Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

In vitro vurdering af myokardie beskyttelse efter hypotermi-forkonditionering i en human hjerte myocytter model

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61837
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cardiothoracic Surgery, Children's Hospital of Nanjing Medical University
* These authors contributed equally

Summary

De forskellige virkninger af forskellige grader af hypotermi på myokardiebeskyttelse er ikke blevet grundigt evalueret. Formålet med denne undersøgelse var at kvantificere niveauet af celledød efter forskellige hypotermibehandlinger i en human kardiomyocytbaseret model, hvilket lagde grunden til fremtidig dybdegående molekylær forskning.

Abstract

Iskæmi /reperfusion-afledt myokardie dysfunktion er et almindeligt klinisk scenarie hos patienter efter hjertekirurgi. Især følsomheden af kardiomyocytter til iskæmisk skade er højere end for andre cellepopulationer. På nuværende tidspunkt giver hypotermi betydelig beskyttelse mod en forventet iskæmisk fornærmelse. Undersøgelser af komplekse hypotermi-inducerede molekylære ændringer er dog fortsat begrænsede. Derfor er det vigtigt at identificere en kulturtilstand svarende til in vivo-forhold, der kan fremkalde skader svarende til den, der observeres i den kliniske tilstand, på en reproducerbar måde. For at efterligne iskæmilignende tilstande in vitro blev cellerne i disse modeller behandlet med ilt/ glukosemangel (OGD). Derudover anvendte vi en standardtidstemperaturprotokol, der blev brugt under hjertekirurgi. Desuden foreslår vi en tilgang til at anvende en enkel, men omfattende metode til kvantitativ analyse af myokardieskader. Apoptose og ekspressionsniveauer for apoptoserelaterede proteiner blev vurderet ved flowcytometri og ved hjælp af et ELISA-kit. I denne model testede vi en hypotese om virkningerne af forskellige temperaturforhold på kardiomyocytapoptose in vitro. Pålideligheden af denne model afhænger af streng temperaturkontrol, kontrollerbare eksperimentelle procedurer og stabile eksperimentelle resultater. Derudover kan denne model bruges til at studere den molekylære mekanisme af hypotermisk kardibeskyttelse, hvilket kan have vigtige konsekvenser for udviklingen af komplementære terapier til brug med hypotermi.

Introduction

Iskæmi/reperfusion-afledt myokardie dysfunktion er et almindeligt klinisk scenarie hos patienter efter hjertekirurgi1,2. Under nonpulsatile lav flow perfusion og perioder med total kredsløbsstop, skader, der involverer alle typer af hjerteceller stadig opstår. Især følsomheden af kardiomyocytter til iskæmisk skade er højere end for andre cellepopulationer. På nuværende tidspunkt giver terapeutisk hypotermi (TH) betydelig beskyttelse mod en forventet iskæmisk fornærmelse hos patienter, der gennemgår hjertekirurgi3,4. TH defineres som en kernetemperatur på 14-34 °C, selv om der ikke er enighed om en definition af køling under hjertekirurgi5,6,7. I 2013 foreslog et internationalt ekspertpanel et standardiseret rapporteringssystem til klassificering af forskellige temperaturområder af systemisk hypotermisk kredsløbsstop8. Baseret på elektroencefalografi og metabolismeundersøgelser af hjernen delte de hypotermi i fire niveauer: dyb hypotermi (≤ 14 °C), dyb hypotermi (14,1-20 °C), moderat hypotermi (20,1-28 °C) og mild hypotermi (28,1-34 °C). Ekspertkonsensussen gav en klar og ensartet klassificering, der gjorde det muligt for undersøgelser at være mere sammenlignelige og give mere klinisk relevante resultater. Denne beskyttelse, som TH yder , er baseret på dens evne til at reducere cellernes metaboliske aktivitet og yderligere begrænse deres højenergifosfatforbrug9,10. Men den rolle, TH i myokardie beskyttelse er kontroversiel og kan have flere virkninger afhængigt af graden af hypotermi.

Myokardie I/R er velkendt for at være ledsaget af øget celleapoptise11. Nylige rapporter har observeret, at programmeret kardiomyocytdød stiger under åben hjertekirurgi og kan falde sammen med nekrose og derved øge antallet af døde myokardieceller12. Derfor er reduktion af kardiomyocytapoptose en nyttig terapeutisk tilgang i klinisk praksis. I mus atrie HL-1 kardiomyocyt model, terapeutisk hypotermi blev vist sig at reducere mitokondrie frigivelse af cytochrom c og apoptose-inducerende faktor (AIF) under reperfusion13. Men effekten af temperatur i reguleringen af apoptose er kontroversiel og synes at afhænge af graden af hypotermi. Cooper og kolleger bemærkede, at sammenlignet med en normoterm kardiopulmonisk bypass kontrolgruppe blev apoptosehastigheden af myokardievæv fra svin med den dybe hypotermiske kredsløbsstop øget14. Derudover har resultaterne af nogle undersøgelser antydet, at dyb hypotermi kan aktivere apoptosevejen, mens mindre aggressiv hypotermi ser ud til at hæmme vejen12,15,16. Årsagen til dette resultat kan skyldes forvirrende virkninger forbundet med iskæmisk skade og manglende forståelse af de mekanismer, hvormed temperaturen påvirker myokardievæv. Derfor bør de temperaturgrænser, hvor apoptose forbedres eller dæmpes, defineres nøjagtigt.

For at få en bedre forståelse af de mekanismer, der er forbundet med hypotermiens effektivitet og give et rationelt grundlag for dens gennemførelse hos mennesker, er det vigtigt at identificere en kulturtilstand svarende til in vivo-tilstande, der kan producere skader svarende til den, der observeres for den kliniske tilstand på en reproducerbar måde. Et vigtigt skridt i retning af at nå dette mål er at etablere de optimale betingelser for at fremkalde kardiomyocytapoptose. Derfor undersøgte vi i denne undersøgelse de metodologiske detaljer om ilt-glukosemangelforsøg med dyrkede celler, en let in vitro-model af iskæmi-reperfusion. Desuden vurderede vi effekten af forskellige hypoxic-iskæmiske tider på kardiomyocytapoptose, og verificerede vores hypotese om effekten af forskellige temperaturforhold på celleapoptose in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Oplysninger om handelsreagenser og -instrumenter er anført i materialeoversigten.

Ac16 menneskelige kardiomyocyt celle linje blev afledt af sammensmeltningen af primære celler fra voksne ventrikulær hjertevæv med SV40-transformerede menneskelige fibroblaster17, som blev købt fra BLUEFBIO (Shanghai, Kina). Cellelinjen udvikler mange biokemiske og morfologiske træk, der er karakteristiske for kardiomyocytter. Derudover er cellelinjen meget udbredt til at evaluere myokardieskader og myokardiefunktion in vitro18,19.

1. Cellekultur

BEMÆRK: Det basale kulturmedium består af serumfri Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM), 10% føtal kvægserum (FBS), 1% hjertemyocyt væksttilskud og 1% penicillin/streptomycin opløsning. Mediet opbevares ved 4 °C og førwarm til 37 °C før brug.

  1. De kryopreserverede kardiomyocyteceller (HCM) fjernes fra flydende nitrogen, og de optøs i et vandbad ved 37 °C.
  2. Ryst forsigtigt hætteglasset (<1 minut) i et 37 °C vandbad, indtil der kun er et lille stykke is tilbage i hætteglasset.
  3. Overfør hætteglasset til en steril laminar flow hætte. Tør ydersiden af hætteglasset med en bomuldskugle dyppet i 70% alkohol.
  4. Der overføres 4 mL forvarmet komplet vækstmedium i centrifugerøret, der indeholder de optøede celler.
  5. Centrifuge celleaffjedringen ved 200 × g i 10 minutter. Efter centrifugering kasseres supernatanten, og pelleten genbruges i 5 mL komplet medium.
  6. Cellerne opbevares ved 37 °C i en befugtet inkubator under en atmosfære med 95% luft og 5% CO2.
    BEMÆRK: Før cellerne høstes til forsøg, får cellerne lov til at vokse, indtil de når ca. 60-70% sammenløb.

2. Etablering af en model for iltglukosemangel (OGD)

BEMÆRK: To timer før undersøgelsesperioden udskiftes vækstmediet med serumfrit medium, og cellerne blev genskåret i en befugtet inkubator i 2 timer ved 37 °C under en atmosfære med 5% CO2.

  1. Aspirér mediet fra en 6-brønds plade og vask forsigtigt cellerne tre gange med fosfat buffered saltvand (PBS).
  2. Der tilsættes 2 mL frisk sukkerfri DMEM pr. brønd.
  3. Dyrkning cellerne ved en konstant temperatur i en tre-gas inkubator under en atmosfære med en blanding af 95% N2, 5% CO2, og 0,1% O2 ved 37 °C for 1, 2, 4, 8, 12 eller 16 h.
  4. Efter hypoxibehandlingen suges mediet fra 6-brøndspladen og cellerne vaskes med PBS (pH 7.4) tre gange.
  5. Tilføj 2 mL komplet DMEM per brønd.
  6. Cellerne opbevares ved 37 °C i en befugtet inkubator under en atmosfære med 95% luft og 5% CO2.

3. Tidstemperaturprotokol

BEMÆRK: En standard tidstemperaturprotokol bruges under hjertekirurgi, som beskrevet tidligere af andre20,21. Behandl HCMs i henhold til følgende protokol (figur 1): tidspunkt 1 (T1) angiver slutningen af induktionen, tidspunkt 2 (T2) angiver slutningen af vedligeholdelsen, og tidspunkt 3 (T3) angiver afslutningen af omvarslen. Analysere kontrolceller, der vedligeholdes under kontinuerlige normotermiske forhold (37 °C). Temperaturforholdene skabes ved hjælp af en tri-gasinkubator, som giver mulighed for præcis temperaturregulering.

  1. To timer før forsøgene suges kulturmediet fra en 6-brønds plade og tilsættes 2 mL frisk serumfri DMEM pr. brønd.
  2. Cellerne inkuberes igen i en befugtet inkubator i 2 timer ved 37 °C under en atmosfære med 5% CO2.
  3. Efter 2 timer suges mediet fra 6-brøndspladen og cellerne vaskes med PBS (pH 7.4) tre gange.
  4. Der tilsættes 2 mL frisk serumfri DMEM pr. brønd.
  5. Reincubat cellerne i tri-gas inkubatoren.
    BEMÆRK: Udskift mediet for at fjerne ubundne celler og snavs.
  6. Skift straks temperaturen ved at placere kulturretterne en tri-gasinkubator.
  7. Efter 1 timers afkøling suges mediet hurtigt ud af 6-brøndspladen og tilsættes 2 mL frisk sukkerfri DMEM pr. brønd.
  8. Dyrkning af cellerne i en tregasinkubator under en atmosfære, der omfatter 95 % N2, 5 % CO2og 0,1 % O2 ved 37 °C i 12 timer for at etablere hypoxi.
  9. Indstil temperaturen som beskrevet nedenfor.
    BEMÆRK: Protokollen starter med 10 timer af en lavtemperaturbehandling efterfulgt af en omvarsningsfase i 2 timer op til 37 °C og 24 h normothermia (37 °C). På hvert tidspunkt fjernes tre petriskåle til analyse.
  10. Efter lavtemperaturbehandling suges mediet fra 6-brøndspladen og vaskes med PBS (pH 7.4) tre gange.
  11. Tilføj 2 mL komplet DMEM per brønd.
  12. Cellerne opbevares ved 37 °C i en befugtet inkubator under en atmosfære med 95% luft og 5% CO2.

4. CCK-8 rentabilitetsanalyse

  1. 0,25% trypsin-ethylendiaminetetraeddikesyre (EDTA) og PBS opvarmes til 37 °C inden brug.
  2. Aspirér mediet, skyl cellerne med 1 mL PBS og tilsæt derefter 0,5 mL på 0,25% trypsin langs brøndens væg. Inkuber ved 37 °C, indtil næsten alle HCMs er løsrevet (ca. 1 min).
  3. Tilsæt 1 mL DMEM komplet medium til brøndene for at neutralisere trypsin.
  4. Celleaffjedringen overføres til et 15 mL centrifugerør, og HCMs overføres ved centrifugering ved 500 × g i 3 min. Aspirere supernatant uden at forstyrre pellet.
  5. 100 μL aliquots af celleaffjedringen (5000 celler/brønd) dispenseres i en 96-brønds plade. Forundersøgelse af pladen i 24 timer i en befugtet inkubator (ved 37 °C)
  6. Brug de dyrkede celler i 96-brøndspladerne til at generere forskellige behandlingsgrupper.
  7. Pladen inkuberes i en passende periode (16 timer) i en inkubator.
  8. Der tilsættes 10 μL CCK-8 opløsning til hver brønd af pladen.
  9. Inkubat pladen i 1 time i inkubatoren.
  10. Absorbansen måles ved 450 nm ved hjælp af en mikropladelæser.
    ADVARSEL: Pas på ikke at introducere bobler til brøndene, da de forstyrrer OD-aflæsningsmålinger.

5. Flowcytometry til apoptoseanalyse

  1. Udfør trypsiniserings- og centrifugeringstrin ved at følge trin 4.2-4.4.
    BEMÆRK: Celler høstes med trypsin uden EDTA. For at vurdere apoptose indsamles både flydende og vedhængende celler.
  2. Centrifuge cellerne i 5 min ved 1000 × g. Supernatanten kasseres og genbruges pellet i 1 mL PBS.
  3. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Ved hjælp af en pipette overføres 100 μL Trypan Blåbehandlet celleaffjedring til et hæmocytometer. Brug en hånd stemmer tæller, tælle de levende, unstained celler i et sæt af 16 kvadrater og derefter bruge PBS til at generere en celle suspension på 1×107 celler / ml.
  4. Der opnås 200 μL af celleophænget (5 × 105 -1 × 106 celler).
  5. Centrifuge i 5 min ved 1000 × g og genbruges pellet i Annexin V-FITC bindende opløsning.
  6. Der tilsættes 5 μL bilag i V-FITC for at farve cellerne.
  7. Der tilsættes 10 μL propidium jod i celleaffjedringen.
  8. Bland forsigtigt cellerne og inkuber dem i 20 minutter ved stuetemperatur i mørke.
    BEMÆRK: Cellerne genbruges 2-3 gange under inkubationen for at forbedre farvningen.
  9. Start flowcytometeret, og sørg for, at softwaren fungerer korrekt.
  10. Åbn to dot plot vinduer i flow cytometry software.
  11. Vælg fremadrettet spredt lys (FSC) på X-aksen og sideopdelt lys (SSC) på Y-aksen for at udelukke cellerester og/eller klumper med hensyn til henholdsvis størrelse og granularitet.
  12. Vælg PE-detektionskanalen (590 mm) og FITC (530 mm), som bruges til at måle cellernes fluorescensintensitet.
  13. Placer det tomme (HCMs, der ikke er blevet farvet) prøverør på flowcytometeret.
  14. Klik på Optag for at indsamle partikler fra suspensionen i det tomme prøveglas, og gate derefter cellepopulationen til yderligere analyse i det første prikområde.
  15. Placer de enkeltfarvede prøver på rørstøttearmen. Klik på Optag for at indsamle partikler fra suspensionen, og gate derefter cellepopulationen til yderligere analyse i det første prikplot.
  16. HCMs opsamles i andre prøverør, og målingen optimeres ved at justere fluorescenskanalernes spændinger.
    BEMÆRK: Ikke-indgroede og enkeltfarvede prøver bruges som kompensationskontrol under eksperimentet.
  17. Statistikkerne for hvert prøveglas vises, og hastigheden af apoptose for hver prøve beregnes.

6. Mitokondriedepolariseringsvurdering

  1. Udfør trypsinisering og centrifugering ved at følge trin 4.2-4.4.
  2. Genbrug cellerne i 500 μL komplet medium, og juster derefter celletætheden justeret til 1 × 105 - 6 × 106 celler
  3. Tilsæt 0,5 ml JC-1 arbejdsløsning til hvert rør.
  4. Cellerne inkuberes i en celleinkubator ved 37 °C i 20 minutter.
    BEMÆRK: I inkubationsperioden tilsættes 1 mL 5× JC-1 farvningsbuffer til 4 mL destilleret vand for at forberede JC-1 farvningsbufferen.
  5. Efter inkubation centrifuges cellerne ved 600 × g i 3 min ved 4 °C.
  6. Supernatanten kasseres og genbruges pellet i 1 mL AF JC-1 farvning buffer.
  7. Gentag trin 6.5 til 6.6 tre gange.
  8. Resuspend HCMs i 1 mL iskold farvning buffer i en 1,5 mL centrifuge rør og bruge cellerne til analyse inden for 30 min.
  9. Vælg PE (590 nm) detektionskanal og FITC (530 nm) for at måle fluorescensintensiteten af JC-1-farvestof i cellerne.
    BEMÆRK: Opsæt flowcytometeret ved at følge trin 5.10-5.17.

7. Reaktiv ilt art analyse

  1. Udfør trypsinisering og centrifugering ved at følge trin 4.2-4.4.
  2. Plette cellerne i dyrkningsmediet med 10 μM DCFDA og justere celletætheden til 1 × 106 - 1 × 107 celler
  3. Inkuber i 30 minutter ved 37 °C.
  4. Rør forsigtigt cellerne op/ned hvert 3-5 min.
  5. Efter inkubationen vaskes cellerne tre gange med serumfrit cellekulturmedium.
  6. Analysér cellerne på et flowcytometer ved at følge trin 5.10-5.17.
    BEMÆRK: DCF er spændt ved 488 nm og emissionsintensiteten målt ved 530 nm.

8. Måling af Caspase 3/ Caspase 8 Aktivitet

  1. Udfør trypsinisering ved at følge trin 4.2-4.4.
  2. Cellerne opsamles ved centrifugering ved 600 × g ved 4 °C i 5 minutter.
  3. Der tilsættes 100 μL lysatbuffer pr. 2 × 106 celler.
  4. Lys cellerne i 15 minutter på is.
  5. Efter inkubation i 15 minutter i et isbad centrifugeres prøven ved 1,6 × 104 x g ved 4 °C i 15 minutter.
  6. Overfør supernatanten til et iskoldt centrifugerør til brug.
    BEMÆRK: Proteinkoncentrationen i prøven skal være mindst 1-3 mg/mL.
  7. Fjern Ac-DEVD-pNA (2 mM) og læg det på et isbad til brug.
  8. Der tilsættes nøjagtigt 40 μL bufferopløsning til den enzymmærkede plade, tilsættes 80 μL af prøven, og tilsættes til sidst 10 μL Ac-DEVD-pNA (2 mM).
  9. Prøven inkuberes ved 37 °C i 120 minutter.
  10. Målte A405-værdien på en mikropladelæser i henhold til producentens anvisninger.
    BEMÆRK: Absorbansen fra den pNA, der genereres af caspase-3/caspase-8, beregnes ved at trække A405-værdien af blindprøvekontrollen fra prøvens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Virkningen af OGD-eksponering på HCMs levedygtighed blev bestemt af CCK-8-analysen. Sammenlignet med den, der blev observeret i kontrolgruppen, blev celledygtigheden væsentligt reduceret på en tidsafhængig måde (figur 2A). Apoptoseraterne for HCMs på forskellige tidspunkter efter reperfusion viste en specifik tendens, hvor apoptoseraterne fra 0 til 16 timer gradvist steg og nåede maksimalsatsen ved 16 timer tidspunktet (Figur 2B). Som OGD for 12 timer reduceret celleaktivitet med ~ 50%, 12 h OGD blev brugt til at fremkalde celleskader i efterfølgende eksperimenter.

Vi undersøgte efterfølgende temperaturens virkning på apoptoseprocessen. Sammenlignet med den, der blev observeret i OGD-gruppen, var procentdelen af levedygtige celler højere i de tre grupper, der blev behandlet med hypotermi (figur 3B). Desuden havde celler i den dybe hypotermigruppe den højeste levedygtighed (>92%), 2,1 gange højere end den, der blev observeret i OGD-gruppen. Desuden viste flowcytometriresultaterne, at hypotermi forhindrede HCMs' apoptose under OGD-betingelser (figur 3A&3C). Fordi mitokondrie dysfunktion er forbundet med apoptose, vi opnået yderligere data til at vurdere mitokondrie lidelser. De intracellulære ROS-niveauer blev bestemt ved hjælp af en DCFH-DA-analyse. Sammenlignet med den, der blev observeret i OGD-gruppen, faldt hypotermibehandlingen de intracellulære ROS-niveauer i HCMs (Figur 4A). Derudover blev mitokondriemembranpotentialet opdaget med JC-1-farvning. Efter OGD-behandling blev den røde fluorescens af JC-1 reduceret betydeligt, og den grønne fluorescens blev signifikant øget. Hypotermibehandlingen hæmmede derimod den OGD-inducerede effekt betydeligt og øgede det røde til det grønne forhold med en stor margin (Figur 4B). Desuden blev faldet i caspase 3/caspase-8 også observeret i de celler, der blev behandlet med hypotermibehandlinger (figur 4C,4D)

Figure 1
Figur 1: Rutediagram over forsøgsproceduren. HCMs blev behandlet i henhold til følgende protokol: tidspunkt 1 (T1) angiver afslutningen af induktion (køling i 2 timer); punkt 2 (T2) angiver vedligeholdelsens afslutning (hypotermi i 10 timer ved den ønskede temperatur) og tidspunkt 3 (T3) angiver afslutningen på omvarslen (omvarslen i to timer op til 37 °C). Temperaturen blev opretholdt ved den ønskede temperatur: 34 °C for mild hypotermi, 31 °C for moderat hypotermi og 17 °C for svær hypotermi. Kontrolceller, der blev opretholdt under kontinuerlige normotermiske forhold (37 °C), blev analyseret. Temperaturforholdene blev skabt ved hjælp af en tri-gas inkubator, som giver mulighed for præcis temperaturregulering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: CCK-8's og bilagin V/PI-analyses vurdering af celleygtighed og apoptose. (A) Celle levedygtighed blev målt ved hjælp af en celle levedygtighed assay. (B) Apoptose blev analyseret ved flow cytometry. *p < 0,05,***p < 0,001 versus normal gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Vurdering af celle levedygtighed og apoptose efter hypotermi behandlinger. (A) Celleapoptose blev påvist ved strømningscytometri. (B) Kvantitativ analyse af apoptose. (C) Celle levedygtighed blev målt ved hjælp af en celle levedygtighed assay. **p < 0,01,***p < 0,001 versus normal gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Analyse af mitokondriefunktion og caspase-3 caspase-8 aktivitet. En intracellulær ROS niveauer. B Kvantificering af mitokondriemembranpotentialet. (C&D) Caspase-8/caspase-3-aktiviteten blev anslået ved hjælp af et ELISA-sæt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus OGD-gruppen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kompleksiteten af intakte dyr, herunder samspillet mellem forskellige typer celler, forhindrer ofte detaljerede undersøgelser af specifikke komponenter af I/R-skade. Derfor er det nødvendigt at etablere en in vitro cellemodel, der nøjagtigt kan afspejle de molekylære ændringer efter iskæmi in vivo. Forskning i OGD-modeller er tidligere blevet rapporteret13,22, og mange avancerede metoder er blevet etableret23,24. Forberedelsesprocessen for OGD-modeller omfatter to vigtige trin: iltmangel og glukosemangel. I denne undersøgelse blev glukosemangel udført ved at dyrke celle i glukosefrit medium, og iltmangel blev opnået ved substitution med nitrogen, som i øjeblikket er en veletableret metode til at forberede OGD-modeller25,26. Afhængigt af celletypen skal der dog tages hensyn til to faktorer, herunder:1) cellesåningstæthed og 2) varigheden af OGD-eksponeringen. Jo større antallet af vedhæftede celler er, jo stærkere er modstanden mod OGD-stress, således at varigheden af såning før OGD er afgørende. HCMs (2 × 105 celler / brønde) blev seedet i 6-brønds plade til 30-34h før OGD, på hvilket tidspunkt cellerne var ca 65% sammenflydende. Højere celletæthed vil reducere OGD's indvirkning på celler. Derudover er det afgørende at minimere potentialet for tab af cellerne under vasketrinnene. Virkningen af varigheden af OGD-eksponering er en anden vigtig faktor i vurderingen af OGD-modellens effektivitet. For eksempel for at studere de beskyttende virkninger af stoffer er det hensigtsmæssigt at vælge en varighed, der forårsager 40-50% celledød uden behandling. Hvis celledøden er for ekstrem, f.eks. 80%, vil det være udfordrende at kvantificere den beskyttende virkning af det reagens, der analyseres. For HCMs resulterede eksponering for OGD i 12 timer i 42% celledød. Derfor blev der i de efterfølgende forsøg brugt en 12-timers OGD-behandling til at fremkalde celleskader.

På grund af forskelle i hypotermiske kinetik mellem in vivo- og in vitro-miljøer er den optimale tilgang og mekanismer for hypotermiinduktion til kardiomyocytmodel fortsat uklar. I de sidste par årtier er flere in vitro-modeller blevet udviklet til at studere kardiomyocytter ved lave temperaturer. For eksempel etablerede Jana Krech et al. en moderat hypotermicellemodel for at studere effekten af temperatur på myokardieapoptose efter iskæmi-reperfusion13. Selvom mange undersøgelser har fokuseret på de fysiologiske virkninger af køling, er der også et stort antal skadelige bivirkninger, der opstår under omvarsel27. Resultaterne af tidligere undersøgelser har vist, at genopvarmning kan fremkalde kontraktil dysfunktion i de isolerede kardiomyocytter27,28. Derfor er temperaturen og hastigheden af genopvarmning særlig vigtig. For strengt at kontrollere effekten af temperatur anvendte vi standardtidstemperaturprotokollen, der blev brugt under hjertekirurgi, som tidligere nævnt20,21. I denne model styres temperaturen nøjagtigt inden for det krævede temperaturområde, herunder tre faser: 1) afkølingsperioden (1 h); 2) temperaturvedligeholderperioden (10 timer) og 3) temperaturvarmningsperioden (2 timer). Desuden er de temperaturer, der anvendes i denne undersøgelse, typiske for milde (34 ° C), moderate (31 ° C) og alvorlige (17 ° C) lave temperaturer, svarende til dem, der anvendes i tidligere publikationer29,30,31. Endelig har vi også testet vores hypotese om virkningerne af forskellige temperaturforhold på kardiomyocyt apoptose in vitro. Som forventet viste resultaterne, at temperaturen reducerede ROS-niveauerne betydeligt, genoprettede MMP og reducerede caspase-8 / caspase-3-aktivitet.

Vi er klar over, at denne undersøgelse blev udført ved hjælp af både en ikke-kontraktil cellelinje og en in vitro-model, som ikke blev påvirket af kropsvæsker. På trods af disse begrænsninger understreger den betydelige forbedring i celleapoptose som følge af hypotermibehandling vigtigheden af at udføre yderligere undersøgelser, herunder in vivo-undersøgelser. Derfor kan denne model bruges til at studere den molekylære mekanisme af hypotermisk kardiobeskyttelse, hvilket kan have vigtige konsekvenser for udviklingen af komplementære terapier til brug med hypotermi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist finansieret af National Natural Science Foundation of China (81970265, 81900281,81700288), China Postdoctoral Science Foundation (2019M651904); og Kinas nationale forsknings- og udviklingsprogram (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit Bio-Technology,China C1062M
Cardiac myocyte growth supplement Sciencell,USA 6252
Caspase 3 activity assay kit Bio-Technology,China C1115
Caspase 8 activity assay kit Bio-Technology,China C1151
DMEM, no glucose Gibco,USA 11966025
Dulbecco's modified eagle medium Gibco,USA 11960044
Fetal bovine serum Gibco,USA 16140071
Flow cytometry CytoFLEX,USA B49007AF
Human myocardial cells BLUEFBIO,China BFN60808678
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 Bio-Technology,China C2006
Penicillin/Streptomycin solution Gibco,USA 10378016
Reactive oxygen species assay kit Bio-Technology,China S0033S
Three-gas incubator Memmert,Germany ICO50
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco,USA 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).
  2. Klein, P., et al. Less invasive ventricular reconstruction for ischaemic heart failure. EUROPEAN JOURNAL OF HEART FAILURE. 21 (12), 1638-1650 (2019).
  3. Otto, K. A. Therapeutic hypothermia applicable to cardiac surgery. VETERINARY ANAESTHESIA AND ANALGESIA. 42 (6), 559-569 (2015).
  4. Wang, X., et al. Safety of Hypothermic Circulatory Arrest During Unilateral Antegrade Cerebral Perfusion for Aortic Arch Surgery. CANADIAN JOURNAL OF CARDIOLOGY. 35 (11), 1483-1490 (2019).
  5. Leshnower, B. G., et al. Moderate Versus Deep Hypothermia With Unilateral Selective Antegrade Cerebral Perfusion for Acute Type A Dissection. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 100 (5), 1563-1568 (2015).
  6. Vallabhajosyula, P., et al. Moderate versus deep hypothermic circulatory arrest for elective aortic transverse hemiarch reconstruction. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 99 (5), 1511-1517 (2015).
  7. Keeling, W. B., et al. Safety of Moderate Hypothermia With Antegrade Cerebral Perfusion in Total Aortic Arch Replacement. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 105 (1), 54-61 (2018).
  8. Yan, T. D., et al. Consensus on hypothermia in aortic arch surgery. Annals of Cardiothoracic Surgery. 2 (2), 163-168 (2013).
  9. Zhou, J., Empey, P. E., Bies, R. R., Kochanek, P. M., Poloyac, S. M. Cardiac arrest and therapeutic hypothermia decrease isoform-specific cytochrome P450 drug metabolism. DRUG METABOLISM AND DISPOSITION. 39 (12), 2209-2218 (2011).
  10. Sharp, W. W., et al. Inhibition of the mitochondrial fission protein dynamin-related protein 1 improves survival in a murine cardiac arrest model. CRITICAL CARE MEDICINE. 43 (2), 38-47 (2015).
  11. Zhu, W. S., et al. Hsp90aa1: a novel target gene of miR-1 in cardiac ischemia/reperfusion injury. Sci Rep. 6, 24498 (2016).
  12. Castedo, E., et al. Influence of hypothermia on right atrial cardiomyocyte apoptosis in patients undergoing aortic valve replacement. Journal of Cardiothoracic Surgery. 2, 7 (2007).
  13. Krech, J., et al. Moderate therapeutic hypothermia induces multimodal protective effects in oxygen-glucose deprivation/reperfusion injured cardiomyocytes. Mitochondrion. 35, 1-10 (2017).
  14. Cooper, W. A., et al. Hypothermic circulatory arrest causes multisystem vascular endothelial dysfunction and apoptosis. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 69 (3), 696-702 (2000).
  15. Kajimoto, M., et al. Selective cerebral perfusion prevents abnormalities in glutamate cycling and neuronal apoptosis in a model of infant deep hypothermic circulatory arrest and reperfusion. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM. 36 (11), 1992-2004 (2016).
  16. Liu, Y., et al. Deep Hypothermic Circulatory Arrest Does Not Show Better Protection for Vital Organs Compared with Moderate Hypothermic Circulatory Arrest in Pig Model. Biomed Research International. 2019, 1420216 (2019).
  17. Davidson, M. M., et al. Novel cell lines derived from adult human ventricular cardiomyocytes. JOURNAL OF MOLECULAR AND CELLULAR CARDIOLOGY. 39 (1), 133-147 (2005).
  18. Khan, K., Makhoul, G., Yu, B., Schwertani, A., Cecere, R. The cytoprotective impact of yes-associated protein 1 after ischemia-reperfusion injury in AC16 human cardiomyocytes. EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE. 244 (10), 802-812 (2019).
  19. Pan, J. A., et al. miR-146a attenuates apoptosis and modulates autophagy by targeting TAF9b/P53 pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Discovery. 10 (9), 668 (2019).
  20. Schmitt, K. R., et al. S100B modulates IL-6 release and cytotoxicity from hypothermic brain cells and inhibits hypothermia-induced axonal outgrowth. NEUROSCIENCE RESEARCH. 59 (1), 68-73 (2007).
  21. Tong, G., et al. Deep hypothermia therapy attenuates LPS-induced microglia neuroinflammation via the STAT3 pathway. Neuroscience. 358, 201-210 (2017).
  22. Yu, Z. P., et al. Troxerutin attenuates oxygenglucose deprivation and reoxygenationinduced oxidative stress and inflammation by enhancing the PI3K/AKT/HIF1alpha signaling pathway in H9C2 cardiomyocytes. Molecular Medicine Reports. 22 (2), 1351-1361 (2020).
  23. Drescher, C., Diestel, A., Wollersheim, S., Berger, F., Schmitt, K. R. How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia. European journal of cardiothoracic surgery. 40 (2), 352-359 (2011).
  24. Diestel, A., Drescher, C., Miera, O., Berger, F., Schmitt, K. R. Hypothermia protects H9c2 cardiomyocytes from H2O2 induced apoptosis. Cryobiology. 62 (1), 53-61 (2011).
  25. Zhang, Y., et al. HIF-1alpha/BNIP3 signaling pathway-induced-autophagy plays protective role during myocardial ischemia-reperfusion injury. BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY. 120, 109464 (2019).
  26. An, W., et al. Exogenous IL-19 attenuates acute ischaemic injury and improves survival in male mice with myocardial infarction. BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY. 176 (5), 699-710 (2019).
  27. Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling. EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).
  28. Yarbrough, W. M., et al. Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure. Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).
  29. Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals. AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).
  30. Bobi, J., et al. Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management. Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).
  31. Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation & Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).

Tags

Medicin Problem 164 Hjertekirurgi Myokardiebeskyttelse Hypotermi Apoptose Mild Hypotermi Moderat Hypotermi Dyb Hypotermi
In vitro vurdering af myokardie beskyttelse efter hypotermi-forkonditionering i en human hjerte myocytter model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zang, X., Yu, D., Yang, Z., Hu, Q.,… More

Zang, X., Yu, D., Yang, Z., Hu, Q., Ding, P., Chen, F., Mo, X. In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model. J. Vis. Exp. (164), e61837, doi:10.3791/61837 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter