Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

In vitro vurdering av myokardbeskyttelse etter hypotermi-prekondisjonering i en human hjerte-myocytter modell

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61837
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cardiothoracic Surgery, Children's Hospital of Nanjing Medical University
* These authors contributed equally

Summary

De distinkte effektene av ulike grader av hypotermi på myokardbeskyttelse har ikke blitt grundig evaluert. Målet med den nåværende studien var å kvantifisere nivåene av celledød etter forskjellige hypotermibehandlinger i en human kardiomyocyttbasert modell, og legge grunnlaget for fremtidig grundig molekylær forskning.

Abstract

Iskemi/reperfusjons-avledet myokarddysfunksjon er et vanlig klinisk scenario hos pasienter etter hjertekirurgi. Spesielt er følsomheten til kardiomyocytter for iskemisk skade høyere enn for andre cellepopulasjoner. For tiden gir hypotermi betydelig beskyttelse mot en forventet iskemisk fornærmelse. Undersøkelser av komplekse hypotermiinduserte molekylære endringer er imidlertid fortsatt begrenset. Derfor er det viktig å identifisere en kulturtilstand som ligner på in vivo-forhold som kan indusere skade som ligner den som observeres i den kliniske tilstanden på en reproduserbar måte. For å etterligne iskemilignende tilstander in vitro, ble cellene i disse modellene behandlet av oksygen / glukosemangel (OGD). I tillegg brukte vi en standard tidstemperaturprotokoll som ble brukt under hjertekirurgi. Videre foreslår vi en tilnærming til å bruke en enkel, men omfattende metode for kvantitativ analyse av hjerteinfarktskade. Apoptose og uttrykksnivåer av apoptose-assosierte proteiner ble vurdert ved strømningscytometri og ved hjelp av et ELISA-sett. I denne modellen testet vi en hypotese om effekten av forskjellige temperaturforhold på kardiomyocytt apoptose in vitro. Påliteligheten til denne modellen avhenger av streng temperaturkontroll, kontrollerbare eksperimentelle prosedyrer og stabile eksperimentelle resultater. I tillegg kan denne modellen brukes til å studere den molekylære mekanismen for hypotermisk kardiobeskyttelse, noe som kan ha viktige implikasjoner for utviklingen av komplementære terapier for bruk med hypotermi.

Introduction

Iskemi/reperfusjons-avledet myokarddysfunksjon er et vanlig klinisk scenario hos pasienter etter hjertekirurgi1,2. Under ikke-permanent lavstrømsperfusjon og perioder med total sirkulasjonsstans oppstår det fortsatt skader som involverer alle typer hjerteceller. Spesielt er følsomheten til kardiomyocytter for iskemisk skade høyere enn for andre cellepopulasjoner. For tiden gir terapeutisk hypotermi (TH) betydelig beskyttelse mot en forventet iskemisk fornærmelse hos pasienter som gjennomgår hjertekirurgi3,4. TH er definert som en kjerne kroppstemperatur på 14-34 °C, selv om det ikke foreligger konsensus om en definisjon av kjøling under hjertekirurgi5,6,7. I 2013 foreslo et internasjonalt ekspertpanel et standardisert rapporteringssystem for å klassifisere ulike temperaturområder for systemisk hypotermisk sirkulasjonsstans8. Basert på elektroencefalografi og metabolisme studier av hjernen, delte de hypotermi i fire nivåer: dyp hypotermi (≤ 14 °C), dyp hypotermi (14,1-20 °C), moderat hypotermi (20,1-28 °C) og mild hypotermi (28,1-34 °C). Ekspertkonsensus ga en klar og ensartet klassifisering, slik at studiene kunne være mer sammenlignbare og gi mer klinisk relevante resultater. Denne beskyttelsen gitt av TH er basert på dens evne til å redusere cellenes metabolske aktivitet, noe som ytterligere begrenser deres frekvens av høyenergifosfater forbruk9,10. Imidlertid er TH-rollen i myokardbeskyttelse kontroversiell og kan ha flere effekter avhengig av graden av hypotermi.

Myokard I/R er kjent for å ledsages av økt celle apoptisis11. Nylige rapporter har observert at programmert kardiomyocyttdød øker under åpen hjertekirurgi, og kan falle sammen med nekrose, og dermed øke antall døde myokardceller12. Derfor er reduksjon av kardiomyocytt apoptose en nyttig terapeutisk tilnærming i klinisk praksis. I musen atrial HL-1 kardiomyocytt modell, terapeutisk hypotermi ble vist å redusere mitokondrie frigjøring av cytokrom c og apoptose-induserende faktor (AIF) under reperfusjon13. Effekten av temperatur i regulering av apoptose er imidlertid kontroversiell og ser ut til å avhenge av graden av hypotermi. Cooper og kolleger observerte at sammenlignet med en normotermisk kardiopulmonal bypass-kontrollgruppe, ble apoptosehastigheten av myokardvev fra griser med den dype hypotermiske sirkulasjonsstansen økt14. I tillegg har resultatene av noen studier antydet at dyp hypotermi kan aktivere apoptosebanen, mens mindre aggressiv hypotermi ser ut til å hemme banen12,15,16. Årsaken til dette resultatet kan skyldes forvirrende effekter forbundet med iskemisk skade og mangel på forståelse av mekanismene ved hvilken temperatur påvirker myokardvev. Derfor bør temperaturgrensene der apoptose forbedres eller dempes, defineres nøyaktig.

For å få en bedre forståelse av mekanismene knyttet til effekten av hypotermi og gi et rasjonelt grunnlag for implementering hos mennesker, er det viktig å identifisere en kulturtilstand som ligner på in vivo-forhold som kan forårsake skade som ligner den som observeres for den kliniske tilstanden på en reproduserbar måte. Et viktig skritt mot å nå dette målet er å etablere de optimale forholdene for å indusere kardiomyocytt apoptose. Følgelig undersøkte vi i den nåværende studien de metodologiske detaljene om oksygenglukosemangelforsøk med dyrkede celler, en facile in vitro-modell av iskemi-reperfusjon. Videre evaluerte vi effekten av forskjellige hypoksiske-iskemiske tider på kardiomyocytt apoptose, og verifiserte vår hypotese om effekten av forskjellige temperaturforhold på celleapoptose in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Informasjon om kommersielle reagenser og instrumenter er oppført i Materiallisten.

AC16 human kardiomyocyttcellelinjen ble avledet fra sammensmelting av primære celler fra voksen ventrikulært hjertevev med SV40-transformerte menneskelige fibroblaster17, som ble kjøpt fra BLUEFBIO (Shanghai, Kina). Cellelinjen utvikler mange biokjemiske og morfologiske egenskaper som er karakteristiske for kardiomyocytter. I tillegg er cellelinjen mye brukt til å evaluere hjerteinfarkt og hjerteinfarktfunksjon in vitro18,19.

1. Cellekultur

MERK: Basalkulturmediet består av serumfritt Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM), 10% foster bovint serum (FBS), 1% hjertemyocytt veksttilskudd og 1% penicillin / streptomycinløsning. Oppbevar mediet ved 4 °C og før 37 °C før bruk.

  1. Fjern kryopreserverte humane kardiomyocyttceller (HCM) fra flytende nitrogen og tine dem i et vannbad ved 37 °C.
  2. Rist hetteglasset forsiktig (<1 minutt) i et 37 °C vannbad til bare et lite stykke is forblir i hetteglasset.
  3. Overfør hetteglasset til en steril laminær strømningshette. Tørk av utsiden av hetteglasset med en bomullsdott dyppet i 70% alkohol.
  4. Overfør 4 ml forhåndsvarslet komplett vekstmedium dråpevis inn i sentrifugerøret som inneholder de tinte cellene.
  5. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 200 × g i 10 minutter. Etter sentrifugering, kast supernatanten og resuspend pellet i 5 ml komplett medium.
  6. Vedlikehold cellene ved 37 °C i en fuktet inkubator under en atmosfære med 95 % luft og 5 % CO2.
    MERK: Før du høster cellene for eksperimenter, får cellene vokse til de når omtrent 60-70% samløp.

2. Etablering av en oksygen-glukosemangel (OGD) modell

MERK: To timer før studieperioden erstatter du vekstmediet med serumfritt medium, og cellene ble reinkubatert i en fuktet inkubator i 2 timer ved 37 °C under en atmosfære med 5 % CO2.

  1. Aspirer mediet fra en 6-brønns plate og vask cellene forsiktig tre ganger med fosfatbufret saltvann (PBS).
  2. Tilsett 2 ml fersk sukkerfri DMEM per brønn.
  3. Kultur cellene ved konstant temperatur i en tre-gass inkubator under en atmosfære med en blanding av 95% N2,5% CO2, og 0,1% O2 ved 37 °C i 1, 2, 4, 8, 12 eller 16 timer.
  4. Etter hypoksibehandlingen aspirerer du mediet fra 6-brønnsplaten og vasker cellene med PBS (pH 7,4) tre ganger.
  5. Tilsett 2 ml fullstendig DMEM per brønn.
  6. Vedlikehold cellene ved 37 °C i en fuktet inkubator under en atmosfære med 95 % luft og 5 % CO2.

3. Protokoll for tidstemperatur

MERK: En standard tidstemperaturprotokoll brukes under hjertekirurgi, som beskrevet tidligere av andre20,21. Behandle HCMer i henhold til følgende protokoll (Figur 1): tidspunkt 1 (T1) angir slutten på induksjonen, tidspunkt 2 (T2) indikerer slutten på vedlikeholdet og tidspunktet 3 (T3) indikerer slutten på omfordelingen. Analyser kontrollceller som vedlikeholdes under kontinuerlige normotermiske forhold (37 °C). Temperaturforholdene er opprettet ved hjelp av en tri-gass inkubator, noe som tillater presis temperaturregulering.

  1. To timer før forsøkene aspirerer du kulturmediet fra en 6-brønns plate og tilsetter 2 ml fersk serumfri DMEM per brønn.
  2. Inkuber cellene i en fuktet inkubator i 2 timer ved 37 °C under en atmosfære med 5 % CO2.
  3. Etter 2 timer aspirerer du mediet fra 6-brønnsplaten og vasker cellene med PBS (pH 7,4) tre ganger.
  4. Tilsett 2 ml fersk serumfri DMEM per brønn.
  5. Reinkubat cellene i tri-gass inkubatoren.
    MERK: Skift ut mediet for å fjerne celler og rusk som ikke er festet.
  6. Endre temperaturen umiddelbart ved å plassere kulturrettene en tri-gass inkubator.
  7. Etter 1 time med kjøling aspirerer du raskt mediet fra 6-brønnsplaten og tilsetter 2 ml fersk sukkerfri DMEM per brønn.
  8. Kultur cellene i en tri-gass inkubator under en atmosfære bestående av 95% N2,5% CO2, og 0,1% O2 ved 37 °C i 12 timer for å etablere hypoksi.
  9. Still inn temperaturen som beskrevet nedenfor.
    MERK: Protokollen starter med 10 timers behandling ved lave temperaturer, etterfulgt av en omflyttingsfase for 2 timer opp til 37 °C og 24 timers normotermi (37 °C). På hvert tidspunkt fjernes tre Petri-retter for analyse.
  10. Etter lavtemperaturbehandling aspirerer du mediet fra 6-brønnsplaten og vasker med PBS (pH 7,4) tre ganger.
  11. Tilsett 2 ml fullstendig DMEM per brønn.
  12. Vedlikehold cellene ved 37 °C i en fuktet inkubator under en atmosfære med 95 % luft og 5 % CO2.

4. CCK-8 levedyktighetsanalyse

  1. Varm opp 0,25% trypsin-etylendiamintetraacetic acid (EDTA) oppløsning og PBS til 37 °C før bruk.
  2. Aspirer mediet, skyll cellene med 1 ml PBS og tilsett deretter 0,5 ml 0,25% trypsin langs brønnens vegg. Inkuber ved 37 °C til nesten alle HCM-er er frittliggende (ca. 1 min).
  3. Tilsett 1 ml DMEM komplett medium til brønnene for å nøytralisere trypsin.
  4. Overfør cellefjæringen til et 15 ml sentrifugerør og pelletS HCM-ene ved sentrifugering ved 500 × g i 3 minutter. Aspirer supernatanten uten å forstyrre pelletsen.
  5. Dispenser 100 μL aliquots av cellefjæringen (5000 celler/brønn) i en 96-brønnsplate. Forkjøp platen i 24 timer i en fuktet inkubator (ved 37 °C.)
  6. Bruk de dyrkede cellene i 96-brønnsplatene til å generere forskjellige behandlingsgrupper.
  7. Inkuber platen i en passende tidsperiode (16 timer) i en inkubator.
  8. Tilsett 10 μL CCK-8-oppløsning til hver brønn på platen.
  9. Inkuber platen i 1 time i inkubatoren.
  10. Mål absorbansen ved 450 nm ved hjelp av en mikroplateleser.
    FORSIKTIG: Pass på at du ikke introduserer bobler til brønnene, da de forstyrrer OD-avlesningsmålinger.

