Zhang, Y., et al. HIF-1alpha/BNIP3 signaling pathway-induced-autophagy plays protective role during myocardial ischemia-reperfusion injury. BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY. 120, 109464 (2019).
- An, W., et al. Exogenous IL-19 attenuates acute ischaemic injury and improves survival in male mice with myocardial infarction. BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY. 176 (5), 699-710 (2019).
- Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling. EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).
- Yarbrough, W. M., et al. Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure. Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).
- Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals. AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).
- Bobi, J., et al. Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management. Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).
- Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation & Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).
