Summary
Farklı hipotermi derecelerinin miyokard koruması üzerindeki belirgin etkileri ayrıntılı olarak değerlendirilmemiştir. Bu çalışmanın amacı, insan kardiyomiyosit tabanlı bir modelde farklı hipotermi tedavilerinin ardından hücre ölüm seviyelerini ölçmek ve gelecekteki derinlemesine moleküler araştırmaların temelini atmaktı.
Abstract
İskemi/reperfüzyondan türetilmiş miyokard disfonksiyonu kalp cerrahisi sonrası hastalarda sık görülen bir klinik senaryodur. Özellikle, kardiyomiyositlerin iskemik yaralanmaya duyarlılığı diğer hücre popülasyonlarından daha yüksektir. Şu anda hipotermi, beklenen iskemik hakarete karşı önemli bir koruma sağlar. Bununla birlikte, karmaşık hipotermi kaynaklı moleküler değişikliklerle ilgili araştırmalar sınırlı kalmaktadır. Bu nedenle, klinik durumda gözlemlenene benzer hasarlara neden olabilecek in vivo durumlara benzer bir kültür durumunun tekrarlanabilir bir şekilde tanımlanması esastır. İn vitro iskemi benzeri durumları taklit etmek için, bu modellerdeki hücreler oksijen /glikoz yoksunluğu (OGD) ile tedavi edildi. Ayrıca kalp cerrahisi sırasında kullanılan standart bir zaman-sıcaklık protokolü uyguladık. Ayrıca, miyokard hasarının nicel analizi için basit ama kapsamlı bir yöntem kullanmak için bir yaklaşım öneriyoruz. Apoptoz ilişkili proteinlerin apoptoz ve ekspresyon düzeyleri akış sitometrisi ve ELISA kiti kullanılarak değerlendirildi. Bu modelde, farklı sıcaklık koşullarının kardiyomiyosit apoptoz in vitro üzerindeki etkileri ile ilgili bir hipotezi test ettik. Bu modelin güvenilirliği sıkı sıcaklık kontrolüne, kontrol edilebilir deneysel prosedürlere ve istikrarlı deneysel sonuçlara bağlıdır. Ek olarak, bu model hipotermik kardiyoproteksiyonun moleküler mekanizmasını incelemek için kullanılabilir, bu da hipotermi ile kullanılmak üzere tamamlayıcı tedavilerin geliştirilmesi için önemli etkileri olabilir.
Introduction
İskemi/reperfüzyondan türetilmiş miyokard disfonksiyonu kalp cerrahisi sonrası hastalarda sık görülen bir klinik senaryodur1,2. Zengin olmayan düşük akış perfüzyonu ve toplam dolaşım durması dönemlerinde, her türlü kalp hücresini içeren hasarlar oluşmaya devam eder. Özellikle, kardiyomiyositlerin iskemik yaralanmaya duyarlılığı diğer hücre popülasyonlarından daha yüksektir. Şu anda, terapötik hipotermi (TH), kalp cerrahisi uygulanan hastalarda beklenen iskemik hakarete karşı önemli bir koruma sağlar3,4. TH, 14-34 ° C çekirdek vücut sıcaklığı olarak tanımlanır, ancak kalp cerrahisi sırasında soğutma tanımı ile ilgili bir fikir birliği yoktur5,6,7. 2013 yılında, uluslararası bir uzman paneli, sistemik hipotermik dolaşım tutuklamasının çeşitli sıcaklık aralıklarını sınıflandırmak için standartlaştırılmış bir raporlama sistemi önerdi8. Beynin elektroensefalografisi ve metabolizma çalışmalarına dayanarak hipotermiyi dört düzeye ayırdılar: derin hipotermi (≤ 14 °C), derin hipotermi (14.1-20 °C), orta hipotermi (20.1-28 °C) ve hafif hipotermi (28.1-34 °C). Uzman konsensüsü, açık ve düzgün bir sınıflandırma sağlayarak çalışmaların daha karşılaştırılabilir olmasını ve klinik olarak daha alakalı sonuçlar vermesini sağladı. TH tarafından sağlanan bu koruma, hücrelerin metabolik aktivitesini azaltma kapasitesine dayanır ve yüksek enerjili fosfat tüketim hızlarını daha da sınırlar9,10. Bununla birlikte, miyokard korumasında TH'nin rolü tartışmalıdır ve hipotermi dereceine bağlı olarak birden fazla etkiye sahip olabilir.
