Summary
De distinkta effekterna av olika grader av hypotermi på skador skydd har inte utvärderats grundligt. Målet med den aktuella studien var att kvantifiera nivåerna av celldöd efter olika hypotermibehandlingar i en human kardiomyocytbaserad modell, vilket lade grunden för framtida djupgående molekylär forskning.
Abstract
Ischemi/reperfusion-härledda skador dysfunktion är ett vanligt kliniskt scenario hos patienter efter hjärtkirurgi. I synnerhet är känsligheten hos kardiomyocyter för ischemisk skada högre än för andra cellpopulationer. För närvarande ger hypotermi ett betydande skydd mot en förväntad ischemisk förolämpning. Undersökningar av komplexa hypotermi-inducerad molekylära förändringar är dock fortfarande begränsade. Det är därför viktigt att identifiera ett odlingstillstånd som liknar in vivo-tillstånd som kan inducera skador som liknar dem som observerats i det kliniska tillståndet på ett reproducerbart sätt. För att efterlikna ischemiliknande tillstånd in vitro behandlades cellerna i dessa modeller av syre/ glukosbrist (OGD). Dessutom tillämpade vi ett standard tidstemperatur protokoll som används under hjärtkirurgi. Dessutom föreslår vi en metod för att använda en enkel men omfattande metod för kvantitativ analys av skador på skador. Apoptos och uttryck nivåer av apoptos-associerade proteiner bedömdes av flöde cytometri och med hjälp av en ELISA kit. I denna modell testade vi en hypotes om effekterna av olika temperaturförhållanden på kardiomyocyt apoptos in vitro. Tillförlitligheten hos denna modell beror på strikt temperaturkontroll, kontrollerbara experimentella procedurer och stabila experimentella resultat. Dessutom kan denna modell användas för att studera den molekylära mekanismen för hypotermisk kardioprotection, vilket kan ha viktiga konsekvenser för utvecklingen av kompletterande terapier för användning med hypotermi.
Introduction
Ischemi/reperfusion-härledd hjärtmuskeldysfunktion är ett vanligt kliniskt scenario hos patienter efter hjärtkirurgi1,2. Under nonpulsatile låg flöde perfusion och perioder av totala cirkulations gripande, skador som omfattar alla typer av hjärtceller fortfarande uppstår. I synnerhet är känsligheten hos kardiomyocyter för ischemisk skada högre än för andra cellpopulationer. För närvarande ger terapeutisk hypotermi (TH) betydande skydd mot en förväntad ischemisk förolämpning hos patienter som genomgår hjärtkirurgi3,4. TH definieras som en kärnkroppstemperatur på 14-34 °C, även om det inte finns någon konsensus om en definition av kylning under hjärtkirurgi5,6,7. År 2013 föreslog en internationell expertpanel ett standardiserat rapporteringssystem för att klassificera olika temperaturintervall för systemiskt hypotermiskt cirkulationsstopp8. Baserat på elektroencefalografi och metabolism studier av hjärnan delade de hypotermi i fyra nivåer: djupgående hypotermi (≤ 14 °C), djup hypotermi (14,1-20 °C), måttlig hypotermi (20,1-28 °C) och mild hypotermi (28,1-34 °C). Expertkonsensus gav en tydlig och enhetlig klassificering, vilket gjorde det möjligt för studier att vara mer jämförbara och ge mer kliniskt relevanta resultat. Detta skydd som TH ger bygger på dess förmåga att minska cellernas metaboliska aktivitet, vilket ytterligare begränsar deras frekvens av högenergifosfatförbrukning9,10. TH: s roll i skador skydd är dock kontroversiell och kan ha flera effekter beroende på graden av hypotermi.
Hjärtinfarkt I/R är välkänt för att åtföljas av ökad cellapoptis11. Nya rapporter har observerat att programmerad kardiomyocyt död ökar under öppen hjärtkirurgi, och kan sammanfalla med nekros, vilket ökar antalet döda hjärtmuskelceller12. Därför, minska kardiomyocyt apoptos är ett användbart terapeutiskt tillvägagångssätt i klinisk praxis. I musen förmaksflimmer HL-1 kardiomyocyt modell, terapeutisk hypotermi visade sig minska mitokondriell frisättning av cytokrom c och apoptos-inducerande faktor (AIF) under reperfusion13. Effekten av temperaturen vid reglering av apoptos är dock kontroversiell och verkar bero på graden av hypotermi. Cooper och kollegor observerade att jämfört med en normoterm cardiopulmonary bypass kontrollgrupp, apoptos frekvensen av skador vävnad från grisar med djupa hypotermiska cirkulations gripandeökades 14. Dessutom har resultaten från vissa studier föreslagit att djup hypotermi kan aktivera apoptosvägen, medan mindre aggressiv hypotermi verkar hämma vägen12,15,16. Anledningen till detta resultat kan bero på förvirrande effekter i samband med skandinaviska skada och brist på förståelse för mekanismerna genom vilka temperaturen påverkar hjärtinfarktvävnad. Därför bör de temperaturgränser vid vilka apoptos förstärks eller dämpas definieras noggrant.
För att få en bättre förståelse för mekanismerna i samband med effekten av hypotermi och ge en rationell grund för dess genomförande hos människor, är det viktigt att identifiera ett odlingstillstånd som liknar in vivo-tillstånd som kan producera skador som liknar de som observerats för det kliniska tillståndet på ett reproducerbart sätt. Ett viktigt steg mot att uppnå detta mål är att fastställa de optimala förutsättningarna för att inducera kardiomyocytapoptos. Följaktligen undersökte vi i den aktuella studien metodologiska detaljer om syre-glukos deprivation experiment med odlade celler, en lätt in vitro-modell av ischemi-reperfusion. Dessutom utvärderade vi effekten av olika hypoxic-skandinaviska tider på kardiomyocyt apoptos och verifierade vår hypotes om effekten av olika temperaturförhållanden på cell apoptos in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Information om kommersiella reagenser och instrument finns i materialförteckningen.
AC16 mänskliga kardiomyocyt cellinje härleddes från fusion av primära celler från vuxna Ventrikulärt hjärtat vävnad med SV40-omvandlade mänskliga fibroblaster17, som köptes från BLUEFBIO (Shanghai, Kina). Cellinjen utvecklar många biokemiska och morfologiska egenskaper som är karakteristiska för kardiomyocyter. Dessutom används cellinjen ofta för att utvärdera skador på hjärtinfarkt och kortokardisk funktion in vitro18,19.
1. Cellkultur
OBS: Basala kulturmediet består av serumfria Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM), 10% fetala nötkreatur serum (FBS), 1% hjärt myocyt tillväxt tillägg och 1% penicillin/streptomycin lösning. Förvara mediet vid 4 °C och förvärmning till 37 °C före användning.
- Ta bort de kryopreserverade mänskliga kardiomyocytcellerna (HCM) från flytande kväve och tina dem i ett vattenbad vid 37 °C.
- Skaka försiktigt injektionsflaskan (<1 minut) i ett 37 °C vattenbad tills endast en liten bit is finns kvar i injektionsflaskan.
- Överför injektionsflaskan till en steril laminär flödeshuv. Torka utsidan av injektionsflaskan med en bomullstuss doppad i 70% alkohol.
- Överför 4 ml förvärmt komplett tillväxtmedium droppe i centrifugröret som innehåller de tinade cellerna.
- Centrifugera cellupphängningen vid 200 × g i 10 minuter. Efter centrifugation, kassera supernatanten och återanvänd pelleten i 5 ml komplett medium.
- Håll cellerna vid 37 °C i en fuktad inkubator under en atmosfär med 95 % luft och 5 % CO2.
OBS: Innan cellerna skördas för experiment får cellerna växa tills de når cirka 60-70% sammanflöde.
2. Upprättande av en modell för syresockerbrist (OGD)
OBS: Två timmar före studieperioden, ersätt tillväxtmediet med serumfritt medium och cellerna återinfuberades i en fuktad inkubator i 2 timmar vid 37 °C under en atmosfär med 5% CO2.
- Aspirera mediet från en 6-brunnsplatta och tvätta försiktigt cellerna tre gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt 2 ml färsk sockerfri DMEM per brunn.
- Odla cellerna vid en konstant temperatur i en tre-gas inkubator under en atmosfär med en blandning av 95% N2,5% CO2, och 0,1% O2 vid 37 °C för 1, 2, 4, 8, 12 eller 16 h.
- Efter hypoxibehandlingen, aspirera mediet från 6-brunnsplattan och tvätta cellerna med PBS (pH 7.4) tre gånger.
- Tillsätt 2 ml komplett DMEM per brunn.
- Håll cellerna vid 37 °C i en fuktad inkubator under en atmosfär med 95 % luft och 5 % CO2.
3. Protokoll för tidstemperatur
OBS: Ett standardprotokoll för tidstemperatur används under hjärtkirurgi, som tidigare beskrivits avandra 20,21. Behandla HCMs enligt följande protokoll (Bild 1): tidspunkt 1 (T1) indikerar slutet på induktion, tidspunkt 2 (T2) indikerar slutet på underhållet och tidspunkt 3 (T3) indikerar slutet på omvärmningen. Analysera kontrollceller som upprätthålls under kontinuerliga normotermiska förhållanden (37 °C). Temperaturförhållandena skapas med hjälp av en tri-gasinkubator, vilket möjliggör exakt temperaturreglering.
- Två timmar före experimenten, aspirera odlingsmediet från en 6-brunnsplatta och tillsätt 2 ml färsk serumfri DMEM per brunn.
- Återinkubera cellerna i en fuktad inkubator i 2 timmar vid 37 °C under en atmosfär med 5 % CO2.
- Efter 2 timmar, aspirera mediet från 6-brunnsplattan och tvätta cellerna med PBS (pH 7.4) tre gånger.
- Tillsätt 2 ml färsk serumfri DMEM per brunn.
- Sätt tillbaka cellerna i tri-gasinkubatorn.
OBS: Byt ut mediet för att ta bort obundna celler och skräp. - Ändra omedelbart temperaturen genom att placera kulturrätterna som en tri-gasinkubator.
- Efter 1 timmes kylning, aspirera snabbt mediet från 6-brunnsplattan och tillsätt 2 ml färsk sockerfri DMEM per brunn.
- Odla cellerna i en tri-gasinkubator under en atmosfär som består av 95% N2,5% CO2och 0,1% O2 vid 37 °C i 12 h för att fastställa hypoxi.
- Ställ in temperaturen enligt beskrivningen nedan.
OBS: Protokollet börjar med 10 timmar av en lågtemperaturbehandling, följt av en omvärmningsfas i 2 timmar upp till 37 °C och 24 h normothermia (37 °C). Vid varje tidpunkt tas tre petriskålar bort för analys. - Efter lågtemperaturbehandling, aspirera mediet från 6-brunnsplattan och tvätta med PBS (pH 7.4) tre gånger.
- Tillsätt 2 ml komplett DMEM per brunn.
- Håll cellerna vid 37 °C i en fuktad inkubator under en atmosfär med 95 % luft och 5 % CO2.
4. CCK-8 lönsamhetsanalys
- Värm 0,25% trypsin-etylendiaminetetraacetic acid (EDTA) lösning och PBS till 37 °C före användning.
- Aspirera mediet, skölj cellerna med 1 ml PBS och tillsätt sedan 0,5 ml 0,25% trypsin längs brunnens vägg. Inkubera vid 37 °C tills nästan alla HCMs lossnar (ca 1 min).
- Tillsätt 1 ml DMEM komplett medium till brunnarna för att neutralisera trypsin.
- Överför cellfjädringen till ett 15 ml centrifugeringsrör och pellet hcms genom centrifugering vid 500 × g i 3 min. Aspirera supernaten utan att störa pelleten.
- Dela ut 100 μL alikvoter av cellupphängningen (5000 celler/brunn) i en 96-brunnsplatta. Förinkubera plattan i 24 timmar i en fuktad inkubator (vid 37 °C)Preincubate the plate for 24 h in a humidified incubator (at 37 °C.)
- Använd de odlade cellerna i 96-brunnsplattorna för att generera olika behandlingsgrupper.
- Inkubera plattan under en lämplig tid (16 timmar) i en inkubator.
- Tillsätt 10 μL CCK-8-lösning till varje brunn på plattan.
- Inkubera plattan i 1 timme i inkubatorn.
- Mät absorbansen vid 450 nm med hjälp av en mikroplatta.
VARNING: Var försiktig så att du inte inför bubblor i brunnarna, eftersom de stör OD-avläsningsmätningar.
5. Flödescytometri för apoptosanalys
- Utför trypsiniserings- och centrifugeringssteg genom att följa steg 4.2-4.4.
OBS: Celler skördas med trypsin utan EDTA. För att bedöma apoptos samlas både flytande och vidhäftande celler in. - Centrifugera cellerna i 5 min vid 1000 × g. Kassera supernaten och återanvänd pelleten i 1 ml PBS.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Använd en pipett och överför 100 μL trypanblåbehandlad cellfjädring till en hemocytometer. Använd en handräkningsräknare, räkna de levande, ouppnrivna cellerna i en uppsättning med 16 rutor och använd sedan PBS för att generera en cellupphängning vid 1×107 celler/ml.
- Få 200 μL av cellupphängningen (5 × 105 -1 × 106 celler).
- Centrifug i 5 min vid 1000 × g och återanvänd pelleten i Annexin V-FITC bindningslösning.
- Tillsätt 5 μL annexin V-FITC för att färga cellerna.
- Tillsätt 10 μL propidiumid i cellfjädringen.
- Blanda försiktigt cellerna och inkubera dem i 20 minuter vid rumstemperatur i mörkret.
OBS: Cellerna återanvänds 2-3 gånger under inkubationen för att förbättra färgningen. - Starta flödescytometern och se till att programvaran fungerar korrekt.
- Öppna två prick plot fönster i flöde cytometri programvara.
- Välj framåtriktat spridda ljus (FSC) på X-axeln och sidospridda ljus (SSC) på Y-axeln för att utesluta cellskräp och/eller klumpar när det gäller storlek respektive granularitet.
- Välj PE (590 mm) detekteringskanal och FITC (530 mm), som används för att mäta cellernas fluorescensintensitet.
- Placera det tomma provröret (HCMs som inte har färgats) på flödescytometern.
- Klicka på Spela in för att samla in partiklar från suspensionen i det tomma provröret och för sedan cellpopulationen för vidare analys i det första punktdiagramt.
- Placera de enfärgade proverna på rörstödsarmen. Klicka på Spela in för att samla in partiklar från suspensionen och för sedan cellpopulationen för vidare analys i det första prickdiagramt.
- Samla HCMs i andra provrör och optimera mätningen genom att justera spänningarna i fluorescenskanalerna.
OBS: Obefläckade och enkelfärgade prover används som kompensationskontroller under försöket. - Visa statistiken för varje provrör och beräkna apoptoshastigheten för varje prov.
6. Bedömning av mitokondriell depolarisering
- Utför trypsinisering och centrifugation genom att följa steg 4.2-4.4.
- Återanvänd cellerna i 500 μL komplett medium och justera sedan celltätheten justerad till 1 × 105 - 6 × 106 celler
- Tillsätt 0,5 ml JC-1 arbetslösning till varje rör.
- Inkubera cellerna i en cellinkubator vid 37 °C i 20 minuter.
OBS: Tillsätt under inkubationstiden 1 ml 5× JC-1 färgbuffert till 4 ml destillerat vatten för att förbereda färgbufferten JC-1. - Efter inkubation, centrifugera cellerna vid 600 × g i 3 min vid 4 °C.
- Kassera supernatanten och återanvänd pelleten i 1 ml JC-1 färgbuffert.
- Upprepa steg 6,5 till 6,6 tre gånger.
- Återanvänd HCMs i 1 ml iskallt färgningsbuffert i ett 1,5 ml centrifugeringsrör och använd cellerna för analys inom 30 min.
- Välj PE (590 nm) detekteringskanal och FITC (530 nm) för att mäta fluorescensintensiteten hos JC-1-färgämnet i cellerna.
OBS: Ställ in flödescytometern genom att följa steg 5.10-5.17.
7. Analys av reaktiva syrearter
- Utför trypsinisering och centrifugation genom att följa steg 4.2-4.4.
- Färga cellerna i odlingsmedium med 10 μM DCFDA och justera celltätheten till 1 × 106 - 1 × 107 celler
- Inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
- Rör försiktigt cellerna upp/ner var 3-5 min.
- Efter inkubationen, tvätta cellerna tre gånger med serumfritt cellkulturmedium.
- Analysera cellerna på en flödescytometer genom att följa steg 5.10-5.17.
OBSERVERA: DCF är exalterad vid 488 nm och utsläppsintensiteten uppmätt till 530 nm.
8. Mätning av Caspase 3/ Caspase 8 Aktivitet
- Utför trypsinisering genom att följa steg 4.2-4.4.
- Samla cellerna genom centrifugering vid 600 × g vid 4 °C i 5 minuter.
- Tillsätt 100 μL lysatbuffert per 2 × 106 celler.
- Lysa cellerna i 15 minuter på is.
- Efter inkubation i 15 minuter i ett isbad, centrifugera provet vid 1,6 × 104 x g vid 4 °C i 15 minuter.
- Överför supernaten till ett iskallt centrifugeringsrör för användning.
OBS: Proteinkoncentrationen i provet bör vara minst 1-3 mg/ml. - Ta bort Ac-DEVD-pNA (2 mM) och placera den på ett isbad för användning.
- Tillsätt exakt 40 μL buffertlösning till den enzymmärkta plattan, tillsätt 80 μL av provet och tillsätt slutligen 10 μL Ac-DEVD-pNA (2 mM).
- Inkubera provet vid 37 °C i 120 minuter.
- Mätte A405-värdet på en mikroplåtläsare enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Den absorbans som produceras av det pNA som genereras av caspase-3/caspase-8 beräknas genom att subtrahera A405-värdet för blankkontrollen från provets.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekten av OGD-exponering på hcms livskraft fastställdes genom CCK-8-analys. Jämfört med den som observerades i kontrollgruppen minskade cellens livskraft avsevärt på ett tidsberoende sätt (figur 2A). Apoptosfrekvensen hos HCMs vid olika tidpunkter efter reperfusion visade en specifik trend, där apoptosfrekvensen gradvis ökade från 0 till 16 timmar och nådde den maximala hastigheten vid 16 h-tidpunkten (figur 2B). Som OGD för 12 h minskad cellaktivitet med ~50%, användes 12 h OGD för att inducera cellskador i efterföljande experiment.
Vi undersökte därefter effekten av temperaturen på processen för apoptos. Jämfört med den som observerades i OGD-gruppen var andelen livskraftiga celler högre i de tre grupper som behandlades med hypotermi (figur 3B). Dessutom hade cellerna i den djupa hypotermigruppen den högsta livskraften (>92%), 2,1 gånger högre än den som observerades i OGD-gruppen. Dessutom visade flödescytometriresultaten att hypotermi förhindrade apoptosen hos HCMs under OGD-förhållanden(figur 3A&3C). Eftersom mitokondriell dysfunktion är associerad med apoptos, fick vi ytterligare data för att bedöma mitokondriella störningar. De intracellulära ROS nivåerna fastställdes med hjälp av en DCFH-DA analys. Jämfört med den som observerades i OGD- gruppen minskade hypotermibehandlingen de intracellulära ROS- nivåerna i HCMs(figur 4A). Dessutom upptäcktes mitokondriellt membran potential med JC-1 färgning. Efter OGD behandling minskades den röda fluorescensen av JC-1 avsevärt, och den gröna fluorescensen ökade betydligt. Hypotermibehandling hämmade däremot signifikant den OGD-inducerade effekten och ökade det röda till det gröna förhållandet med stor marginal (figur 4B). Dessutom observerades minskningen av caspase 3/caspase-8 också i de celler som behandlades med hypotermibehandlingar (figur 4C,4D)
Figur 1: Flödesschema över försöksförfarandet. HCMs behandlades enligt följande protokoll: tid punkt 1 (T1) indikerar slutet på induktion (kylning i 2h); Tidpunkt 2 (T2) anger slutet på underhållet (hypotermi i 10h vid önskad temperatur). och tidspunkt 3 (T3) anger slutet på omvärmning (omvärmning i två timmar upp till 37 °C). Temperaturen bibehölls vid önskad temperatur: 34 °C för mild hypotermi, 31°C för måttlig hypotermi och 17 °C för svår hypotermi. Kontrollceller som upprätthålls under kontinuerliga normothermic villkor (37 °C) analyserades. Temperaturförhållandena skapades med hjälp av en tri-gasinkubator, vilket möjliggör exakt temperaturreglering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Utvärdering av cellens livskraft och apoptos av analyserna CCK-8 och Annexin V/PI. a) Cellens livskraft mättes med hjälp av en cellviabilitetsanalys. (B) Apoptos analyserades av flöde cytometri. *p < 0,05,***p < 0,001 jämfört med Normal grupp. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Utvärdering av cellens livskraft och apoptos efter hypotermibehandlingar. (A) Cell apoptos upptäcktes av flöde cytometri. B)Kvantitativ analys av apoptos. C)Cellens livskraft mättes med hjälp av en cellviabilitetsanalys. **p < 0,01,***p < 0,001 jämfört med Normal grupp. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Analys av mitokondriell funktion och caspase-3 caspase-8 aktivitet. En intracellulär ROS nivåer. B Kvantifiering av mitokondriell membranpotential. (C&D) Caspase-8/caspase-3-aktiviteten uppskattades med hjälp av ett ELISA-kit. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 jämfört med OGD-gruppen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Komplexiteten hos intakta djur, inklusive interaktioner mellan olika typer av celler, förhindrar ofta detaljerade studier av specifika komponenter i I/R-skada. Därför är det nödvändigt att upprätta en in vitro-cellmodell som exakt kan återspegla de molekylära förändringarna efter ischemi in vivo. Forskning om OGD-modeller har tidigarerapporterats 13,22, och många sofistikerade metoder haretablerats 23,24. Förberedelseprocessen för OGD-modeller innehåller två viktiga steg: syrebrist och glukosbrist. I den aktuella studien utfördes glukosbrist av odlingscell i glukosfritt medium, och syrebrist uppnåddes genom substitution med kväve, vilket för närvarande är en väletablerad metod för att förbereda OGD-modellerna25,26. Beroende på celltyp måste dock två faktorer beaktas, inklusive:1) cellfrötäthet och 2) varaktighet för OGD-exponering. Ju större antal bifogade celler, desto starkare motståndskraft mot OGD-stress, så att såddtiden före OGD är avgörande. HCMs (2 × 105 celler/brunnar) såddes i 6-brunnsplatta i 30-34h före OGD, då celler var ungefär 65% konfluenta. Högre celltäthet minskar OGD:s inverkan på celler. Dessutom är det viktigt att minimera risken för förlust av cellerna under tvättstegen. Effekten av OGD-exponeringens varaktighet är en annan viktig faktor för att utvärdera effekten av OGD-modellen. Till exempel, för att studera de skyddande effekterna av droger, är det lämpligt att välja en varaktighet som orsakar 40-50% celldöd utan behandling. Om celldöden är för extrem, t.ex. 80%, kommer det att vara utmanande att kvantifiera den skyddande effekten av reagenset som analyseras. För HCMs resulterade exponering för OGD i 12 timmar i 42% celldöd. I de efterföljande experimenten användes därför en 12-timmars OGD-behandling för att inducera cellskador.
På grund av skillnaden i hypotermisk kinetik mellan in vivo- och in vitro-miljöer är det optimala tillvägagångssättet och mekanismerna för hypotermiinduktion för kardiomyocytmodell fortfarande oklart. Under de senaste decennierna har flera in vitro-modeller utvecklats för att studera kardiomyocyter vid låga temperaturer. Till exempel etablerade Jana Krech et al. en måttlig hypotermicellmodell för att studera effekten av temperaturen på myokardisk apoptos efter ischemi-reperfusion13. Även om många studier har fokuserat på de fysiologiska effekterna av kylning, Det finns också ett stort antal skadliga biverkningar som uppstår under omvärmning27. Resultaten från tidigare studier har visat att omvärmning kan inducera kontraktil dysfunktion i de isolerade kardiomyocyterna27,28. Därför är temperaturen och hastigheten på omvärmning särskilt viktig. För att strikt kontrollera effekten av temperaturen tillämpade vi det vanliga tidstemperaturprotokollet som används under hjärtkirurgi, som tidigarenämnts 20,21. I denna modell styrs temperaturen noggrant inom det önskade temperaturområdet, inklusive tre steg: 1) kylperioden (1 h); 2) Temperaturperioden (10 timmar). och 3) temperatursänkningsperioden (2 timmar). Dessutom är de temperaturer som används i denna studie typiska för milda (34 ° C), måttliga (31 ° C) och svåra (17 ° C) låga temperaturer, jämförbara med de som används i tidigare publikationer29,30,31. Slutligen testade vi också vår hypotes om effekterna av olika temperaturförhållanden på kardiomyocyt apoptos in vitro. Som förväntat visade resultaten att temperaturen avsevärt minskade ROS-nivåerna, återställde MMP och minskade caspase-8 / caspase-3-aktiviteten.
Vi är medvetna om att denna studie utfördes med både en icke-kontraktil cellinje och en in vitro-modell, som inte påverkades av några kroppsvätskor. Trots dessa begränsningar betonar den betydande förbättringen av cell apoptos som härrör från hypotermi behandling vikten av att utföra ytterligare undersökning, inklusive in vivo studier. Därför kan denna modell användas för att studera den molekylära mekanismen för hypotermisk kardioprotection, vilket kan ha viktiga konsekvenser för utvecklingen av kompletterande terapier för användning med hypotermi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades delvis av National Natural Science Foundation of China (81970265, 81900281,81700288), China Postdoctoral Science Foundation (2019M651904); och Kinas nationella centrala forsknings- och utvecklingsprogram (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit | Bio-Technology,China | C1062M | |
| Cardiac myocyte growth supplement | Sciencell,USA | 6252 | |
| Caspase 3 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1115 | |
| Caspase 8 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1151 | |
| DMEM, no glucose | Gibco,USA | 11966025 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco,USA | 11960044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco,USA | 16140071 | |
| Flow cytometry | CytoFLEX,USA | B49007AF | |
| Human myocardial cells | BLUEFBIO,China | BFN60808678 | |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Bio-Technology,China | C2006 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco,USA | 10378016 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Bio-Technology,China | S0033S | |
| Three-gas incubator | Memmert,Germany | ICO50 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco,USA | 25200056 |
References
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).
- Klein, P., et al. Less invasive ventricular reconstruction for ischaemic heart failure. EUROPEAN JOURNAL OF HEART FAILURE. 21 (12), 1638-1650 (2019).
- Otto, K. A. Therapeutic hypothermia applicable to cardiac surgery. VETERINARY ANAESTHESIA AND ANALGESIA. 42 (6), 559-569 (2015).
- Wang, X., et al. Safety of Hypothermic Circulatory Arrest During Unilateral Antegrade Cerebral Perfusion for Aortic Arch Surgery. CANADIAN JOURNAL OF CARDIOLOGY. 35 (11), 1483-1490 (2019).
- Leshnower, B. G., et al. Moderate Versus Deep Hypothermia With Unilateral Selective Antegrade Cerebral Perfusion for Acute Type A Dissection. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 100 (5), 1563-1568 (2015).
- Vallabhajosyula, P., et al. Moderate versus deep hypothermic circulatory arrest for elective aortic transverse hemiarch reconstruction. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 99 (5), 1511-1517 (2015).
- Keeling, W. B., et al. Safety of Moderate Hypothermia With Antegrade Cerebral Perfusion in Total Aortic Arch Replacement. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 105 (1), 54-61 (2018).
- Yan, T. D., et al. Consensus on hypothermia in aortic arch surgery. Annals of Cardiothoracic Surgery. 2 (2), 163-168 (2013).
- Zhou, J., Empey, P. E., Bies, R. R., Kochanek, P. M., Poloyac, S. M. Cardiac arrest and therapeutic hypothermia decrease isoform-specific cytochrome P450 drug metabolism. DRUG METABOLISM AND DISPOSITION. 39 (12), 2209-2218 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Inhibition of the mitochondrial fission protein dynamin-related protein 1 improves survival in a murine cardiac arrest model. CRITICAL CARE MEDICINE. 43 (2), 38-47 (2015).
- Zhu, W. S., et al. Hsp90aa1: a novel target gene of miR-1 in cardiac ischemia/reperfusion injury. Sci Rep. 6, 24498 (2016).
- Castedo, E., et al. Influence of hypothermia on right atrial cardiomyocyte apoptosis in patients undergoing aortic valve replacement. Journal of Cardiothoracic Surgery. 2, 7 (2007).
- Krech, J., et al. Moderate therapeutic hypothermia induces multimodal protective effects in oxygen-glucose deprivation/reperfusion injured cardiomyocytes. Mitochondrion. 35, 1-10 (2017).
- Cooper, W. A., et al. Hypothermic circulatory arrest causes multisystem vascular endothelial dysfunction and apoptosis. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 69 (3), 696-702 (2000).
- Kajimoto, M., et al. Selective cerebral perfusion prevents abnormalities in glutamate cycling and neuronal apoptosis in a model of infant deep hypothermic circulatory arrest and reperfusion. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM. 36 (11), 1992-2004 (2016).
- Liu, Y., et al. Deep Hypothermic Circulatory Arrest Does Not Show Better Protection for Vital Organs Compared with Moderate Hypothermic Circulatory Arrest in Pig Model. Biomed Research International. 2019, 1420216 (2019).
- Davidson, M. M., et al. Novel cell lines derived from adult human ventricular cardiomyocytes. JOURNAL OF MOLECULAR AND CELLULAR CARDIOLOGY. 39 (1), 133-147 (2005).
- Khan, K., Makhoul, G., Yu, B., Schwertani, A., Cecere, R. The cytoprotective impact of yes-associated protein 1 after ischemia-reperfusion injury in AC16 human cardiomyocytes. EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE. 244 (10), 802-812 (2019).
- Pan, J. A., et al. miR-146a attenuates apoptosis and modulates autophagy by targeting TAF9b/P53 pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Discovery. 10 (9), 668 (2019).
- Schmitt, K. R., et al. S100B modulates IL-6 release and cytotoxicity from hypothermic brain cells and inhibits hypothermia-induced axonal outgrowth. NEUROSCIENCE RESEARCH. 59 (1), 68-73 (2007).
- Tong, G., et al. Deep hypothermia therapy attenuates LPS-induced microglia neuroinflammation via the STAT3 pathway. Neuroscience. 358, 201-210 (2017).
- Yu, Z. P., et al. Troxerutin attenuates oxygenglucose deprivation and reoxygenationinduced oxidative stress and inflammation by enhancing the PI3K/AKT/HIF1alpha signaling pathway in H9C2 cardiomyocytes. Molecular Medicine Reports. 22 (2), 1351-1361 (2020).
- Drescher, C., Diestel, A., Wollersheim, S., Berger, F., Schmitt, K. R. How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia. European journal of cardiothoracic surgery. 40 (2), 352-359 (2011).
- Diestel, A., Drescher, C., Miera, O., Berger, F., Schmitt, K. R. Hypothermia protects H9c2 cardiomyocytes from H2O2 induced apoptosis. Cryobiology. 62 (1), 53-61 (2011).
- Zhang, Y., et al. HIF-1alpha/BNIP3 signaling pathway-induced-autophagy plays protective role during myocardial ischemia-reperfusion injury. BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY. 120, 109464 (2019).
- An, W., et al. Exogenous IL-19 attenuates acute ischaemic injury and improves survival in male mice with myocardial infarction. BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY. 176 (5), 699-710 (2019).
- Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling. EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).
- Yarbrough, W. M., et al. Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure. Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).
- Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals. AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).
- Bobi, J., et al. Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management. Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).
- Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation & Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).