5. Strømningscytometri for apoptoseanalyse

  1. Utfør forsøks- og sentrifugeringstrinn ved å følge trinn 4.2-4.4.
    MERK: Celler høstes med trypsin uten EDTA. For å vurdere apoptose samles både flytende og tilhengerceller.
  2. Sentrifuger cellene i 5 min ved 1000 × g. Kast supernatanten og resuspender pelletsen i 1 ml PBS.
  3. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer. Bruk en pipette og overfør 100 μL Trypan Blue-behandlet cellefjæring til et hemocytometer. Bruk en håndtellingsteller til å telle de levende, ikke-inngrodde cellene i ett sett med 16 firkanter, og bruk deretter PBS til å generere en cellesuspensjon ved 1×107 celler/ml.
  4. Få 200 μL av celleopphenget (5 × 105-1 × 106 celler).
  5. Sentrifuge i 5 min ved 1000 × g og resuspender pellets i annexin V-FITC bindingsløsning.
  6. Tilsett 5 μL annexin V-FITC for å farge cellene.
  7. Tilsett 10 μL propidiumjodid i cellesuspensjonen.
  8. Bland forsiktig cellene og inkuber dem i 20 minutter ved romtemperatur i mørket.
    MERK: Cellene resuspenderes 2-3 ganger under inkubasjonen for å forbedre fargingen.
  9. Start flytcytometeret og sørg for at programvaren fungerer som den skal.
  10. Åpne to prikkplottvinduer i flytcytometriprogramvaren.
  11. Velg fremoverspredning av lys (FSC) på X-aksen og sidespredt lys (SSC) på Y-aksen for å utelate cellerester og/eller klumper når det gjelder henholdsvis størrelse og detaljnivå.
  12. Velg PE (590 mm) deteksjonskanal og FITC (530 mm), som brukes til å måle fluorescensintensiteten til cellene.
  13. Plasser det tomme (HCM-ene som ikke er farget) prøverøret på strømningscytometeret.
  14. Klikk Registrer for å samle partikler fra suspensjonen i det tomme prøverøret, og gate deretter cellepopulasjonen for videre analyse i det første prikkplottet.
  15. Plasser de enkeltfargede prøvene på rørstøttearmen. Klikk Registrer for å samle partikler fra suspensjonen, og gate deretter cellepopulasjonen for videre analyse i det første prikkplottet.
  16. Samle HCMs i andre prøverør og optimaliser målingen ved å justere spenningene til fluorescenskanalene.
    MERK: Uoppdagede og enkeltfargede prøver brukes som kompensasjonskontroller under eksperimentet.
  17. Vis statistikken for hvert prøverør og beregn frekvensen av apoptose for hver prøve.

6. Mitokondrie depolarisering vurdering

  1. Utfør trypsinisering og sentrifugering ved å følge trinn 4.2-4.4.
  2. Resuspend cellene i 500 μL av komplett medium, og juster deretter celletettheten justert til 1 × 105 - 6 × 106 celler
  3. Tilsett 0,5 ml JC-1 arbeidsløsning til hvert rør.
  4. Inkuber cellene i en celleinkubator ved 37 °C i 20 minutter.
    MERK: I inkubasjonsperioden tilsettes 1 ml 5× JC-1 fargebuffer til 4 ml destillert vann for å klargjøre JC-1-fargingsbufferen.
  5. Etter inkubasjon, sentrifuger cellene ved 600 × g i 3 min ved 4 °C.
  6. Kast den supernatante og resuspend pellet i 1 ml JC-1 fargebuffer.
  7. Gjenta trinn 6,5 til 6,6 tre ganger.
  8. Resuspend HCMs i 1 ml iskald farging buffer i en 1,5 ml sentrifuge rør og bruke cellene til analyse innen 30 min.
  9. Velg PE (590 nm) deteksjonskanal og FITC (530 nm) for å måle fluorescensintensiteten til JC-1 fargestoff i cellene.
    MERK: Sett opp strømningscytometeret ved å følge trinn 5.10-5.17.