Miyokard I/R'ye artmış hücre apoptizisi11eşlik ettiği bilinmektedir. Son raporlar, programlanmış kardiyomiyosit ölümünün açık kalp ameliyatı sırasında arttığını ve nekrozla çakışabileceğini ve böylece ölü miyokard hücrelerinin sayısını artırdığını gözlemlemıştır12. Bu nedenle kardiyomiyosit apoptozun azaltılması klinik pratikte yararlı bir terapötik yaklaşımdır. Fare atriyal HL-1 kardiyomiyosit modelinde, terapötik hipotermi, reperfüzyon sırasında sitokrom c ve apoptoz indükleyici faktörün (AIF) mitokondriyal salınımını azalttığı gösterilmiştir13. Bununla birlikte, sıcaklığın apoptozu düzenlemedeki etkisi tartışmalıdır ve hipotermi derecesine bağlı olduğu görülmektedir. Cooper ve meslektaşları, normotermik kardiyopulmoner bypass kontrol grubuna kıyasla, derin hipotermik dolaşım durması olan domuzlardan gelen miyokard dokusunun apoptoz oranının14arttığını gözlemlediler. Ek olarak, bazı çalışmaların sonuçları derin hipotermi apoptoz yolunu aktive edebilirken, daha az agresif hipotermi12 , 15,16yolunu inhibe ediyor gibi görünmektedir. Bu sonucun nedeni, iskemik yaralanma ile ilişkili kafa karıştırıcı etkilerden ve sıcaklığın miyokard dokusunu etkilediği mekanizmaların anlaşılmamasından kaynaklanabilir. Bu nedenle, apoptozun artırıldığı veya zayıfladığı sıcaklık sınırları doğru bir şekilde tanımlanmalıdır.
Hipotermi etkinliği ile ilişkili mekanizmaların daha iyi anlaşılması ve insanlarda uygulanması için rasyonel bir temel sağlamak için, klinik durum için tekrarlanabilir bir şekilde gözlemlenene benzer hasar üretebilecek in vivo koşullara benzer bir kültür durumunun tanımlanması esastır. Bu hedefe ulaşmak için önemli bir adım, kardiyomiyosit apoptozun indüklene için en uygun koşulları belirlemektir. Bu nedenle, bu çalışmada, iskemi-reperfüzyonun bir facile in vitro modeli olan kültürlü hücrelerle yapılan oksijen-glikoz yoksunluğu deneyleri ile ilgili metodolojik ayrıntıları araştırdık. Ayrıca, farklı hipoksik-iskemik zamanların kardiyomiyosit apoptoz üzerindeki etkisini değerlendirdik ve farklı sıcaklık koşullarının hücreli apoptoz in vitro üzerindeki etkisine ilişkin hipotezimizi doğruladık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ticari reaktifler ve aletlerle ilgili bilgiler Malzeme Tablosundalistelenmiştir.
AC16 insan kardiyomiyosit hücre hattı, yetişkin ventrikül kalp dokusundan birincil hücrelerin BLUEFBIO'dan (Şanghay, Çin) satın alınan SV40 dönüştürülmüş insan fibroblastları17ile füzyonundan türetilmiştir. Hücre hattı kardiyomiyositlerin karakteristik birçok biyokimyasal ve morfolojik özelliğini geliştirir. Ek olarak, hücre hattı miyokard hasarını ve miyokard fonksiyonunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır in vitro18,19.
1. Hücre kültürü
NOT: Bazal kültür ortamı serumsuz Dulbecco'nun modifiye Eagle medium (DMEM), %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 kardiyak miyozit büyüme takviyesi ve %1 penisilin/streptomisin çözeltisi içerir. Ortamı kullanmadan önce 4 °C'de ve ön ısıtmadan 37 °C'ye saklayın.
- Kriyoprezer korunmuş insan kardiyomiyosit (HCM) hücrelerini sıvı azottan çıkarın ve 37 °C'de bir su banyosunda çözün.
- Şişeyi (<1 dakika) 37 °C'lik bir su banyosunda şişenin içinde sadece küçük bir buz parçası kalana kadar hafifçe sallayın.
- Şişeyi steril bir laminar akış başlığına aktarın. Şişenin dışını% 70 alkole batırılmış bir pamuk topu ile silin.
- 4 mL önceden ısıtılmamış komple büyüme ortamını, çözülmüş hücreleri içeren santrifüj tüpüne damla yönünde aktarın.
- Hücre süspansiyonu 10 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve peletin 5 mL'lik tam orta olarak yeniden ıslatın.
- Hücreleri% 95 hava ve% 5 CO2ile bir atmosfer altında nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de koruyun.
NOT: Deneyler için hücreleri toplamadan önce, hücrelerin yaklaşık% 60-70 izdiah edene kadar büyümesine izin verilir.
2. Oksijen-glukoz yoksunluğu (OGD) modelinin kurulması
NOT: Çalışma döneminden iki saat önce, büyüme ortamını serumsuz ortamla değiştirin ve hücreler% 5CO2 ile bir atmosfer altında 37 ° C'de 2 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde yeniden kapatıldı.
- Ortamı 6 kuyulu bir plakadan emiş ve hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez hafifçe yıkayın.
- Kuyu başına 2 mL taze şekersiz DMEM ekleyin.
- Hücreleri bir atmosfer altında üç gazlı bir inkübatörde% 95 N 2 , % 5 CO 2 ve 1,2,4, 8,12veya 16 saat boyunca 37 ° C'de% 0.1 O 2 karışımı ile sabit bir sıcaklıkta kültürleyin.
- Hipoksi tedavisinden sonra, ortamı 6 kuyulu plakadan aspire edin ve hücreleri PBS (pH 7.4) ile üç kez yıkayın.
- Kuyu başına 2 mL tam DMEM ekleyin.
- Hücreleri% 95 hava ve% 5 CO2ile bir atmosfer altında nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de koruyun.
3. Zaman sıcaklığı protokolü
NOT: Kalp cerrahisi sırasında daha önce diğerleri tarafından açıklandığı gibi standart bir zaman sıcaklığı protokolü kullanılır20,21. HCM'leri aşağıdaki protokole göre tedavi edin (Şekil 1): zaman noktası 1 (T1) indüksiyonun sonunu, zaman noktası 2 (T2) bakımın sonunu ve zaman noktası 3 (T3) yeniden ısıtmanın sonunu gösterir. Sürekli normotermik koşullar altında tutulan kontrol hücrelerini analiz edin (37 °C). Sıcaklık koşulları, hassas sıcaklık düzenlemesine izin veren bir üç gaz inkübatörü kullanılarak oluşturulur.
- Deneylerden iki saat önce, kültür ortamını 6 kuyulu bir plakadan epire edin ve kuyu başına 2 mL taze serumsuz DMEM ekleyin.
- Hücreleri% 5 CO 2 ile bir atmosfer altında 37 ° C'de 2 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatördeyenideninkübatör.
- 2 saat sonra, ortamı 6 kuyulu plakadan aspire edin ve hücreleri PBS (pH 7.4) ile üç kez yıkayın.
- Kuyu başına 2 mL taze serumsuz DMEM ekleyin.
- Üç gazlı inkübatördeki hücreleri yeniden kuluçkaya yatırın.
NOT: Eklenmemiş hücreleri ve kalıntıları kaldırmak için ortamı değiştirin. - Kültür yemeklerini üç gazlı bir inkübatör yerleştirerek sıcaklığı hemen değiştirin.
- 1 saat soğudktan sonra, ortamı 6 kuyulu plakadan hızlı bir şekilde aspire edin ve kuyu başına 2 mL taze şekersiz DMEM ekleyin.
- Hipoksiyi kurmak için 37 °C'de %95 N 2 ,%5CO 2 ve%0,1O2'den oluşan bir atmosfer altında üç gazlı inkübatördeki hücreleri kültüre edin.
- Sıcaklığı aşağıda açıklandığı gibi ayarlayın.
NOT: Protokol, düşük sıcaklıklı bir tedavinin 10 h'si ile başlar, ardından 2 h ila 37 °C ve 24 saat normotermi (37 °C) için yeniden ısıtma aşaması ile başlar. Her zaman noktasında, analiz için üç Petri kabı çıkarılır. - Düşük sıcaklık tedavisinden sonra, ortamı 6 kuyulu plakadan aspire edin ve PBS (pH 7.4) ile üç kez yıkayın.
- Kuyu başına 2 mL tam DMEM ekleyin.
- Hücreleri% 95 hava ve% 5 CO2ile bir atmosfer altında nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de koruyun.
4. CCK-8 uygulanabilirlik tahlilleri
- Kullanmadan önce %0,25 tripsin-etylenediaminetetraasetik asit (EDTA) çözeltisini ve PBS'yi 37 °C'ye ısıtın.
- Ortamı aspire edin, hücreleri 1 mL PBS ile durulayın ve ardından kuyunun duvarı boyunca% 0,25 tripsin 0,5 mL ekleyin. Hemen hemen tüm HCM'ler ayrılana kadar 37 °C'de kuluçkaya yaslanın (yaklaşık 1 dk).
- Tripsin nötralize etmek için kuyulara 1 mL DMEM komple orta ekleyin.
- Hücre süspansiyonunu 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve HCM'leri 3 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleme ile pelet edin. Peletin rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin.
- Hücre süspansiyonunun 100 μL'lik aliquotlarını (5000 hücre/kuyu) 96 kuyu plakasına dağıtın. Plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde (37 °C'de) 24 saat önceden kesin.
- Farklı tedavi grupları oluşturmak için 96 kuyu plakalarındaki kültürlü hücreleri kullanın.
- Plakayı bir inkübatörde uygun bir süre (16 saat) kuluçkaya yatırın.
- Plakanın her kuyusuna 10 μL CCK-8 çözeltisi ekleyin.
- Plakayı inkübatörde 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Bir mikro plaka okuyucu kullanarak emiciliği 450 nm'de ölçün.
DİkKAT: OD okuma ölçümlerine müdahale ettikleri için kuyulara kabarcık sokmamaya dikkat edin.
5. Apoptoz analizi için akış sitometrisi
- 4.2-4.4 adımlarını izleyerek trypsinization ve santrifüjleme adımlarını gerçekleştirin.
NOT: Hücreler EDTA olmadan tripsin ile toplanır. Apoptrozu değerlendirmek için hem yüzen hem de yapışan hücreler toplanır. - Hücreleri 1000 × g'da 5 dakika santrifüj edin. Süpernatant atın ve peleti 1 mL PBS'de yeniden atın.
- Hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Bir pipet kullanarak, 100 μL Trypan Mavi işlem görmüş hücre süspansiyonu hemositometreye aktarın. Bir el çetele sayacı kullanarak, canlı, lekelenmemiş hücreleri 16 karelik bir kümede sayın ve sonra PBS'yi kullanarak 1×107 hücre/ml'de bir hücre süspansiyonu oluşturun.
- Hücre süspansiyonunun 200 μL'× elde edin (5 ×10 5 -1 × 106 hücre).
- 1000 g'da 5 dakika santrifüj × ve peletin Ek V-FITC bağlama çözeltisinde yeniden kullanın.
- Hücreleri boyamak için 5 μL Annexin V-FITC ekleyin.
- Hücre süspansiyonuna 10 μL propidium iyodür ekleyin.
- Hücreleri hafifçe karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Lekelenmeyi iyileştirmek için hücreler kuluçka sırasında 2-3 kez yeniden biriktirilir. - Akış sitometresini başlatın ve yazılımın uygun şekilde çalıştığından emin olun.
- Akış sitometri yazılımında iki nokta çizim penceresi açın.
- Hücre kalıntılarını ve/veya kümeleri sırasıyla boyutları ve tanecikleri açısından dışlamak için X ekseninde öne dağılmış ışığı (FSC) ve Y eksenindeki yan dağınık ışığı (SSC) seçin.
- Hücrelerin floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılan PE (590 mm) algılama kanalını ve FITC'yi (530 mm) seçin.
- Boş (boyanmamış HCM'ler) numune tüpünü akış sitometresine yerleştirin.
- Boş örnek tüpteki süspansiyondan parçacık toplamak için Kaydet'i tıklatın ve sonra ilk nokta çiziminde daha fazla analiz için hücre popülasyonunun kapısını kapatın.
- Tek lekeli numuneleri tüp destek koluna yerleştirin. Süspansiyondan parçacık toplamak için Kaydet'i tıklatın ve sonra ilk nokta çiziminde daha fazla analiz için hücre popülasyonunun kapısını girin.
- Diğer numune tüplerindeki HCM'leri toplayın ve floresan kanallarının voltajlarını ayarlayarak ölçümü optimize edin.
NOT: Deney sırasında kompanzasyon kontrolü olarak lekesiz ve tek lekeli numuneler kullanılır. - Her numune tüpünün istatistiklerini görüntüleyin ve her numunenin kesme oranı hesaplayın.
6. Mitokondriyal depolarizasyon değerlendirmesi
- 4.2-4.4 adımlarını izleyerek trypsinization ve santrifüjleme gerçekleştirin.
- Hücreleri 500 μL tam ortamda yeniden biriktirin ve ardından 1 × 105 - 6 × 106 hücreye ayarlanmış hücre yoğunluğunu ayarlayın
- Her tüpe 0,5 mL JC-1 çalışma çözümü ekleyin.
- Hücreleri 37 °C'de bir hücre inkübatöründe 20 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Kuluçka süresi boyunca, JC-1 boyama tamponunu hazırlamak için 4 mL damıtılmış suya 1 mL 5× JC-1 boyama tamponu ekleyin. - Kuluçkadan sonra, hücreleri 600 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüj edin.
- Süpernatant atın ve peletin 1 mL JC-1 boyama tamponunda yeniden süzülür.
- 6,5 ile 6,6 olan adımları üç kez yineleyin.
- HCM'leri 1,5 mL santrifüj tüpünde 1 mL buz gibi boyama tamponunda yeniden kullanın ve hücreleri 30 dakika içinde analiz için kullanın.
- Hücrelerdeki JC-1 boyasının floresan yoğunluğunu ölçmek için PE (590 nm) algılama kanalını ve FITC'yi (530 nm) seçin.
NOT: 5.10-5.17 adımlarını izleyerek akış sitometresini ayarlayın.
7. Reaktif oksijen türleri tahlili
- 4.2-4.4 adımlarını izleyerek trypsinization ve santrifüjleme gerçekleştirin.
- Kültür ortamındaki hücreleri 10 μM DCFDA ile lekelenin ve hücre yoğunluğunu 1 × 10 6 -1 × 107 hücreye ayarlayın
- 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
- Hücreleri her 3-5 dakikada bir yavaşça yukarı / aşağı borulayın.
- Kuluçkadan sonra hücreleri serumsuz hücre kültürü ortamı ile üç kez yıkayın.
- 5.10-5.17 adımlarını izleyerek akış sitometresti üzerindeki hücreleri analiz edin.
NOT: DCF 488 nm'de heyecanlanır ve emisyon yoğunluğu 530 nm olarak ölçülür.
8. Caspase Ölçümü 3/ Caspase 8 Aktivitesi
- 4.2-4.4 adımlarını izleyerek trypsinization gerçekleştirin.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 4 °C'de 600 × g'da santrifüjleme ile toplayın.
- 2 × 106 hücre başına 100 μL lysate tampon ekleyin.
- Hücreleri buzda 15 dakika boyunca yalım.
- Bir buz banyosunda 15 dakika kuluçkaya yatırtıktan sonra, numuneyi 15 dakika boyunca 4 °C'de1,6 × 10 4 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatantı kullanmak için buz gibi bir santrifüj tüpüne aktarın.
NOT: Numunedeki protein konsantrasyonu en az 1-3 mg/mL olmalıdır. - Ac-DEVD-pNA'yı (2 mM) çıkarın ve kullanmak için bir buz banyosuna yerleştirin.
- Enzim etiketli plakaya doğru bir şekilde 40 μL tampon çözeltisi ekleyin, numunenin 80 μL'sini ekleyin ve son olarak 10 μL Ac-DEVD-pNA (2 mM) ekleyin.
- Numuneyi 37 °C'de 120 dakika kuluçkaya yatırın.
- Üreticinin talimatlarına göre bir mikro plaka okuyucusunda A405 değeri ölçüldü.
NOT: Caspase-3/caspase-8 tarafından üretilen pNA tarafından üretilen absorbans, boş kontrolün A405 değeri numuneninkinden çıkarılarak hesaplanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OGD maruziyetinin HCM'lerin canlılığı üzerindeki etkisi CCK-8 tahlili ile belirlendi. Kontrol grubunda gözlenenlerle karşılaştırıldığında, hücre canlılığı zamana bağlı olarak önemli ölçüde azaldı (Şekil 2A). Reperfüzyondan sonra farklı zamanlarda HCM'lerin apoptoz oranları, 0 ila 16 saat arasında, apoptoz oranlarının kademeli olarak arttığı ve 16 saat zaman noktasında maksimum orana ulaştığı belirli bir eğilim göstermiştir (Şekil 2B). 12 saat için OGD hücre aktivitesini ~%50 azalttığı için, sonraki deneylerde hücre hasarına neden olmak için 12 h OGD kullanıldı.
Daha sonra sıcaklığın apoptoz süreci üzerindeki etkisini inceledik. OGD grubunda gözlenenlerle karşılaştırıldığında, hipotermi ile tedavi edilen üç grupta canlı hücrelerin yüzdesi daha yüksekti (Şekil 3B). Ek olarak, derin hipotermi grubundaki hücreler OGD grubunda gözlenenden 2,1 kat daha yüksek canlılığa (%92) sahipti. Ek olarak, akış sitometrisi sonuçları hipotermilerin OGD koşullarında HCM'lerin apoptozlanmasını önlediğini göstermiştir (Şekil 3A&3C). Mitokondriyal disfonksiyon apoptoz ile ilişkili olduğundan, mitokondriyal bozuklukları değerlendirmek için ek veriler elde ettik. Hücre içi ROS düzeyleri DCFH-DA tahlili kullanılarak belirlendi. OGD grubunda gözlenenlerle karşılaştırıldığında, hipotermi tedavisi HCM'lerde hücre içi ROS seviyelerini azalttı(Şekil 4A). Ayrıca JC-1 lekelenme ile mitokondriyal membran potansiyeli saptandı. OGD tedavisinden sonra, JC-1'in kırmızı floresan önemli ölçüde azaldı ve yeşil floresan önemli ölçüde arttı. Buna karşılık, Hipotermi tedavisi OGD kaynaklı etkiyi önemli ölçüde inhibe etti ve kırmızıyı yeşil orana büyük bir farkla artırdı (Şekil 4B). Ayrıca hipotermi tedavileri yapılan hücrelerde de kaspaz 3/kaspaz-8 azalması gözlenmiştir (Şekil 4C,4D)
Şekil 1: Deneysel prosedürün akış şeması. HCM'ler aşağıdaki protokole göre tedavi edildi: zaman noktası 1 (T1) indüksiyonun sonunu gösterir (2 saat boyunca soğutma); zaman noktası 2 (T2) bakımın sona erer (istenen sıcaklıkta 10 saat boyunca hipotermi); ve zaman noktası 3 (T3) yeniden ısıtmanın sonunu gösterir (37 °C'ye kadar iki saat boyunca yeniden ısıtma). Sıcaklık istenen sıcaklıkta korundu: hafif hipotermi için 34 °C, orta hipotermi için 31 °C ve şiddetli hipotermi için 17 °C. Sürekli normotermik koşullarda (37 °C) tutulan kontrol hücreleri analiz edildi. Sıcaklık koşulları, hassas sıcaklık düzenlemesine izin veren bir üç gaz inkübatörü kullanılarak oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hücre canlılığı ve apoptozun CCK-8 ve Annexin V/PI tahlilleri ile değerlendirilmesi. (A) Hücre canlılığı, hücre canlılığı tahlili kullanılarak ölçüldü. (B) Apoptoz akış sitometrisi ile analiz edildi. *p < 0.05,***p < 0.001 ile Normal grup. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hipotermi tedavileri sonrasında hücre canlılığının ve apoptozun değerlendirilmesi. (A) Hücreli apoptoz akış sitometrisi ile saptırıldı. (B) Apoptozun nicel analizi. (C) Hücre canlılığı, hücre canlılığı tahlili kullanılarak ölçüldü. **p < 0.01,***p < 0.001 ile Normal grup. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mitokondriyal fonksiyon ve caspaz-3 kaspaz-8 aktivitesinin analizi. Hücre içi ROS seviyeleri. B Mitokondriyal membran potansiyelinin nicelleştirilmesi. (C&D) Kaspaz-8/caspase-3 aktivitesi elisa kiti kullanılarak tahmin edildi. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 OGD grubuna karşı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Farklı hücre türleri arasındaki etkileşimler de dahil olmak üzere sağlam hayvanların karmaşıklıkları, genellikle I /R yaralanmasının belirli bileşenlerinin ayrıntılı çalışmalarını önler. Bu nedenle, in vivo iskemi sonrası moleküler değişiklikleri doğru bir şekilde yansıtabilecek bir in vitro hücre modeli oluşturmak gerekir. OGD modelleri üzerinde yapılan araştırmalar daha önce13,22ve birçok sofistike yöntem oluşturulmuştur23,24. OGD modellerinin hazırlık süreci iki temel adım içerir: oksijen yoksunluğu ve glikoz yoksunluğu. Bu çalışmada, glikozsuz ortamda hücrenin kültleştirilmesiyle glikoz yoksunluğu, şu anda OGD modelleri25 , 26hazırlamak için iyi kurulmuş bir yöntem olan azot ileikameile oksijen yoksunluğu sağlanmıştır. Bununla birlikte, hücre tipine bağlı olarak,:1) hücre tohumlama yoğunluğu ve 2) OGD maruziyet süresi dahil olmak üzere iki faktör göz önünde bulundurulmalıdır. Bağlı hücrelerin sayısı ne kadar fazla olursa, OGD stresine karşı direnç o kadar güçlüdür, böylece OGD'den önceki tohumlama süresi çok önemlidir. HCM'ler (2 ×10 5 hücre/kuyu) OGD'den önce 30-34 saat boyunca 6 kuyu plakasında tohumlandı ve bu sırada hücreler yaklaşık% 65 birleştirilmişti. Daha yüksek hücre yoğunluğu OGD'nin hücreler üzerindeki etkisini azaltacaktır. Ek olarak, yıkama adımları sırasında hücrelerin kayıp potansiyelini en aza indirmek çok önemlidir. OGD maruz kalma süresinin etkisi, OGD modelinin etkinliğini değerlendirmede bir diğer önemli faktördür. Örneğin, ilaçların koruyucu etkilerini incelemek için, tedavi olmadan% 40-50 hücre ölümüne neden olan bir süre seçmek uygundur. Hücre ölümü çok aşırıysa, örneğin% 80, o zaman analiz edilen reaktifin koruyucu etkisini ölçmek zor olacaktır. HCM'lerde 12 saat boyunca OGD'ye maruz kalmak %42 hücre ölümü ile sonuçlandı. Bu nedenle, sonraki deneylerde hücre hasarına neden olmak için 12 saatlik bir OGD tedavisi kullanılmıştır.
İn vivo ve in vitro ortamlar arasındaki hipotermik kinetik farkı nedeniyle, kardiyomiyosit modeli için hipotermi indüksiyonunun optimal yaklaşımı ve mekanizmaları belirsizliğini korumaktadır. Son birkaç on yılda, düşük sıcaklıklarda kardiyomiyositleri incelemek için birkaç in vitro model geliştirilmiştir. Örneğin, Jana Krech ve ark. iskemi-reperfüzyondan sonra sıcaklığın miyokard apoptozu üzerindeki etkisini incelemek için orta derecede bir hipotermi hücre modeli kurdu13. Birçok çalışma soğutmanın fizyolojik etkilerine odaklanmış olsa da, yeniden ısıtma sırasında meydana gelen çok sayıda zararlı yan etki de vardır27. Önceki çalışmaların sonuçları, yeniden ısıtmanın izole kardiyomiyositlerde kontrtil disfonksiyona neden olabileceğini göstermiştir27,28. Bu nedenle, yeniden ısıtma sıcaklığı ve hızı özellikle gereklidir. Sıcaklığın etkisini sıkı bir şekilde kontrol etmek için, daha önce de belirtildiği gibi kalp cerrahisi sırasında kullanılan standart zaman sıcaklığı protokolünü uyguladık20,21. Bu modelde, sıcaklık üç aşama dahil olmak üzere gerekli sıcaklık aralığında doğru bir şekilde kontrol edilir: 1) soğutma süresi (1 saat); 2) sıcaklık koruma süresi (10 saat); ve 3) sıcaklığın yeniden ısıtma süresi (2 saat). Ek olarak, bu çalışmada kullanılan sıcaklıklar, önceki yayınlarda kullanılanlarla karşılaştırılabilir hafif (34 ° C), orta (31 ° C) ve şiddetli (17 ° C) düşük sıcaklıklara özgü29,30,31. Son olarak, farklı sıcaklık koşullarının kardiyomiyosit apoptoz in vitro üzerindeki etkileri ile ilgili hipotezimizi de test ettik. Beklendiği gibi, sonuçlar sıcaklığın ROS seviyelerini önemli ölçüde azalttığını, MMP'yi geri yüklediğini ve caspase-8 / caspase-3 aktivitesini azalttığını gösterdi.
Bu çalışmanın hem kasılmayan bir hücre hattı hem de herhangi bir vücut sıvısı etkilenmeyen bir in vitro model kullanılarak yapıldığının farkındayız. Bu sınırlamalara rağmen, hipotermi tedavisinden kaynaklanan hücre apoptozundaki önemli iyileşme, in vivo çalışmalar da dahil olmak üzere daha fazla araştırma yapmanın önemini vurgulamaktadır. Bu nedenle, bu model hipotermik kardiyoproteksiyonun moleküler mekanizmasını incelemek için kullanılabilir, bu da hipotermi ile kullanılmak üzere tamamlayıcı tedavilerin geliştirilmesi için önemli etkileri olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81970265, 81900281,81700288), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2019M651904) tarafından finanse edildi; ve Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit | Bio-Technology,China | C1062M | |
| Cardiac myocyte growth supplement | Sciencell,USA | 6252 | |
| Caspase 3 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1115 | |
| Caspase 8 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1151 | |
| DMEM, no glucose | Gibco,USA | 11966025 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco,USA | 11960044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco,USA | 16140071 | |
| Flow cytometry | CytoFLEX,USA | B49007AF | |
| Human myocardial cells | BLUEFBIO,China | BFN60808678 | |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Bio-Technology,China | C2006 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco,USA | 10378016 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Bio-Technology,China | S0033S | |
| Three-gas incubator | Memmert,Germany | ICO50 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco,USA | 25200056 |
References
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).
- Klein, P., et al. Less invasive ventricular reconstruction for ischaemic heart failure. EUROPEAN JOURNAL OF HEART FAILURE. 21 (12), 1638-1650 (2019).
- Otto, K. A. Therapeutic hypothermia applicable to cardiac surgery. VETERINARY ANAESTHESIA AND ANALGESIA. 42 (6), 559-569 (2015).
- Wang, X., et al. Safety of Hypothermic Circulatory Arrest During Unilateral Antegrade Cerebral Perfusion for Aortic Arch Surgery. CANADIAN JOURNAL OF CARDIOLOGY. 35 (11), 1483-1490 (2019).
- Leshnower, B. G., et al. Moderate Versus Deep Hypothermia With Unilateral Selective Antegrade Cerebral Perfusion for Acute Type A Dissection. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 100 (5), 1563-1568 (2015).
- Vallabhajosyula, P., et al. Moderate versus deep hypothermic circulatory arrest for elective aortic transverse hemiarch reconstruction. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 99 (5), 1511-1517 (2015).
- Keeling, W. B., et al. Safety of Moderate Hypothermia With Antegrade Cerebral Perfusion in Total Aortic Arch Replacement. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 105 (1), 54-61 (2018).
- Yan, T. D., et al. Consensus on hypothermia in aortic arch surgery. Annals of Cardiothoracic Surgery. 2 (2), 163-168 (2013).
- Zhou, J., Empey, P. E., Bies, R. R., Kochanek, P. M., Poloyac, S. M. Cardiac arrest and therapeutic hypothermia decrease isoform-specific cytochrome P450 drug metabolism. DRUG METABOLISM AND DISPOSITION. 39 (12), 2209-2218 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Inhibition of the mitochondrial fission protein dynamin-related protein 1 improves survival in a murine cardiac arrest model. CRITICAL CARE MEDICINE. 43 (2), 38-47 (2015).
- Zhu, W. S., et al. Hsp90aa1: a novel target gene of miR-1 in cardiac ischemia/reperfusion injury. Sci Rep. 6, 24498 (2016).
- Castedo, E., et al. Influence of hypothermia on right atrial cardiomyocyte apoptosis in patients undergoing aortic valve replacement. Journal of Cardiothoracic Surgery. 2, 7 (2007).
- Krech, J., et al. Moderate therapeutic hypothermia induces multimodal protective effects in oxygen-glucose deprivation/reperfusion injured cardiomyocytes. Mitochondrion. 35, 1-10 (2017).
- Cooper, W. A., et al. Hypothermic circulatory arrest causes multisystem vascular endothelial dysfunction and apoptosis. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 69 (3), 696-702 (2000).
- Kajimoto, M., et al. Selective cerebral perfusion prevents abnormalities in glutamate cycling and neuronal apoptosis in a model of infant deep hypothermic circulatory arrest and reperfusion. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM. 36 (11), 1992-2004 (2016).
- Liu, Y., et al. Deep Hypothermic Circulatory Arrest Does Not Show Better Protection for Vital Organs Compared with Moderate Hypothermic Circulatory Arrest in Pig Model. Biomed Research International. 2019, 1420216 (2019).
- Davidson, M. M., et al. Novel cell lines derived from adult human ventricular cardiomyocytes. JOURNAL OF MOLECULAR AND CELLULAR CARDIOLOGY. 39 (1), 133-147 (2005).
- Khan, K., Makhoul, G., Yu, B., Schwertani, A., Cecere, R. The cytoprotective impact of yes-associated protein 1 after ischemia-reperfusion injury in AC16 human cardiomyocytes. EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE. 244 (10), 802-812 (2019).
- Pan, J. A., et al. miR-146a attenuates apoptosis and modulates autophagy by targeting TAF9b/P53 pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Discovery. 10 (9), 668 (2019).
- Schmitt, K. R., et al. S100B modulates IL-6 release and cytotoxicity from hypothermic brain cells and inhibits hypothermia-induced axonal outgrowth. NEUROSCIENCE RESEARCH. 59 (1), 68-73 (2007).
- Tong, G., et al. Deep hypothermia therapy attenuates LPS-induced microglia neuroinflammation via the STAT3 pathway. Neuroscience. 358, 201-210 (2017).
- Yu, Z. P., et al. Troxerutin attenuates oxygenglucose deprivation and reoxygenationinduced oxidative stress and inflammation by enhancing the PI3K/AKT/HIF1alpha signaling pathway in H9C2 cardiomyocytes. Molecular Medicine Reports. 22 (2), 1351-1361 (2020).
- Drescher, C., Diestel, A., Wollersheim, S., Berger, F., Schmitt, K. R. How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia. European journal of cardiothoracic surgery. 40 (2), 352-359 (2011).
- Diestel, A., Drescher, C., Miera, O., Berger, F., Schmitt, K. R. Hypothermia protects H9c2 cardiomyocytes from H2O2 induced apoptosis. Cryobiology. 62 (1), 53-61 (2011).
- Zhang, Y., et al. HIF-1alpha/BNIP3 signaling pathway-induced-autophagy plays protective role during myocardial ischemia-reperfusion injury. BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY. 120, 109464 (2019).
- An, W., et al. Exogenous IL-19 attenuates acute ischaemic injury and improves survival in male mice with myocardial infarction. BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY. 176 (5), 699-710 (2019).
- Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling. EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).
- Yarbrough, W. M., et al. Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure. Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).
- Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals. AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).
- Bobi, J., et al. Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management. Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).
- Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation & Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).
