Summary
Различные последствия различных степеней гипотермии на защиту миокарда не были тщательно оценены. Целью настоящего исследования была количественная оценка уровней клеточной смертности после различных методов лечения гипотермии в модели на основе кардиомиоцитов человека, заложив основу для будущих углубленных молекулярных исследований.
Abstract
Ишемия / реперфузия полученных дисфункции миокарда является распространенным клиническим сценарием у пациентов после сердечной хирургии. В частности, чувствительность кардиомиоцитов к ишемической травме выше, чем у других популяций клеток. В настоящее время переохлаждение обеспечивает значительную защиту от ожидаемого ишемического оскорбления. Однако исследования сложных молекулярных изменений, вызванных переохлаждением, остаются ограниченными. Таким образом, важно определить состояние культуры, похожее на условия in vivo, которые могут вызвать ущерб, аналогичный тому, который наблюдается в клиническом состоянии в воспроизводимой манере. Для имитации ишемии, как условия in vitro, клетки в этих моделях были обработаны кислорода / глюкозы лишения (OGD). Кроме того, мы применили стандартный протокол температуры времени, используемый во время кардиохирургии. Кроме того, мы предлагаем подход к использованию простого, но всеобъемлющего метода количественного анализа травмы миокарда. Уровень апоптоза и экспрессии белков, связанных с апоптозом, оценивался по цитометрии потока и использованию комплекта ELISA. В этой модели мы протестировали гипотезу о влиянии различных температурных условий на кардиомиоцит апоптоз in vitro. Надежность этой модели зависит от строгого контроля температуры, контролируемых экспериментальных процедур и стабильных экспериментальных результатов. Кроме того, эта модель может быть использована для изучения молекулярного механизма гипотермических кардиопротекторов, которые могут иметь важные последствия для развития дополнительных методов лечения для использования с переохлаждением.
Introduction
Ишемия / реперфузия полученных дисфункции миокарда является распространенным клиническим сценарием у пациентов послесердечной хирургии 1,2. Во время непульсатной перфузии низкого потока и периодов полного ареста кровообращения, повреждения, связанные со всеми типами клеток сердца все еще происходит. В частности, чувствительность кардиомиоцитов к ишемической травме выше, чем у других популяций клеток. В настоящее время терапевтическая гипотермия (TH) обеспечивает существенную защиту от ожидаемого ишемического оскорбления у пациентов, перенесшихоперацию на сердце 3,4. TH определяется как температура основного тела 14-34 градусов по Цельсию, хотя не существует консенсуса в отношении определения охлаждения во времясердечной хирургии 5,6,7. В 2013 году международная группа экспертов предложила стандартизированную систему отчетности для классификации различных температурных диапазонов системного гипотермии кровообращенияарест 8. Основываясь на электроэнцефалографии и метаболизме мозга, они разделили переохлаждение на четыре уровня: глубокое переохлаждение (≤ 14 градусов по Цельсию), глубокое переохлаждение (14,1-20 градусов по Цельсию), умеренное переохлаждение (20,1-28 градусов по Цельсию) и легкое переохлаждение (28,1-34 градусов по Цельсию). Консенсус экспертов обеспечил четкую и единую классификацию, что позволило бы исследованиям быть более сопоставимыми и обеспечить более клинически значимые результаты. Эта защита, предоставляемая TH, основана на его способности снижать метаболическую активность клеток, еще больше ограничивая их скорость потребления высокойэнергии фосфатов 9,10. Тем не менее, роль TH в защите миокарда является спорным и может иметь многочисленные последствия в зависимости от степени переохлаждения.
Миокарда I / R, как известно, сопровождается увеличением ячейки apoptisis11. Последние сообщения показали, что запрограммированная смерть кардиомиоцитов увеличивается во время операции на открытом сердце, и может совпадать с некрозом, тем самым увеличивая число мертвых клетокмиокарда 12. Таким образом, снижение кардиомиоцитов апоптоз является полезным терапевтическим подходом в клинической практике. В мышиных предсердий HL-1 кардиомиоцитов модели, терапевтическая гипотермия было показано, уменьшить митохондриальный релиз цитохрома c и апоптоз вызывающий фактор (AIF) во время reperfusion13. Тем не менее, влияние температуры в регулировании апоптоза является спорным и, как представляется, зависит от степени переохлаждения. Купер и его коллеги отметили, что по сравнению с нормотермической сердечно-легочной контрольной группой, апоптоз миокарда ткани свиней с глубоким переохлаждением кровообращения былувеличен на 14. Кроме того, результаты некоторых исследований показали, что глубокое переохлаждение может активировать апоптоз путь, в то время как менее агрессивные гипотермии, какпредставляется, подавляют путь 12,15,16. Причиной такого результата могут быть смешанные эффекты, связанные с ишемической травмой и непониманием механизмов, с помощью которых температура влияет на миокардную ткань. Таким образом, температурные пределы, при которых апоптоз усиливается или затухается, должны быть точно определены.
Чтобы лучше понять механизмы, связанные с эффективностью гипотермии и обеспечить рациональную основу для ее реализации в организме человека, важно определить культурное состояние, похожее на условия in vivo, которые могут привести к повреждению, аналогичному тому, которое наблюдается для клинического состояния в воспроизводимым образом. Важным шагом на пути к достижению этой цели является создание оптимальных условий для индуцирования кардиомиоцитов апоптоза. Соответственно, в настоящем исследовании мы исследовали методологические детали, касающиеся экспериментов по лишению кислорода-глюкозы культурных клеток, легкой в пробирке модели ишемии-реперфузии. Кроме того, мы оценили влияние различных гипоксико-ишемических времен на кардиомиоцит апоптоз и проверили нашу гипотезу о влиянии различных температурных условий на клеточный апоптоз в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Информация о коммерческих реагентах и инструментах указана в таблице материалов.
Линия клеток ак16 человека кардиомиоцитов была получена от слияния первичных клеток из ткани сердца взрослого желудочка с ПОМОЩЬю СВ40-преобразованныхфибробластов человека 17, которые были приобретены у BLUEFBIO (Шанхай, Китай). Клеточная линия развивает многие биохимические и морфологические особенности, характерные для кардиомиоцитов. Кроме того, линия клеток широко используется для оценки повреждения миокарда и функции миокарда впробирке 18,19.
1. Культура клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Базальная среда культуры состоит из без сыворотки Dulbecco в модифицированной среде eagle (DMEM), 10% плода бычьей сыворотки (FBS), 1% сердечного дополнения роста миоцитов, и 1% пенициллин / стрептомицин раствор. Храните среду при 4 градусах Цельсия и до 37 градусов по Цельсию перед использованием.
- Удалите криоконсервированные клетки кардиомиоцитов человека (HCM) из жидкого азота и оттайте их в водяной бане при 37 градусах Цельсия.
- Аккуратно встряхните флакон (Lt;1 минута) в водяной бане 37 градусов по Цельсию, пока только небольшой кусочек льда остается во флаконе.
- Перенесите флакон в стерильный ламинарный капюшон. Протрите снаружи флакона с ватным тампоном, смоченной в 70% алкоголя.
- Передача 4 мл предварительной полной среды роста в центрифугу, содержащую оттаящие клетки.
- Центрифуга клеточной суспензии при 200 × в течение 10 минут. После центрифугации отбросьте супернатант и повторно наполньте гранулы в 5 мл полной среды.
- Поддерживайте клетки при 37 градусах Цельсия во влажном инкубаторе под атмосферой с 95% воздуха и 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед сбором клеток для экспериментов, клетки могут расти до достижения примерно 60-70% слияния.
2. Создание модели лишения кислорода и глюкозы (OGD)
ПРИМЕЧАНИЕ: За два часа до периода исследования, заменить рост среды с сывороткой свободной среды, и клетки были перевоплощенные в увлажненной инкубатор для 2 ч при 37 градусов по Цельсию в атмосфере с 5% CO2.
- Аспирировать среду из 6-хорошо пластины и аккуратно мыть клетки три раза с фосфатом буфера солевого раствора (PBS).
- Добавьте 2 мл свежей без сахара DMEM на колодец.
- Культура клеток при постоянной температуре в трех газах инкубатора в атмосфере со смесью 95% N2, 5% CO2, и 0,1% O2 при 37 КК для 1, 2, 4, 8, 12 или 16 ч.
- После лечения гипоксии, аспирировать среды из 6-хорошо пластины и мыть клетки с PBS (рН 7,4) в три раза.
- Добавьте 2 мл полного DMEM за колодец.
- Поддерживайте клетки при 37 градусах Цельсия во влажном инкубаторе под атмосферой с 95% воздуха и 5% CO2.
3. Протокол температуры времени
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный протокол температуры времени используется во время сердечной хирургии, как описано ранеедругими 20,21. Лечить HCMs в соответствии со следующим протоколом (Рисунок 1): точка времени 1 (T1) указывает на конец индукции, точка времени 2 (T2) указывает на конец обслуживания и точка времени 3 (T3) указывает на конец повторного времени. Анализ контрольных ячеек, поддерживаемых в непрерывных нормотермальных условиях (37 градусов по Цельсию). Температурные условия создаются с помощью трех газа инкубатора, который позволяет точно регуляции температуры.
- За два часа до экспериментов, аспирировать культурную среду из 6-хорошо пластины и добавить 2 мл свежей сыворотки свободной DMEM на колодец.
- Повторно инкубировать клетки в увлажненные инкубатор в течение 2 ч при 37 градусов по Цельсию в атмосфере с 5% CO2.
- После 2 ч, аспирировать средний от 6-хорошо пластины и мыть клетки с PBS (рН 7,4) в три раза.
- Добавьте 2 мл свежей сыворотки DMEM на колодец.
- Повторное вкубировать клетки в трех-газовый инкубатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Замените среду, чтобы удалить незакрепленные клетки и мусор. - Немедленно измените температуру путем устанавливать тарелки культуры инкубатор tri-газа.
- После 1 ч охлаждения, быстро аспирировать средний от 6-хорошо пластины и добавить 2 мл свежего сахара без DMEM на колодец.
- Культура клеток в трех-газовый инкубатор под атмосферой, состоящей из 95% N2, 5% CO2, и 0,1% O2 при 37 градусов по Цельсию для 12 ч, чтобы установить гипоксию.
- Установите температуру, как описано ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол начинается с 10 ч низкотемпо температуре лечения, а затем повторной фазы для 2 ч до 37 градусов по Цельсию, и 24 ч нормотермии (37 градусов по Цельсию). Каждый раз для анализа удаляются три чашки Петри. - После низкотемператной обработки, аспирировать средний от 6-хорошо пластины и мыть с PBS (рН 7,4) в три раза.
- Добавьте 2 мл полного DMEM за колодец.
- Поддерживайте клетки при 37 градусах Цельсия во влажном инкубаторе под атмосферой с 95% воздуха и 5% CO2.
4. Анализ жизнеспособности CCK-8
- Разогреть 0,25% трипсина-этилендиаминтетраатетической кислоты (ЭДТА) раствор и PBS до 37 градусов по Цельсию до использования.
- Аспирировать среду, промыть клетки с 1 мл PBS, а затем добавить 0,5 мл 0,25% трипсина вдоль стенки хорошо. Инкубация при 37 градусов по Цельсию до тех пор, пока почти все HCMs отделены (примерно 1 мин).
- Добавьте 1 мл полной среды DMEM к скважинам, чтобы нейтрализовать трипсин.
- Перенесите подвеску клетки в центрифугу 15 мл и гранулировать HCMs центрифугой при 500 × в течение 3 минут. Аспирировать супернатант, не нарушая гранулы.
- Выпределите 100 мкл алицитов клеточной подвески (5000 клеток/хорошо) в пластину из 96 колодец. Предустановить пластину на 24 ч во влажном инкубаторе (при 37 градусов по Цельсию)
- Используйте культурные клетки в 96-хорошо пластин для создания различных групп лечения.
- Инкубировать пластину в течение соответствующего периода времени (16 ч) в инкубаторе.
- Добавьте 10 йл раствора CCK-8 к каждой пластине.
- Инкубировать тарелку в течение 1 часа в инкубаторе.
- Измерьте абсорбанс на 450 нм с помощью микропластиного считыватель.
ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не ввести пузырьки в скважины, так как они мешают измерениям чтения ОД.
5. Цитометрия потока для анализа апоптоза
- Выполните шаги трипсинизации и центрифугации, следуя шагам 4.2-4.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки собирают с трипсином без ЭДТА. Для оценки апоптоза собираются как плавающие, так и адепт-клетки. - Центрифуга клетки в течение 5 мин при 1000 × г. Откажитесь от супернатанта и перерасходуйте гранулы в 1 мл PBS.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Используя пипетки, перенесите 100 МКЛ подвески трипан синей клетки на гемоцитометр. Используя счетчик ручных подсчетов, подсчитайте живые, неопликанные клетки в одном наборе из 16 квадратов, а затем используйте PBS для создания подвески ячейки на 1×107 ячеек/мл.
- Получить 200 МКЛ клеточной подвески (5 × 105 -1 × 106 клеток).
- Центрифуга в течение 5 мин при 1000 × г и повторно помесят гранулы в растворе связывания Annexin V-FITC.
- Добавьте 5 МКЛ приложения V-FITC для окрашивания клеток.
- Добавьте 10 МКЛ йодида пропидия в клеточную суспензию.
- Аккуратно смешайте клетки и инкубировать их в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки перерасходуются 2-3 раза во время инкубации для улучшения окрашивания. - Запустите цитометр потока и убедитесь, что программное обеспечение работает надлежащим образом.
- Откройте два точечных окна участка в программном обеспечении цитометрии потока.
- Выберите вперед рассеянный свет (FSC) на оси X и боковой рассеянный свет (SSC) на оси Y, чтобы исключить клеточный мусор и/или сгустки с точки зрения их размера и детализации, соответственно.
- Выберите канал обнаружения PE (590 мм) и FITC (530 мм), который используется для измерения интенсивности флуоресценции клеток.
- Поместите пустую (HCMs, которые не были окрашены) образец трубки на поток цитометра.
- Нажмите Запись, чтобы собрать частицы из подвески в пустой пробной трубке, а затем ворота популяции клеток для дальнейшего анализа в первой точке участка.
- Поместите однооплечатые образцы на опорную руку трубки. Нажмите Запись, чтобы собрать частицы из подвески, а затем ворота популяции клеток для дальнейшего анализа в первой точке участка.
- Соберите HCMs в других пробных трубках и оптимизируйте измерение путем регулировать напряжения каналов флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Незапачканные и одноразовые образцы используются в качестве компенсационных элементов управления во время эксперимента. - Отобразить статистику каждой образца трубки и рассчитать скорость апоптоза каждого образца.
6. Оценка митохондриальной деполяризации
- Выполните трипсинизацию и центрифугу, следуя шагам 4.2-4.4.
- Переусердуйте клетки в 500 МКЛ полной среды, а затем отрегулируйте плотность клеток, скорректированную до 1 × 105 - 6 × 106 клеток
- Добавьте 0,5 мл рабочего раствора JC-1 в каждую трубку.
- Инкубировать клетки в клеточном инкубаторе при 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: В инкубационный период добавьте 1 мл 5× JC-1 окрашивания буфера до 4 мл дистиллированной воды для подготовки JC-1 окрашивания буфера. - После инкубации центрифуга клетки при 600 градусах × в течение 3 мин при 4 градусах Цельсия.
- Отбросьте супернатант и повторно посовелайте гранулы в 1 мл буфера окрашивания JC-1.
- Повторите шаги от 6,5 до 6,6 три раза.
- Повторное использование HCMs в 1 мл ледяного окрашивания буфера в 1,5 мл центрифуги трубки и использовать клетки для анализа в течение 30 минут.
- Выберите канал обнаружения PE (590 нм) и FITC (530 нм) для измерения интенсивности флуоресценции красителя JC-1 в клетках.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка цитометра потока следующими шагами 5.10-5.17.
7. Анализ реактивных видов кислорода
- Выполните трипсинизацию и центрифугу, следуя шагам 4.2-4.4.
- Пятно клеток в среде культуры с 10 МКМ DCFDA и настроить плотность клеток до 1 × 106 - 1 × 107 клеток
- Инкубировать в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию.
- Аккуратно пипетки клетки вверх / вниз каждые 3-5 минут.
- После инкубации, мыть клетки три раза с сывороткой свободной клеточной культуры среды.
- Проанализируйте клетки на цитометре потока, следуя шагам 5.10-5.17.
ПРИМЕЧАНИЕ: DCF возбуждается на 488 нм и интенсивность выбросов измеряется на 530 нм.
8. Измерение активности Каспаса 3/ Каспаса 8
- Выполните трипсинизацию следующими шагами 4.2-4.4.
- Соберите клетки путем центрифугации при 600 × при 4 градусах Цельсия в течение 5 минут.
- Добавьте 100 МКЛ лизатного буфера на 2 × 106 ячеек.
- Высасыв клетки в течение 15 минут на льду.
- После инкубации в течение 15 минут в ледяной ванне, центрифуга образца на 1,6 × 104 х г при 4 градусов по Цельсию в течение 15 минут.
- Перенесите супернатант в ледяную центрифугу для использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация белка в образце должна быть не менее 1-3 мг/мл. - Удалите Ac-DEVD-pNA (2 мМ) и поместите его на ледяную ванну для использования.
- Точно добавьте 40 мкл буферного раствора в пластину с маркировкой фермента, добавьте 80 МКЛ образца и, наконец, добавьте 10 МКЛ Ac-DEVD-pNA (2 мМ).
- Инкубировать образец при 37 градусов по Цельсию в течение 120 минут.
- Измеренное значение A405 на микроплатформе в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Абсорбт, производимый pNA, генерируемый каспазой-3/каспаз-8, рассчитывается путем вычитания значения A405 пустого контроля из значения образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Влияние воздействия ОГД на жизнеспособность ГСМ было определено анализом CCK-8. По сравнению с тем, что наблюдалось в контрольной группе, жизнеспособность клеток была значительно снижена в зависимости от времени образом(рисунок 2A). Апоптоз ставки HCMs в разное время после reperfusion показал определенную тенденцию, где от 0 до 16 ч, апоптоз ставки постепенно увеличились и достигли максимальной скорости на 16 ч точкивремени (рисунок 2B). Поскольку OGD для 12 ч снизил активность клеток на 50%, 12 ч OGD был использован, чтобы вызвать повреждение клеток в последующих экспериментах.
Впоследствии мы изучили влияние температуры на процесс апоптоза. По сравнению с тем, что наблюдается в группе OGD, процент жизнеспособных клеток был выше в трех группах, обработанных с переохлаждением(рисунок 3B). Кроме того, клетки в группе глубокого переохлаждения имели самую высокую жизнеспособность (92%), что в 2,1 раза выше, чем в группе ОГД. Кроме того, результаты цитометрии потока показали, что переохлаждение предотвратило апоптоз HCMs в условиях OGD (рисунок3A и 3C). Поскольку митохондриальная дисфункция связана с апоптозом, мы получили дополнительные данные для оценки митохондриальных расстройств. Уровни внутриклеточного ROS определялись с помощью анализа DCFH-DA. По сравнению с тем, что наблюдается в группе OGD, лечение гипотермии снизило внутриклеточные уровни ROS в HCMs(рисунок 4A). Кроме того, митохондриальный мембранный потенциал был обнаружен при окрашивание JC-1. После лечения ОГД, красная флуоресценция JC-1 была значительно снижена, и зеленая флуоресценция была значительно увеличена. В отличие от этого, лечение гипотермии значительно ингибировало эффект, вызванный ОГД, и увеличивало красный к зеленому соотношению на большой запас(рисунок 4B). Кроме того, снижение каспазы 3/caspase-8 наблюдалось также в клетках, которые лечились с помощью лечения гипотермии(рисунок 4C,4D)
Рисунок 1: Диаграмма потока экспериментальной процедуры. HCMs были обработаны в соответствии со следующим протоколом: точка времени 1 (T1) указывает на конец индукции (охлаждение для 2h); точка времени 2 (T2) указывает на окончание технического обслуживания (гипотермия на 10ч при желаемой температуре); и точка времени 3 (T3) указывает на конец повторного овея (повторное овенение в течение двух часов до 37 градусов по Цельсию). Температура поддерживалась при желаемой температуре: 34 градуса по Цельсию при легком переохлаждении, 31 градус по Цельсию при умеренном переохлаждении и 17 градусов по Цельсию при сильном переохлаждении. Были проанализированы контрольные клетки, поддерживаемые в непрерывных нормотермальных условиях (37 градусов по Цельсию). Температурные условия были созданы с помощью трех газа инкубатора, который позволяет точное регулирование температуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Оценка жизнеспособности клеток и апоптоза с помощью анализов CCK-8 и Annexin V/PI. (A) Жизнеспособность клеток измерялась с помощью анализа жизнеспособности клеток. (B) Апоптоз был проанализирован поток цитометрии. «P LT; 0.05,» p lt; 0.001 против обычной группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Оценка жизнеспособности клеток и апоптоза после лечения гипотермии. (A) Апоптоз клеток был обнаружен цитометрией потока. (B)Количественный анализ апоптоза. (C) Жизнеспособность клеток была измерена с помощью анализа жизнеспособности клеток. «P LT; 0.01,01, й лт; 0,001 против обычной группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Анализ митохондриальной функции и активности каспазы-3 каспазы-8. Внутриклеточные уровни ROS. B Количественная оценка митохондриального мембранного потенциала. (CиD) Активность каспаса-8/каспаса-3 оценивалась с использованием комплекта ELISA. 0,05, 0,001 евро; 0,01, 0,001 против группы OGD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сложности нетронутых животных, в том числе взаимодействия между различными типами клеток, часто препятствуют детальному изучению конкретных компонентов травмы I/R. Поэтому необходимо создать модель клеток in vitro, которая может точно отражать молекулярные изменения после ишемии in vivo. Исследования моделей OGD ранее сообщалось13,22, и многие сложные методы былисозданы 23,24. Процесс подготовки моделей OGD включает в себя два ключевых шага: лишение кислорода и лишение глюкозы. В настоящем исследовании, лишение глюкозы было выполнено культивирования клеток в глюкозе свободной среде, и лишение кислорода было достигнуто путем замены азотом, который в настоящее время является устоявшимся методом для подготовки моделей OGD25,26. Однако, в зависимости от типа клетки, необходимо учитывать два фактора, в том числе:1) плотность посева клеток и 2) продолжительность воздействия OGD. Чем больше количество прикрепленных клеток, тем сильнее устойчивость к стрессу ОГД, так что продолжительность посева до OGD имеет решающее значение. HCMs (2 × 105 клеток/колодцев) были посеяны в 6-наилучшим образом плите для 30-34h перед OGD, на том времени клетки были приблизительно 65% confluent. Более высокая плотность клеток уменьшит влияние OGD на клетки. Кроме того, крайне важно свести к минимуму потенциал потери клеток во время мытья шагов. Влияние продолжительности воздействия OGD является еще одним важным фактором в оценке эффективности модели OGD. Например, для изучения защитного воздействия препаратов, целесообразно выбрать продолжительность, которая вызывает 40-50% клеточной смерти без лечения. Если гибель клеток слишком экстремальна, например, 80%, то будет сложно количественно оценить защитный эффект анализируемого реагента. Для HCMs, воздействие OGD в течение 12 часов привело к 42% клеточной смерти. Поэтому в последующих экспериментах для индуцирования повреждения клеток использовалось 12-часовое лечение ОГД.
Из-за разницы в гипотермических кинетики между in vivo и in vitro среды, оптимальный подход и механизмы индукции гипотермии для кардиомиоцитов модели остается неясным. За последние несколько десятилетий было разработано несколько моделей in vitro для изучения кардиомиоцитов при низких температурах. Например, Яна Креч и др. создали умеренную модель клеток гипотермии для изучения влияния температуры на апоптоз миокарда после ишемии-реперфузии13. Хотя многие исследования были сосредоточены на физиологические эффекты охлаждения, Есть также большое количество вредных побочных эффектов, которые происходят во время повторного27. Результаты предыдущих исследований показали, что повторное войну может вызвать контрактивную дисфункцию в изолированных кардиомиоцитах27,28. Поэтому особенно важны температура и скорость повторного овея. Чтобы строго контролировать влияние температуры, мы применили стандартный протокол температуры времени, используемый во время кардиохирургии,как упоминалось ранее 20,21. В этой модели температура точно контролируется в пределах требуемого температурного диапазона, включая три этапа: 1) период охлаждения (1 ч); 2) период поддержания температуры (10 ч); и 3) период повышения температуры (2 ч). Кроме того, температуры, используемые в данном исследовании, являются типичными для легких (34 градусов по Цельсию), умеренных (31 градусов по Цельсию) и суровых (17 градусов по Цельсию) низких температур, сопоставимых с теми, которыеиспользовались в предыдущих публикациях 29,30,31. Наконец, мы также проверили нашу гипотезу о влиянии различных температурных условий на кардиомиоцит апоптоз в пробирке. Как и ожидалось, результаты показали, что температура значительно снизила уровень ROS, восстановила MMP и снизила активность каспазы-8/каспасы-3.
Мы знаем, что это исследование было проведено с использованием как неконт контрактульной клеточной линии, так и модели in vitro, которая не была затронута никакими жидкостями организма. Несмотря на эти ограничения, значительное улучшение апоптоза клеток в результате лечения гипотермии подчеркивает важность проведения дальнейших исследований, в том числе in vivo исследований. Таким образом, эта модель может быть использована для изучения молекулярного механизма гипотермических кардиопротекторов, которые могут иметь важные последствия для развития дополнительных методов лечения для использования с переохлаждением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа частично финансировалась Национальным фондом естественных наук Китая (81970265, 81900281 81700288), Китайским постдокторантным научным фондом (2019M651904); и Национальная программа ключевых исследований и разработок Китая (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit | Bio-Technology,China | C1062M | |
| Cardiac myocyte growth supplement | Sciencell,USA | 6252 | |
| Caspase 3 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1115 | |
| Caspase 8 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1151 | |
| DMEM, no glucose | Gibco,USA | 11966025 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco,USA | 11960044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco,USA | 16140071 | |
| Flow cytometry | CytoFLEX,USA | B49007AF | |
| Human myocardial cells | BLUEFBIO,China | BFN60808678 | |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Bio-Technology,China | C2006 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco,USA | 10378016 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Bio-Technology,China | S0033S | |
| Three-gas incubator | Memmert,Germany | ICO50 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco,USA | 25200056 |
References
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).
- Klein, P., et al. Less invasive ventricular reconstruction for ischaemic heart failure. EUROPEAN JOURNAL OF HEART FAILURE. 21 (12), 1638-1650 (2019).
- Otto, K. A. Therapeutic hypothermia applicable to cardiac surgery. VETERINARY ANAESTHESIA AND ANALGESIA. 42 (6), 559-569 (2015).
- Wang, X., et al. Safety of Hypothermic Circulatory Arrest During Unilateral Antegrade Cerebral Perfusion for Aortic Arch Surgery. CANADIAN JOURNAL OF CARDIOLOGY. 35 (11), 1483-1490 (2019).
- Leshnower, B. G., et al. Moderate Versus Deep Hypothermia With Unilateral Selective Antegrade Cerebral Perfusion for Acute Type A Dissection. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 100 (5), 1563-1568 (2015).
- Vallabhajosyula, P., et al. Moderate versus deep hypothermic circulatory arrest for elective aortic transverse hemiarch reconstruction. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 99 (5), 1511-1517 (2015).
- Keeling, W. B., et al. Safety of Moderate Hypothermia With Antegrade Cerebral Perfusion in Total Aortic Arch Replacement. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 105 (1), 54-61 (2018).
- Yan, T. D., et al. Consensus on hypothermia in aortic arch surgery. Annals of Cardiothoracic Surgery. 2 (2), 163-168 (2013).
- Zhou, J., Empey, P. E., Bies, R. R., Kochanek, P. M., Poloyac, S. M. Cardiac arrest and therapeutic hypothermia decrease isoform-specific cytochrome P450 drug metabolism. DRUG METABOLISM AND DISPOSITION. 39 (12), 2209-2218 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Inhibition of the mitochondrial fission protein dynamin-related protein 1 improves survival in a murine cardiac arrest model. CRITICAL CARE MEDICINE. 43 (2), 38-47 (2015).
- Zhu, W. S., et al. Hsp90aa1: a novel target gene of miR-1 in cardiac ischemia/reperfusion injury. Sci Rep. 6, 24498 (2016).
- Castedo, E., et al. Influence of hypothermia on right atrial cardiomyocyte apoptosis in patients undergoing aortic valve replacement. Journal of Cardiothoracic Surgery. 2, 7 (2007).
- Krech, J., et al. Moderate therapeutic hypothermia induces multimodal protective effects in oxygen-glucose deprivation/reperfusion injured cardiomyocytes. Mitochondrion. 35, 1-10 (2017).
- Cooper, W. A., et al. Hypothermic circulatory arrest causes multisystem vascular endothelial dysfunction and apoptosis. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 69 (3), 696-702 (2000).
- Kajimoto, M., et al. Selective cerebral perfusion prevents abnormalities in glutamate cycling and neuronal apoptosis in a model of infant deep hypothermic circulatory arrest and reperfusion. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM. 36 (11), 1992-2004 (2016).
- Liu, Y., et al. Deep Hypothermic Circulatory Arrest Does Not Show Better Protection for Vital Organs Compared with Moderate Hypothermic Circulatory Arrest in Pig Model. Biomed Research International. 2019, 1420216 (2019).
- Davidson, M. M., et al. Novel cell lines derived from adult human ventricular cardiomyocytes. JOURNAL OF MOLECULAR AND CELLULAR CARDIOLOGY. 39 (1), 133-147 (2005).
- Khan, K., Makhoul, G., Yu, B., Schwertani, A., Cecere, R. The cytoprotective impact of yes-associated protein 1 after ischemia-reperfusion injury in AC16 human cardiomyocytes. EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE. 244 (10), 802-812 (2019).
- Pan, J. A., et al. miR-146a attenuates apoptosis and modulates autophagy by targeting TAF9b/P53 pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Discovery. 10 (9), 668 (2019).
- Schmitt, K. R., et al. S100B modulates IL-6 release and cytotoxicity from hypothermic brain cells and inhibits hypothermia-induced axonal outgrowth. NEUROSCIENCE RESEARCH. 59 (1), 68-73 (2007).
- Tong, G., et al. Deep hypothermia therapy attenuates LPS-induced microglia neuroinflammation via the STAT3 pathway. Neuroscience. 358, 201-210 (2017).
- Yu, Z. P., et al. Troxerutin attenuates oxygenglucose deprivation and reoxygenationinduced oxidative stress and inflammation by enhancing the PI3K/AKT/HIF1alpha signaling pathway in H9C2 cardiomyocytes. Molecular Medicine Reports. 22 (2), 1351-1361 (2020).
- Drescher, C., Diestel, A., Wollersheim, S., Berger, F., Schmitt, K. R. How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia. European journal of cardiothoracic surgery. 40 (2), 352-359 (2011).
- Diestel, A., Drescher, C., Miera, O., Berger, F., Schmitt, K. R. Hypothermia protects H9c2 cardiomyocytes from H2O2 induced apoptosis. Cryobiology. 62 (1), 53-61 (2011).
- Zhang, Y., et al. HIF-1alpha/BNIP3 signaling pathway-induced-autophagy plays protective role during myocardial ischemia-reperfusion injury. BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY. 120, 109464 (2019).
- An, W., et al. Exogenous IL-19 attenuates acute ischaemic injury and improves survival in male mice with myocardial infarction. BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY. 176 (5), 699-710 (2019).
- Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling. EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).
- Yarbrough, W. M., et al. Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure. Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).
- Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals. AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).
- Bobi, J., et al. Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management. Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).
- Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation & Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).