7. Reaktive oksygenarter analyse

  1. Utfør trypsinisering og sentrifugering ved å følge trinn 4.2-4.4.
  2. Flekk cellene i kulturmedium med 10 μM DCFDA og juster celletettheten til 1 × 106 - 1 × 107 celler
  3. Inkuber i 30 minutter ved 37 °C.
  4. Rør cellene forsiktig opp/ned hvert 3-5 min.
  5. Etter inkubasjonen, vask cellene tre ganger med serumfritt cellekulturmedium.
  6. Analyser cellene på et strømningscytometer ved å følge trinn 5.10-5.17.
    MERK: DCF er spent på 488 nm og utslippsintensiteten målt til 530 nm.

8. Måling av kaspase 3/ caspase 8 aktivitet

  1. Utfør forsøk ved å følge trinn 4.2-4.4.
  2. Samle cellene ved sentrifugering ved 600 × g ved 4 °C i 5 minutter.
  3. Tilsett 100 μL lysatbuffer per 2 × 106 celler.
  4. Lyse cellene i 15 minutter på is.
  5. Etter å ha inkubert i 15 min i et isbad, sentrifugerer du prøven ved 1,6 × 104 x g ved 4 °C i 15 minutter.
  6. Overfør supernatanten til et iskaldt sentrifugerør for bruk.
    MERK: Proteinkonsentrasjonen i prøven skal være minst 1-3 mg/ml.
  7. Fjern Ac-DEVD-pNA (2 mM) og plasser den på et isbad for bruk.
  8. Tilsett nøyaktig 40 μL bufferløsning til den enzymmerkede platen, tilsett 80 μL av prøven, og tilsett til slutt 10 μL Ac-DEVD-pNA (2 mM).
  9. Inkuber prøven ved 37 °C i 120 minutter.
  10. Målte A405-verdien på en mikroplateleser i henhold til produsentens instruksjoner.
    MERK: Absorbansen som produseres av pNA generert av caspase-3/caspase-8, beregnes ved å trekke A405-verdien for den tomme kontrollen fra prøvens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Effekten av OGD-eksponering på levedyktigheten til HCMer ble bestemt av CCK-8-analysen. Sammenlignet med det som ble observert i kontrollgruppen, ble celle levedyktigheten betydelig redusert på en tidsavhengig måte (figur 2A). Apoptosehastighetene til HCM-er på forskjellige tidspunkter etter reperfusjon viste en bestemt trend, hvor fra 0 til 16 h økte apoptosehastighetene gradvis og nådde maksimal hastighet ved 16-timers tidspunktet (Figur 2B). Som OGD for 12 h redusert celleaktivitet med ~ 50%, 12 h OGD ble brukt til å indusere celleskader i etterfølgende eksperimenter.

Vi undersøkte deretter effekten av temperatur på prosessen med apoptose. Sammenlignet med det som ble observert i OGD-gruppen, var prosentandelen levedyktige celler høyere i de tre gruppene som ble behandlet med hypotermi (figur 3B). I tillegg hadde celler i den dype hypotermigruppen høyest levedyktighet (>92%), 2,1 ganger høyere enn det som ble observert i OGD-gruppen. I tillegg viste strømningscytometriresultatene at hypotermi forhindret apoptose av HCMer under OGD-forhold (figur 3A&3C). Fordi mitokondrie dysfunksjon er forbundet med apoptose, fikk vi ytterligere data for å vurdere mitokondrieforstyrrelser. De intracellulære ROS-nivåene ble bestemt ved hjelp av en DCFH-DA-analyse. Sammenlignet med det som ble observert i OGD-gruppen, reduserte hypotermibehandlingen de intracellulære ROS-nivåene i HCMer (figur 4A). I tillegg ble mitokondriemembranpotensial påvist med JC-1 farging. Etter OGD-behandling ble den røde fluorescensen av JC-1 betydelig redusert, og den grønne fluorescensen ble betydelig økt. Hypotermibehandlingen hemmet derimot den OGD-induserte effekten betydelig og økte det røde til det grønne forholdet med stor margin (figur 4B). Videre ble reduksjonen av caspase 3/caspase-8 også observert i cellene som ble behandlet med hypotermibehandlinger (Figur 4C,4D)

Figure 1
Figur 1: Flytskjema for den eksperimentelle prosedyren. HCMer ble behandlet i henhold til følgende protokoll: tidspunkt 1 (T1) indikerer slutten av induksjon (kjøling i 2t); tidspunkt 2 (T2) indikerer slutten av vedlikeholdet (hypotermi i 10 timer ved ønsket temperatur); og tidspunkt 3 (T3) indikerer slutten på omvarselet (omflytting i to timer opp til 37 °C). Temperaturen ble opprettholdt ved ønsket temperatur: 34 °C for mild hypotermi, 31 °C for moderat hypotermi og 17 °C for alvorlig hypotermi. Kontrollceller opprettholdt under kontinuerlige normotermiske forhold (37 °C) ble analysert. Temperaturforholdene ble opprettet ved hjelp av en tri-gass inkubator, noe som muliggjør presis temperaturregulering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Evaluering av celle levedyktighet og apoptose ved CCK-8 og Annexin V/PI analyser. (A) Celle levedyktighet ble målt ved hjelp av en celle levedyktighetsanalyse. (B) Apoptose ble analysert ved strømningscytometri. *p < 0,05,***p < 0,001 versus Normal gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Evaluering av celle levedyktighet og apoptose etter hypotermibehandlinger. (A) Celleapoptose ble påvist ved strømningscytometri. (B) Kvantitativ analyse av apoptose. (C) Celle levedyktighet ble målt ved hjelp av en celle levedyktighet analyse. **p < 0,01,***p < 0,001 kontra normal gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Analyse av mitokondriefunksjon og caspase-3 caspase-8 aktivitet. Et Intracellulært ROS-nivå. B Kvantifisering av mitokondrielt membranpotensial. (CogD) Caspase-8/caspase-3-aktiviteten ble estimert ved hjelp av et ELISA-sett. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus OGD-gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kompleksiteten til intakte dyr, inkludert samspillet mellom ulike typer celler, forhindrer ofte detaljerte studier av spesifikke komponenter av I / R-skade. Derfor er det nødvendig å etablere en in vitro-cellemodell som nøyaktig kan gjenspeile molekylære endringer etter iskemi in vivo. Forskning på OGD-modeller har tidligere blitt rapportert13,22, og mange sofistikerte metoder er etablert23,24. Forberedelsesprosessen til OGD-modeller inkluderer to viktige trinn: oksygenmangel og glukosemangel. I den nåværende studien ble glukosemangel utført ved å dyrke celle i glukosefritt medium, og oksygenmangel ble oppnådd ved substitusjon med nitrogen, som for tiden er en veletablert metode for å forberede OGD-modeller25,26. Avhengig av celletype må imidlertid to faktorer vurderes, inkludert:1) cellesåtetthet og 2) varighet av OGD-eksponering. Jo større antall vedlagte celler, jo sterkere er motstanden mot OGD-stress, slik at varigheten av såing før OGD er avgjørende. HCMs (2 × 105 celler/brønner) ble sådd i 6-brønnsplate i 30-34 timer før OGD, da cellene var ca. 65% konfluente. Høyere celletetthet vil redusere virkningen av OGD på celler. I tillegg er det avgjørende å minimere potensialet for tap av cellene under vasketrinnene. Effekten av varigheten av OGD-eksponering er en annen viktig faktor for å evaluere effekten av OGD-modellen. For eksempel, for å studere de beskyttende effektene av narkotika, er det hensiktsmessig å velge en varighet som forårsaker 40-50% celledød uten behandling. Hvis celledøden er for ekstrem, for eksempel 80%, vil det være utfordrende å kvantifisere den beskyttende effekten av reagenset som analyseres. For HCMer resulterte eksponering for OGD i 12 timer i 42% celledød. Derfor, i de påfølgende forsøkene, ble en 12-timers OGD-behandling brukt til å indusere celleskade.

På grunn av forskjell i hypotermiske kinetikk mellom in vivo- og in vitro-miljøer, er den optimale tilnærmingen og mekanismene for hypotermiinduksjon for kardiomyocyttmodell fortsatt uklart. I løpet av de siste tiårene har flere in vitro-modeller blitt utviklet for å studere kardiomyocytter ved lave temperaturer. For eksempel etablerte Jana Krech et al. en moderat hypotermicellemodell for å studere effekten av temperatur på myokard apoptose etter iskemi-reperfusjon13. Selv om mange studier har fokusert på de fysiologiske effektene av kjøling, er det også et stort antall skadelige bivirkninger som oppstår under omvarsel27. Resultatene fra tidligere studier har vist at rewarming kan indusere kontraktil dysfunksjon i isolerte kardiomyocytter27,28. Derfor er temperaturen og hastigheten på omvarsling spesielt viktig. For å strengt kontrollere effekten av temperatur, brukte vi standard tidstemperaturprotokollen som ble brukt under hjertekirurgi, som tidligere nevnt20,21. I denne modellen styres temperaturen nøyaktig innenfor ønsket temperaturområde, inkludert tre trinn: 1) kjøleperioden (1 t); 2) temperaturholdingsperioden (10 t); og 3) temperatur-omvarslingsperioden (2 t). I tillegg er temperaturene som brukes i denne studien typiske for milde (34 ° C), moderate (31 ° C) og alvorlige (17 ° C) lave temperaturer, sammenlignbare med de som brukes i tidligere publikasjoner29,30,31. Til slutt testet vi også vår hypotese om effekten av forskjellige temperaturforhold på kardiomyocytt apoptose in vitro. Som forventet viste resultatene at temperaturen reduserte ROS-nivåene betydelig, gjenopprettet MMP og redusert caspase-8 / caspase-3 aktivitet.

Vi er klar over at denne studien ble utført ved hjelp av både en ikke-kontraktil cellelinje og en in vitro-modell, som ikke ble påvirket av kroppsvæsker. Til tross for disse begrensningene understreker den betydelige forbedringen i celleapoptose som følge av hypotermibehandling viktigheten av å utføre videre undersøkelser, inkludert in vivo-studier. Derfor kan denne modellen brukes til å studere den molekylære mekanismen for hypotermisk kardiobeskyttelse, som kan ha viktige implikasjoner for utvikling av komplementære terapier for bruk med hypotermi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis finansiert av National Natural Science Foundation of China (81970265, 81900281,81700288), China Postdoctoral Science Foundation (2019M651904); og National Key Research and Development Program of China (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit Bio-Technology,China C1062M
Cardiac myocyte growth supplement Sciencell,USA 6252
Caspase 3 activity assay kit Bio-Technology,China C1115
Caspase 8 activity assay kit Bio-Technology,China C1151
DMEM, no glucose Gibco,USA 11966025
Dulbecco's modified eagle medium Gibco,USA 11960044
Fetal bovine serum Gibco,USA 16140071
Flow cytometry CytoFLEX,USA B49007AF
Human myocardial cells BLUEFBIO,China BFN60808678
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 Bio-Technology,China C2006
Penicillin/Streptomycin solution Gibco,USA 10378016
Reactive oxygen species assay kit Bio-Technology,China S0033S
Three-gas incubator Memmert,Germany ICO50
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco,USA 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).
  2. Klein, P., et al. Less invasive ventricular reconstruction for ischaemic heart failure. EUROPEAN JOURNAL OF HEART FAILURE. 21 (12), 1638-1650 (2019).
  3. Otto, K. A. Therapeutic hypothermia applicable to cardiac surgery. VETERINARY ANAESTHESIA AND ANALGESIA. 42 (6), 559-569 (2015).
  4. Wang, X., et al. Safety of Hypothermic Circulatory Arrest During Unilateral Antegrade Cerebral Perfusion for Aortic Arch Surgery. CANADIAN JOURNAL OF CARDIOLOGY. 35 (11), 1483-1490 (2019).
  5. Leshnower, B. G., et al. Moderate Versus Deep Hypothermia With Unilateral Selective Antegrade Cerebral Perfusion for Acute Type A Dissection. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 100 (5), 1563-1568 (2015).
  6. Vallabhajosyula, P., et al. Moderate versus deep hypothermic circulatory arrest for elective aortic transverse hemiarch reconstruction. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 99 (5), 1511-1517 (2015).
  7. Keeling, W. B., et al. Safety of Moderate Hypothermia With Antegrade Cerebral Perfusion in Total Aortic Arch Replacement. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 105 (1), 54-61 (2018).
  8. Yan, T. D., et al. Consensus on hypothermia in aortic arch surgery. Annals of Cardiothoracic Surgery. 2 (2), 163-168 (2013).
  9. Zhou, J., Empey, P. E., Bies, R. R., Kochanek, P. M., Poloyac, S. M. Cardiac arrest and therapeutic hypothermia decrease isoform-specific cytochrome P450 drug metabolism. DRUG METABOLISM AND DISPOSITION. 39 (12), 2209-2218 (2011).
  10. Sharp, W. W., et al. Inhibition of the mitochondrial fission protein dynamin-related protein 1 improves survival in a murine cardiac arrest model. CRITICAL CARE MEDICINE. 43 (2), 38-47 (2015).
  11. Zhu, W. S., et al. Hsp90aa1: a novel target gene of miR-1 in cardiac ischemia/reperfusion injury. Sci Rep. 6, 24498 (2016).
  12. Castedo, E., et al. Influence of hypothermia on right atrial cardiomyocyte apoptosis in patients undergoing aortic valve replacement. Journal of Cardiothoracic Surgery. 2, 7 (2007).
  13. Krech, J., et al. Moderate therapeutic hypothermia induces multimodal protective effects in oxygen-glucose deprivation/reperfusion injured cardiomyocytes. Mitochondrion. 35, 1-10 (2017).
  14. Cooper, W. A., et al. Hypothermic circulatory arrest causes multisystem vascular endothelial dysfunction and apoptosis. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 69 (3), 696-702 (2000).
  15. Kajimoto, M., et al. Selective cerebral perfusion prevents abnormalities in glutamate cycling and neuronal apoptosis in a model of infant deep hypothermic circulatory arrest and reperfusion. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM. 36 (11), 1992-2004 (2016).
  16. Liu, Y., et al. Deep Hypothermic Circulatory Arrest Does Not Show Better Protection for Vital Organs Compared with Moderate Hypothermic Circulatory Arrest in Pig Model. Biomed Research International. 2019, 1420216 (2019).
  17. Davidson, M. M., et al. Novel cell lines derived from adult human ventricular cardiomyocytes. JOURNAL OF MOLECULAR AND CELLULAR CARDIOLOGY. 39 (1), 133-147 (2005).
  18. Khan, K., Makhoul, G., Yu, B., Schwertani, A., Cecere, R. The cytoprotective impact of yes-associated protein 1 after ischemia-reperfusion injury in AC16 human cardiomyocytes. EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE. 244 (10), 802-812 (2019).
  19. Pan, J. A., et al. miR-146a attenuates apoptosis and modulates autophagy by targeting TAF9b/P53 pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Discovery. 10 (9), 668 (2019).
  20. Schmitt, K. R., et al. S100B modulates IL-6 release and cytotoxicity from hypothermic brain cells and inhibits hypothermia-induced axonal outgrowth. NEUROSCIENCE RESEARCH. 59 (1), 68-73 (2007).
  21. Tong, G., et al. Deep hypothermia therapy attenuates LPS-induced microglia neuroinflammation via the STAT3 pathway. Neuroscience. 358, 201-210 (2017).
  22. Yu, Z. P., et al. Troxerutin attenuates oxygenglucose deprivation and reoxygenationinduced oxidative stress and inflammation by enhancing the PI3K/AKT/HIF1alpha signaling pathway in H9C2 cardiomyocytes. Molecular Medicine Reports. 22 (2), 1351-1361 (2020).
  23. Drescher, C., Diestel, A., Wollersheim, S., Berger, F., Schmitt, K. R. How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia. European journal of cardiothoracic surgery. 40 (2), 352-359 (2011).
  24. Diestel, A., Drescher, C., Miera, O., Berger, F., Schmitt, K. R. Hypothermia protects H9c2 cardiomyocytes from H2O2 induced apoptosis. Cryobiology. 62 (1), 53-61 (2011).
  25. Zhang, Y., et al. HIF-1alpha/BNIP3 signaling pathway-induced-autophagy plays protective role during myocardial ischemia-reperfusion injury. BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY. 120, 109464 (2019).
  26. An, W., et al. Exogenous IL-19 attenuates acute ischaemic injury and improves survival in male mice with myocardial infarction. BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY. 176 (5), 699-710 (2019).
  27. Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling. EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).
  28. Yarbrough, W. M., et al. Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure. Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).
  29. Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals. AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).
  30. Bobi, J., et al. Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management. Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).
  31. Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation & Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).

Tags

Medisin Utgave 164 Hjertekirurgi Myokardbeskyttelse Hypotermi Apoptose Mild hypotermi Moderat hypotermi Dyp hypotermi
In vitro vurdering av myokardbeskyttelse etter hypotermi-prekondisjonering i en human hjerte-myocytter modell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zang, X., Yu, D., Yang, Z., Hu, Q.,… More

Zang, X., Yu, D., Yang, Z., Hu, Q., Ding, P., Chen, F., Mo, X. In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model. J. Vis. Exp. (164), e61837, doi:10.3791/61837 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter