Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

الإدخال الانتقالي المشترك لبروتينات الغشاء في الأقراص النانوية سابقة التشكيل

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61844
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biophysical Chemistry, Goethe University Frankfurt

Summary

يتيح الإدخال الانتقالي المشترك في الأقراص النانوية المشكلة مسبقا دراسة بروتينات الغشاء المركبة الخالية من الخلايا في بيئات دهنية محددة دون ملامسة المنظفات. يصف هذا البروتوكول إعداد مكونات النظام الأساسية والمعلمات الحرجة لتحسين كفاءة التعبير وجودة العينة.

Abstract

تسمح أنظمة التعبير الخالية من الخلايا بالتصميم المصمم خصيصا لبيئات التفاعل لدعم الطي الوظيفي حتى للبروتينات المعقدة مثل بروتينات الغشاء. يتم توضيح الإجراءات التجريبية للإدخال والطي الانتقالي المشترك لبروتينات الغشاء في أغشية سابقة التشكيل ومحددة يتم توفيرها كأقراص نانوية. البروتوكول خال تماما من المنظفات ويمكنه توليد ملليغرام من العينات النقية في غضون يوم واحد. يمكن استخدام عينات بروتين الغشاء / القرص النانوي الناتجة لمجموعة متنوعة من الدراسات الوظيفية والتطبيقات الهيكلية مثل التبلور أو الرنين المغناطيسي النووي أو المجهر الإلكتروني. يتم وصف إعداد المكونات الرئيسية الأساسية مثل lysates الخالية من الخلايا ، والأقراص النانوية ذات الأغشية المصممة ، وحلول المخزون الحرجة ، بالإضافة إلى تجميع تفاعلات التعبير الخالية من الخلايا المكونة من جزأتين. نظرا لأن متطلبات الطي لبروتينات الغشاء يمكن أن تكون متنوعة للغاية ، فإن التركيز الرئيسي لهذا البروتوكول هو تعديل المعلمات وخطوات التفاعل المهمة لجودة العينة مثل مركبات التفاعل الأساسية الحرجة ، أو تكوين غشاء الأقراص النانوية ، أو بيئة الأكسدة والاختزال والمرافقة ، أو تصميم قالب الحمض النووي. يتم إثبات العملية برمتها من خلال تخليق البروتيورهودوبسين ومستقبلات G-protein المقترنة.

Introduction

تعتبر بروتينات الغشاء (MPs) أهدافا صعبة في دراسات إنتاج البروتين بسبب عدم قابليتها للذوبان في البيئات المائية. تشتمل منصات إنتاج MP التقليدية على أنظمة قائمة على الخلايا مثل E. coli أو الخميرة أو الخلايا حقيقية النواة. يتم استخراج أعضاء البرلمان المؤتلف المركب إما من أغشية الخلايا أو إعادة طيها من أجسام التضمين1. بعد ذوبان المنظفات ، يمكن نقل النواب إلى بيئات غشائية مناسبة من خلال بروتوكولات إعادة التشكيل في المختبر. إلى جانب الحويصلات والجسيمات الشحمية ، أصبحت إعادة تشكيل MP في أغشية مستوية في شكل أقراص نانوية2 أو جسيمات ساليبرو3 تقنيات روتينية في الآونة الأخيرة. ومع ذلك ، فإن كل هذه الاستراتيجيات تنطوي على اتصال المنظفات مع النواب التي يمكن أن تؤدي إلى زعزعة الاستقرار ، وتفكك oligomers ، وحتى فقدان بنية البروتين والنشاط4. وبالتالي ، يمكن أن يكون فحص ظروف الذوبان وإعادة التشكيل المثلى للمنظفات مملا ويستغرق وقتا طويلا5.

تسمح الطبيعة المفتوحة للأنظمة الخالية من الخلايا (CF) بتزويد تفاعل التعبير مباشرة بأغشية مسبقة التشكيل ذات تركيبة دهنية محددة. في وضع التعبير القائم على الدهون هذا (L-CF) ، تتاح للنواب المركبين الفرصة للإدراج بشكل مشترك في الطبقات الثنائية المقدمة 6,7 (الشكل 1). يبدو أن الأقراص النانوية التي تتكون من بروتين سقالة غشائية (MSP) يحيط بقرص ثنائي الطبقة من الدهون المستوية8 مناسبة بشكل خاص لهذه الاستراتيجية 9,10. يمكن تجميع الأقراص النانوية بشكل روتيني في المختبر مع مجموعة متنوعة من الدهون المختلفة ، فهي مستقرة للغاية ، ويمكن تركيز المخزونات حتى 1 ملليمتر. ومع ذلك ، فإن تعبير MSP في E. coli وتنقيته ضروري. كاستراتيجية بديلة ، يمكن التعبير عن MSP بشكل مشترك مع النائب المستهدف في تفاعلات CF المزودة بالجسيمات الشحمية 11،12،13. تتم إضافة قوالب الحمض النووي لكل من MSP و MP إلى التفاعل ويمكن أن تتشكل أقراص MP / nanodiscs عند التعبير. في حين يتم تجنب إنتاج MSP ، تتطلب استراتيجية التعبير المشترك ضبطا دقيقا دقيقا لتركيزات قالب الحمض النووي النهائي ويمكن توقع اختلافات أعلى في كفاءة إنتاج العينات.

إن الإدخال الانتقالي المشترك للنواب في أغشية الأقراص النانوية سابقة التشكيل هو آلية غير فسيولوجية ولا تزال غير معروفة إلى حد كبير مستقلة عن آلات translocon وتسلسلات الإشارات13،14،15،16. المحددات الرئيسية لكفاءة الإدخال هي نوع بروتين الغشاء وكذلك تكوين الدهون في الغشاء المقدم ، مع تفضيل متكرر للدهون سالبة الشحنة15,17. نظرا لأن أغشية الأقراص النانوية محصورة نسبيا في الحجم ، يتم إطلاق كمية كبيرة من الدهون عند إدخال MP18. يتيح اختلاف حجم القرص النانوي إدخال وضبط مجمعات MP قليلة القلة الأعلى15,18. من بين أمور أخرى ، تم عرض التجميع الصحيح للمجمعات المتجانسة للقناة الأيونية KcsA ، وللمضخة الأيونية proteorhodopsin (PR) ولنقل الأدوية المتعددة EmrE15,18. من المرجح أن يدخل النواب غشاء القرص النانوي المتماثل من كلا الجانبين بتردد متساو نسبيا. لذلك ينبغي اعتبار أن المونومرات المختلفة أو الأوليغومرات التي يتم إدخالها في قرص نانوي واحد قد يكون لها اتجاهات متعاكسة. ومع ذلك ، يمكن أن يحدث التحيز في التوجه بسبب آليات الإدراج التعاونية كما هو مذكور لتشكيل hexamers PR و KcsA tetramers18. قد ينتج تحيز آخر في اتجاه MP عن مفاتيح توجيه النواب المدخلين ربما على حافة أغشية القرص النانوي.

يعد إنتاج محللات التليف الكيسي من سلالات الإشريكية القولونية تقنية روتينية موثوقة ويمكن إجراؤها في أي مختبر كيميائي حيوي تقريبا19,20. يجب مراعاة أنه إلى جانب تكوين جسر ثاني كبريتيد ، فإن معظم التعديلات الأخرى بعد الترجمة غائبة إذا تم تصنيع MP باستخدام E. coli lysates. في حين أن هذا قد يولد عينات أكثر تجانسا للدراسات الهيكلية ، فقد يكون من الضروري استبعاد الآثار المحتملة على وظيفة أهداف MP. ومع ذلك ، فإن الإنتاج الفعال لعينات عالية الجودة من مستقبلات البروتين G المقترنة (GPCR) 14،21،22 ، أو ناقلات حقيقية النواة 23 أو تجمعات كبيرة غير متجانسة 24 في محللات E. coli CF تشير إلى ملاءمتها حتى للأهداف المعقدة. يمكن الحصول على كميات المقياس التحضيري (≈ 1 ملغم/مل) من العينة باستخدام تكوين خلية التبادل المستمر الخالي من الخلايا (CECF) المكون من مقصورتين، والذي يتكون من خليط تفاعل (RM) وحجرة خليط تغذية (FM). يتجاوز حجم FM حجم RM من 15 إلى 20 ضعفا ويوفر خزانا من مركبات الطاقة منخفضة الوزن الجزيئي والسلائف19. وبالتالي يتم تمديد تفاعل التعبير لعدة ساعات ويتم زيادة العائد النهائي لهدف MP. يتم فصل مقصورات RM و FM بواسطة غشاء غسيل الكلى مع قطع 10-14 kDa. تتطلب المقصورتان تصميما خاصا لحاوية تفاعل CECF (الشكل 1). أشرطة غسيل الكلى التجارية كحاويات RM في تركيبة مع حاويات زجاجية شبكية مصممة خصيصا تحمل FM هي أمثلة مناسبة. يمكن التلاعب بعوائد MP بشكل أكبر عن طريق تعديل نسب RM: FM أو عن طريق تبادل FM بعد فترة معينة من الحضانة.

غالبا ما يتطلب العائد وجودة MP تحسينا مكثفا لمعلمات التفاعل. ميزة مهمة لتعبير CF هي إمكانية تعديل وضبط أي مركب تقريبا وفقا للمتطلبات الفردية ل MP. تتمثل الاستراتيجية المباشرة في التركيز أولا على تحسين إنتاجية MP من خلال إنشاء بروتوكول إنتاج أساسي ثم تحسين جودة MP من خلال ضبط التفاعل وظروف الطي. يؤدي غياب العمليات الفسيولوجية في محللات CF وانخفاض تعقيدها إلى ارتفاع معدلات النجاح للإنتاج الفعال ل MPs25. الاعتبارات الروتينية لتصميم قالب الحمض النووي وتحسين تركيز أيون Mg 2+ كافية في معظم الحالات للحصول على عوائد مرضية26. اعتمادا على وضع التعبير ، يمكن أن يصبح تحسين جودة MP مستهلكا للوقت ، حيث يجب فحص مجموعة أكبر من المعلمات14،17،22.

لإنشاء منصة التعبير CF الموصوفة ، تعد البروتوكولات ضرورية لإنتاج محللات E. coli CF (i) ، وبوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (ii) ، والأقراص النانوية (iii) ، ومركبات تفاعل CECF الأساسية (iv) (الشكل 1). وكثيرا ما تستخدم مشتقات سلالة E. coli K12 A1927 أو BL21 لإعداد S30 الفعال (الطرد المركزي عند 30000 × g) lysates. إلى جانب الليزات S30 ، يمكن استخدام الليزات المقابلة التي يتم طردها مركزيا في قوى g أخرى (مثل S12). تختلف الليزات في كفاءة التعبير وفي تعقيد البروتين. تمت دراسة بروتيوم S30 lysate الذي أعده البروتوكول الموصوف بالتفصيل28. لا يزال بروتين S30 يحتوي على بعض بروتينات الغشاء الخارجي المتبقية التي يمكن أن تسبب مشاكل خلفية عند التعبير عن القنوات الأيونية وتحليلها. بالنسبة لهذه الأهداف ، يوصى باستخدام محللات S80-S100. تعديل قيم أثناء إعداد lysate هو تحريض استجابة SOS عن طريق الجمع بين الصدمة الحرارية وإمدادات الإيثانول في مرحلة نمو منتصف السجل للخلايا. يتم إثراء محللات HS30 الناتجة في المرافقين ويمكن استخدامها في المزج مع S30 lysates لتحسين MP قابل للطي22. يتم تشغيل تعبير CF في محللات E. coli كعملية نسخ / ترجمة مقترنة مع قوالب الحمض النووي التي تحتوي على المروجين الذين يتم التحكم فيهم بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (T7RNAP). يمكن إنتاج الإنزيم بكفاءة في خلايا النجوم BL21 (DE3) التي تحمل البلازميد pAR121929.

يتم تجميع نسختين من MSP1E3D1 في قرص نانوي واحد يبلغ قطره 10-12 نانومتر، ولكن البروتوكول الموضح أدناه قد يعمل أيضا مع مشتقات MSP الأخرى. ومع ذلك ، فإن الأقراص النانوية الأكبر من تلك التي تم تشكيلها باستخدام MSP1E3D1 تميل إلى أن تكون أقل استقرارا في حين أن الأقراص النانوية الأصغر التي تم تشكيلها باستخدام مشتقات MSP مثل MSP1 قد لا تستوعب MPs أو مجمعات MP. يمكن تجميع الأقراص النانوية MSP1E3D1 في المختبر مع مجموعة كبيرة ومتنوعة من الدهون المختلفة أو مخاليط الدهون. عادة ما تكون الأقراص النانوية سابقة التشكيل مستقرة لمدة > 1 سنة عند -80 درجة مئوية ، في حين أن الاستقرار قد يختلف لمكونات الدهون المختلفة. لفحص تأثيرات الدهون على طي واستقرار MP، فمن الضروري إعداد مجموعة شاملة من الأقراص النانوية التي تم تجميعها مع مجموعة متنوعة تمثيلية من الدهون / مخاليط الدهون. الدهون التالية قد تعطي اختيار بداية جيدة: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG) ، 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) ، 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG) ، 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) ، 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) و 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC).

يتم وصف بروتوكول لإعداد تفاعل CECF 3 مل. من الممكن إجراء المزيد من التحجيم لأعلى أو لأسفل بنسبة 1: 1. بالنسبة لتكوين CECF المكون من جزأين ، يجب إعداد RM يحتوي على جميع المركبات و FM يحتوي فقط على المركبات منخفضة الوزن الجزيئي. يمكن استخدام أجهزة غسيل الكلى التجارية سعة 3 مل مع 10-14 كيلو دالتون MWCO كحاويات RM ، والتي يتم وضعها بعد ذلك في حاويات زجاجية شبكية مخصصة تحمل FM (الشكل 1D)30. نسبة RM:FM هي 1:20 ، لذلك يجب إعداد 60 مل من FM ل 3 مل RM. يمكن أن تكون جودة أو تركيز أو نوع العديد من المكونات حاسمة بالنسبة للعائد النهائي و / أو جودة MP المركب (الجدول 1). يجب إعداد قوالب الحمض النووي وفقا للمبادئ التوجيهية المنشورة ويمكن أن يؤدي تحسين الكودون لإطار القراءة للهدف إلى زيادة تحسين إنتاجية المنتج بشكل كبير26. بالنسبة لتفاعل CECF على نطاق تحضيري ، يتم وصف بروتوكول ثابت لإنتاج العلاقات العامة. لإنشاء بروتوكولات تعبير للنواب الجدد ، من الضروري عادة إجراء شاشات تحسين لبعض المركبات (الجدول 1) لتحسين الإنتاجية والجودة. بالنسبة لأيونات Mg2+ ، يوجد تركيز مثالي جيد التركيز يظهر في كثير من الأحيان تباينا كبيرا لقوالب الحمض النووي المختلفة. مركبات تفاعل CF الأخرى مثل دفعات جديدة من T7RNAP أو S30 lysates قد تزيد من تحويل تركيز Mg2+ الأمثل. على سبيل المثال ، يتم وصف شاشة Mg 2+ نموذجية ضمن نطاق تركيز14-24 mM وفي خطوات من 2 mM. يتم فحص كل تركيز في تكرارات وفي تفاعلات CECF على نطاق تحليلي. كحاوية تفاعل CECF ، يتم استخدام حاويات زجاجية Mini-CECF Plexiglas30 المصممة خصيصا والتي تحمل RM مع لوحات صغيرة قياسية ذات 24 بئرا تحمل FM (الشكل 1B). وبدلا من ذلك، يمكن استخدام خراطيش غسيل الكلى التجارية مع الصفائح الدقيقة للآبار ذات العمق 96 أو غيرها من أجهزة الدياليزر التجارية في الإعدادات المناسبة (الشكل 1C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد S30 lysate

  1. اليوم 1: اخرج الخلايا من مخزون الجلسرين على صفيحة أجار LB واحتضنها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. اليوم 2: قم بتلقيح 200 مل من وسط LB مع الخلايا من صفيحة الأجار واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 12-14 ساعة.
  3. اليوم 3: قم بتلقيح 10 لتر من وسط YPTG المعقم (10 جم / لتر من مستخلص الخميرة ، 16 جم / لتر من التريبتون ، 5 جم / لتر من كلوريد الصوديوم ، 19.8 جم / لتر من الجلوكوز ، 4.4 مللي مترKH 2 PO4 ، 8 mM K2HPO4) مخفف إلى 37 درجة مئوية في مفاعل خزان مقلي سعة 15 لتر مع 100 مل من ما قبل الزرع (1:100). تزرع عند 37 درجة مئوية ، 500 دورة في الدقيقة وتهوية عالية (~ 3 أحجام هواء في الدقيقة). لمنع الرغوة المفرطة ، أضف رغوة معقمة.
  4. قياس الكثافة البصرية (OD) عند 600 نانومتر في فترات زمنية منتظمة. بعد حوالي 2 ساعة ، ستدخل الثقافة مرحلة السجل.
  5. تعديل لمحلل HS30: عندما تكون الخلايا في منتصف مرحلة السجل (OD600 ≈ 3.6-4.2) أضف 300 مل من الإيثانول إلى وسط الاستزراع واستمر في الزراعة عند 42 درجة مئوية ، 500 دورة في الدقيقة ، وتهوية عالية (حوالي 3 أحجام هواء في الدقيقة) لمدة 45 دقيقة أخرى. ثم تابع تبريد وحصاد مزرعة الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.6. لإنتاج محلل S30 القياسي ، تخطى هذه الخطوة وتابع الخطوة 1.6.
  6. عندما تكون الخلايا في منتصف مرحلة السجل (OD600 ≈ 3.6-4.2) ، يقوم جهاز التخمير البارد بالتبريد بدرجة حرارة أقل من 20 درجة مئوية في غضون < 30 دقيقة. يجب أن يكون OD600 النهائي حوالي 4.5-5.5. احصد الخلايا عند 4500 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت. حافظ على الخلايا عند 4 درجات مئوية خلال الخطوات التالية.
    ملاحظة: أثناء التبريد ، يمكن أن تحدث رغوة مفرطة. في هذه الحالة ، إما إضافة مضاد للرغوة أو تقليل سرعة التحريك و / أو تقليل تدفق الهواء في المفاعل الحيوي.
  7. قم بتعليق الخلايا تماما في 300 مل من المخزن المؤقت S30-A (10 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.2 ، 14 mM Mg (OAc) 2 ، 60 mM KCl ، 6 mM 2-mercaptoethanol) باستخدام ملعقة متبوعة بسحب التعليق لأعلى ولأسفل حتى التجانس. جهاز طرد مركزي عند 8000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين.
    تحذير: 2-ميركابتوإيثانول سام. تجنب ملامسة الجلد أو الجهاز التنفسي. إذا كان ذلك ممكنا ، اعمل تحت غطاء محرك السيارة. وزن كوب جهاز الطرد المركزي الفارغ قبل خطوة الغسيل الأخيرة. بعد الطرد المركزي ، قم بوزن حبيبة الخلية الرطبة وإما المضي قدما في الخطوة 1.8 أو تخزين الكريات حتى مزيد من الاستخدام.
    ملاحظة: وزن حبيبة الخلية الرطبة هو 5-7 جم لكل 1 لتر من ثقافة المفاعل الحيوي. في هذه المرحلة ، قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا ويمكن تجميد الكريات في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية لمدة 4-8 أسابيع.
  8. الخلايا جيدا في 1.1 وحدة تخزين (1 جم = 1 مل) من المخزن المؤقت S30-B (10 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.2 ، 14 mM Mg (OAc) 2 ، 60 mM KOAc ، 1 mM DTT ، قرص واحد من مثبط الأنزيم البروتيني cOmplete). املأ التعليق في خلية ضغط ضغط فرنسية مبردة مسبقا وقم بتعطيل الخلايا عند 1000 رطل لكل بوصة مربعة. تمرير الخلايا من خلال الصحافة الفرنسية مرة واحدة.
  9. قم بطرد مركزي للليزات عند 30000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب جديد وكرر خطوة الطرد المركزي.
    ملاحظة: قد تكون هناك طبقة فضفاضة وغروي موجودة أعلى الكرية بعد الطرد المركزي الأول ، والتي لا ينبغي نقلها مع supernatant.
  10. ضع خطوة عالية الملح والحرارة لإزالة مكونات التحلل غير المستقرة وإطلاق mRNA من الريبوسومات. اضبط الليزات على 0.4 مليون كلوريد الصوديوم واحتضنها عند 42 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة في حمام مائي.
    ملاحظة: ستؤدي هذه الخطوة إلى تكوين راسب كبير. اقلب الأنبوب أو قلبه أثناء الحضانة من وقت لآخر.
  11. انقل التعليق العكر (عادة 50-80 مل) إلى أنابيب غسيل الكلى مع قطع 10-14 kDa وديالي ضد 5 لتر S30-C المخزن المؤقت (10 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.2 ، 14 mM Mg (OAc) 2 ، 60 mM KOAc ، 0.5 mM DTT). استبدل المخزن المؤقت لغسيل الكلى S30-C بعد 2-3 ساعات ودياليز لمدة 12-14 ساعة أخرى.
  12. اليوم 4: انقل التعليق المائل إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي عند 30000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل supernatant (S30 lysate) إلى أنابيب 50 مل طازجة واخلطها برفق. يجب أن يكون تركيز البروتين في الليزات حوالي 30-40 ملغ / مل. قم بتجميد الأليكوتات بالصدمات (على سبيل المثال 0.5 مل ، 1 مل) في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية. الأليكوتس مستقرة لمدة > 1 سنة.

2. التعبير وتنقية بوليميراز الحمض النووي الريبي T7

  1. اليوم 1: قم بتلقيح وسط 200 مل LB يحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين مع خلايا BL21 (DE3) Star x pAR1219 المطلية حديثا واحتضان عند 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة لمدة 12-16 ساعة.
  2. اليوم 2: قم بتلقيح مرق رائع سعة 1 لتر (12 جم / لتر من التريبتون ، 24 جم / لتر من مستخلص الخميرة ، 4 مل / لتر جلسرين) في قارورة محيرة سعة 2 لتر مع 10 مل من مرحلة ما قبل الزرع واحتضنها عند 37 درجة مئوية وإثارة 180 دورة في الدقيقة. يجب أن يكون OD600 المبدئي حوالي 0.1.
  3. عندما يصل OD600 إلى 0.6-0.9 ، أضف IPTG إلى تركيز نهائي قدره 1 mM للحث على التعبير T7RNAP ومواصلة الزراعة لمدة 5 ساعات أخرى.
  4. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4500 × غرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تجميد الخلايا في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  5. اليوم 3: أضف 30 مل من المخزن المؤقت للتعليق البارد (30 ملليمتر Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 مع قرص واحد من مثبط الأنزيم البروتيني cOmplete) إلى حبيبة الخلايا المجمدة وقم بإذابة الكريات في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة. ثم ، الكريات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل حتى التجانس.
  6. قم بإجراء تعطيل الخلايا باستخدام مكبس فرنسي كما هو موضح في القسم السابق أو استخدم جهاز صوتنة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، جهاز طرد مركزي عند 20000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ونقل supernatant إلى أنبوب جديد.
  7. لتعجيل الحمض النووي الجينومي ، أضف كبريتات الستربتومايسين ببطء وتحت إثارة لطيفة إلى supernatant حتى يتم الوصول إلى تركيز نهائي قدره 3٪ (w / v). تحضن في 4 درجات مئوية لمدة 5-10 دقائق تحت إثارة لطيفة. جهاز طرد مركزي عند 20000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  8. قم بتصفية السوبرناتانت بمرشح 0.45 ميكرومتر وقم بتحميله على عمود Q-Sepharose بحجم عمود (CV) يبلغ 40 مل متوازن مع مخزن مؤقت لتوازن CV 2 (30 mM Tris-HCl و pH 8.0 و 10 mM EDTA و 50 mM NaCl و 5٪ glycerol و 10 mM 2-mercaptoethanol) باستخدام مضخة تمعجية بمعدل تدفق 4 مل / دقيقة. بعد ذلك ، قم بتوصيل العمود بكاشف الأشعة فوق البنفسجية واستمر في الاستخلاص باستخدام مخزن مؤقت للتوازن حتى تصل إشارة الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر إلى خط أساس مستقر.
  9. Elute T7RNAP مع تدرج من 50 mM إلى 500 mM NaCl لكل CV بمعدل تدفق 3 مل / دقيقة. جمع كسور 1 مل وإعداد عينات لتحليل SDS-PAGE عن طريق خلط 10 ميكرولتر من كل كسر مع 2 × SDS عينة المخزن المؤقت. قم بتشغيل SDS-PAGE وقم بتلطيخ الجل باستخدام Coomassie Blue R. T7RNAP يجب أن يظهر كشريط بارز عند حوالي 90 كيلو دالتون إلى جانب العديد من النطاقات الإضافية من الشوائب.
  10. كسور المسبح التي تحتوي على T7RNAP والدياليز باستخدام أغشية مع 12-14 kDa MWCO لمدة 12-16 ساعة في المخزن المؤقت لغسيل الكلى (10 mM K 2 HPO 4 /KH2PO4 ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 10 mM NaCl ، 0.5 mM EDTA ، 1 mM DTT ، 5٪ (w / v) الجلسرين).
  11. اليوم 4: جمع محلول T7RNAP والتركيز باستخدام وحدات مرشح مع 12-14 MWCO إلى تركيز نهائي من 3-10 ملغ / مل. قد يبدأ T7RNAP في الترسيب أثناء التركيز. توقف عن التركيز على الفور بمجرد حدوث التعكر في العينة. أضف الجلسرين إلى تركيز نهائي قدره 50٪ (ث / v) واخلطه بلطف. قم بتجميد الصدمات 0.5-1 مل من الأليكوتات وتخزينها عند -80 درجة مئوية. يمكن تخزين أليكوتات T7RNAP العاملة عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب الحصول على ما يقرب من 20-40 مل من 5 ملغم / مل T7RNAP المنقى جزئيا مع 20000-40000 وحدة من تخمير 1 لتر. لاختبار الكمية المثلى لكل دفعة T7RNAP ، يجب إجراء تفاعلات التعبير CF للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) الذي يحتوي على 0.02 mg / mL-0.1 mg / mL من عينة T7RNAP المحضرة.

3. التعبير وتنقية MSP1E3D1

  1. اليوم 1: قم بتحويل خلايا النجوم E. coli BL21 (DE3) باستخدام متجه pET28(a)-MSP1E3D131 باستخدام تحويل الصدمة الحرارية القياسي أو بروتوكولات المعالجة الكهربائية. قم بإخراج أو لوحة الخلايا المحولة على LB agar التي تحتوي على 30 ميكروغرام / مل kanamycin وتحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
  2. اليوم 2: قم بتلقيح 200 مل من وسط LB مع استكمال 0.5٪ (ث / v) من الجلوكوز و 30 ميكروغرام / مل من الكاناميسين مع مستعمرة واحدة تم التقاطها من صفيحة أجار واحتضانها عند 37 درجة مئوية عند 180 دورة في الدقيقة لمدة 12-16 ساعة.
  3. اليوم 3: قم بتلقيح 10 لتر LB متوسط مكمل بنسبة 0.5٪ (ث / v) من الجلوكوز و 30 ميكروغرام / مل من kanamycin مع 100 مل من ما قبل الزرع في مفاعل حيوي مقلوب. إجراء التخمير عند 37 درجة مئوية ، 500 دورة في الدقيقة وتهوية ما يقرب من 3 أحجام المفاعل الحيوي في الدقيقة. في حالة الرغوة المفرطة ، أضف مضاد الرغوة.
    ملاحظة: يمكن استخدام قوارير الاهتزاز المحيرة بدلا من جهاز التخمير.
  4. عند OD600 من 6.5-7.5 ، أضف IPTG إلى تركيز نهائي قدره 1 mM واستمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4500 × غرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اغسل كريات الخلايا ب 200 مل من كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ (ث / v) وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 8000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت وانقل الخلايا إلى أنابيب سعة 50 مل باستخدام ملعقة. وزن الكريات الرطبة المتوقع هو 8-12 جم لكل لتر من ثقافة المفاعل الحيوي. قم بتجميد كريات الخلايا بالصدمات في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  5. اليوم 4: للتنقية ، قم بإذابة كريات الخلايا في حمام مائي في RT. قم بتعليق الخلايا في المخزن المؤقت MSP-A (40 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 300 mM NaCl ، 1٪ (w / v) Triton X-100 ، قرص واحد من كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني c0mplete لكل تعليق خلوي 50 مل) لإنتاج تعليق خلوي بنسبة 30-40٪ (w / v).
  6. قم بتعطيل الخلايا عن طريق الصوتنة أو باستخدام مكبس فرنسي وأجهزة طرد مركزي عند 30000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب جديد وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر. ضع الترشيح على عمود حمض النتريلوتريكاسيتيك المحمل ب Ni2+ (CV > 15 mL) المتوازن مع 5 CV من المخزن المؤقت MSP-B (40 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 300 mM NaCl ، 1٪ (w / v) Triton X-100) باستخدام مضخة تمعجية.
    ملاحظة: لتسهيل الترشيح ، يمكن صوتنة supernatant لمدة دقيقة أخرى لتحطيم شظايا الحمض النووي الكبيرة.
  7. بعد تحميل العينة، اغسل العمود ب 5 CV MSP-B، و 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl، و pH 8.9، و 300 mM NaCl، و 50 mM حمض الكوليك)، و 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl، و pH 8.9، و 300 mM NaCl)، و 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl، و pH 8.0، و 300 mM NaCl) و 5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl، والرقم الهيدروجيني 8.0، 300 ملليمتر كلوريد الصوديوم، 50 ملليمتر إيميدازول).
    ملاحظة: حمض الكوليك في المخزن المؤقت MSP-C مهم لإزالة الدهون المرتبطة ب MSP. حمض الكوليك غير قابل للذوبان تماما عند قيم الأس الهيدروجيني المنخفضة. لذلك يجب تعديل قيمة الرقم الهيدروجيني إلى 8.9 في MSP-C و MSP-D. من المهم غسل العمود باستخدام المخزن المؤقت MSP-D ، لأن انخفاض درجة الحموضة قد يتسبب في ترسب حمض الكوليك المتبقي وسد العمود أو إتلافه.
  8. Elute MSP مع MSP-G (40 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 300 mM NaCl ، 300 mM imidazole). جمع كسور من 1 مل ومراقبة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر. جمع وتجميع كسور ذروة الاستخراج.
  9. نقل كسور MSP المجمعة إلى أنابيب غشاء غسيل الكلى MWCO 12-14 kDa ودياليز مقابل 5 لتر من MSP-H (40 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 300 mM NaCl ، 10٪ (w / v) الجلسرين) لمدة 2-3 ساعات عند 4 درجات مئوية. قم بالتغيير إلى مخزن مؤقت MSP-H طازج سعة 5 لترات وقم بدياليز لمدة 12-16 ساعة أخرى عند 4 درجات مئوية.
  10. اليوم 5: انقل محلول MSP إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي عند 18000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الراسب. انقل supernatant إلى أنبوب جديد وركز إلى 200-800 ميكرومتر باستخدام أجهزة الترشيح الفائق مع 12-14 kDa MWCO عند 4 درجات مئوية. قياس التركيز باستخدام جهاز قياس الأشعة فوق البنفسجية/VIS. استخدم معامل الانقراض 27.31 M-1 cm-1 والكتلة الجزيئية 31.96 kDa لحساب التركيز.
    ملاحظة: عادة ما ينتج عن التعبير في المفاعل الحيوي 15-30 ملغ من MSP1E3D1 لكل مزرعة لتر.
  11. الاقتباسات المجمدة بالصدمات من محلول MSP المركز في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

4. تجميع الأقراص النانوية MSP1E3D1

  1. اليوم1: تحضير 1-2 مل من مخزون الدهون 50 مللي متر (DMPG ، DOPG ، POPG DMPC ، DOPC أو POPC) في كولات الصوديوم 100 mM. يخزن على درجة حرارة -20 درجة مئوية إذا لم يستخدم في نفس اليوم.
    ملاحظة: يجب أن يكون محلول الدهون واضحا. إذا لم يكن المحلول واضحا ، فقد يتم زيادة تركيز كولات الصوديوم إلى 150 ملليمتر.
  2. امزج محلول MSP1E3D1 مع محلول الدهون. أضف دوديسيل فوسفوكولين (DPC) بتركيز نهائي قدره 0.1٪ (w/v). يمكن تعديل تفاعلات التجميع إلى أحجام نهائية تبلغ 3 مل (الجدول 2) أو 12 مل المقابلة للأحجام النموذجية لأشرطة غسيل الكلى (10 كيلوداد MWCO). احتضان تفاعلات التجميع لمدة 1 ساعة عند 21 درجة مئوية تحت إثارة لطيفة.
    ملاحظة: لكل دهون، يجب استخدام نسبة محددة من الدهون MSP1E3D1:لضمان تحضير قرص نانوي متجانس (الجدول 2). بالنسبة للدهون الجديدة أو مخاليط الدهون ، يجب تحديد النسبة المثلى من خلال تجربة تجريبية وتحليل كروماتوغرافيا استبعاد الحجم14.
  3. قبل البلل غشاء كاسيت غسيل الكلى مع المخزن المؤقت لتشكيل القرص (DF) (10 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 100 mM NaCl). انقل خليط التجميع إلى كاسيت غسيل الكلى باستخدام حقنة. يمكن إزالة فقاعات الهواء المحتملة عن طريق الشفط باستخدام المحقنة.
  4. الأيام 1-4: انزع القطر مقابل 3 × 5 لتر من المخزن المؤقت لتحديد الاتجاه لمدة 10-20 ساعة في RT تحت التحريك باستخدام قضيب تحريك. ثم انقل خليط التجميع من كاسيت غسيل الكلى إلى وحدات تصفية الطرد المركزي مع 10 kDa MWCO متوازنة مع المخزن المؤقت DF. ركز على 4000 × جم عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن أن يشير مزيج غسيل الكلى العكر إلى وجود نسبة ستويشيومتري خاطئة من MSP:lipid. يجب إزالة الراسب عند 18000 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية قبل تركيز العينة. لتجنب هطول الأمطار أثناء تركيز العينة، استخدم وحدات الترشيح الفائق ذات المحطة الميتة الكبيرة.
  5. ركز الأقراص النانوية المجمعة على تركيز لا يقل عن 300 ميكرومتر. ضع في اعتبارك أن قرصا نانويا واحدا يتكون من جزيئين MSP1E3D1 ، وبالتالي ، يجب تقسيم تركيز MSP على 2 لتحديد الكمية الصحيحة من الأقراص النانوية.
    ملاحظة: سينتج عن الإعداد الموضح (الجدول 2) 0.6-1 مل من محلول قرص نانوي 300 ميكرومتر.
  6. جهاز الطرد المركزي لإعداد القرص النانوي المركز عند 18000 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الراسب. ثم ، استنشق supernatant وتجميد الصدمات 50 ميكرولتر aliquots في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: من المستحسن تقييم نجاح تكوين القرص النانوي باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. يجب أن تكون العينة أحادية التشتت ويجب أن تحتوي فقط على كمية منخفضة من الركام. تشير المجاميع إلى أن كمية الدهون في الإعداد مرتفعة للغاية. كمرجع ، يمكن استخدام MSP1E3D1 المنقى . إذا أظهر إعداد القرص النانوي ذروة في ذروة المرجع MSP1E3D1 ، فإن نسبة الدهون المختارة إلى MSP1E3D1 كانت منخفضة للغاية.

5. إعداد تفاعل المقياس التحضيري 3 مل CECF

  1. اليوم 1: إعداد جميع حلول المخزون اللازمة كما هو مدرج (الجدول 3). يتم تخزين المخزونات عند -20 درجة مئوية وتذوب في درجة حرارة الغرفة. تأكد من خلط جميع الأسهم جيدا بعد الذوبان وقبل السحب. حساب الأحجام المطلوبة لجميع المخزونات ووضع مخطط السحب (الجدول 4). سيتم إضافة المركبات عالية الوزن الجزيئي فقط إلى RM. بالنسبة للمركبات منخفضة الوزن الجزيئي ، يمكن إعداد مزيج رئيسي 3 × مدمج ل RM و FM.
    ملاحظة: قد تكون الكميات النهائية من المخاليط المركبة أقل من المحسوبة بسبب فقدان الحجم أثناء الخلط. يمكن تجنب ذلك عن طريق إضافة حجم زائد من 2-5٪ للتعويض عن فقدان الحجم.
  2. قم بموازنة غشاء كاسيت غسيل الكلى 3 مل في 100 mM Tris-acetate ، الرقم الهيدروجيني 8.0. تأكد من إزالة المخزن المؤقت الزائد.
  3. استخدام حقنة لنقل RM إلى كاسيت غسيل الكلى. قم بإزالة الهواء الزائد في حجرة RM عن طريق الشفط باستخدام المحقنة. ضع كاسيت غسيل الكلى في غرفة غسيل الكلى.
  4. املأ غرفة غسيل الكلى ب 60 مل من FM. ضع الغطاء على الغرفة وشد البراغي لإصلاحه. احتضان الغرفة لمدة 12-16 ساعة عند 30 درجة مئوية عند 200 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: تأكد من بقاء الغرفة في وضع مستقيم أثناء الإثارة ، وإلا سيتم إعاقة تبادل المركبات الجزيئية المنخفضة.
  5. اليوم 2: باستخدام حقنة ، استنشق RM من غرفة غسيل الكلى. انقل RM إلى أنابيب جديدة وأجهزة طرد مركزي عند 16000 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة الراسب. انقل السوبرناتانت إلى أنابيب جديدة. يمكن الآن تحليل البروتين الموجود في supernatant بشكل أكبر.
    ملاحظة: في بعض الحالات، ستكون الكريات موجودة بعد الطرد المركزي. يمكن أن يوفر ذلك معلومات مهمة حول مدى ملاءمة الأقراص النانوية التي تم تحليلها أو مركبات التفاعل للحفاظ على قابلية MP المركبة للذوبان. لذلك ينصح بتحليل كمية الهدف المحتمل وجودها في الراسب باستخدام SDS-PAGE أو Western Blot أو عن طريق التقييم البصري لحجم الكريات.

6. مقياس تحليلي 60 ميكرولتر إعداد تفاعل CECF لفحص أيون Mg2+

  1. اليوم 1: امزج جميع مكونات المزيج الرئيسي 3x المعني ووزع 60 ميكرولتر على RM و825ميكرولتر على FM. املأ FM ب H 2 O وامزج FM عن طريق الدوامة. نقل FM إلى 3 آبار من 24 بئرا (الجدول 5).
    ملاحظة: نظرا لعدم إمكانية الوصول إلى حاوية Mini-CECF المخصصة، يتم حساب الأحجام الواردة في الجدول 5 لتفاعل يتم إجراؤه في خراطيش غسيل الكلى (10-14 kDa MWCO، RM: 100 μL) بحجم FM يبلغ 1.7 مل في 96 لوحة بئر عميقة (2 مل) (الشكل 1).
  2. قطع أنابيب غسيل الكلى السليلوز المجددة مع 10-14 كيلو دالتون MWCO إلى ما يقرب من 25 × 20 مم قطع الحجم وتخزينها في H2O مع 0.05٪ (ث / v) أزيد الصوديوم.
    تحذير: أزيد الصوديوم سام جدا. تجنب أي ملامسة للجلد أو الغشاء المخاطي. لا تستخدم حاويات معدنية لأن أزيد الصوديوم يمكن أن يتفاعل مع المعادن لتشكيل أزيدات معدنية متفجرة.
  3. قبل تجميع حاوية Mini-CECF ، قم بإزالة H2O الزائد من أغشية غسيل الكلى باستخدام أنسجة. ضع قطعة غشاء واحدة على كل حاوية وقم بإصلاح الأغشية بحلقة بولي تترافلور إيثيلين.
  4. انقل حاوية Mini-CECF إلى آبار صفيحة 24 بئرا مع 825 ميكرولتر من FM. تجنب فقاعات الهواء أسفل غشاء غسيل الكلى في حاوية Mini-CECF.
  5. أضف مكونات جزيئية عالية إلى RM كما هو موضح (الجدول 5) واخلطها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. أضف 60 ميكرولتر إلى حاوية التفاعل. تجنب فقاعات الهواء أثناء نقل المحلول اللزج.
  6. قطع 2 8 × 10 سم من فيلم اللدائن الحرارية الختم ولفها حول لوحة 24 بئر مع حاويات التفاعل في الداخل. هذا سوف يقلل من التبخر من خليط التفاعل. الآن ضع غطاء لوحة زراعة الخلايا على اللوحة وقم بإصلاحها بشريط. احتضن اللوحة عند 30 درجة مئوية وإثارة 200 دورة في الدقيقة لمدة 12-16 ساعة.
  7. اليوم 2: حصاد مزيج التفاعل عن طريق ثقب غشاء غسيل الكلى مع طرف ماصة في حاوية Mini-CECF وشفط RM. نقل RM إلى أنابيب جديدة وأجهزة طرد مركزي عند 16000 × g عند 4 °C لمدة 10 دقائق لإزالة الرواسب. انقل السوبرناتانت إلى أنابيب جديدة. يمكن الآن تحليل البروتين الموجود في supernatant بشكل أكبر.
    ملاحظة: في بعض الحالات ، بعد الطرد المركزي ، ستكون الكريات موجودة. هذا يمكن أن يوفر معلومات مهمة عن مدى ملاءمة الأقراص النانوية التي تم تحليلها أو مركبات التفاعل الأخرى للحفاظ على MP المركب قابلا للذوبان. لذلك ينصح بتحليل مقدار الهدف المحتمل وجوده في الراسب بواسطة SDS-PAGE أو Western Blot أو التقييم البصري لحجم الكريات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويتجلى تأثير ضبط مركبات التفاعل على العائد النهائي أو جودة النواب المركبين. يتمثل النهج الروتيني المتكرر في ضبط تركيز Mg2+ الأمثل في تفاعلات CF عن طريق التعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) كشاشة مريحة لكفاءة النظام. على سبيل المثال ، تم تصنيع GFP من متجه pET-21a (+) بتركيزات Mg 2+ بين 14 و24 mM (الشكل 2). حدد تحليل SDS-PAGE التركيز الأمثل ل Mg 2+ عند 20 mM (الشكل 2A) ، والذي يتوافق بشكل جيد مع قياسات التألق التكميلية (الإثارة عند 485 نانومتر ، وقياس الانبعاثات عند 535 نانومتر) من تفاعل CF الفائق (الشكل 2B). بالنسبة للتعبير CF عن PR البكتيري المعبر عنه من ناقل pIVEX 2.3 ومستقبل الديك الرومي β 1 الأدرينالية (Tβ1 AR) المعبر عنهمن ناقل pET-21a (+) ، تم تحديد التركيز الأمثل Mg 2+ عند 20-22 mM.

وكمثال آخر، يتم عرض تحسين جودة النواب المركبين مع الاستراتيجية الموصوفة. المعلمات القابلة للضبط للإدخال الانتقالي المشترك لل MPs في الأقراص النانوية سابقة التشكيل هي (i) تكوين الدهون في غشاء القرص النانوي و (ii) تركيز القرص النانوي النهائي في التفاعل. من المعروف جيدا أن البيئة الكارهة للماء هي معلمة مهمة للطي الصحيح ، وتجميع قلة القلة ، واستقرار النواب. نظرا لأنه يمكن تعديل تكوين الدهون في الأقراص النانوية ، فإن النهج الموصوف يتيح فحصا منهجيا مباشرا لتأثيرات الدهون على بنية ووظيفة MP. في التجارب الأولية ، يوصى بفحص الدهون باستخدام مجموعات رأس فوسفاتيديل كولين (PC) وفوسفاتيديل جليسيرول (PG) واختبار أطوال السلسلة المختلفة والتشبع. يظهر تأثير تكوين الغشاء وتركيز القرص النانوي على كفاءة الذوبان وجودة اثنين من أعضاء البرلمان المختلفين. PR هي مضخة بروتون منشطة بالضوء و MP مستقرة للغاية وعالية التوليف تصل إلى تركيزات نهائية من > 100 ميكرومتر في RM. وبالتالي ، يوصى باستخدامه كعنصر تحكم إيجابي لضمان إعداد التفاعل الصحيح حيث يمكن تقييم تركيز PR بسهولة عن طريق قياس الامتصاص عند 530 نانومتر في supernatant RM. في المقابل ، Tβ1AR هو مثال على عائلة كبيرة من مستقبلات G-protein حقيقية النواة (GPCRs) وهو MP. معقد وغير مستقر. ومن أجل الرصد المريح، تم تصنيع بنية اندماج Tβ1AR-GFP وتم تحديد التركيز الكلي للمستقبلات القابلة للذوبان في القرص النانوي في تفاعلات التليف الكيسي عن طريق تألق GFP (الشكل 3A). تم تحديد جزء المستقبل النشط المطوي وظيفيا والملزم بالرباط باستخدام اختبار ربط المرشح والليجند المسمى [3H]-dihydroalprenolol (الشكل 3B). تم إجراء فحص ربط المرشح كما هو موضح سابقا14. باختصار ، تم تحديد تركيز Tβ1AR-GFP في RM من خلال تألقه. تم احتضان GPCR مع الرباط الموسوم إشعاعيا لمدة 1 ساعة عند 20 درجة مئوية ، وتطبيقه على مرشح ، وتم غسل الرباط غير المقيد. لتحديد ارتباط [3H]-dihydroalprenolol غير المحدد ، تم تشبع المستقبل بألبرينولول غير المسمى في تفاعل التحكم. تم قياس عدد الرباط المشع في المرشحات في عداد تلألؤ وتم تحديد كمية الرباط المرتبط من خلال نشاط الملصق المحدد الخاص به. ثم تم حساب النسبة المئوية لنشاط ربط GPCR من كمية الرباط المرتبط ، وتركيز Tβ1AR-GFP ، وحجم المقايسة. يتشابه التوليف الكلي وذوبان القرص النانوي ل Tβ1AR-GFP مع جميع تركيبات الأغشية التي تم تحليلها وفي حدود 8-13 ميكرومتر (الشكل 3A). في المقابل ، يمكن اكتشاف اختلاف أعلى بكثير في جودة GPCR المركبة. يتم الحصول على أقل نشاط مع أقل من 10 ٪ من الكسر النشط مع الدهون DMPC و POPC. مع DOPG و POPG ، يمكن زيادة الجزء النشط من Tβ1AR-GFP إلى حوالي 30٪ (الشكل 3B). تشير النتائج إلى أن شحنة مجموعة رأس الدهون وكذلك مرونة سلسلة الأحماض الدهنية هي معدلات مهمة للطي ونشاط GPCR هذا.

إلى جانب تكوين القرص النانوي ، يمكن أن يكون تركيزها النهائي في تفاعل CF عاملا مهما لجودة MP. بمجرد تحديد تركيبة غشائية مناسبة للقرص النانوي ، يجب فحص تركيزه أثناء تخليق MP. من الواضح أن تركيز القرص النانوي يحتاج إلى تعديل وفقا لكفاءة التعبير عن MP. يؤدي تخليق CF لمستقبلات Tβ1AR-GFP و PR إلى تركيزات نهائية تبلغ حوالي 10 ميكرومتر و 100 ميكرومتر في RM ، على التوالي. إذا تم فحص تركيز القرص النانوي ضمن نطاق 3.75-60 ميكرومتر ، يتم الحصول على ذوبان كامل ل GPCR عند حوالي 30 ميكرومتر من الأقراص النانوية ، مما يعطي نسبة Tβ 1 AR: nanodisc من1: 3 (الشكل 4A). في المقابل ، تم تحقيق الذوبان الكامل للعلاقات العامة بالفعل باستخدام ما يقرب من 10 ميكرومتر من الأقراص النانوية ويعطي نسبة PR: nanodisc تبلغ 10: 1 (الشكل 4B). لذلك من الضروري وجود فائض من الأقراص النانوية لتحقيق ذوبان كامل تقريبا ل Tβ1AR-GFP ، في حين تشير النسبة المقلوبة في حالة العلاقات العامة إلى إدخال نسخ PR متعددة في قرص نانوي واحد. أكدت الدراسات اللاحقة لمجمعات PR / nanodisc النقية مع مطياف الكتلة الأصلي هذه الملاحظة ووجدت انتشارا لأشكال قليلة القلة الأعلى من العلاقات العامة إذا تم تصنيعها بتركيزات أقل من القرص النانوي15,18. وبالتالي يمكن استخدام معايرة أعضاء البرلمان المركبين من CF مع الأقراص النانوية كأداة لإطلاق تجمعات قليلة القلة ودراسة آثارها على وظيفة MP.

Figure 1
الشكل 1: استراتيجية التعبير CECF لإدخال بروتينات الغشاء في الأقراص النانوية. (أ) سير العمل الأساسي الذي يوضح الخطوات الرئيسية للعملية. (ب) أوعية تفاعل مقياس تحليلي مخصصة لتعبير CECF. (ج) خراطيش غسيل الكلى المتاحة تجاريا لإعداد CECF على نطاق تحليلي. (د) إعداد الميزان التحضيري (3 مل RM) بما في ذلك كاسيت غسيل الكلى سعة 3 مل وحاوية FM زجاجية شبكية مخصصة. (ه) الإدخال الانتقالي المشترك للنواب في الأقراص النانوية سابقة التشكيل وفحص الدهون في تكوين CECF. يحتوي RM على آلات النسخ / الترجمة المطلوبة والأقراص النانوية بينما توجد مركبات منخفضة الوزن الجزيئي في كلتا المقصورتين. يتم توضيح التطبيقات البيوكيميائية والهيكلية لعينات MP/nanodisc المنتجة بشكل أكبر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تأثير تركيزات Mg2+ المختلفة على تخليق CF GFP. تم تصنيع GFP في تفاعلات CF مع تركيزات Mg2 + ضمن نطاق 14-24 mM. (أ) يظهر تحليل صفحة SDS أقوى نطاق من GFP عند 20 mM Mg2+. م: علامة. (ب) تألق GFP بعد التعبير CF بتركيزات مختلفة من Mg2 + . الحد الأقصى من التألق GFP عند 20 mM Mg2+ يتوافق مع 4.6 mg / mL. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري لقياس مكرر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تأثير تكوين غشاء القرص النانوي على قابلية الذوبان وجودة GPCR المركب بواسطة CF. تم تصنيع إنتاجية ونشاط Tβ1AR-GFP في وجود أقراص نانوية 30 ميكرومتر تحتوي على تركيبات غشائية مختلفة. يتم إعطاء البروتين المركب الكلي ( A ) وجزء من المستقبل النشط المرتبط بالرباط (B) بالميكرومتر. تم قياس النشاط عن طريق فحص ربط المرشح باستخدام الليجند المسمى إشعاعيا [3H]-dihydroalprenolol. تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية للثلاثة أضعاف المستقلة. بيانات مأخوذة من المخطوطةالمنشورة سابقا 14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: شاشة الذوبان للأعضاء المركبين CF مع زيادة تركيزات القرص النانوي. تم تصنيع النواب في وجود أقراص نانوية مزودة ضمن نطاق 3.75-60 ميكرومتر (A) التعبير عن Tβ1AR-GFP مع الأقراص النانوية (DMPC) في تفاعل CF. تم تحديد التركيز الكلي عن طريق قياس التألق لاندماج GFP. بيانات مأخوذة من المخطوطةالمنشورة سابقا 14. تم تحليل العينات المنقاة لعلامة التقارب بواسطة SDS-PAGE ويظهر تلطيخ Coomassie-Blue نطاقين بارزين يقابلان Tβ1AR-GFP عند حوالي 50 kDa و MSP1E3D1 فوق 25 kDa (B) تعبير PR مع أقراص نانوية (DOPG) في تفاعل CF. تم تحديد التركيز الكلي للعلاقات العامة عن طريق قياس الامتصاص عند 530 نانومتر. البيانات المأخوذة من المخطوطة المنشورة سابقا10,18. تظهر الصور اللون الأحمر لردود الفعل النهائية بسبب وجود العلاقات العامة المطوية. توضح الصور التوضيحية تجميع PR المعدل نحو تكوينات قليلة الأبعاد أقل عند زيادة تركيزات الأقراص النانوية ، كما هو موضح في مطياف الكتلة الأصلياللاحق 18. تم تحليل العينات النقية لعلامة التقارب بواسطة SDS-PAGE ويظهر تلطيخ Coomassie-Blue نطاقين بارزين يقابلان العلاقات العامة عند حوالي 20 kDa و MSP1E3D1 فوق 25 kDa. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مركب نطاق التركيز النهائي التأثير على عينة MP
ملغ2+ 10 - 30 مللي متر أدر
دي تي تي 1 - 20 مللي متر تشكيل جسر ثاني كبريتيد ، قابلة للطي
20 خليط من الأحماض الأمينية1 0.2 – 2 مللي متر أدر
GSSG : GSH2 (1-10 ميكرومتر) : (1-10 ميكرومتر) تشكيل جسر ثاني كبريتيد ، قابلة للطي
الأقراص النانوية 10 - 100 ميكرومتر الذوبان ، تجميع oligomeric ، قابلة للطي
نوع الدهون الذوبان ، تجميع oligomeric ، قابلة للطي
S30 : HS30 ليسات3 (50-100 %) : (50-100 %) طي
S12 - S100 20 – 50 % العائد ، خلفية MP في مقايسات القناة
قالب الحمض النووي 0.5 – 30 نانوغرام/ميكرولتر RM الغلة ، تجميع oligomeric ، قابلة للطي
تصميم قالب الحمض النووي أدر
1 ، قد يختلف الخليط وفقا للتكوين الفردي ل MP إلى على سبيل المثال تحسين العائد أو تحسين مخططات وضع العلامات NMR.
2 ، يجب دائما إعداد GSH طازجة.
3 ، يجب أن يكون إجمالي تركيز محلل CF في RM 35٪ على الأقل مع محتوى S30 لا يقل عن 50٪ من أجل ضمان مستويات تعبير عالية.

الجدول 1: مكونات الفحص النقدي لتفاعلات التليف الكيسي.

MSP1E3D1 الدهون DPC
نسبه (مخزون 410 ميكرومتر) (50 000 ميكرومتر مخزون) (10٪ (ث / ت) الأسهم)
الدهون الدهون : MSP V (MSP) ج (MSP النهائي) V (الدهون) ج (نهائي الدهون) V (DPC) ج (نهائي DPC) المخزن المؤقت DF
[ميكرولتر] [ميكرومتر] [ميكرولتر] [ميكرومتر] [ميكرولتر] [%] [ميكرولتر]
DMPC 115 : 1 1500.0 205.0 1415.0 23 575 30.0 0.1 55.5
DOPC 80 :1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPC 85 : 1 1500.0 205.0 1046.0 17 425 30.0 0.1 425.0
DMPG 110 : 1 1500.0 205.0 1353.0 22 550 30.0 0.1 117.0
دوبج 80 : 1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPG 90 : 1 1500.0 205.0 1107.0 18 450 30.0 0.1 363.0

الجدول 2: نسب الدهون إلى MSP1E3D1 ل 3 مل في إعدادات التجميع في المختبر.

مركب تركيز اعداد
قالب بلازميد الحمض النووي1 > 400 ميكروغرام / مل في 10 ملليمتر Tris-HCl الرقم الهيدروجيني 8.0 إعداد مجموعة ميدي/ماكسي (مثل Qiagen)2
خليط من 20 الأحماض الأمينية3 25 مللي متر لكل منها في H2O بقايا الراسب4
خليط من 4 NTPs (75 x) c (CTP) 240 mM ، c (ATP) 360 mM ، c (UTP) 240 mM ، c (GTP) 240 mM
في H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7-8 باستخدام KOH		 يبقى القليل من الراسب4
فوسفات الأسيتيل 1 متر في H2O ، اضبط الرقم الهيدروجيني 7-8 باستخدام KOH بقايا الراسب4
فوسفو (اينول) حمض البيروفيك (K +) 1 متر في H2O ، اضبط الرقم الهيدروجيني 7-8 باستخدام KOH
حمض الفولينيك 10 ملغم/مل في H2O بقايا الراسب4
دي تي تي 0.5 م في H2O
c0mplete كوكتيل مثبط للأنزيم البروتيني 1 قرص لكل 1 مل في H2O
تريس أسيتات، درجة الحموضة 8.0 2.4 م في H2O
ملغ (OAc)2 1 متر في H2O
كواك 10 م في H2O
ريبولوك RNase-مثبط 40 يو/مل ثيرمو فيشر العلمية
tRNA (الإشريكية القولونية) 40 ملغم/مل في H2O روش (ألمانيا)
T7RNAP 3-7 ملغم/مل5 انظر قسم البروتوكول 2
بيروفات كيناز 10 ملغم/مل روش (ألمانيا)
الأقراص النانوية (DMPG) 0.2-1.0 mM6 في 10 mM Tris-Cl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 100 mM كلوريد الصوديوم انظر القسمين 3 و4 من البروتوكول
1 ، يمكن استخدام قالب PCR بتركيزات مماثلة.
2 ، نوعية الحمض النووي "مصغرة" عدة أعدت ليست مرضية.
3 ، يميل السيستين إلى أن يكون غير مستقر ويمكن إضافته بشكل منفصل.
4 ، الحل مشبع ، خلط شامل على الفور قبل إزالة aliquots ضروري.
5 ، لكل دفعة T7RNAP جديدة ، يوصى بإجراء شاشة أولية لتحديد أفضل تركيز نهائي.
6 ، يمكن أن تعتمد قابلية ذوبان الأقراص النانوية على تركيبها الدهني.

الجدول 3: إعداد حلول مخزون CF.

مركب
لماسترميكس (3.0 x) ج (نهائي) V [ميكرولتر]
خليط من 20 من الأحماض الأمينية 1 مللي متر 2520.0
خليط من 4 NTPs (75 x) 1x 840.0
فوسفات الأسيتيل 20 مللي متر 1260.0
الفوسفو (اينول)
حمض البيروفيك		 20 مللي متر 1260.0
حمض الفولينيك 0.1 ملغم/مل 630.0
تريس أسيتات، درجة الحموضة 8.0 100 مللي متر 2625.0
c0mplete 50 × 1x 1260.0
ملغ (OAc)2 19.8 (= 20)1 مللي متر 1260.0
كواك 180 (= 270)2 مللي متر 1140.0
دي تي تي 2 مللي متر 252.0
H2O 7953.0
مجموع 21 000
ل RM ج (نهائي) V [ميكرولتر]
3x ماسترميكس 1 × 1000.0
مثبط RNase 0.3 يو/ميكرولتر 22.5
tRNA (الإشريكية القولونية) 0.5 ملغم/مل 37.5
الأقراص النانوية (DMPG)3 10 ميكرومتر 75.0
قالب الحمض النووي4 0.015 نانوغرام/ميكرولتر 112.5
بيروفات كيناز 0.04 ملغم/مل 12.0
T7RNAP5 0.03 ملغم/مل 15.0
S30 ليسات 0.35 % 1050.0
الشبكية المتحولةبالكامل 6 0.6 ملليمتر 9.0
H2O - 666.5
مجموع 3000.0
ل FM ج (نهائي) V [ميكرولتر]
ماسترميكس (3 ×) 1 × 20 000
H2O - 40 000
مجموع 60 000
يتم المساهمة في 1 ، 0.2 mM Mg2 + من S30 lysate.
تساهم 2 ، 90 mM K + من فوسفات الأسيتيل وحمض البيروفيك الفوسفو (enol).
3 ، حل الأسهم المحسوبة هو 400 ميكرومتر.
4 ، حل المخزون المحسوب هو 400 ميكروغرام / مل.
5 ، محلول المخزون المحسوب هو 6 ملغ / مل.
6 ، عامل مساعد محدد للعلاقات العامة ، حل المخزون هو 200 mM في DMSO.

الجدول 4: مخطط السحب لتفاعل CECF مع 3 مل من RM و 60 مل من FM

مركب
لماسترميكس (3.0 x) ج (نهائي) V [ميكرولتر]
خليط من 20 من الأحماض الأمينية 1 مللي متر 864.0
خليط من 4 NTPs 1x 288.0
فوسفات الأسيتيل 20 مللي متر 432.0
فوسفو (اينول) حمض البيروفيك 20 مللي متر 432.0
حمض الفولينيك 0.1 ملغم/مل 216.0
تريس أسيتات، درجة الحموضة 8.0 100 مللي متر 900.0
c0mplete 1x 432.0
ملغ (OAc)2 13,8 (= 14) مللي متر1 298.0
كواك 180 (= 270) مللي متر2 389.0
دي تي تي 2 مللي متر 86.4
H2O - 2862.6
المجموع [ميكرولتر]1 - 7200.0
تركيز2+ ملغ
14 مللي متر 16 مللي متر 18 مللي متر 20 مللي متر 22 مللي متر 24 مللي متر
ل RM ج (نهائي) V [ميكرولتر] V [ميكرولتر] V [ميكرولتر] V [ميكرولتر] V [ميكرولتر] V [ميكرولتر]
3x ماسترميكس 1 × 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0
0.1 م ملغ(OAc)2 14-24 مللي متر 0.0 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0
مثبط RNase 0.3 يو/ميكرولتر 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
tRNA (الإشريكية القولونية) 0.5 ملغم/مل 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
قالب الحمض النووي3 0.015 نانوغرام/ميكرولتر 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5
بيروفات كيناز 0.04 ملغم/مل 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8
T7RNAP4 0.03 ملغم/مل 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
S30 ليسات 35 % 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0
H2O - 49.7 45.7 41.7 37.7 33.7 29.7
المجموع [ميكرولتر]5 - 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0
تركيز2+ ملغ
14 مللي متر 16 مللي متر 18 مللي متر 20 مللي متر 22 مللي متر 24 مللي متر
ل RM ج (نهائي) V [ميكرولتر] V [ميكرولتر] V [ميكرولتر] V [ميكرولتر] V [ميكرولتر] V [ميكرولتر]
3x ماسترميكس 1 × 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0
0.1 م ملغ(OAc)2 14-24 مللي متر 0.0 68.0 136.0 204.0 272.0 340.0
H2O - 2267.0 2199.0 2131.0 2064.0 1995.0 1927.0
المجموع [ميكرولتر]5 - 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0
يتم المساهمة في 1 ، 0.2 mM Mg2 + من S30 lysate. يتم ضبط المزيج الرئيسي إلى أدنى تركيز للفحص.
تساهم 2 ، 90 mM K + من فوسفات الأسيتلي وحمض البيروفيك الفوسفو (enol).
3 ، حل المخزون المحسوب هو 400 ميكروغرام / مل.
4 ، محلول المخزون المحسوب هو 6 ملغ / مل.
5 ، يتم تنفيذ ردود الفعل في التكرارات.

الجدول 5: مخطط السحب لشاشة تركيز Mg2+ مع 100 ميكرولتر من RM و 1.7 مل من FM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتم وصف الإعداد والاستراتيجيات لتحسين تعبير CF والإدراج الانتقالي المشترك للنواب الوظيفيين في الأقراص النانوية. وتشمل المعدات المطلوبة مفاعلا حيويا، وجهازا فرنسيا للضغط أو ما شابه ذلك، وقارئا للأشعة فوق البنفسجية/VIS ومضنا، وأوعية تفاعل CF مناسبة لإعداد تكوين مقصورتين، وحاضنة يتم التحكم في درجة حرارتها. المعدات القياسية الأخرى هي أجهزة الطرد المركزي لحصاد خلايا E. coli بالإضافة إلى أجهزة الطرد المركزي على الطاولة التي تصل إلى 30000 × g على الأقل لإعداد S30 lysates. إذا كان يجب إعداد محللات S80-S100 ، فإن أجهزة الطرد المركزي الفائقة ضرورية. تتوفر المعدات المدرجة بانتظام في مختبرات الكيمياء الحيوية ولا يلزم استثمارات أولية أكبر للبدء في التعبير عن التليف الكيسي. علاوة على ذلك ، فإن تخمير ومناولة خلايا E. coli لمستحضرات تحلل CF و T7RNAP هي تقنيات شائعة وقوية. أغلى المركبات هي محلل CF و T7RNAP والأقراص النانوية. يمكن إعدادها بواسطة بروتوكولات موثوقة وفعالة وتكون الأليكوتات مستقرة لسنوات عند -80 درجة مئوية. تتطلب البروتوكولات ثلاثة أيام لكل من تحضير تحلل CF و T7RNAP وأسبوع واحد تقريبا للتعبير عن MSP وتنقيته والتشكيل المسبق للأقراص النانوية. يمكن توفير الحمض النووي للقالب المستهدف باستخدام pET-21 أو pIVEX أو أنظمة ناقلات مماثلة. لإعداد أنظمة تعبير CF وتحسينها ، يمكن استخدام إنتاج متغيرات GFP مثل GFP (GFP +) أو superfolderGFP كشاشة20,32. بالنسبة لظروف إنتاج MP ، فإن التعبير عن PR هو نظام نموذجي جيد أو تحكم إيجابي لأنه يطوي في ظل العديد من الظروف المختلفة ويمكن مراقبته بسهولة عن طريق الامتصاص عند 530 نانومتر10،15،18. لإنشاء بروتوكول تعبير CF فعال ل MP جديد ، يوصى بتحسين codon لإطار القراءة المستهدف واستخدام الانصهار مع GFP المتصل ب C الطرفي25,26. وتشمل المواد الأخرى المطلوبة المواد الكيميائية والإنزيمات التي تتوفر جميعها تجاريا. يجب الحصول على هذه المكونات بجودة عالية وحساب التكلفة الإجمالية لتفاعل CF الموصوف مع 3 مل من RM و 60 مل من FM سيصل إلى حوالي 150-200 يورو. وبالتالي فإن التطبيق الرئيسي لأنظمة التعبير CF هو إنتاج البروتينات التي يصعب الحصول عليها في أنظمة التعبير الكلاسيكية القائمة على الخلايا مثل العديد من MPs أو السموم. علاوة على ذلك ، تعد أنظمة CF منصات أساسية في البيولوجيا التركيبية ، كما أن مجالات التطبيقات المتنامية باستمرار تجعلها لا غنى عنها بشكل متزايد كأداة في البحث الجزيئي. من بين أمور أخرى ، التطبيقات الروتينية هي وضع العلامات على البروتينات أو العمليات عالية الإنتاجية أو تصميم الخلايا الاصطناعية.

تمكن الاستراتيجية المثبتة من إنتاج خال من المنظفات من أعضاء البرلمان النقيين الذين تم إدخالهم بالفعل في بيئات الدهون المرغوبة من الأقراص النانوية عالية الذوبان. بمجرد إنشاء بروتوكول التعبير CF ل MP وتحسينه ، يكون الإنتاج سريعا جدا ويمكن الحصول على عينات نقية في أقل من 24 ساعة حتى في النطاق التحضيري. يتم تنقية مجمعات MP/nanodisc مباشرة من تفاعل التليف الكيسي عن طريق الستربتافيدين II أو علامات البولي هيستيدين المرفقة ب MP. تسمح العملية بإجراء تحليل وظيفي وهيكلي متوازي لعينات MP متطابقة بواسطة مجموعة من التقنيات المختلفة33. وبالتالي فإن سرعة وكفاءة الاستراتيجية تنافسية للنهج التقليدية التي تستخدم أنظمة التعبير القائمة على الخلايا واستخراج المنظفات من أغشية الخلايا تليها إعادة التشكيل الروتيني في المختبر 5,34. إن إمكانية الوصول المفتوحة إلى تفاعلات CF تسهل العديد من الدراسات الميكانيكية الفريدة لطي MP وإدخال الغشاء 15,16,18 أو تجميع MP المعقد15,18,24 أو اللائحة الوظيفية 23.

هناك اختلاف مهم في تعبير CF على التعبير القائم على الخلايا وهو عدم وجود أنظمة لمراقبة الجودة لمنتج البروتين المركب. أي بولي ببتيد مترجم مستقل عن طيه الوظيفي سينتهي به المطاف في عينة المنتج النهائية. علاوة على ذلك ، فإن عملية الإدخال في أغشية الأقراص النانوية اصطناعية ومستقلة عن الانتقال وقد تؤدي إما إلى تكامل غير مكتمل أو قد لا تعمل على الإطلاق مع عدد من أهداف MP. وبالتالي ، يمكن أن يكون جزء المنتج المذاب أخيرا في تفاعل CF غير متجانس تماما يحتوي على أعضاء البرلمان المرتبطين بالأعضاء المدمجين جزئيا أو المرتبطين بالغشاء فقط. وبالتالي ، يمكن طي جزء صغير فقط من عينة منقية من مجمعات MP/nanodisc وظيفيا. يعد تعديل تكوين الغشاء والضبط الدقيق لنسب MP إلى nanodisc عن طريق تعديل تركيزات الأقراص النانوية وقوالب الحمض النووي أدوات مناسبة للتحسين. ومع ذلك ، فإن نهج مراقبة الجودة النهائية مثل التنميط الاستبعاد للحجم والمقايسات الوظيفية الكمية المحددة المستهدفة ضرورية دائما لتحسين بروتوكولات التعبير CF. وبالتالي ، فإن توافر مثل هذه الفحوصات يمكن أن يحد من التطبيقات ، خاصة في المشاريع بما في ذلك أعضاء البرلمان الذين يحتاجون إلى بيئات ليبوسومية للوظيفة مثل الناقلات أو القنوات أو المضخات. علاوة على ذلك ، يمكن أن تحد قيود حجم الأقراص النانوية من إدخال مجموعات MP الكبيرة.

في الأمثلة الموثقة ، يكون التباين في الجزء المطوي وظيفيا من GPCR Tβ1AR-GFP ضمن نطاق بضعة بالمائة ، يصل إلى حوالي 30٪. يتطلب الطي الوظيفي تعديلا دقيقا لعدد من المعلمات14 وقد تكون عملية تحسين فردية ومملة مماثلة ضرورية ل GPCRs الأخرى وكذلك22. ومع ذلك ، فإن العائد الذي تم تحقيقه أخيرا من GPCR المطوي وظيفيا يتنافس مع أنظمة الإنتاج الأخرى ويسمح بإعداد > 1000 مقايسة إشعاعية لدراسات ربط الليجند من تفاعل واحد 60 ميكرولتر في مفاعل Mini-CECF على نطاق تحليلي. تجدر الإشارة إلى أن دراسات ربط الرباط لبنى الاندماج GPCR-GFP لا تتطلب أي خطوات تنقية. إذا لزم الأمر ، يمكن تحقيق التنقية من خلال الاستفادة من علامات التقارب المرفقة ب MP المركب ، مثل علاماته أو علامة العقدية II. ثم يتم تخفيف RM في المخزن المؤقت المطلوب وتحميله على عمود كروماتوغرافيا التقارب المقابل الذي تم توازنه مسبقا وفقا لذلك. وقد ساعد التقييم الهيكلي للعلاقات العامة وغيرها من أعضاء البرلمان المركبين من CF بواسطة التحليل الطيفي للرنين المغناطيسي النووي أو التبلور بالفعل على إنشاء أنظمة تعبير CF كمنصات أساسية في أبحاث MP. يمكن أن تصبح الاستراتيجية الموصوفة لإنتاج مجمعات MP/nanodisc مثيرة للاهتمام بشكل خاص للدراسات الهيكلية المستقبلية بواسطة المجهر الإلكتروني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نود أن نشكر منحة دويتشه فورشونغسجيمينشافت (DFG) BE1911/8-1 ، ومشروع LOEWE GLUE ، ومركز الأبحاث التعاوني النقل والاتصالات عبر الأغشية (SFB807) على الدعم المالي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris) Carl Roth (Germany) 4855
2-Mercaptoethanol Carl Roth (Germany) 4227
2-Propanol Carl Roth (Germany) 9781
[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride American Radiolabeled Chemicals (USA) ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP) Merck (Germany) 1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) Sigma Aldrich (Germany) A9251
Alprenolol hydrochloride Merck (Germany) A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose® Sigma-Aldrich (Germany) Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1 Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1 B.Braun (Germany)
Centrifuge Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acid Carl Roth (Germany) 8137
Coomassie Brilliant Blue R250 Carl Roth (Germany) 3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks Schott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt Sigma-Aldrich (Germany) C1506
D-glucose monohydrate Carl Roth (Germany) 6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate Carl Roth (Germany) 6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing Fisher Scientific (Germany) 8700152
Dithiothreit Carl Roth (Germany) 6908
Ethanol Carl Roth (Germany) K928
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma-Aldrich (Germany) 47612
French pressure cell disruptor SLM; Amico Instruments (USA)
Glycerol Carl Roth (Germany) 3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) Sigma-Aldrich (Germany) G8877
Hydrochloric Acid Carl Roth (Germany) K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL GE Life Sciences (Germany) GE17-5248
Imidazole Carl Roth (Germany) 3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Carl Roth (Germany) 2316
Kanamycin Carl Roth (Germany) T832
L-Alanine Carl Roth (Germany) 3076.1
L-Arginine Carl Roth (Germany) 6908
L-Asparagine Carl Roth (Germany) HN23
L-Aspartic Acid Carl Roth (Germany) T202
L-Cysteine Carl Roth (Germany) T203
L-Glutamic Acid Carl Roth (Germany) 3774
L-Glutamine Carl Roth (Germany) 3772
L-Glycine Carl Roth (Germany) 3187
L-Histidine Carl Roth (Germany) 3852
L-Isoleucine Carl Roth (Germany) 3922
L-Leucine Carl Roth (Germany) 1699
L-Lysine Carl Roth (Germany) 4207
L-Methionine Carl Roth (Germany) 9359
L-Proline Carl Roth (Germany) 1713
L-Phenylalanine Carl Roth (Germany) 1709
L-Serine Carl Roth (Germany) 4682
L-Threonine Carl Roth (Germany) 1738
L-Tryptophane Carl Roth (Germany) 7700
L-Tyrosine Carl Roth (Germany) T207
MD100 dialysis units Scienova (Germany) 40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES) Carl Roth (Germany) 6763
n-dodecylphosphocholine Antrace (USA) F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell Biorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems Biorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000 Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseine Carl Roth (Germany) 6681
Peristaltic pump: ip-12 Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium salt Sigma Aldrich (Germany) 860077
Potassium dihydrogen phosphate Carl Roth (Germany) P018
Potassium acetate Carl Roth (Germany) 4986
Potassium chloride Carl Roth (Germany) 6781
Pyruvate Kinase Roche (Germany) 10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SL Hidex (Finland)
SDS pellets Carl Roth (Germany) 8029
Sodium azide Sigma-Aldrich (Germany) K305
Sodium chloride Carl Roth (Germany) P029
Spectrophotometer Nanodrop Peqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark® Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli) Roche (Germany) 10109550001
Ultra sonificator Labsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP) Sigma-Aldrich (Germany) U6625
Y-30 antifoam Sigma-Aldrich (Germany) A6457
Yeast extract Carl Roth (Germany) 2904

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  2. Ritchie, T. K., et al. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs. Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).
  3. Frauenfeld, J., et al. A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  4. Yang, Z., et al. Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains. Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).
  5. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  6. Junge, F., et al. Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins. New Biotechnology. 28 (3), (2011).
  7. Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).
  8. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  9. Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Membrane protein expression: no cells required. Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).
  10. Roos, C., et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).
  11. Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).
  12. Patriarchi, T., et al. Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).
  14. Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).
  15. Henrich, E., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 1-19 (2017).
  16. Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  17. Henrich, E., et al. Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway. Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).
  18. Peetz, O., et al. Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).
  19. Kigawa, T., et al. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).
  20. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  21. Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs. BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).
  22. Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding. Methods. 147 (1), 73-83 (2018).
  23. Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer. Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).
  24. Matthies, D., et al. Cell-free expression and assembly of ATP synthase. Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).
  25. Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins. Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).
  26. Haberstock, S., et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).
  27. Falkinham, J. O., Clark, A. J. Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12. Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).
  28. Foshag, D., et al. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).
  29. Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).
  30. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  31. Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation. Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).
  32. Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).
  33. Henrich, E., et al. From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs. Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).
  34. Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 165 ، التعبير في المختبر ، خال من الخلايا ، L-CF ، خال من المنظفات ، أقراص نانوية ، بروتينات غشائية ، مستقبلات مقترنة بالبروتين G ، بروتيرودوبسين ، تصميم غشاء ، إدخال غشاء متعدي مشترك
الإدخال الانتقالي المشترك لبروتينات الغشاء في الأقراص النانوية سابقة التشكيل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Levin, R., Koeck, Z., Dötsch,… More

Levin, R., Koeck, Z., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs. J. Vis. Exp. (165), e61844, doi:10.3791/61844 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter